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RhoA és una proteïna GTPasa amb un paper rellevant en importants processos cel·lulars. Els nivells d’expressió de RhoA i/o la seva activitat es troben alterats en molts tipus de càncer, però curiosament s’han trobat mutacions recurrents i específiques de tumor en càncer gàstric de tipus difús (CGD), carcinoma de cèl·lules escamoses de cap i coll (CCECC), limfoma de Burkitt, leucèmia/limfoma T de l’adult i limfoma T angioimmunoblàstic, suggerint un paper diferent y depenent de tumor per cada proteïna mutant. En aquest treball hem caracteritzat a nivell funcional set de les mutacions recurrents en RHOA. Els nostres resultats indiquen que, alguns dels mutants exhibeixen una disminució en l’estabilitat de la proteïna i una localització predominant al nucli en comparació amb la proteïna RhoA nativa. A més, l’avaluació dels efectes de la sobreexpressió de les formes de RhoA mutades en l’organització del citoesquelet va mostrar una reducció general en la formació de filaments d’actina i una major capacitat d’adhesió a substrat. Finalment, la majoria dels mutants estudiats mostraren una senyalització depenent de les vies NFkB i del factor de resposta sèrica reduïda. Per conèixer els mecanismes moleculars desregulats per les mutacions de RhoA, s’avaluà l’interactoma. La capacitat d’unió de les diferents proteïnes mutants de RhoA a Rhotekina resultà ser depenent de la seva estabilitat proteica. A més, l’avaluació de la interacció entre les diferents proteïnes RhoA i els seus efectors més comuns mitjançant un sistema de doble híbrid en llevat, demostrà la incapacitat de tots els mutants de DGC estudiants d’unir PKN1. Tanmateix, el mutant de CCECC RhoA E40Q resultà deficient en la unió a NET1 y kinectina. El CCECC és un grup molt heterogeni de càncers. Les mancances en la millora de la supervivència i en els tractaments personalitzats han promogut la investigació activa dels mecanismes moleculars associats al seu desenvolupament. Encara que RHOA està mutat en només l’1,5% dels pacients de CCECC, més del 60% d’aquestes mutacions succeeixen a E40Q, el que suggereix un paper determinant en el procés de carcinogènesi. L’avaluació immunohistoquímica dels nivells de RhoA en mostres de teixit de CCECC va indicar que l’expressió de RhoA s’associa amb una pitjor supervivència en pacients amb tumors de laringe específicament. Per estudiar el paper de RhoA nativa a CCECC, es van generar línies cel·lulars isogèniques deplecionades de RHOA mitjançant ARN d’interferència (RHOA KD) i inactivació genètica mitjançant la tecnologia CRISPR/Cas9 (RHOA KO). Els resultats van mostrar un alentiment del creixement cel·lular in vitro i in vivo, així com una disminució del potencial de migració in vitro en línies cel·lulars tumorals derivades de llengua i laringe. Aquests resultats confirmen que RHOA actua com un oncogèn a CCECC. Seguidament, es va avaluar el paper de la mutació E40Q en sistemes cel·lulars de sobreexpressió de RhoA de manera induïble amb doxiciclina. Sorprenentment, la sobreexpressió de RhoA nativa o E40Q en cèl·lules de faringe va reduir el creixement cel·lular in vitro. Per tant, vam decidir reintroduir RhoA nativa o E40Q en els sistemes cel·lulars de llengua i laringe RHOA KD i RHOA KO generats prèviament. Curiosament, la reintroducció de RhoA nativa i E40Q no va afectar el creixement cel·lular ni les capacitats de migració de les cèl·lules. En conjunt, la complexitat del patró mutacional de RHOA sense precedents, específic del tipus de tumor, i els nostres resultats, mostren que els diferents mutants de RhoA presenten diferents papers oncogènics. A més, demostrem que RhoA a CCECC proporciona un avantatge de creixement per a les cèl·lules tumorals que donen suport al possible paper oncogènic en aquest tipus tumoral. RhoA es una proteína GTPasa con un papel relevante en importantes procesos celulares. Los niveles de expresión de RhoA y/o su actividad se encuentran alterados en muchos tipos de cáncer, pero curiosamente, se han encontrado mutaciones recurrentes y específicas de tumor en cáncer gástrico de tipo difuso (CGD), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC), linfoma de Burkitt, leucemia/linfoma T del adulto y linfoma T angioinmunoblástico, sugiriendo un papel distinto y dependiente de tumor para cada proteína mutante. En este trabajo hemos caracterizado a nivel funcional siete de las mutaciones recurrentes en RHOA. Nuestros resultados indican que, algunos de los mutantes exhiben una disminución en la estabilidad de la proteína y una localización predominante en el núcleo en comparación con la proteína RhoA nativa. Además, la evaluación de los efectos de la sobreexpresión de las formas de RhoA mutadas en la organización del citoesqueleto mostró una reducción general en la formación de filamentos de actina, y una mayor capacidad de adhesión a sustrato. Finalmente, la mayoría de los mutantes estudiados mostraron una señalización dependiente de las vías NFkB y del factor de respuesta sérica reducida. Para conocer los mecanismos moleculares desregulados por las mutaciones de RhoA, se evaluó su interactoma. La capacidad de unión de las diferentes proteínas mutantes de RhoA a Rhotekina resultó ser dependiente de su estabilidad proteica. Además, la evaluación de a interacción entre las diferentes proteína RhoA y sus efectores más comunes mediante un sistema de doble híbrido en levadura, demostró la incapacidad de todos los mutantes de DGC estudiados de unir a PKN1. Sin embargo, el mutante de CCECC RhoA E40Q resultó deficiente en la unión a NET1 y kinectina. El CCECC es un grupo muy heterogéneo de cánceres. Las carencias en la mejora de la supervivencia y en los tratamientos personalizados han promovido la investigación activa de los mecanismos moleculares asociados su desarrollo. Aunque RHOA está mutado sólo en el 1,5% de los pacientes de CCECC, más del 60% de estas mutaciones ocurren en E40Q, lo que sugiere un papel determinante en el proceso de carcinogénesis. La evaluación inmunohistoquímica de los niveles de RhoA en muestras de tejido de CCECC indicó que la expresión de RhoA se asocia con una peor supervivencia en pacientes con tumores de laringe específicamente. Para estudiar el papel de RhoA nativa en CCECC, se generaron líneas celulares isogénicas deplecionadas de RHOA mediante ARN de interferencia (RHOA KD) e inactivación genética mediante la tecnología CRISPR/Cas9 (RHOA KO). Los resultados mostraron una ralentización del crecimiento celular in vitro e in vivo, así como una disminución del potencial de migración in vitro en líneas celulares tumorales derivadas de lengua y laringe. Estos resultados confirman que RHOA actúa como un oncogén en CCECC. Seguidamente, se evaluó el papel de la mutación E40Q en sistemas celulares de sobreexpresión de RhoA de manera inducible con doxiciclina. Sorprendentemente, la sobreexpresión de RhoA nativa o E40Q en células de faringe redujo el crecimiento celular in vitro. Por consiguiente, decidimos reintroducir RhoA nativa o E40Q en los sistemas celulares de lengua y laringe RHOA KD y RHOA KO generados previamente. Curiosamente, la reintroducción de RhoA nativa y E40Q no afectó el crecimiento celular ni las capacidades de migración de las células. En conjunto, la complejidad del patrón mutacional de RHOA sin precedentes, específico del tipo de tumor, y nuestros resultados muestran que los distintos mutantes de RhoA presentan diferentes papeles oncogénicos. Además, demostramos que RhoA en CCECC proporciona una ventaja de crecimiento para las células tumorales que apoyan el posible papel oncogénico en este tipo tumoral. RhoA is a small GTPase with an important role in key cellular processes. RhoA expression levels and/or activity are altered in multiple cancers, but interestingly, recurrent and tissue-specific hotspot mutations have been recently identified in diffuse gastric cancer (DGC), head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), Burkitt lymphoma, adult T-cell leukemia/lymphoma and angioimmunoblastic T-cell lymphoma, suggesting a distinctive and tumor-dependent role of each mutant protein. In this work, seven recurrent RHOA mutations have been functionally characterized. Our results indicate that some RhoA mutants display lower protein stability and a predominant nuclear localization compared to the wild-type (wt) RhoA. Moreover, the evaluation of the effects of mutant RhoA overexpression on the cytoskeleton organization showed a general reduction in the formation of actin filaments, and a higher cell adhesion capacity. Finally, we observed a reduced NFkB and serum response factor signaling in most of the hotspot RhoA mutants studied. To dissect the molecular mechanisms deregulated due to RhoA mutations, we investigated the protein interactome. Binding of the different RhoA mutants to Rhotekin effector protein trough a pull-down assay was dependent on RhoA protein levels. A yeast-two-hybrid system approach between RhoA forms and the most common RhoA effector proteins, evidenced that all the studied DGC mutants were unable to bind to PKN1; whereas, the HNSCC hotspot mutant RhoA E40Q failed to bind to NET1 and kinectin. HNSCC is a very heterogeneous group of cancers. The lack of survival improvement and personalized treatments has promoted an active research into the molecular mechanisms of HNSCC. RHOA is mutated only in around of 1.5% of the HNSCC cases, but interestingly, more than 60% of these mutations occur in E40Q, suggesting a possible active role in the tumorigenic process. Immunohistochemical analysis of RhoA expression in HNSCC tissue microarray indicated that RHOA expression is associated with shorter survival outcomes in patients with larynx tumors. To study the role of wt RhoA in HNSCC, we engineered isogenic cell line systems downregulated for RHOA through the directed targeting of RHOA by shRNA (RHOA KD) and by CRISPR/Cas9 technology (RHOA KO). Results showed an impairment of cell growth in vitro and in vivo, as well as a decrease of the migration potential in vitro, both in tongue and larynx-derived tumor cell lines. These results confirm that RHOA acts as an oncogene in HNSCC. Next, the role of E40Q hotspot mutation was evaluated in doxycycline-inducible RhoA overexpressing cell systems. Surprisingly, RhoA wt or E40Q overexpression in pharynx cells reduced cell growth in vitro. Hence, we decided to re-introduce RhoA wt or E40Q in tongue and larynx cell lines RHOA KD and RHOA KO cell systems. Intriguingly, the reintroduction of RhoA wt and E40Q did not affect cell growth and migration capabilities of the cells. Altogether, the unprecedented tumor-type-dependent complexity in the mutational landscape of RhoA and our results indicate that the different RhoA hotspot mutations exhibit different oncogenic roles. Furthermore, specifically in HNSCC we demonstrate that RhoA provides a growth advantage for the cancer cells supporting a possible oncogenic role of RhoA in this tumor type. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina

La miosina VI (MYO6) es un motor molecular que puede anclar moléculas o proporcionar tráfico de corto alcance a lo largo del citoesqueleto de actina valiéndose de la energía obtenida de la hidrólisis de ATP. La miosina VI se mueve hacia el extremo negativo de los filamentos de actina, en dirección opuesta al resto de miosinas. Se ha demostrado que la función de transporte de la miosina VI está implicada en varios procesos celulares, como la endocitosis, el tráfico endocítico y de reciclaje de vesículas, la autofagia, la exocitosis y la transcripción nuclear; y su función de anclaje se ha visto involucrada en el mantenimiento de la estructura del complejo de Golgi, de las estereocilias de las células ciliadas cocleares, de la membrana de las microvellosidades de los enterocitos, y en el mantenimiento de las uniones adherentes. La miosina VI se expresa en la mayoría de los tejidos, pero sus niveles de expresión varían considerablemente entre ellos. Además, la miosina VI puede existir en varias isoformas que se expresan diferentemente dependiendo del tipo de tejido. Estas isoformas interactúan con diferentes moléculas y, por lo tanto, llevan a cabo diferentes funciones. La miosina VI está altamente expresada en las células epiteliales del intestino delgado y grueso, estando principalmente localizada en la membrana apical y en la basolateral, aunque también está presente de forma difusa en el citoplasma. La miosina VI ha sido relacionada con determinados tipos de cáncer. En el cáncer ovárico, el de próstata y en la leucemia linfoide, se ha visto que la miosina VI está sobre-expresada, donde se le atribuye un papel en la migración y la invasión. Otros estudios también han asociado la sobre-expresión de la miosina VI con una mayor proliferación celular en cánceres como el hepático, el de mama y el de pulmón. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de la miosina VI en el cáncer colorrectal, el tercer tipo más común de cáncer en el mundo. En este estudio, mediante el uso de un ‘tissue microarray’ (TMA) que contenía muestras de tejido normal de colon, tumores colorrectales primarios de estadio Dukes' C y muestras de metástasis de ganglios linfáticos, se observó que la expresión de MYO6 se reduce o se pierde con frecuencia en tumores primarios en comparación con la expresión de células epiteliales normales de colon; y que incluso aún se reduce más en las metástasis de los ganglios linfáticos, en comparación con los tumores primarios. Además, en pacientes con cáncer colorrectal localmente avanzado, la baja expresión de MYO6 en el tumor primario se asoció con una supervivencia general y una supervivencia libre de enfermedad más cortas. Para poder estudiar el posible papel de la miosina VI en el cáncer colorrectal, se diseñaron modelos celulares isogénicos inducibles por doxiciclina para reducir la expresión de MYO6. Los resultados mostraron que la inactivación de MYO6 no altera la capacidad de diferenciación/polarización de las células de cáncer de colon. Tampoco la capacidad de migración y de invasión in vitro, ni la habilidad de metastatizar en modelos de ratón, se vieron afectadas. Sin embargo, se observó que la reducción de la expresión de MYO6 incrementaba el crecimiento de las células de cáncer de colon en un modelo de xenoinjertos subcutáneos en ratones inmunodeficientes NOD/SCID, a pesar de no provocar ningún cambio en el crecimiento in vitro. Por otro lado, la ausencia de MYO6 en ratones ApcMin/+ o en los tratados con AOM, no aceleró la tumorigénesis intestinal. Colectivamente, estos resultados indican que la pérdida de MYO6 es importante para promover el crecimiento de las células de cáncer colon, lo que indica un posible papel supresor tumoral de MYO6 en el cáncer colorrectal. Myosin VI (MYO6) is a molecular motor that can provide short range trafficking along the actin cytoskeleton by using the energy from ATP hydrolysis or anchor cargoes to actin filaments. Myosin VI moves towards the minus-end of actin filaments, in the opposite direction to the rest of myosins. The trafficking function of myosin VI has been shown to be involved in several cellular processes, such as, endocytosis, endocytic trafficking and recycling of vesicles, autophagy, exocytosis and nuclear transcription; and its anchoring function has been shown to be involved in the maintenance of Golgi complex, cochlear hair-cell stereocilia, enterocytic brush border membrane and adherens-junctions. Myosin VI is widely expressed in most tissues, but its expression levels vary considerably among them. Moreover, myosin VI can exist in several isoforms that are expressed in a tissue-specific manner. The isoforms interact with different binding partners and thus, carry out different functions. Myosin VI is highly expressed in the epithelial cells of small and large intestine, being mainly localized to the apical and basolateral membranes, although it is also present diffusely in the cytoplasm. Myosin VI has been involved in certain types of cancer. In ovarian carcinoma, prostate cancer and lymphoid leukemia myosin VI is found overexpressed with a role in migration and invasion. Other studies have also associated MYO6 overexpression with an increased cell proliferation in cancers such as, hepatocellular carcinoma, breast cancer and lung cancer. However, little is known about the role of myosin VI in colorectal cancer, the third most common type of cancer worldwide. In this study, using a tissue microarray containing samples from normal colon tissues, primary Dukes’C colorectal tumors and lymph node metastases, MYO6 expression was observed to be frequently reduced or lost in primary tumors compared to normal colonic epithelial cells. Moreover, MYO6 levels were further reduced in regional lymph node metastases compared to primary tumors. Importantly, low tumor MYO6 expression was associated with shorter overall and disease-free survival in patients with locally advanced colorectal cancer. Therefore, to study the possible role of MYO6 in colorectal cancer, isogenic cell line systems with doxycycline-inducible MYO6 downregulation were engineered. The results showed that MYO6 inactivation does not alter the differentiation/polarization capability of colon cancer cells. The migration and invasion ability in vitro and the potential to metastasize in an in vivo mouse model were neither altered by MYO6 knockdown. Nevertheless, although no changes were observed in the growth in vitro, MYO6 inactivation increased the growth of colon cancer cells in a subcutaneous xenograft model in immunodeficient NOD/SCID mice. On the other hand, absence of MYO6 in ApcMin/+ or AOM-treated mice did not accelerate intestinal tumorigenesis. Collectively, our results indicate that loss of MYO6 provides a significant growth advantage to colon cancer cells, indicating a possible tumor suppressor role of MYO6 in colorectal cancer.

[eng] Gastric cancer (GC) is one of the most common types of cancer in the Western World and accounts for over 700,000 deaths every year worldwide. The prognosis is dismal, with an average 5-year survival rate of less than 20%, mainly because of late diagnosis, due to the early stages are clinically silent. The cause of GC is multifactorial, as infectious agents, enviromental or/and genetic factors. Based on Lauren’s histologic classification, there are 2 types of GC: intestinal (IGC) and diffuse (DGC). Diffuse carcinoma cells lacks cohesion and invade tissues independently or in small clusters, is more common in young patients and behaves more aggressively than the intestinal type. Recent findings published in Nature and Nature Genetics identified frequent hotspots (14-24%) mutations in the small GTPase RHOA in the diffuse type of gastric tumors. To investigate the mechanism that underlies downstream of RHOA we analyzed the capacity of the mutations more commonly found in gastric tumors to bind to different effectors. We observed that the mutations found in gastric tumors specifically affect the capacity of RHOA to bind to PKN effector family. Therefore, in this thesis we study and characterized the role of PKN1 in GC. We demonstrated that the downregulation of PKN1 with shRNA or the deletion mediated by CRISPR/Cas9 results in the increase of proliferation in the diffuse gastric cell lines “in vitro” and “in vivo”. Moreover, the opposite effect is observed when we overexpress the constitutively active form of PKN1 in diffuse gastric cell lines with moderate or low levels of PKN1. In addition, we use a novel mouse model with conditional expression in the gastric mucosa of the RHOA-Y42C mutation (the most frequent mutation found in DGC) to investigate the role of RHOA in gastric tumorogenesis initiated by either N-methyl-N-nitrosourea (MNU) or Apc mutations. The mice with expression of the RHOA- Y42C have a significant increase in the number of tumors indicating that RhoA-Y42C is important for progression of the gastric tumors. Finally, we performed a preclinical testing of a new therapeutic approach, such as dietary supplements of arachidonic acid, a well- established activator of PKN1. The work carried out in this thesis will shed light on the newly identified deregulation of RHOA-PKN signaling in gastric cancer and provide a solid rationale for therapeutic targeting of this pathway.

Miosina VB es una proteína que actúa como un motor molecular usando la energía del ATP para moverse a lo largo de filamentos de actina. Participa en el trafico intracelular de endosomas de reciclaje en la parte subapical de células polarizadas y no polarizadas. Su expresión es muy abundante en el intestino donde participa en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad de los enterocitos. Mutaciones en MYO5B causan la enfermedad de inclusión de microvellosidades, in raro trastorno congénito que afecta a las células epiteliales del intestino cursando con diarrea acuosa persistente que suele ser fatal. Esta enfermedad se caracteriza por la presencia de alteraciones morfológicas en los enterocitos, atrofia de las vellosidades y deslocalización de proteínas del polo apical y basolateral del enterocito. Su patología molecular no se conoce, principalmente por la falta de modelos animales. En el presente estudio, describimos un versátil modelo murino con inactivación constitutiva de Myo5b e inactivación condicional en las células epiteliales intestinales inducida por tamoxifeno. En ambos casos, los animales muestras un cuadro clínico muy semejantes al de los pacientes con enfermedad de inclusión de microvellosidades, presentado diarrea y deshidratación que causan la muerte del animal. A nivel histológico, el intestino muestra las mismas alteraciones en los enterocitos que las presentes en pacientes humanos, incluyendo atrofia de vellosidades y deslocalización de marcadores proteicos. Además, la inactivación de Myo5b también provocó hiperproliferación de las criptas intestinales. Por lo tanto, el modelo animal presentado constituye una herramienta muy útil para investigar las causas moleculares de la enfermedad y ensayar de manera preclínica fármacos u otras opciones terapéuticas. Por otro lado, la pérdida de polaridad y diferenciación es también una de las señas de identidad de los carcinomas metastásicos avanzados y correlaciona con un mal pronóstico de los pacientes. En concreto, para el cáncer colorrectal, investigaciones previas llevadas a cabo en nuestro laboratorio ya han demostrado que la pérdida de miosina IA promueve la progresión la enfermedad y tiene actividad supresora de tumores. Dicha proteína es abundante en el borde en cepillo de los enterocitos, y participa en el mantenimiento de la estructura polarizada. Otros estudios han señalado la relación entre la inactivación de MYO5B con un incremento en la motilidad e invasión de células de cáncer gástrico, aunque todavía no se conoce nada de su relación con en el cáncer colorrectal. Para resolver esta cuestión, hemos diseñado modelos in vitro inducibles por doxiciclina para sobre expresar y reducir la expresión de dicha proteína en líneas celulares de cáncer de colon. Además, se ha empleado la tecnología CRISPR/Cas9 para inactivar la expresión de MYO5B en la línea de cáncer de colon Caco2-BBE. Los resultados muestran cambios en la polarización y diferenciación de dichas líneas celulares, de acuerdo con observaciones previas. También se ha observado una posible relación entre MYO5B y la capacidad de movilidad e invasión de las líneas de cáncer de colon. Sin embargo, la hiperproliferación observada en el intestino de los ratones no se reproduce en las líneas de cáncer de colon empleadas tras reducir o sobre expresar MYO5B, o en modelos xenograft subcutáneos in vivo de dichas líneas. Por otro lado, usando un microarray de tejidos con 155 muestras de tumores primarios de pacientes con cáncer colorrectal en estadio Dukes C se ha comprobado que una reducción en la expresión de MYO5B se asocia con una disminución en el tiempo de recaída y en la supervivencia total de los pacientes de cáncer de colon. Además, tumores con un grado de diferenciación bajo también expresan niveles de MYO5B significativamente reducidos. Finalmente, todos estos resultados indican que MYO5B juega un papel importante en la diferenciación del intestino normal y de las líneas de cáncer de colon. De la misma manera, MYO5B también podría desempeñar un papel en la progresión del cáncer colorrectal promoviendo movilidad e invasión de las células tumorales., Myosin VB is a molecular motor protein that uses the energy of ATP to move along actin filaments. It participates in the recycling endosomes trafficking in the subapical cytoplasmic region of non-polarized and polarized cells. It is highly expressed in the small and large intestine, where its role in the establishment of polarized function in enterocytes is also well known. Inactivating mutations of MYO5B have been associated with microvillus inclusion disease (MVID), a rare congenital disorder of the intestinal epithelial cells that presents with persistent life-threatening watery diarrhea. It is characterized by morphological enterocyte abnormalities such as microvillus atrophy and mislocalization of apical and basolateral protein transporters. The molecular pathology of the disease is not well known mainly due to the lack of animal models. In the present study, we report a versatile murine model with targeted inactivation of Myo5b. This model allowed us to generate and characterized a constitutive Myo5b knockout mice and a tamoxifen-inducible intestinal-epithelium-specific Myo5b knockout. In both cases, the mice closely resemble the phenotype of MVID patients, developing watery diarrhea and dehydration causing the death of the animal. Histological study of the intestine showed all the characteristic enterocyte defects observed in MVID patients, including microvillus atrophy and mislocalization of protein markers. Moreover, the inactivation of MYO5B also originated hyperproliferation of the intestinal crypts. Therefore, our mice constitute a useful model to further investigate the underlying molecular mechanism of this disease and to preclinically assess the efficacy of novel therapeutic approaches. In addition, hyperproliferation as well as loss of cell polarity, differentiation, and tissue architecture are hallmarks of advanced metastatic carcinomas and strongly correlate with poor patient prognosis. Specifically, for colorectal cancer, the third most common type of cancer worldwide, we have previously demonstrated that the loss of brush border MYO1A, also involved in cell polarity, promotes cancer progression and has tumor suppressor activity. Other studies have indicated a relationship between MYO5B inactivation and gastric cancer, promoting invasion and motility, but little is known regarding its role in colorectal cancer. To address this question, we have developed novel doxycycline-inducible in vitro models of MYO5B overexpression and downregulation. Moreover, we have generated MYO5B knockout Caco2-BBE cells using CRISPR/Cas9 technology. Our results showed changes in the polarization and differentiation of colon cancer cells, in agreement with previous observations in the normal intestine. Moreover, we have observed a relationship between MYO5B and the motility and invasion capacity of colon cancer cells, indicating a possible role of MYO5B in colon cancer progression. However, the effect of MYO5B loss in cell proliferation observed in our Myo5b knockout mice could not be confirmed in our models in vitro and in vivo, employing cell line-derived xenografts. In addition, using a tissue microarray containing triplicate samples from 155 primary Dukes C colorectal tumors, reduced MYO5B expression was found to be associated with shorter disease-free and overall survival of the patients. Moreover, poorly differentiated tumors showed significantly reduced expression of MYO5B. Collectively, our results indicate that MYO5B plays an important role in the differentiation of the normal intestinal epithelium and colon cancer cells, as well as a possible role in cancer progression promoting cell motility and invasion.

[cat] El càncer colorectal és una malaltia causada per canvis genètics i epigenètics. La inactivació de gens supressors de tumors i l'activació d'oncogens són fites clau en la progressió tumoral. Els pacients amb càncer en estadi III o IV són sotmesos a cirurgia seguida de quimioteràpia. No obstant això, només el 30% dels pacients mostren una resposta objectiva fins i tot als millors agents quimioterapèutics disponibles. En aquest estudi es van utilitzar assajos d'alt rendiment de tot el genoma per caracteritzar millor els aspectes importants de la progressió oncogènica, com la desregulació de la proliferació i l'expressió aberrant causada per mecanismes epigenètics. La ràpida proliferació tumoral s'associa al pitjor pronòstic del pacient, aquí hem caracteritzat la signatura transcripcional de les cèl.lules de càncer colorectal amb ràpida proliferació de cèl.lules en un intent d'identificar els gens importants per sostenir el creixement tumoral i que podrien ser utilitzats com a dianes terapèutiques. Per comprendre millor els mecanismes subjacents a la profunda reprogramació transcripcional observada en les cèl.lules canceroses, es va investigar l'associació entre els nivells de metilació de l'ADN en els promotors i els nivells d'expressió d'aquests gens en línies cel.lulars de càncer colorectal. Els resultats d'aquest estudi poden contribuir a la identificació de noves dianes quimioterapèutics per a pacients amb càncer colorectal, i la caracterització de nous gens / vies amb activitat supressora de tumors, que són silenciats epigeneticament., [eng] Colorectal cancer is a disease caused by genetic and epigenetic changes. Inactivation of tumor suppressor genes and activation of oncogenes are key landmarks in tumor progression. However, the list of tumor suppressor genes and oncogenes is far from complete, even in the case of the tumor types that are best characterized, such as colorectal cancer. Colorectal cancer is the second most frequent cause of cancer-related death in the Western world and is a serious health issue for the European Union. Patients having stage III or IV cancer undergo surgery followed by chemotherapy. However, the clinical management of these patients is far from optimal, and only about 30 % of the patients show an objective response to even the best chemotherapeutic agents available. In this study genome-wide high throughput assays were used to better characterize important aspects of the oncogenic progression such as deregulation of proliferation and aberrant expression caused by epigenetic mechanisms. Because rapid tumor proliferation is associated with poor patient prognosis, here we characterized the transcriptional signature of rapidly proliferating colorectal cancer cells in an attempt to identify genes important to sustain tumor growth and that could be used as novel therapeutic targets. The proliferation rate of 52 colorectal cancer cell lines was determined and genome-wide expression profiling of a subset of these lines was assessed by microarray analysis. The expression of 1,290 genes was significantly correlated with the growth rates of colorectal cancer cells. These included genes involved in cell cycle, RNA processing/splicing and protein transport. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and protoporphyrinogen oxidase (PPDX) were shown to have higher expression in faster growing cancer cells. Importantly, pharmacological and genetic inhibition of GAPDH or PPDX reduced the growth of colon cancer cells in vitro and in vivo. To better understand the mechanisms underlying the profound transcriptional reprogramming observed in cancer cells, we investigated the association between the levels of DNA methylation in the promoters of >14,000 genes and the levels of expression of these genes in a panel of 45 colorectal cancer cell lines. A group of cell lines with significantly higher methylation levels was observed, supporting the notion that there is a group of colorectal tumors with a CpG methylator phenotype (CIMP+). A significant negative regulation between methylation and expression levels was observed for 1,409 genes, suggesting that these genes are silenced during the tumorigenic process through this epigenetic mechanism. A significant number of these genes were zinc finger proteins, suggesting an important role of these DNA-binding proteins on the tumorigenic process. Strikingly, approximately one fourth of these genes are not associated with CpG islands, indicating that DNA methylation outside these CpG rich regions is an important mechanism regulating gene expression and significantly contribute to tumor progression. In addition, we postulate that at least some of those genes have tumor suppressor activity. As a proof-of-concept, we show that restoration of the expression of ZNF238, a gene showing a significant methylation/expression correlation, resulted in reduced growth of colon cancer cells in vitro and in vivo. In conclusion, in this study we shed new light on the mechanisms underlying the uncontrolled proliferation of colon cancer cells and the expression reprograming imposed in these cells through CpG methylation. The results of this study may contribute to the identification of novel chemotherapeutic targets for patients with colorectal cancer, and the characterization of novel genes/pathways with tumor suppressor activity, that are epigenetically silenced.

Los receptores EPH (receptores de efrina) constituyen la subfamilia más grande de los receptores tirosina quinasas en mamífero. Se unen a las efrinas, ancladas a las membranas celulares mediante un enlace glicosilfosfatidilinositol (GPI) (efrinas de tipo A) o mediante una dominio transmembrana seguido por un dominio citoplasmático (efrinas de tipo B). El complejo receptor-ligando activa una cascada de señalización tanto en las células que expresan los receptores EPH como en las células adyacentes, que expresan las efrinas. Este mecanismo se denomina “forward” y “reverse signalling”, respectivamente. La interacción entre receptor y su ligando puede desencadenar una amplia gama de respuestas celulares incluyendo la adhesión, repulsión y la segregación/posicionamiento celular durante la separación de los tejidos en las primeras fases de desarrollo embrionario. Los mecanismos que regulan estas distintas respuestas dependen en gran medida del tipo celular y del tejido. Aunque, los receptores EPH han sido ampliamente caracterizados para sus funciones durante el desarrollo embrionario, se encuentran re-expresados en una variedad de tumores malignos humanos. No obstante, dependiendo del tipo de tumor, de su estadio y de la actividad quinasa, los receptores EPH pueden actuar induciendo o inhibiendo la progresión del cáncer. Los receptores EPH de tipo B están involucrados en la homeostasis del epitelio intestinal y la pérdida de función de estos receptores es un evento clave en la progresión del cáncer de colon, sobretodo de adenoma a carcinoma. El receptor EPHA3, identificado y aislado por primera vez ellas membranas de células pre-B de leucemia linfoblástica aguda, se encuentra ampliamente expresado durante el desarrollo embrionario, particularmente en el tejido nervioso y corazón. Tal como se espera de su primera identificación, se ha demostrado que también está involucrado en muchos tipos de cáncer. Los efectos inactivantes de distintas mutaciones somáticas encontradas en varios tipos de cáncer, sugieren fuertemente que la proteína EPHA3 suprime las propiedades de las células cancerígenas a través un mecanismo que dependería de su unión con la efrina y de su actividad quinasa. Dos estudios independientes de secuenciación de ADN empleando técnicas de nueva generación, descubrieron una alta frecuencia de mutaciones en EPHA3 en una amplia cohorte de tumores de colon humano y, más importante, la mayoría de estas mutaciones se descubrieron afectar la actividad quinasa o el dominio de unión con el ligando. Sin embargo, la función de EPHA3 en la tumorigenesis intestinal no ha sido investigada a fondo. Por lo tanto, en este estudio se utilizaron dos líneas celulares de cáncer de colon humano, LS174 y DLD1, para sobre-expresar de forma inducible por doxiciclina el receptor EPHA3. Hemos observado que la reintroducción de EPHA3 en líneas de cáncer de colon no afecta el crecimiento de las células cultivadas en sustratos sólidos, en medio semi-solido (soft-agar) o como xenotrasplantes en ratones inmunodeprimidos. Además, se utilizó un modelo transgénico de ratón en el que el gen EphA3 ha sido suprimido y descubrimos que la inactivación específica de uno o los dos alelos de este gen no inicia el proceso tumorígenico en el intestino de los ratones. Tampoco observamos cambios en el tamaño o en el número de tumores intestinales en ratones donde la tumorigenesis intestinal se inició genéticamente (modelo de ratón Apcmin/+) o farmacológicamente (tratamiento con azoximetano). También hemos observado que la sobreexpresión de EPHA3 en células de cáncer de colon no afecta su capacidad de migración o de invasión en ensayos in vitro. Para profundizar el papel de EPHA3 en el proceso metastático, se usó un modelo murino de metástasis de pulmón observando que la reintroducción de EPHA3 en células de cáncer de colon inyectadas en las colas de ratones inmunodeprimidos no altera su capacidad migratoria y de generar metástasis en otros órganos in vivo. Estos resultados confirman los datos de inmunhistoquimica donde observamos ausencia de diferencias en los niveles de tinción de EPHA3 en los nódulos linfáticos respeto a los tumores primarios de pacientes con cáncer colorrectal localmente avanzado (estadio Dukes C). Por último, el análisis inmuhistoquimico de los niveles de tinción de EPHA3 en pacientes con cáncer colorrectal (estadio Dukes C) no reveló ninguna correlación con la supervivencia y otras características clinicopatologicas de estos pacientes. En conclusión, en este estudio, reportamos que el mecanismo de señalización quinasa dependiente del receptor EPHA3, aunque está frecuentemente inactivado en cáncer colorrectal, no juega un papel como supresor de la tumorigenesis intestinal durante ningún estadio de la progresión del tumor, tanto in vitro como in vivo. Estos resultados, esclarecen el papel de EPHA3 en cáncer colorrectal y evidencian la importancia de estudios funcionales para confirmar el papel de los genes identificados como posibles candidatos de la progresión tumoral empleando técnicas avanzadas de secuenciación genómica de tumores., EPHs, which make up the largest family of mammalian receptor tyrosine kinases, bind cell surface–associated Ephrins that have either a glycosylphosphatidylinositol (GPI) membrane anchor (A-type Ephrins) or a transmembrane region followed by a conserved cytoplasmatic tail (B-type Ephrins). Clustering of EPH receptors and their ligand at the surface of adjacent cells activates downstream signaling in both the EPH- and Ephrin-expressing cells, termed forward and reverse signaling, respectively. Eph–ephrin interactions can trigger a wide array of cellular responses including cell adhesion, repulsion and cell sorting/positioning during tissue boundary and the mechanisms leading to these different responses are highly dependent on the cell type and tissue context. Although most extensively characterized for their roles in development, Eph receptors are re-expressed in a variety of human malignancies. However, depending on the tumor type, disease stage and kinase function, EPH overexpression can promote or inhibit tumor progression. The role of EPHB receptors was discovered to be involved in the homeostasis of the normal intestinal epithelium and loss of function of B-type EPHs is a key event of colorectal cancer progression, mainly from adenoma to carcinoma. The EPHA3 receptor, originally recognized and isolated from membranes of pre-B acute lymphoblastic leukemia cells, is widely expressed during embryonic development, with the highest levels occurring in the nervous system and heart. As expected from its first identification, it was then implicated as having a key role in many cancers. The inactivating effects of many somatic mutations found in different cancers, strongly suggest that wild-type EPHA3 receptor suppresses the malignant properties of cancer cells in an ephrin-and kinase-dependent manner. Two independent studies of next-generation DNA sequencing using large cohorts of human colorectal cancer samples showed unexpected high mutation frequency in EPHA3 and, importantly many of these mutations were found to impair the kinase activity or ligand binding domain. However, the function of EPHA3 in intestinal tumorigenesis has not been thoroughly investigated. Thus, in this study we generated a doxycycline-dependent EPHA3 overexpression system in two different human colon cancer cell lines, LS174 and DLD1. Importantly, we found that the reintroduction of EPHA3 in colon cancer cells did not affect their growth on a solid substrate, soft agar or as xenografts in immunodeficient mice. Moreover, using a full knockout mouse model we show that targeted inactivation of one or both alleles of EphA3 did not initiate the tumorigenic process in the murine intestine, and had no effects on tumor size/multiplicity after tumor initiation either genetically or pharmacologically. Restoring EPHA3 levels in colon cancer cells did not modulate their motility/invasion in vitro. In addition, to more closely investigate the role of EPHA3 in the metastatic process, we used a mouse model of lung metastasis and found that the ectopic overexpression of EPHA3 in human colon cancer cells, injected in to the tail vein of immunodeficient mice, does not affect their capability in vivo to migrate and colonize distant organs. These results are consistent with our immunohistochemistry data showing no EPHA3 expression differences in primary Dukes C tumors and matched lymph node metastases. Finally, immunohistochemical analysis of EPHA3 tumor levels did not reveal associations with survival or clinicopathological features of Duke C colorectal cancer patients. In conclusion, here we report that the kinase dependent signaling of EPHA3, despite frequently inactivated in colorectal cancer, does not play a tumor suppressive function in intestinal tumorigenesis and, importantly, in any stage of the cancer progression using either in vivo or in vivo experimental models. These results significantly contribute to our understanding of the role of EPH signaling during colorectal carcinogenesis, and highlighting the need for detailed functional studies to confirm the relevance of putative cancer driver genes identified in sequencing efforts of the cancer genome.

Tesi realitzada al Laboratori de Tumors del Desenvolupament, Hospital-Fundació Sant Joan de Déu, [spa] El neuroblastoma (NB) agrupa un espectro muy heterogéneo de tumores que evolucionan de forma radicalmente distinta. La variedad de comportamiento clínico del NB determina el enfoque terapéutico, que puede variar entre un abordaje terapéutico intensivo multimodal o una actitud expectante. Por lo tanto, la clasificación precisa de los diferentes subtipos de NB es importante para determinar el tratamiento más apropiado. Actualmente los sistemas de clasificación de riesgo clínico en NB se basan en distintos parámetros clínicos, biológicos y morfológicos. No obstante, todavía existen casos donde estos sistemas de clasificación muestran una utilidad clínica limitada. Existen perfiles de expresión génica que definen el comportamiento biológico de cada subgrupo de NB y que permiten predecir el pronóstico de los pacientes. Sin embargo, las listas de genes son demasiado extensas para poder implementarlas en la rutina clínica. En esta tesis, hemos desarrollado un modelo estadístico de predicción de pronóstico basado en la combinación lineal de los niveles de expresión de tres genes, CHD5, NME1 y PAFAH1B1, diferencialmente expresados en subgrupos de NB con comportamiento clínico distinto y asociados de forma estadísticamente significativa con la evolución clínica del paciente. Su potencial predictivo ha sido validado utilizando datos de expresión obtenidos experimentalmente mediante qRT-PCR y de dos bases de datos públicas de microarrays de expresión. En todas las cohortes analizadas el modelo muestra una excelente capacidad para clasificar a los pacientes con una evolución clínica distinta. Los distintos análisis multivariantes ha identificado el modelo como un marcador de predicción de pronóstico independiente a los marcadores actualmente aceptados para NB. En conclusión, se ha desarrollado un modelo estadístico de predicción de pronóstico basado en una técnica convencional (qRT-PCR), que podría ayudar a refinar los actuales sistemas de estratificación de riesgo clínico en NB. Uno de los genes incluidos en este modelo, CHD5, es un potencial gen supresor de tumores localizado en la región cromosómica 1p36.31, recurrentemente perdida en NB. Estudios previos han identificado que CHD5 se expresa en tejidos neurales normales y en NB de bajo riesgo clínico. Nosotros hemos descrito por primera vez el perfil inmunofenotípico de CHD5. En tejidos neurales normales se identificó expresión nuclear en células de estirpe neuronal mientras que las células gliales mostraron ausencia de tinción. La caracterización en los tumores neuroblásticos (TN) ha identificado la expresión proteica circunscrita al núcleo de las células neuroblásticas en diferenciación y de las células ganglionares, y ausente en los neuroblastos indiferenciados y las células de tipo Schawnn. En los TN, la tinción nuclear muestra una correlación estadísticamente significativa con una evolución clínica más favorable de los pacientes. Sugiriendo que la tinción inmunohistoquímica de CHD5 podría representar un marcador útil para refinar los actuales sistemas de determinación del pronóstico en NB. El análisis de la expresión de este gen en muestras apareadas de NB obtenidas al diagnóstico y post-tratamiento, también sugiere podría representar un marcador inmunohistoquímico clínicamente útil para una identificación rápida de pacientes que no se benefician del tratamiento convencional ya que actualmente en NB no existe ningún biomarcador de respuesta a tratamiento. Las modificaciones epigenéticas representan uno de los principales mecanismos de modulación de la expresión génica. Alteraciones en estos mecanismos, como la alteración del patrón de metilación del ADN, podrían estar implicadas en las variaciones de expresión génica identificadas entre subgrupos de NB. En NB se han identificado numerosos genes que sufren hipermetilación así como la asociación entre subgrupos clínicos de riesgo y genes hipermetilados. Sin embargo el patrón global de metilación del NB es aún considerablemente desconocido. Mediante microarrays hemos realizado un análisis global del estado de metilación del genoma del NB que nos ha permitido identificar patrones de metilación específicos del NB, así como patrones distintivos entre subgrupos clínicos y biológicos de NB. Nuestras observaciones muestran como el ADN del NB se ve afectado por una elevada disminución de los niveles de metilación. Dicha hipometilación es gen-específica y afecta a funciones biológicas relacionadas con cáncer así como a genes relevantes para la patogénesis del NB como CCND1. Cabe destacar que la metilación diferencial de CCND1 afecta principalmente a una región evolutivamente conservada y funcionalmente relevante localizada en 3’UTR, sugiriendo que la hipometilación fuera de las regiones promotoras puede tener un papel en el desarrollo del NB. La hipermetilación afecta genes involucrados en el desarrollo celular y en la proliferación, como RASSF1A, POU2F2 o HOXD3 entre otros. Los resultados obtenidos proporcionan nuevos candidatos a biomarcadores epigenéticos asociados al NB, así como nuevos conocimientos sobre las bases moleculares de estos tumores., [eng] Neuroblastoma (NB) is heterogeneous in terms of their biological, genetic and morphological characteristics and exhibit radically different outcomes. Since treatment strategies vary from a “watch and wait” approach to multimodal intensive regimens, precise risk assessment is critical for therapeutic decisions. Various combinations of prognostic markers have been used successfully for risk group distinction, yet there remain cases where these markers have demonstrated limited clinical utility. Microarray gene studies have contributed to identify set of genes with prognostic importance in NB. However, it use in clinical practice is limited by the large sets of genes identified. We developed a PCR-based predictor model using the expression patterns of three genes (CHD5, NME1 and PAFAH1B1) associated with NB patient’s outcome. The validation process showed that our model could stratify patients into groups with markedly divergent clinical outcome. Multivariate analysis corroborated that the proposed model was an independent predictor marker for survival on NB patients. In conclusion, we propose a robust and technically simple PCR-based one score predictor model, which could help refine current stratification systems of clinical risk stratification of NB. CHD5, one of the genes included on the predictor model, is a tumor suppressor gene located on chromosome 1p36.31, a region recurrently lost in high risk NB. Previous data showed a restricted gene expression to neuronal-derived tissues and in NB with low risk features. We have described for the first time the immunophenotypic profile of CHD5 in normal human neural tissues as well as primary neuroblastic tumors (NT). In TN, CHD5 immunoreactivity was found restricted to differentiating neuroblasts and absent in undifferentiated neuroblasts and stromal Schwann cells. A strong correlation of CHD5 expression with favorable clinical evolution was found. Our results suggest that CHD5 could represent an outcome marker in NB that can be tested by conventional immunohistochemistry. Disruption of DNA methylation is a hallmark of human cancer. Several genes have been described as hypermethylated in NB and have been related to NB clinical risk groups and patient outcome. However, genome-wide DNA methylation patterns have not been extensively studied. Differential microarray-based DNA methylation analyses, allowed us to identify patterns characteristic for NB so as NB clinical and biological subtypes. We observed that gene-specific loss of DNA methylation is more prevalent than gene promoter hypermethylation. Remarkably, such hypomethylation affected cancer-related biological functions and genes relevant to NB pathogenesis as CCND1. In particular, CCND1 differential methylation affects mostly an evolutionary conserved functionally relevant 3’-UTR region, suggesting that hypomethylation outside promoter regions may play a role in NB pathogenesis. Hypermethylation targeted genes involved in cell development and proliferation such as RASSF1A, POU2F2 or HOXD3, among others. Our results provide new epigenetic biomarkers candidate associated with NB as well as insights into the molecular pathogenesis of this tumor.