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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The Norcoclaurine Synthase enzyme is known to be the Pictet-Spenglerase responsible for catalyzing the condensation of dopamine and 4-hydroxyphenylacetaldehyde, leading to the formation of s-norcoclaurine, the first metabolite in the biosynthesis of benzylisoquinoline alkaloids. Recently, the Norcoclaurine Synthase has shown great promiscuity towards many aldehyde and ketone substrates, raising great interest in further understandings. In this work, we computationally investigate the structural aspects of this enzyme regarded to the substrate (S)-citronellal, a long-chain aliphatic aldehyde that contrasts with the natural aldehyde, 4-hydroxyphenylacetaldehyde. Furthermore, we also investigated the mechanism of a condensation reaction between dopamine and (S)citronellal catalyzed by the Norcoclaurina Synthase. For that, we employed molecular docking methodologies, classical molecular dynamics simulation, and density functional theory. We demonstrate through molecular docking and molecular dynamics simulations that the preferential enzyme-substrate binding mode presents the dopamine more deeply anchored in the active site, interacting with the amino acid LYS122 in a conformation considered active, meaning it will favor the occurrence of the reaction. Also, the (S)citronellal occupies the cavity entrance, having part of its chain solvent-exposed, which may be indicative of the promiscuity of the enzyme concerning the carbonylated compounds. From a mechanistic aspect, through density functional theory and cluster methodology, we showed that the reaction path has three fewer intermediates than the previously published one. Furthermore, we also found that the conformational constraints experienced by the substrates considerably alter the activation energy barrier for the cyclization step. A enzima Norcoclaurina Sintase é conhecida por ser a Pictet-Spenglerase responsável por catalisar a condensação da dopamina e do 4-hidroxifenilacetaldeído, levando à formação da s-norcoclaurina, o primeiro metabólito na biossíntese dos alcalóides benzilisoquinolínicos. Recentemente, estudos mostraram que a Norcoclaurina Sintase possui alta promiscuidade frente a muitos aldeídos e cetonas, despertando grande interesse para seu uso. Neste trabalho, investigamos computacionalmente os aspectos estruturais dessa enzima em relação ao substrato (S)citronelal, um aldeído alifático de cadeia longa que contrasta com o aldeído natural, o 4-hidroxifenilacetaldeído. Além disso, investigamos também o mecanismo de reação de condensação entre a dopamina e o (S)citronelal catalisado pela Norcoclaurina Sintase. Para tanto, empregamos metodologias de ancoramento molecular, simulação de dinâmica molecular clássica e teoria do funcional da densidade. Demonstramos através do ancoramento molecular e de simulações de dinâmica molecular que o modo de ligação preferencial enzima-substrato apresenta a dopamina mais profundamente ancorada no sítio ativo, interagindo com o amino ácido LYS122 em uma conformação considerada ativa, o que significa que irá favorecer a ocorrência da reação, enquanto que o (S)citronelal ocupa a entrada da cavidade, tendo uma parte de sua cadeia exposta ao solvente, o que pode ser um indicativo da promiscuidade da enzima em relação aos compostos carbonilados. Do ponto de vista mecanístico, utilizando a teoria do funcional da densidade e a metodologia de cluster, mostramos que o caminho da reação possui três intermediários a menos em relação ao previamente publicado. Além disso, também descobrimos que as restrições conformacionais experimentadas pelos substratos alteram consideravelmente a barreira de energia de ativação para a etapa de ciclização.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Bactérias do gênero Pseudomonas apresentam um arsenal formidável de enzimas que permitem que hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) sejam utilizados como única fonte de carbono. Dentre essas enzimas, a 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenase de Pseudomonas sp. C18 (DoxG), uma extradiol dioxigenase Fe+2-dependente, catalisa a conversão do 1,2-dihidroxinaftaleno em 2-hidroxi-2H-cromeno-2-carboxilato via uma dioxigenação. Uma reação que não encontra correspondência em síntese clássica. Essa enzima destaca-se por possuir um sítio ativo volumoso que a dota de promiscuidade, sendo capaz de clivar, além de uma série de catecóis, bifenis policlorados (BPCs). Essa formidável capacidade contrasta com a fácil oxidação do cofator Fe+2 pelo oxigênio presente no ar, processo observado durante a lise e purificação da enzima que leva a sua inativação. Nosso objetivo foi determinar quais fatores influenciam a reativação da enzima, bem como as estratégias para aprimorar sua estabilidade e atividade catalítica. A DoxG foi expressa e purificada em condições aeróbicas. A caracterização foi feita pela determinação de sua massa monomérica via eletroforese e experimentos de espalhamento dinâmico de luz consistentes com um estado octamérico com massa de aproximadamente 270 kDa em solução aquosa. A velocidade de reconstituição da holoenzima mostrou ser um processo sensível a vários fatores: (1) a incubação com o íon Fe2+ mostrou-se a forma mais eficiente de reativação; (2) a velocidade de reativação depende da concentração do íon Fe2+; (3) o pH de 5,75 propiciou a forma mais rápida de reativação, sendo que em meios mais alcalinos a disponibilidade do cofator foi limitada e em meios mais ácidos o processo foi afetado negativamente pela protonação de resíduos do sítio ativo que se complexam ao cofator; (4) embora a força iônica com NaCl ou KCl não afetou a reativação, sais ou tampões com ânions capazes de se ligar ao Fe+2 (ex. sulfato) afetaram a disponibilidade do mesmo; (5) a reativação de 90% da enzima requereu duas horas e meia de incubação com o íon Fe2+. Além desses pontos, observou-se que o íon Mn+2 não pôde substituir o íon Fe+2 como cofator, no entanto, conferiu maior estabilidade a DoxG. Estudos de inativação térmica demonstraram que na presença de Mn+2, a enzima não perdeu sua atividade consideravelmente após ser incubada por quarenta minutos a 60 °C. Os estudos de atividade enzimática mostraram que a DoxG foi capaz de catalisar a clivagem do catecol, 3-metilcatecol e 2,3-dihidroxibifenil, sendo que a eficiência catalítica (kcat/Km) para a clivagem do 2,3-dihidroxibifenil foi 1000 vezes maior do que para o catecol e 10 vezes maior do que para o 3-metilcatecol. Bacteria of the genus Pseudomonas have a formidable arsenal of enzymes allowing them to use polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) as the sole carbon source. Among these enzymes, the 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. C18 (DoxG), a Fe+2-dependent dioxygenase extradiol, catalyzes the conversion of 1,2-dihydroxynaphthalene to 2-hydroxy-2H-chromene-2-carboxylate via a dioxygenation. A reaction with no match in classical synthesis. This enzyme exhibits a large active site endorsing its promiscuity, which is able to cleave, in addition to a series of catechols, the polychlorinated biphenyls (BPCs). This formidable capacity contrasts with the facile oxidation of the Fe+2 cofactor by the oxygen present in the air, a process that occurs throughout the lysis and purification of the enzyme and leads to its inactivation. Our goal is to determine the factors to efficient enzyme reactivation, as well as strategies to improve its stability and catalytic activity. Therefore, DoxG was expressed and purified under aerobic conditions. Characterization was done by its monomeric mass determined by electrophoresis and by its oligomeric state estimated using dynamic light scattering, which was consistent with an octamer in aqueous solution showing a molecular mass of about 270 kDa. The rate of holoenzyme reconstitution was sensitive to several factors: (1) incubation with Fe2+ was the most efficient form of reactivation; (2) the reactivation rate depends on concentration of the Fe2+; (3) the pH of 5.75 provided the fastest reactivation. In more alkaline media the availability of the cofactor was limited and in more acidic media the process was negatively affected by protonation of active-site residues involved in the complexation of the cofactor; (4) although the ionic strength using NaCl or KCl did not affect the reactivation, salts or buffers with anions capable of binding Fe+2 (e.g. sulfate) affected its availability; (5) reactivation of 90% of the enzyme required two and a half hours of incubation with Fe2+. In addition, it was observed that Mn+2 could not replace the Fe+2 as cofactor, however, it provided greater stability to DoxG. Thermal inactivation studies showed that in the presence of Mn+2, the enzyme did not lose its activity considerably after being incubated for forty minutes at 60 °C. The enzyme activity studies showed that DoxG was able to catalyze the cleavage of catechol, 3-methylcatechol, and 2,3-dihydroxybiphenyl. The catalytic efficiency (kcat/Km) for cleavage of 2,3-dihydroxybiphenyl was 1000-fold and 10-fold greater than catechol and 3-methylcatechol, respectively.

As leucemias são neoplasias malignas caracterizadas pela proliferação de células imaturas do sistema hematopoiético. A Leucemia Mieloide Aguda (LMA) é uma neoplasia maligna caracterizada pelo acúmulo de mieloblastos na medula óssea e sangue periférico, sendo uma das leucemias mais prevalentes no adulto. A heterogeneidade genômica da doença dificulta o estabelecimento de protocolos de tratamento. Já a Leucemia Mieloide Crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa rara caracterizada pelo acúmulo de células mieloides e presença do cromossomo Philadelfia (Ph). Os inibidores de tirosina quinase são os principais agentes quimioterápicos disponíveis, porém existem pacientes que não respondem adequadamente ao tratamento. Portanto, a busca por novos compostos com atividade antitumoral é justificada. Neste trabalho foi realizado estudo in silico para a busca dos alvos proteicos de nove compostos com atividade antitumoral conhecida frente às linhagens THP-1 e K562. Três desses compostos são triterpenos (1 ao 3) e seis são análogos alcaloides de 3-alquilpiridina (4, 5, 6, 7, 8 e 9). Foi utilizada a metodologia de target fishing para a busca dos alvos, baseado no princípio da similaridade em que moléculas semelhantes podem se ligar aos mesmos alvos. O banco de dados ChEMBL foi utilizado na busca de moléculas com atividade citotóxica frente às linhagens THP-1 e K562, para em seguida serem comparadas aos compostos de interesse por meio do cálculo do coeficiente de Tanimoto (Tc), que avalia a similaridade entre moléculas. O Tc foi calculado usando os fingerprints MACCS e PubChem. Os compostos com valores de Tc maiores ou igual a 0,75 foram considerados para a pesquisa bibliográfica de alvos já descritos na literatura. Outra estratégia foi o uso de servidores para a predição de alvo molecular. As proteínas 6-fosfofruto-2-quinase/frutose-2,6-bifosfatase 3 (PFKFB3) e nicotinamida fosforibosiltransferase (NAMT) foram indicadas como possíveis alvos para o composto 7 e a fosfatase 2 indutora da fase M (CDC25B) para os compostos 1 e 3. As estruturas cristalográficas desses potenciais alvos foram obtidas por meio do Protein Data Bank (PDB). Os compostos 7, 1 e 3 foram submetidos a simulações de acoplamento molecular com o programa GOLD. O estudo in silico foi bem-sucedido na busca de alvos moleculares para o composto 7, visto que interações importantes descritas na literatura com o sítio de ligação das proteínas PFKFB3 e NAMPT foram observadas. Por outro lado, os compostos 1 e 3 não se ligaram no sítio de ligação da proteína CDC25B de forma favorável. Leukemias are malignant neoplasms characterized by the proliferation of immature cells of the hematopoietic system. Acute Myeloid Leukemia (AML) is a malignant neoplasm characterized by the accumulation of myeloblasts in the bone marrow and peripheral blood, being one of the most prevalent leukemias in adults. The genomic heterogeneity of the disease makes it difficult to establish treatment protocols. On the other hand, Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a rare myeloproliferative disease characterized by the accumulation of myeloid cells and the presence of the Philadelfia (Ph) chromosome. Tyrosine kinase inhibitors are the main chemotherapeutic agents available, but there are patients who do not respond adequately to treatment. Therefore, the search for new compounds with antitumor activity is justified. In this work, an in silico study was carried out to search for protein targets for nine compounds with known antitumor activity against the THP-1 and K562 strains. Three compounds are triterpenes (1 to 3) and six are alkaloid analogs of 3-alkylpyridine (4, 5, 6, 7, 8 and 9). The target fishing methodology was used to search for targets, based on the principle of similarity in which similar molecules can bind to the same targets. The ChEMBL database was used to search for molecules with cytotoxic activity against the THP-1 and K562 strains, to then be compared to the compounds of interest by calculating the Tanimoto coefficient (Tc), which assesses the similarity between molecules. The Tc was calculated using the MACCS and PubChem fingerprints. Compounds with Tc values greater than or equal to 0.75 were considered for the bibliographic search of targets already described in the literature. Another strategy was the use of servers for the prediction of molecular targets. The proteins 6- phosphofruct-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 3 (PFKFB3) and nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) were indicated as possible targets for compound 7 and phase M inducing phosphatase 2 (CDC25B) for the compounds 1 and 3. The crystallographic structures of these potential targets were obtained using the Protein Data Bank (PDB). Compounds 7, 1 and 3 were submitted to docking simulations with the GOLD program. The in silico study was successful in the search for molecular targets for compound 7, since important interactions described in the literature with the binding site of the PFKFB3 and NAMPT proteins were observed. On the other hand, compounds 1 and 3 did not bind at the CDC25B protein binding site favorably.

A presente Tese de Doutorado envolveu o estudo teórico da dinâmica e reatividade de metaloenzimas envolvidas na degradação de compostos organofosfatos. Em particular, a degradação do triester de fosfato paraoxon pela enzima fosfotriesterase. Inicialmente a hidrólise não enzimática do paraoxon em solução aquosa foi estudada onde se obteve, diferente hidrólise alcalina, que a hidrólise neutra ocorre em duas etapas, através de um mecanismo AN + DN, com a formação de um intermediário pentacoordenado de fósforo. A reação apresenta energias livres de ativação de 31,8 e 1,9 kcalmol-1 para a primeira e segunda etapas, respectivamente, prossegue através de uma sequência de processos de transferência de prótons a partir da molécula de água nucleofílica e terminando com a protonação do grupo de saída nitrofenolato. A inclusão explícita das moléculas de água de solvatação mostrou-se essencial para descrever os processos de transferência de prótons ao longo da coordenada de reação e também para estabilizar o intermediário pentacoordenado. A hidrólise do paraoxon também foi estudada utilizando um modelo do sítio ativo da enzima fosfotriesterase de Pseudomonas diminuta contendo íons Cd2+. A partir deste estudo foi proposto um mecanismo básico consistindo em: i) Troca da molécula de água coordenada e coordenação do substrato ao átomo de Cdß mais exposto ao solvente de forma monodentada, ii) protonação do ligante em ponte µ-hidroxo pela molécula de água e formação in situ do nucleófilo, iii) formação de um intermediário pentacoordenato com quebra de ligação química do grupo de saída e formação de ligação química para com o nucleófilo, iv) protonação do resíduo de aminoácido Asp301 e restauração do sítio ativo através da coordenação de outra molécula de água do meio solvente. Foi mostrado que as moléculas de água inicialmente coordenadas no sítio ativo desempenham um papel crucial na estabilização dos estados de transição e do intermediário pentacoordenado. A reação ocorre através de um mecanismo de duas etapas (AN + DN), com barreiras de energia de 12,9 e 1,9 kcalmol-1 para a primeira e segunda etapas, respectivamente, em excelente concordância com os dados experimentais. Para os sistemas enzimáticos estudados, a inclusão da energia de dispersão contribui para diminuir as barreiras de energia em até 26%. O mecanismo básico para a anzima Cd2+/Cd2+ de PTE proposto mostrou ser uma proposta consistente mecanisticamente e viável cineticamente. Os efeitos dos diferentes cofatores metálicos presentes no sítio ativo da enzima fosfotriesterase de Pseudomonas diminuta foram avaliados através de simulações de dinâmica molecular clássica. O modelo de íon livre e modelo de íon ligado com parametrização de potencial foram utilizados para a descrição dos metais de transição e parametrização do campo de força. As simulações da apoenzima de fosfotriesterase, em relação aos sistemas de Zn(II)-Zn(II) e Zn(II)- Cd(II), mostrou que a simples mudança de um dos metais no sítio ativo, através das análises de RMSF e PCA já são suficientes para provocar e mostrar modificações de dinâmica nas protéinas. Realizou-se simulações envolvendo o inibidor dietil metilbenzil fosfato e o substrato dietil p-nitrofenol fosfato nos sistemas parametrizados de Zn(II)-Zn(II) e Cd(II)-Cd(II). Através dos resultados foi mostrado que o inibidor dietil metilbenzil fosfato desloca-se do sítio ativo e fica durante a maior parte da simulação de dinâmica molecular clássica interagindo com resíduos de aminoácidos da superfície da enzima e com o meio solvente em ambos os sistemas. Entretanto, para o sustrato dietil p-nitrofenol fosfato percebemos uma modificação estrutural e reorientação do substrato ao mudar sua posição no sítio ativo. Os resultados obtidos nas simulações de PTE indicam que os dados correlacionados na literatura trazem informações que podem não ser adequadas em virtude: i) das formas de equilibração de energia do sistema enzimático de PTE; ii) e do espaço de tempo curto das simulações realizadas. Os estudos de dinâmica molecular mostraram que mudanças nos cofatores metálicos levam a mudanças expressivas na dinâmica das metaloenzimas e, portanto, afetam na reatividade enzimática. The present PhD thesis involved the theoretical study of the dynamics and reactivity of metalloenzymes involved in the degradation of organophosphate compounds. In particular, the degradation of the phosphate triester paraoxon by the phosphotriesterase enzyme. Initially the nonenzymatic hydrolysis of paraoxon in aqueous solution was studied where it was obtained that, different alkaline hydrolysis, neutral hydrolysis occurs in two stages, through an AN + DN mechanism, with the formation of a pentacoordenado phosphorus intermediate. The reaction exhibits activation free energies of 31.8 and 1.9 kcalmol-1 for the first and second stages, respectively, proceeding through a sequence of proton transfer processes from the nucleophilic water molecule and ending with protonation of the nitrophenolate leaving group. The explicitinclusion of solvation water molecules was essential to describe the proton transfer processes along the reaction coordinate and also to stabilize the pentacoordenated intermediate. The hydrolysis ofparaoxon was also studied using an active site model of the enzyme phosphotriesterase of Pseudomonas diminuta containing Cd2+ ions. From this study a basic mechanism was proposed consisting of: i) Co-ordinate water molecule change and coordination of the substrate to the Cd atom most exposed to the solvent in a monodentate way, ii) protonation of the -hydroxyl bridge ligand by the water molecule and in situ formation of the nucleophile, iii) formation of a pentacoordenate intermediate with significant breaking of chemical bonding of the leaving group and formation of chemical attachment to the nucleophile, iv) protonation of the amino acid residue Asp301 and restoration of the active site by coordination of another water molecule of the solventmedium. It has been shown that the water molecules initially coordinated at the active site play a crucial role in the stabilization of the transition states and the pentacoordinate intermediate. The reaction takes place through a two-step mechanism (AN + DN), with energy barriers of 12.9 and 1.9 kcal mol-1 for the first and second steps, respectively, in excellent agreement with the experimental data. For the enzymatic systems studied, the inclusion of dispersion energy contributes to decreaseenergy barriers by up to 26%. The basic mechanism for the proposed PTE Cd2+/Cd2+ enzyme proved to be a mechanistically consistent and kinetically feasible proposal. The effects of the different metallic cofactors present in the active site of the phosphotriesterase enzyme ofPseudomonas diminuta were evaluated through simulations of Classical Molecular Dynamics. The free ion model and ion model connected with potential parameterization were used for the description of transition metals and parameterization of the force field. The phosphotriesteraseapoenzyme simulations, in relation to the Zn(II)-Zn(II) and Zn(II)-Cd(II) systems, showed that the simple change of one of the metals in the active site, through the RMSF and PCA are already sufficient to provoke and show changes of dynamics in the proteins. Simulations involving thediethyl methylbenzyl phosphate inhibitor and the diethyl p-nitrophenol phosphate substrate were carried out in the Zn(II)-Zn(II) and Cd(II)-Cd(II) parametrized systems. From the results it has been shown that the diethyl methylbenzyl phosphate inhibitor moves from the active site and remains for most of the classical molecular dynamics simulation interacting with amino acid residues from the surface of the enzyme and with the solvent medium in both systems. However, for the substratediethyl p-nitrophenol phosphate we noticed a structural modification and reorientation of the substrate by changing its position in the active site. The results obtained in the PTE simulations indicate that the correlated data in the literature provide information that may not be adequate dueto: i) the energy equilibration of the PTE enzyme system; ii) and the short time of the simulations. Molecular dynamics studies have shown that changes in metal cofactors lead to significant changes in the dynamics of metalloenzymes and therefore affect enzymatic reactivity.

Neste trabalho são investigadas e comparadas, de forma detalhada, modificações estruturais do derivado glicosilado da PS-2, a [pOAcGlc-trz-A14]PS-2, sendo empregadas, para tal objetivo, as espectroscopias de dicroísmo circular (CD) e de ressonância magnética nuclear (RMN). Primeiramente foi realizada a síntese do glicopiranosil-triazol-peptídeo [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 empregando a estratégia Fmoc de síntese em fase sólida aliada a reação de cicloadição entre alcinos e azidas catalisada por cobre (I) (CuAAC). Em seguida, o produto foi purificado e caracterizado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e espectrometria de massas (MS). Foram realizados estudos de preferências conformacionais da [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 por CD em diferentes meios e condições, como na presença de vesículas fosfolipídicas, micelas e em misturas de diferentes proporções de TFE:H2O. Os resultados obtidos a partir dessas análises indicaram um alto grau de estruturação helicoidal para condições comumente utilizadas em estudos de RMN em solução. Sendo assim, foram adquiridos espectros de RMN desse composto em TFE-d2:H2O (60:40) e na presença de micelas de DPC-d38 (400 mmol.L-1). Respectivas correlações foram assinaladas e as informações obtidas a partir dessas análises convertidas em restrições para cálculos estruturais. Foram realizadas análises comparativas entre as estruturas tridimensionais obtidas as estruturas da PS-2 em TFE-d2:H2O (60:40) já relatadas na literatura, bem como entre as estruturas calculadas da [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 nos diferentes meios analisados. Assim, os resultados apontam para diferenças mais pronunciadas para a porção C-terminal, sendo elas constituídas principalmente por diferentes orientações da porção glicosídica nos diferentes meios analisados e interações de stacking aromáticos entre os resíduos H-18 e F-19. In this work, structural modifications of the glycosylated derivative of PS-2, [pOAcGlc-trz-A14]PS-2, are investigated and compared in detailed by using circular dichroism (CD) and nuclear magnetic resonance (NMR). Firstly, glucopyranosyl-triazole-peptide [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 was performed employing a Fmoc strategy of solid phase synthesis associated with copper (I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition reaction. The product was then purified and characterized by high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS). The conformational preferences of [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 were investigated by CD in different environment and conditions, such as in the presence of phospholipid vesicles, micelles and in mixtures with different TFE:H2O ratios. The obtained results indicated high degrees of helical structure in the membrane media commonly used for NMR experiments. Thus, NMR spectra were obtained for the compound in TFE-d2: H2O (60:40) and in the presence of DPC-d38 micelles (400 mmol.L-1). The respective correlations were assigned and the information obtained from these analyses were converted into geometric restrictions for structural calculations. Comparative analyses between the obtained three-dimensional structures and the ones of PS-2 in TFE-d2: H2O (60:40), already report in the literature, between the calculated structures of [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 in the different environment were performed. The obtained results point to more pronounced differences in the C-terminal portion, in which different orientations of the glycosidic group of the glucopyranosyl-triazole-peptide in the different environment analyzed and aromatic stacking interactions between the H-18 and F-19 residues are observed.

Os mecanismos de ação e o potencial biológico de peptídeos antimicrobianos sugerem que esses compostos podem ser utilizados como alternativas aos antibióticos comumente utilizados, para o desenvolvimento de novas terapias. A disponibilidade de tais compostos em diferentes fontes naturais estabeleceu uma alternativa para a descoberta de novas moléculas biologicamente ativas. Até o ponto em que sabemos, apenas dois peptídeo isolados do anuro Leptodactylus labyrinthicus, chamados pentadactilina e ocellatina-F1, têm demonstrado atividades antimicrobianas. Dessa forma, a fim de explorar o potencial antimicrobiano dos compostos/peptídeos dessa espécie, foram caracterizados três peptídeos, isolados a partir da secreção de pele desse anuro, assim como foram investigadas as suas atividades antimicrobianas, interações com membranas e estruturas tridimensionais de alta resolução. Três estruturas primárias foram determinadas por degradação automática de Edman e, para a obtenção dos três peptídeos em maior escala, utilizou-se a metodologia de síntese em fase sólida. Os peptídeos obtidos foram submetidos a ensaios de susceptibilidade antimicrobiana, contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e contra cepas de fungos. As propriedades hemolíticas dos peptídeos também foram investigadas em ensaios com eritrócitos de sangue de coelho. As preferências conformacionais dos peptídeos e as suas interações com membranas foram investigadas por espectroscopias de ressonância magnética nuclear (RMN) e dicroísmo circular (CD), além de ensaios de extravasamento de marcador químico incorporado em lipossomas.As composições de aminoácidos das três ocellatinas foram determinadas e as sequências exibem 100% de homologia para os primeiros 22 resíduos de aminoácidos (sequência da ocellatina-LB1). A ocellatina-LB2 apresenta um resíduo extra de Asn, enquanto a ocellatina-F1 apresenta resíduos extras de Asn-Leu-Lys na porção C-terminal. A ocellatina-F1 apresenta maior potencial antimicrobiano e um espectro de atividade mais amplo, em comparação com os outros peptídeos. As capacidades de interações com membranas e de formação de poros dos peptídeos estão diretamente correlacionadas com as suas atividades antimicrobianas, i.e., ocellatina-F1 > ocellatina-LB1 > ocellatina-LB2. As espectroscopias de CD e RMN revelam que todos os peptídeos adquirem um elevado conteúdo helicoidal na presença de meios miméticos de membrana e fortes interações de peptídeo-membrana. Os três peptídeos, apesar da elevada homologia, têm diferentes graus de estrutura próximo da extremidade C-terminal. A ocellatina-F1 mostra, em média, maiores conteúdos helicoidais e, maior definição estrutural na região C-terminal, especialmente em relação à ocellatina-LB2, certamente, devido à presença de resíduos extra Asn-23, Lys-24, e Leu-25. Os resultados obtidos indicam que os três resíduos de aminoácidos extras na porção C-terminal da ocellatina-F1, desempenham um papel importante na promoção de interações peptídeo-membrana mais fortes, nas propriedades antimicrobianas e na estruturação da região C-terminal. O resíduo adicional de Asn-23 presente na sequência de ocellatina-LB2 parece diminuir o seu potencial antimicrobiano e a força das interações peptídeo-membrana The mechanisms of action and the biological potential of antimicrobial peptides suggest that these compounds can be used as alternatives for new therapies. The availability of these compounds from several different natural sources has opened an avenue for the discovery of new biologically active molecules. Up to our knowledge, only two peptides isolated from the frog Leptodactylus labyrinthicus, namely pentadactylin and ocellatin-F1, have shown antimicrobial activities, therefore, in order to explore the antimicrobial potential of this species, we have characterized three novel peptides isolated from the anuran skin secretion, as well as investigated their antimicrobial activities, membrane interactions and high-resolution three-dimensional structures. Three peptide sequences were determined by automated Edman degradation and higher amounts of these compounds were prepared by solid-phase synthesis. The antimicrobial activity was tested using Gram-positive and Gram-negative bacteria and two fungal strains. The haemolytic properties of the peptides was also investigated in assays with rabbit blood erythrocytes. The conformational preferences of the peptides and their membrane interactions have been investigated by nuclear magnetic resonance (NMR) and circular dichroism (CD) spectroscopy and liposome dye release assays. The amino acid compositions of three ocellatins were determined and the sequences exhibit 100 % homology for the first 22 residues (Ocellatin-LB1 sequence). Ocellatin-LB2 carries an extra Asn residue and Ocellatin-F1 extra Asn-Lys-Leu residues at C-terminus. Ocellatin-F1 presents a stronger antibiotic potential and a broader spectrum of activities compared to the other peptides. The membrane interactions and pore formation capacities of the peptides correlate directly with their antimicrobial activities, i.e., Ocellatin-F1 > Ocellatin-LB1 > Ocellatin-LB2. Both CD and NMR spectroscopies reveal that all peptides acquire high helical contents in membrane environments and stronger peptide-membrane interactions. Despite the high sequence homology, the structural stabilities near the C-terminus are different for the three peptides. Ocellatin-F1 shows in average stronger helical propensities and a higher structural degree near the C-terminus, especially when compared to Ocellatin-LB2. The obtained results indicate that the three extra amino acid residues at the Ocellatin-F1 C-terminus play an important role in promoting stronger peptide-membrane interactions, antimicrobial properties and the structural stability of the peptide C-terminus. The extra Asn-23 residue present in Ocellatin-LB2 sequence seems to decrease its antimicrobial potential and the strength of the peptide-membrane interactions.

Os estudos sobre peptídeos antibacterianos tem mostrado um grande potencial dessas espécies em substituir vários antibióticos no combate às superbactérias. Os estudos mostram que esse potencial antibacteriano está intimamente ligado à conformação adotada por esses peptídeos, quando em contato com as membranas fosfolipídicas das bactérias. Esse trabalho é dividido em três diferentes capítulos. A necessidade de meios biomiméticos orientados magneticamente para estudos de RMN trouxe um novo desafio em relação à orientação de bicelas fosfolipídicas. Isso levou à busca por dados, inexistentes na literatura, da dependência temporal da orientação das bicelas em diferentes campos. O segundo capítulo mostra estudos da topologia do peptídeo homodimérico homotarsinina, originalmente isolado da secreção cutânea do anuro Phyllomedusa tarsius, quando esse se encontra ligado a meios que visam mimetizar as membranas celulares de bactérias. Esses estudos topológicos, realizados por meio da ressonância magnética nuclear, buscam a determinação da orientação relativa entre as cadeias na estrutura do dímero em ambiente de membrana. A última parte deste trabalho mostra os resultados obtidos por ressonância magnética nuclear e cálculos computacionais sobre a estruturação do peptídeo antibacteriano LyeTx I mn[delta]K Ac, que foi obtido por modificações químicas na estrutura primária do peptídeo nativo, LyeTx I, originalmente isolado do veneno do aracnídeo Lycosa erythrognatha. The study of antibacterial peptides has shown a great potential to substitute a great number of different antibiotics in the fight against super bacteria. Several studies show that the antibacterial activity is intrinsically linked to the conformation adopted by these peptides when in contact with bacteria phospholipid membranes. This work is divided in three different chapters. The necessity of magnetically oriented biomimetic media for this study brought a new challenge in relation to the orientation of bicelles. This lead to the search for new data about the time dependence orientation of bicelles exposed to magnetic fields of different magnitudes. The second chapter covers the topological study of the homodimeric peptide homotarsinin, originally isolated from the skin secretion of the tree frog Phyllomedusa tarsius, when bound to media that mimics bacterial cellular membranes. These topological studies were performed in membrane environments by nuclear magnetic resonance and they look to elucidate the relative orientation adopted by the two chains within the homodimer structure. The last part of this work shows the results obtained by nuclear magnetic resonance and computational calculations about the structure of the antibacterial peptide LyeTx I mnK Ac, which was obtained by chemical modifications of the wild type peptide LyeTx I, originally isolated from the venom of the arachnid Lycosa erythrognatha.