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The genetic engineering of human mesenchymal stromal cells (hMSCs) is a promising strategy to improve their therapeutic potential and clinical translation. Viral vectors based on human adenovirus type 5 (HAdV-5) are a versatile tool for this purpose. However, due to a lack of coxsackie and adenovirus receptor (CAR) expression, transduction of hMSCs with HAdV-5 vectors is naturally very inefficient, and strategies to overcome this limitation are essential for therapeutic application. In the present study, we identified and characterized several transduction enhancers which significantly improved the transduction of hMSCs with HAdV-5 vectors. Especially with the polyamines spermine and spermidine, expression levels of a reporter transgene were increased more than 1000 fold, and significantly elevated expression and secretion of a potential therapeutic protein (Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein (TSG-6)) was achieved. Furthermore, we found that the genetically charge-modified vector HAdV-5-HexPos3 (exchange of 13 negatively charged amino acids by four lysines in the hypervariable region 1 (HVR1) of Hexon) enabled efficient transduction of hMSCs (and several tumor cell lines) without the need for enhancing molecules. Transduction with HAdV-5-HexPos3 was even significantly higher than with the chimeric vector HAdV-5/3, which has been shown to be one of the most efficient adenovirus-based vectors for the transduction of hMSCs to date. We found that HAdV-5-HexPos3 uses a CAR-independent uptake mechanism that involves binding to heparan sulfate proteoglycans (HSPGs), while the interactions with non-cellular blood components were unaltered. In addition, we evaluated the enhanced transduction of hMSCs in two pre-clinical models of hMSC-based oncolytic virotherapy, in which hMSCs were used as carrier cells for oncolytic viruses to the tumor tissue. However, neither in two human head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) xenograft tumor models established in mice nor in a chorioallantoic-membrane (CAM) model migration of transduced hMSCs towards the tumor was detected. Nevertheless, in in vitro analyses, we showed that both, transduced or infected hMSCs, migrated towards several cell lines, including HNSCC cell lines. Moreover, we confirmed efficient replication of wildtype and life cycle modified HAdV-5 viruses in hMSCs, which was significantly accelerated by a knock-out mutation of the adenoviral E1B 19K protein. Strikingly, replication-competent vectors carrying the HexPos3 modification showed significantly improved replication, highlighting the potential of HAdV-5-HexPos3 for hMSC-based oncolytic approaches. In summary, transduction enhancers and the novel HAdV-5-HexPos3 mutant are valuable tools for the efficient genetic engineering of hMSCs either to overexpress therapeutic transgenes or in the context of oncolytic virotherapy. However, in vivo testing of hMSC-based oncolytic approaches requires further investment in suitable animal models.

Kai-Liang Zhang,1,* Rui-Ping Li,1,*Bao-Ping Zhang,1,2,* Shu-Ting Gao,1 Bo Li,1 Chun-Juan Huang,1 Rui Cao,1 Jing-Yang Cheng,1 Xiao-Dong Xie,3 Zhan-Hai Yu,1 Xin-Yu Feng21Department of Stomatology, Lanzhou University, Lanzhou 730000, People’s Republic of China; 2Department of Civil Engineering and Mechanics, Lanzhou University, Gansu 730000, People’s Republic of China; 3Department of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Gansu 730000, People’s Republic of China*These authors contributed equally to this workPurpose: The efficacy of traditional therapies for oral carcinoma (OC) is limited. Oncolytic adenovirus, a novel strategy of cancer therapy, shows potential use in OC treatment. However, its clinical application is limited by pre-existing neutralizing antibodies. Thus, this study aimed to examine the efficacy of a new modified adenovirus against OC in vitro and in vivo.Materials and methods: A multiple modified adenovirus (MMAD) armed with IL-13 (MMAD-IL-13) was constructed, and its effect on Cal-27 cells was examined. The potency of MMAD-IL-13 was examined in vitro and in vivo. For in vitro experiment, CCK-8 kit was used to determine the IC50 of MMAD-IL-3 in OC cell lines. For in vivo experiment, Cal-27 xenograft models were used to determine the antitumor effect of MMAD-IL-13. Apoptosis was measured in Cal-27 cells by Western blotting assay. Immunity response was detected in Cal-27 xenograft models 7 days after intratumoral injection with MMAD-IL-13. The potency of MMAD and MMAD-IL-13 was compared in Cal-27 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) models.Results: MMAD-IL-13 was successfully constructed; the harvested virus could be replicated and they overexpressed human IL-13 in Cal-27 cells. Compared with MMAD, MMAD-IL-13 showed enhanced antitumor effect in vitro by inducing apoptosis and reducing percentage of M2 macrophages in tumor environment in vivo. MMAD-IL-13 also showed potent antitumor effect in Cal-27, SCC-4, and Tca8113 cells in vitro and in Cal-27 xenograft models in vivo. However, MMAD-IL13 did not harm normal human oral epithelial cells in vitro and exhibited no effect on body weight in Cal-27 xenograft models. In Cal-27 PBMC models, MMAD-IL-13 showed stronger antitumor effect than MMAD.Conclusion: A new oncolytic adenovirus carrying the human IL-13 gene was constructed. This virus effectively led to remission of tumor development and death of OC cells in vivo and in vitro, showing its potential as a clinical cancer therapy.Keywords: oncolytic virus, adenovirus 5, IL-13, OC

Human multipotent mesenchymal stromal cells (hMSCs) are currently developed as cell therapeutics for different applications, including regenerative medicine, immune modulation, and cancer treatment. The biological properties of hMSCs can be further modulated by genetic engineering. Viral vectors based on human adenovirus type 5 (HAdV-5) belong to the most frequently used vector types for genetic modification of human cells in vitro and in vivo. However, due to a lack of the primary attachment receptor coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) in hMSCs, HAdV-5 vectors are currently not suitable for transduction of this cell type without capsid modification. Here we present several transduction enhancers that strongly enhance HAdV-5-mediated gene transfer into both bone marrow- and adipose tissue-derived hMSCs. Polybrene, poly-l-lysine, human lactoferrin, human blood coagulation factor X, spermine, and spermidine enabled high eGFP expression levels in hMSCs. Importantly, hMSCs treated with enhancers were not affected in their migration behavior, which is a key requisite for many therapeutic applications. Exemplary, strongly increased expression of tumor necrosis factor (TNF)-stimulated gene 6 (TSG-6) (a secreted model therapeutic protein) was achieved by enhancer-facilitated HAdV-5 transduction. Thus, enhancer-mediated HAdV-5 vector transduction is a valuable method for the engineering of hMSCs, which can be further exploited for the development of innovative hMSC therapeutics., publishedVersion

A large portion of the human genome is composed of repeated sequences, with Alu retrotransposons representing the most abundant repetitive elements. Alu sequences belong to the class of the Short Interspersed Nuclear Elements (SINEs) and depend on the Long Interspersed Nuclear Elements (LINEs) for their mobilization into the genome. The efficiency of Alu amplification during primate evolution suggests a positive driving force for their accumulation, bringing up to 1 million copies in the human genome. For unclear reasons, the majority of Alu sequences is repressed by tight epigenetic silencing, which is released in response to cell stresses such as virus infection and cancer progression. Adenovirus 5 (Ad5) is known to cause an increase of Alu transcription in HeLa, myelogenous leukemia and embryonic kidney cell lines, even though the virus factors that are responsible for this transcriptional enhancement have not been identified yet. Potential candidates could be represented by oncovirus proteins that induce a global remodeling of the host epigenetic landscape. For example, the Adenovirus early E1A protein interacts with the host tumor suppressor Rb, the lysine acetylase p300 and the p400 ATP-dependent chromatin remodeling complex, resulting in the induction of quiescent fibroblasts to enter the S-phase of the cell cycle. The exceptional success of Alu expansion and their retention even at the cost of a strong epigenetic silencing, which is released by virus infection, led us to investigate the molecular mechanism of Alus activation and their potential involvement in various cell processes. Firstly, genome-wide Alu profiling was performed in quiescent human primary fibroblasts infected with the Ad5 dl1500 mutant, which only expresses the oncovirus small E1A protein. A total of 1880 Polymerase III (Pol III) transcribed Alus were detected through high throughput RNA-sequencing (RNA-seq), revealing a 4-fold increase of the average Alu expression induced by small E1A. With the aim of identifying small E1A-host protein interactions that are crucial for the activation of Alu expression, the host proteins Rb, p300 and p400 were put under investigation. Alu expression profiling was performed in cells infected with small E1A mutants that are not capable to bind Rb, p300 or p400. RNA-seq and RT-qPCR data revealed that the small E1A-p400 binding mutant was the least efficient in activating Alu expression, whereas a milder effect was reported for small E1A-Rb and small E1A-p300 binding mutants. Moreover, ChIP-sequencing (ChIP-seq) analyses of dl1500 infected fibroblasts revealed an enrichment of H3K4me1 within the body of small E1A-induced Alus. Our data point toward the existence of H3K4me1 Alu loci that are recognized by p400 bound by small E1A, resulting in Alu transcription in response to virus infection. Secondly, two Alu sequences were stably overexpressed in one primary and one cancer cell line (human fibroblasts and HeLa cells, respectively) and differential gene expression in Alu-overexpressing cells was performed through RNA-seq data analysis. Among the two Alu- overexpressing fibroblast cell lines, 330 genes were detected as Differentially Expressed (DE), whereas only two genes were differentially expressed in HeLa cells. Interestingly, DE genes detected in Alu-overexpressing fibroblasts were significantly enriched in pathways belonging to cell cycle progression and mitotic entry. The promotion of cell cycle was also supported by a significantly higher percentage of cells in the S-phase compared to control samples as revealed by flow cytometry. The studies conducted in this work identify Ad5 small E1A as one of the virus factors that enhance Alu transcription, possibly through binding with the p400 complex. Interestingly, the overexpression of two Alu sequences in human fibroblasts leads to the stimulation of cell cycle progression, resulting in the same phenotype as previously observed in Ad5 infected fibroblasts. This brings us to speculate that the overexpression of Alu sequences during stress response to viral infection could be exploited by Ad5 to sustain cell proliferation.

Highlights • Immunization with MERS spike protein nanoparticles induced only Th2-biased response. • Heterologous prime-boost immunization induced both Th1 and Th2-biased responses. • Our vaccination strategy showed the protective effect against MERS-CoV., The Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) is a highly pathogenic and zoonotic virus with a fatality rate in humans of over 35%. Although several vaccine candidates have been developed, there is still no clinically available vaccine for MERS-CoV. In this study, we developed two types of MERS-CoV vaccines: a recombinant adenovirus serotype 5 encoding the MERS-CoV spike gene (Ad5/MERS) and spike protein nanoparticles formulated with aluminum (alum) adjuvant. Next, we tested a heterologous prime–boost vaccine strategy, which compared priming with Ad5/MERS and boosting with spike protein nanoparticles and vice versa, with homologous prime–boost vaccination comprising priming and boosting with either spike protein nanoparticles or Ad5/MERS. Although both types of vaccine could induce specific immunoglobulin G against MERS-CoV, neutralizing antibodies against MERS-CoV were induced only by heterologous prime–boost immunization and homologous immunization with spike protein nanoparticles. Interestingly, Th1 cell activation was induced by immunization schedules including Ad5/MERS, but not by those including only spike protein nanoparticles. Heterologous prime–boost vaccination regimens including Ad5/MERS elicited simultaneous Th1 and Th2 responses, but homologous prime–boost regimens did not. Thus, heterologous prime–boost may induce longer-lasting immune responses against MERS-CoV because of an appropriate balance of Th1/Th2 responses. However, both heterologous prime–boost and homologous spike protein nanoparticles vaccinations could provide protection from MERS-CoV challenge in mice. Our results demonstrate that heterologous immunization by priming with Ad5/MERS and boosting with spike protein nanoparticles could be an efficient prophylactic strategy against MERS-CoV infection.

Aktuelle Influenza A Virus (IAV) Impfungen induzieren eine Stamm-spezifische Immunität und sind nur gegen die im Impfstoff enthaltenen Stämme wirksam. Schutz gegen veränderte IAV oder neue Subtypen wird nicht erzeugt. In dieser Arbeit wurde ein Impfstoff-Ansatz verfolgt, der einen möglichst breiten Schutz gegen alle IAV Stämme gewährleistet. Dazu wurden Mäuse intranasal mit adenoviralen Vektoren kodierend für Hämagglutinin und Nucleoprotein immunisiert. Das interne virale Protein Nukleoprotein ist zwischen allen IAV Stämmen konserviert und ein optimales Ziel für eine breit-schützende T Zell-Antwort. Darüber hinaus wurden Vektoren kodierend für IL-1\(\beta\) oder IL-18 in den Impfstoff integriert, um die T Zell-Antwort zu verbessern. IL-1\(\beta\)- aber nicht IL-18-kodierende Vektoren verbesserten sowohl die humorale als auch die T Zell-Antwort. Insbesondere lokale CD8\(^+\) T Zellen in der Lunge wurden vermehrt induziert und führten zu einem verbesserten Schutz gegen heterologe H1N1, H3N2 und H7N7 Stämme.

The NanoSight LM10 with Nanoparticle tracking analysis (NTA) software was evaluated for the quantification of latex particles, adenovirus 5, and influenza virus. The inter-day variability was determined by measuring the same sample over several consecutive days and the method’s accuracy was demonstrated by using known concentrations of the subject particles. NTA analysis was also used to quantify chromatographic fractions of adenovirus and influenza virus after purification on a CIM monolithic column. NTA results were compared and evaluated against hemagglutination (HA) and end point dilution assay, determining total and infection virus particle number, respectively. The results demonstrated that nanoparticle tracking analysis is a method for fast estimation of virus concentration in different samples. In addition, it can provide a better insight into the sample status, regarding the level of virus aggregation.

Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronische, progressive und systemische Autoimmunerkrankung, in deren Zentrum das dauerhaft entzündete Synovialgewebe der Gelenke steht. Aufgrund vielfältiger Knochen- und Knorpel-destruierender Prozesse kommt es zu irreversiblen Funktionalitätsverlusten der betroffenen Gelenke. Eine tragende Rolle bei der Ausprägung der klinischen Manifestationen wird dabei der exzessiven Synthese des proinflammatorischen Cytokins IL-1 zugesprochen. Dessen Aktivität kann durch kompetitive Blockade des IL-1 Rezeptors Typ I mit dem natürlich vorkommenden, antiinflammatorischen IL-1 Rezeptorantagonisten (IL-1Ra) inhibiert werden. Der Cytokin-blockierende Therapieansatz mit Anakinra, einem rekombinant hergestellten IL-1Ra, konnte die pharmakologischen Behandlungsmöglichkeiten der RA seit 2001 wesentlich erweitern. Gleichwohl erfordern die geringen Halbwertszeiten von IL-1Ra regelmäßige subkutane Injektionen, um hinreichende therapeutische Wirkstoffspiegel im Patienten aufrecht zu erhalten. Vor diesem Hintergrund bieten somatische Gentherapiekonzepte eine vielversprechende Alternative zu den konventionellen Behandlungsstrategien bei der RA-Therapie. Ein IL-1Ra-Gentransfer ins Gelenk soll die persistierende, lokale, endogene Synthese des therapeutischen IL-1Ra-Proteins ermöglichen und lässt in dieser Hinsicht eine nachhaltige Verbesserung der klinischen Symptomatik erwarten. In dieser Arbeit wurden dafür gentherapeutische Foamyvirus-Adenovirus-Hybridvektoren (FAD) zur Expression des IL-1Ra entwickelt und die Funktionalität der Konstrukte evaluiert. Die Vektoren sollten die effizienten adenoviralen Transduktionsmechanismen mit dem Potential der foamyviralen somatischen Integration für einen direkten in vivo Gentransfer kombinieren. Das System besteht aus einem adenoviralen Hochkapazitätsvektor vom Serotyp 5, der eine selbstinaktivierende PFV-Vektorkassette unter Kontrolle des Reversen Tetracyclin Transaktivator Systems (Tet-On) enthält. In FAD-transduzierten Zellen wurde die funktionelle Induzierbarkeit der PFV-Vektorexpression nachgewiesen und die Kinetik der PFV-Partikelfreisetzung charakterisiert. Nach Induktion der PFV-Vektorkassette konnte in FAD-transduzierten Zellen ein langfristig-stabiler IL-1Ra-Gentransfer gezeigt werden. Ferner konnten protektive Effekte eines FAD-vermittelten IL-1Ra-Gentransfers im Zellkulturmodell nachgewiesen werden. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten eine erfolgreiche Transduktion von Synovialzellen nach intraartikulärer Applikation von FAD-Vektoren. Das Tetracyclin-regulierbare Hybridvektorsystem zur Expression des IL-1Ra, das in der vorliegenden Arbeit geschaffen wurde, könnte zukünftig die Basis für ein effektives Werkzeug zum intraartikulären Gentransfer in der klinischen Praxis bieten., Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, progressive and systemic autoimmune disease, characterized by invasive synovial hyperplasia. Several inflammatory cartilage- and bone- destroying processes lead to an irreversible loss of joint functionality. The excessive synthesis of the pro-inflammatory cytokine IL-1 has been implicated as a primary mediator of pathology in RA. The activity of IL-1 is initiated upon binding to the IL-1 receptor type I and can be inhibited by the naturally occurring anti-inflammatory IL-1 receptor antagonist (IL1-Ra) protein. The cytokine-blocking therapeutic approach with anakinra, a recombinant form of IL-1Ra, has significantly improved the pharmacological treatment of RA since 2001. Nevertheless, due to the short half-life of IL-1Ra, repeated subcutaneous injections are required to maintain therapeutic concentrations in the patient. Thus, somatic gene therapy may offer a promising alternative to conventional therapeutic strategies for treating RA. Following gene delivery of IL-1Ra, it may be expected that a sustained improvement of clinical symptoms is achievable due to the endogenous cellular synthesis and local secretion of the therapeutic IL-1Ra protein. In this work, foamy virus-adenovirus hybrid vectors (FAD) were developed for the expression of IL-1Ra and the functionality of the constructs was evaluated. The hybrids combine the high transduction efficiency of adenovirus vectors with the integrative potential provided by prototype foamy virus (PFV) vectors, for direct in vivo gene transfer. In the system, a complete expression cassette for self-inactivating PFV vectors, which is under the control of the tetracycline-dependent regulatory system (Tet-On), was inserted into the backbone of a serotype 5-based high-capacity adenoviral vector. In FAD-transduced cells, the induction of the PFV vector cassette was demonstrated and the release of secondary infectious PFV vectors was characterized. After the induction of the PFV vector cassette in FAD-transduced cells, a stable long-term IL1-Ra expression was shown. Furthermore, the anti-inflammatory potential of the FAD-mediated IL-1Ra gene transfer was successfully evaluated in a cell culture model. Animal studies indicated successful transduction of cells in the synovium after intra-articular application of FAD-vectors. The tetracycline-inducible hybrid vector system for the expression of IL-1Ra, which was created in the present work, may provide the future basis for an effective tool for intra-articular gene transfer in clinical settings.

Trotz einer Vielzahl von Behandlungsstrategien wie Chirurgie, Bestrahlungs- und Chemotherapie ist die Prognose fuer Patienten mit Glioblastoma multiforme (GBM) derzeit sehr schlecht. Daher sind neue, verbesserte Behandlungsansätze dringend notwendig. Hierzu wurde in dieser Arbeit ein neu entwickelter, chimärer adenoviraler Vektor für die Behandlung von GBM getested. Der Vektor kombiniert verschiedene Aspekte, die die Behandlungsaussichten von malignen Erkrankungen mit Hilfe von viraler Therapie verbessern könnten. Hierzu zählt der Austausch der Wildtyp-Serotyp 5 (Ad5) Fiberproteine mit denen vom Serotyp 35 (Ad35). Ad35 Fiberproteine binden an humanen CD46 als Ligand, während Wildtyp Ad5 am Rezeptor CAR bindet. Der Rezeptor CAR ist auf Krebszellen meist unterrepresentiert. Zusätzlich hat der Vektor die Fähigkeit sich spezifisch in Tumorzellen zu replizieren. Dies geschieht durch die Deletion aller E1A und E1B Gene in Kombination mit dem Einsatz einer Expressionskassette, die nach tumorspezifischer homologer Rekombination aktiviert wird und die Transgene AdE1A und „TNF-related apoptosis inducing ligand“ (TRAIL) exprimiert. AdE1A ermöglicht effiziente intratumorale Produktion von neuen viralen Partikeln, während TRAIL die Fähigkeit besitzt, in Krebszellen Apoptose auszulösen. Zunächst haben wir die Oberflächenexpression von CD46 in den humanen GBM Zelllinien SF767, T98G und U-87 MG nachgewiesen, gefolgt vom Nachweis effizienter in vitro Infektion der Zellen mit dem Vektor Ad5.35.IR-E1A/TRAIL. Der Vektor löste stärkeres Zellsterben in allen Zellinien im Vergleich zum Wildtyp oder Ad5.35.IR-E1A ohne TRAIL aus. Analyse mittels TUNEL-Test verifizierte, dass Apoptose-Vermittlung tatsächlich der Auslöser der beobachteten Abtötung der Krebszellen ist. Untersuchung der onkolytischen Fähigkeiten von Ad5.35.IR-E1A/TRAIL in vivo mit Hilfe eines GBM Xenograft-Modells in NOD/SCID Mäusen zeigte signifikante Inhibition des Tumorwachstums. Detektion von adenoviralen Protein mit einem Antikörper, welcher gegen das Kapsidprotein gerichtet ist, zeigte effiziente virale Ausbreitung im Tumorgewebe. Bereiche in denen virale Kapside nachgewiesen werden konnten wurden ebenfalls mittels TUNEL-Färbung positiv auf Apoptose getestet. Dies legt Nahe, dass das Virus in der Lage ist, sich in vivo nach Applikation im Gewebe auszubreiten und Apoptose auszulösen. Intratumorale Injektion führte zu signifikanter Verminderung des soliden Tumorgewebes. Allerdings war dieser Effekt nur über einen kurzen Zeitraum zu beobachten. Es besteht die Möglichkeit das dies an einer behindertern intratumoralen Ausbreitung von neugebildeten viralen Partikeln liegt. Unsere Studie demonstriert, dass die Verwendung des viralen Vektors Ad5.35.IR-E1A/TRAIL eine neue onkolytische Behandlungsstrategie für humane GBM Tumore eröffnet. Des weitern schlagen wir Vektor-Modifikationen vor, die nötig sind um eine potentielle Therapie effektiver zu gestalten., Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive brain tumor, and patients rarely survive for more than 2 years. Gene therapy may offer new treatment options and improve the prognosis for patients with GBM. Adenovirus-mediated gene therapy strategies for brain tumors have been limited by inefficient gene transfer due to low expression of the adenovirus serotype 5 (Ad5) receptor. We have used an adenovirus vector that specifically replicates in tumor cells and uses an Ad5 capsid and the adenovirus serotype (Ad35) fiber for efficient infection of malignant tumor cells. This vector also expresses adenovirus E1A and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) in a tumor-specific manner. Here, we show that this oncolytic vector (Ad5/Ad35.IR-E1A/TRAIL) efficiently infects the GBM tumor cell lines SF767, T98G, and U-87 MG. Tumor cell killing was markedly enhanced with Ad5/Ad35.IR-E1A/TRAIL compared with wild-type Ad5 and Ad35 virus or Ad5/Ad35.IR-E1A- vectors without TRAIL expression in vitro. In vivo experiments using s.c. xenografted U-87 MG cells in NOD/SCID mice showed a significant growth delay of tumors after i.t. injection of Ad5/Ad35.IR-E1A/TRAIL, whereas adenovirus wild-type injections showed only marginal or no effect. Our findings indicate that the use of a capsid-modified adenoviral vector, in combination with TRAIL expression, is a promising novel approach for gene therapy of glioblastoma.

1. Hintergrund und Ziele Die hypertrophe Narbenbildung ist eine humanspezifische fibroproliferative Erkrankung, die sich vor allem in einer vermehrten Ablagerung der Extrazellulärmatrix in der Dermis und Subkutis auszeichnet. Durch Produktion, Sekretion und Wirkung spielt der Botenstoff TGF-beta ebenso wie die Differenzierung der Myofibroblasten gleichermaßen in der physiologischen sowie auch in der verzögerten oder gestörten Wundheilung eine Schlüsselrolle. Die Signaltransduktion erfolgt in der TGF-beta Superfamilie über die Smad-Proteine als Signalmediatoren, wobei Rezeptor-assoziierte Smads (R-Smads), allgemein mediierende Smads (Co-Smads) und inhibitorische Smads (I-Smads) wie das Smad7 unterschieden werden. Zielsetzung dieser Arbeit war die in vivo Blockade der TGF-beta1–spezifischen Signaltransduktion mit Hilfe eines für Smad7 codierenden adenoviralen Vektors (adSmad7) am Modell der hypertrophen Narbe am Kaninchenohr. 2. Methoden Nach Deepithelisierung der Ohrinnenfläche bis auf das Perichondrium über eine Fläche von 1,5 x 5 cm bei 24 ausgewachsenen, weiblichen Weißen Neuseelandkaninchen wurde ein Hydrokolloidverband angelegt. 28 Tage nach der chirurgischen Intervention erfolgte die Boost-Injektion von adSmad7, Dexamethason oder Kontrollen mittels eines Dermojets. Nach Randomisierung wurden in festgelegten Zeitintervallen je zwei Tiere nekropsiert, die Ohren photographiert und die exzidierten Narbenareale zur histologischen und molekularbiologischen Aufarbeitung verwendet. Nach Fixierung und Paraffin- Einbettung der Präparate wurden konventionelle Histologien sowie Immunhistochemien zum Nachweis der Signal- und Effektorproteine PAI I, Smad3, Smad7, alpha-SMA, Procollagen 1alpha1 und 1alpha2 TGFbeta RII angefertigt und analysiert. Zur molekularbiologischen Untersuchung wurden nach Proteinextraktion- und konzentrationsbestimmung mittels BCA- Assay Western-Blot-Analysen durchgeführt. 3. Ergebnisse und Beobachtungen Die Planimetrie und Analyse der Wundflächen zeigt, dass nach in vivo Applikation von adSmad7 eine deutlich geringere Wundkontraktion und flachere Narbenbildung resultiert. Des Weiteren kann histologisch und molekularbiologisch eine Senkung der Expression von TGFbeta1-abhängigen Matrix-Proteinen wie Procollagen 1alpha1 und 1alpha2 nachgewiesen werden. Lediglich die intraläsionäre Gabe von adSmad7 hemmt die Expression des intrazellulär funktionellen alpha-SMA während der Narbenreifung fast vollständig. Die Expression des degradationshemmenden PAI 1 wird durch die Applikation von Smad7 blockiert. Zudem inhibieren adSmad7 und Dexamethason den TGFbeta1-Signalweg sowohl auf Rezeptor- als auch Signalproteinebene. Während adSmad7 eine dauerhafte Hemmung der TGFbeta1 abhängigen Proteinexpression bewirkt, kann bei Dexamethason-Gabe ein Rebound-Phänomen beobachtet werden. 4. Praktische Schlussfolgerungen Bei der Entstehung und Ausbildung hypertropher Narben durch überschießende Expression von fibrotisch wirkenden Proteinen spielt TGFbeta1 eine zentrale Rolle. Nach intraläsionärer Applikation sowie ektoper Überexprimierung von Smad7 wird die TGFbeta1 abhängige Signaltransduktionskette auf Rezeptor- und Signalproteinebene und die davon abhängige Kontraktionsfähigkeit der Zellen der Extrazelluärmatrix langfristig und äußerst effektiv gehemmt und wirkt sich somit begünstigend auf fibroproliferative Erkrankungen aus. Die positive, antifibrotische Wirkung von Dexamethason erscheint von kurzer Dauer mit anschließender überschießender Exprimierung von patho-funktionellen Proteinen, was die häufig beobachteten Rezidive hypertropher Narben nach Beendigung der Kortikosteroid-Therapie erklären könnte. 1. Aim Hypertrophic scarring is defined as cutaneous fibroproliferative disorder, characterized by imbalance of deposition and impaired degradation of extracellular matrix. High expression levels of TGF-beta1 lead to fibroblast activation and transdifferentiation to myofibroblasts thus enhancing production of extracellular matrix and up-regulation of cytokine and cytoskeletal protein expression. The TGF-beta family mediates their intracellular signals through Smad proteins which are subsummized into receptor-regulated Smads (R-Smads), common mediator Smads (Co-Smads), and inhibitory Smads (I-Smads) like Smad7. Intrinsic control of this signalling system is gained by Smad7 working as negative feedback regulator in many cell types. Therefore we hypothesized, that ectopic overexpression of Smad7 can reduce hypertrophic scarring in a standardized in vivo animal model. Hypertrophic scars were treated by an adenovirus encoding for Smad7 (adSmad7) and dexamethasone. Untreated sites served as controls. 2. Methods A fibroproliferative reaction comparable to human hypertrophic scarring was induced in 24 full-grown female White New Zealand rabbits. A rectangular area of 1.5 x 5 cm was carefully incised on the inner surface of each rabbit ear, deepithelialized without damaging the perichondrium of the auricular cartilage and covered with a hydrocolloid dressing. 28 days following operation each animal received an intralesional boost with adSmad7, dexamethasone or controls using the Dermojet® mechanic injection system. Subsequently every other day 2 rabbits were sacrificed. All animal scars were digitally photographed and completely excised for histological, immunohistochemical and molecular biological examinations. Therefore biopsies were fixed in formalin, embedded in paraffin. Conventional and immunohistochemical staining was performed by antibodies against TGF-beta receptor type II (TbetaRII), Smad3 and 7, PAI-1, alpha1 and alpha2 chain of procollagene type I and alpha-SMA. For further investigation scar tissue was homogenizised and whole cell lysates were probed by immunoblotting. 3. Results All lesions were digitally photographed únder standard conditions and scar extension was measured by using a digital planimetry tool followed by statistical evaluation. AdSmad7 treated specimen showed significantly reduced shrinkage. Contraction and height of scars was compared to dexamethasone treated specimen or controls. Histological, immunohistochemical and microscopically achieved results demonstrated that application of adSmad7 resulted in reduced expression of TGF-beta1 dependant extracellular matrix proteins like the alpha1 and alpha2 chain of procollagene type I. Intralesional injection of adSmad7 significantly blocked the expression of intracellular functional smooth muscle actin (alpha-SMA) during hypertrophic scarring as well as the expression of plasminogen activator inhibitor 1 (PAI 1), an inhibitor of degradation. AdSmad7 permanently inhibited the TGF beta1 specific Smad signalling pathway and reduced expression of TGF-beta1 dependant extracellular matrix proteins, whereas injection of dexamethasone seemed to cause rebound phenomena. 4. Conclusion TGF-beta1 is a crucial factor during scar maturation and hypertrophic scarring characterized by overexpression of fibroproliferative proteins. We showed that intralesional application of Smad7 leads to effective and stable inhibition of the TGF beta1 specific Smad signalling pathway on receptor and mediator levels. Subsequently contractility of extracellular matrix was decreased, thus indicating a beneficial role of Smad7 in fibroproliferative diseases. Dexamethasone has positive impact on TGF-beta1 specific signalling and collagen metabolism in hypertrophic scars for short time. A rebound effect with excessive expression of extracellulär matrix proteins and high levels of endogenous TGF-beta1 activity can be determined explaining high recurrence rates of dexamethasone therapy used in clinical approach.

Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Induktion von Immunantworten. Unreife, hoch endozytotische Dendritische Zellen nehmen Antigene über internalisierende Rezeptoren auf und präsentieren diese mittels MHC-I und MHC-II. Eine erfolgreiche Induktion von Immunantworten durch Dendritische Zellen ist hierbei abhängig von einem gleichzeitigen Reifungsprozess. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss einer gegen DEC-205 gerichteten genetischen, heterologen \(\it {prime/boost}\)-Immunisierung auf die Immunogenität verschiedener Antigene charakterisiert und optimiert. Hierbei ergab sich eine signifikante Steigerung der Immunantworten durch einen Plasmid-DNS Impfstoff nach Zugabe der kostimulierenden \(\it {toll-like}\) Rezeptor-Liganden CpG und Poly I:C. Obgleich die Kostimulation im Falle adenoviraler Vektorimpfstoffe nicht möglich war, konnte ein Vektor-kodierter und gegen DEC-205 gerichteter Impfstoff weitere Steigerungen der Immunantworten erzielen.

In dieser Arbeit konnte an einem standardisierten Verbrennungs-Infektions-Modell gezeigt werden, das es möglich ist mittels der adenoviralen Gentherapie das humane Cathelicidin hCAP18/LL37 in 2 o verbrannte und mit Pseudomonas aeruginosa infizierte Haut zu transfizieren und anschließend in therapeutischen Konzentrationen zu expremieren. Durch die lokale Überexpression des Host Defense Peptids hCAP18/LL37 konnte so eine hoch signifikante Inhibition des Wachstums von Pseudomonas aeruginosa über einen Zeitraum von sieben Tagen nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnten die anhand der Auszählung von Colony forming units gewonnen Daten zusätzlich durch den immunhistochemischen Nachweis von hCAP18/LL37 Transkripten in Gewebeschnitten und den semi-quantitativen Nachweis von mRNA des Transgens durch real time RT-PCR in Stanzbiopsien validiert werden.

Bislang ist nicht bekannt, ob der Aminosäureaustausch R145G im cTnI eine veränderte Antwort auf Stimulation \(\beta\)-adrenerger Rezeptoren (AR) verursacht. Daher wurde dessen Einfluss auf die Kontraktion adulter Ratten-Kardiomyocyten untersucht. Zur Expression von humanem cTnI-R145G wurden rekombinante Adenoviren verwendet. cTnI-R145G führt zu einer signifikanten Reduktion der Sarkomerverkürzung sowie deren Verkürzungs- und Relaxationsgeschwindigkeit. \(\beta_{1}\)/\(\beta_{2}\)-AR Stimulierung bewirkt nahezu die Aufhebung der negativen Effekte auf die Sarkomerverkürzung. Die Verringerung der Verkürzungs- und Relaxationsgeschwindigkeiten sind offensichtlich mit dem \(\beta_{2}\)-AR assoziiert. Stimulierung des \(\beta_{1}\)-AR heben die negativen Einflüsse auf die kinetischen Parameter auf. Die Effekte hängen vermutlich mit einem veränderten \(Ca^{2+}\)-Haushalt zusammen. Die Ergebnisse untermauern die Hypothese, dass \(\beta_{1}\)- und \(\beta_{2}\)-AR die Kontraktion unterschiedlich regulieren und der \(\beta_{2}\)-AR an \(G_{s}\)- und \(G_{i}\)-Proteine koppeln kann.

Derzeit verfügbare virale Vektoren sind nicht in der Lage, sämtliche Anforderungen einer gentherapeutischen Anwendung zu erfüllen. Daher werden zunehmend individuelle Eigenschaften verschiedener Viren in Hybridvektorsystemen vereint. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst zwei durch eine Mehrfachklonierungsstelle (multiple cloning site, mcs) getrennte Erkennungssequenzen der Flp-Rekombinase (Flp Recognition Target, FRT) aus Saccharomyces cerevisiae in einen „gutless“ Adenovirus-Vektor eingebracht. In einem zweiten Schritt wurde das Gen der Flp-Rekombinase unter Kontrolle des Tet-ON-Systems (CMVenhancer, 7xTet-Operator-Sequenz, SV40 Minimal-Promotor) in dasselbe Molekül kloniert. Weiterhin wurden definierte Genabschnitte von Herpesvirus saimiri, die eine tragende Rolle bei der Replikation und der Ausbildung der episomalen Persistenz des Virus spielen, sowie ein Reportergen und therapeutisch wirksame Gene zwischen die FRT-Erkennungssequenzen kloniert. Auf diese Weise wurden Hybridvektoren aus Herpesvirus saimiri und dem humanen Adenovirus Typ 5 (Ad5) geschaffen. Zur Prävention der vorzeitigen Exzision des Replikons während der Verpackungsphase der adenoviralen Partikel wurde auf Basis von 293Cre Zellen eine spezialisierte Verpackungszelllinie etabliert. Dazu wurde unter Selektionsdruck von Hygromycin B das Gen des Transsilencer-Proteins TetR(sB)-KRAB stabil transfiziert, wodurch die Expression der Flp-Rekombinase in diesen Zellen reprimiert ist. Bei Expression der Flp Rekombinase durch Derepression mit Tetrazyklin (Tc) oder in Zellen ohne TetR(sB)-KRAB erfolgt die homologe Rekombination an deren spezifischen Erkennungssequenzen, was zur Exzision und Zirkularisierung der zwischen ihnen liegenden Nukleinsäureabschnitten führt. Auf diese Weise wurden die HVS-Sequenzen in episomaler Form freigesetzt. Dies konnte durch Reportergenanalyse nach transienter Transfektion in 293Cre-Zellen gezeigt werden. Weiterentwickelte Versionen des Systems wurden mit dem GeneSwitchTM-System ausgestattet. Hier steht der molekulare Schalter (Switch) unter Kontrolle des HVS ORF14-Promotors bzw. des Promotors des Elongationsfaktors 1 alpha (EF1a); durch Induktion mit Mifepriston (RU486) erfolgte vom konditionalen Promotor die Expression von humanem Interleukin-10 (hIL-10) oder Interleukin-1 Rezeptor Antagonist (IL-1RA) nach experimenteller Infektion von Zellen menschlicher Herkunft und anderer Primaten (HFF, A549, Vero). Mit diesem auf nur einem Plasmid basierenden System ist es gelungen, sowohl den Transfer und die Freisetzung eines rhadinoviralen Episoms als auch die gezielte Expression therapeutischer Gene zu realisieren. The currently available viral vectors do not meet all the requirements for a successful gene therapy. Specific properties of different virus types are therefore combined within a novel hybrid vector system. In this approach, two recognition sites for the Flp-recombinase (FRT) separated by a polylinker-region were inserted into a gutless adenoviral vector. The flp recombinase gene controlled by seven tet operator sequences (tetO) and a CMV-enhancer/SV40 minimal promoter hybrid was then cloned into the same molecule. Furthermore, defined sequences of Herpesvirus saimiri, which shall ensure replication and episomal persistence as well as a reporter-gene and cytokine genes relevant for the therapy e.g. of Rheumatoid Arthritis (RA), were inserted between the FRT-sites, creating a hybrid vector composed of Herpesvirus saimiri and Adenovirus Type 5 (Ad5) in this final step. A specific packaging cell line based on HEK293Cre was established to avoid the premature excision and circularization of the replicon during the packaging of adenoviral particles. The gene of the transsilencer-protein TetR(sB)-KRAB was stably introduced into 293Cre cells by selective pressure of Hygromycin B, for the purpose of repressing the Flp-Recombinase expression during vector production. Absence of TetR(sB)-KRAB or derepression by adding tetracycline allows for Flp-expression. Homologous recombination at the FRT-sites takes place and results in excision and circularisation of the sequences located inbetween. By this means, the HVS-sequences and adjacent genes are released as an episome. This could be shown by luciferase reporter gene assay which is dependent on circularisation after transient transfection of HEK293Cre as well as infection of HFF-, A549-, HeLa and Vero-cells. Improved versions of the system have been extended by the GeneSwitchTM-System that allows conditional expression of IL-10 or IL1-RA, induced by addition of Mifepristone, in experimental target cells such as HFF-, A549- and Vero-cells. This particular system employs a single construct for transfer and deliberate release of our Rhadinovirus-based episome as well as inducible expression of therapeutical genes within a target cell population.

Conditionally replicating viruses are currently being investigated regarding applicability in cancer therapy with the aim to achieve specific, virus-mediated oncolysis. One promising oncolytic approach is based on the observation that activated Ras, which occurs in 30% of all malignant tumors, may interfere with the activity of PKR, a central kinase of the cell’s antiviral response. PKR-sensitive viruses should thereby be able to selectively replicate in Ras-transformed tumor cells, while sparing the surrounding tissue. Initial promising experiments using reovirus and vesicular stomatitis virus, which are naturally sensitive to PKR action, were followed by experiments with PKR-sensitive virus mutants, such as influenza virus dNS1 and herpes simplex virus R3616. Disadvantages of these approaches are lacking genetic accessibility on the one hand, and high pathogenicity of the parental viruses on the other. Adenoviruses, however, only cause mild respiratory disease and are widely used as well characterized tools in gene therapy. In this dissertation, we successfully transferred the principle of Ras-mediated oncolysis onto adenoviruses. PKR-sensitive adenoviruses (Ad dVA) were created through targeted mutation, and their selective replication could be confirmed in various Ras-transformed tumor cells. Mechanistic studies, however, raised doubts about a generalizable concept of Ras-dependent replication of oncolytic viruses. Once, mutated Ras was not able to directly interfere with PKR activity. In addition, we found adenoviruses to actively trigger Ras-dependent signaling pathways to ensure efficient translation. We thus suspect indirect effects of Ras-dependent transformation on PKR effector mechanisms to be responsible for increased permissiveness of Ras-mutated tumor cells towards PKR-sensitive adenoviruses. In accordance with this hypothesis, the susceptibility of Ad dVA-permissive cells to PKR-mediated apoptosis was markedly decreased. Our findings generally support the applicability of PKR-sensitive adenoviruses in virus-mediated oncolysis, but concomitantly emphasize the necessity to fully elucidate the underlying mechanisms., Konditional replizierende Viren werden derzeit hinsichtlich ihrer Einsetzbarkeit in der Krebstherapie untersucht, mit dem Ziel der spezifischen, Virus-vermittelten Onkolyse. Ein vielversprechender onkolytischer Ansatz beruht auf der Beobachtung, dass aktiviertes Ras, wie es in 30 % aller malignen Tumoren vorkommt, möglicherweise die Aktivität der PKR, einer zentralen Kinase der wirtszelleigenen Virusabwehr, beeinträchtigt. Auf diese Weise könnten PKR-sensitive Viren selektiv in Ras-transformierten Tumorzellen replizieren, während das umliegende Gewebe verschont bleibt. Nach aussichtsreichen Versuchen mit Reoviren und Vesikulären Stomatitis Viren, die eine natürliche Sensitivität gegenüber der PKR-Wirkung besitzen, folgten Versuche mit PKR-sensitiven Virusmutanten, wie z. B. Influenza Virus dNS1 und Herpes Simplex Virus R3616. Nachteile all dieser onkolytischen Viren sind zum einen die schlechte genetische Manipulierbarkeit und zum anderen die hohe Pathogenität der Parentalviren. Adenoviren hingegen verursachen weitgehend ungefährliche Krankheiten und dienen als gut charakterisiertes System schon lange als Vektoren in der Gentherapie. In dieser Doktorarbeit ist es gelungen, das Prinzip der Ras-abhängigen Onkolyse auf Adenoviren zu übertragen. Durch gezielte Mutationen konnten PKR-sensitive Adenoviren (Ad dVA) hergestellt werden, und ihre selektive Replikationsfähigkeit konnte in verschiedenen Ras-transformierten Tumorzellen bestätigt werden. Mechanistische Untersuchungen ließen allerdings Zweifel an der Allgemeingültigkeit des molekularen Konzepts der Ras-abhängigen Replikation onkolytischer Viren aufkommen. Zum einen war mutiertes Ras nicht in der Lage, direkt mit der PKR-Aktivität zu interferieren. Zum anderen aktivierten Adenoviren gezielt Ras-abhängige Signalwege, um eine effiziente Translation zu gewährleisten. Wir vermuten deshalb indirekte Einflüsse der Ras-abhängigen Transformation auf PKR-Effektor-mechanismen als Urache für die erhöhte Permissivität von Ras-mutierten Tumor-zellen für PKR-sensitive Viren. In Übereinstimmung damit war die Fähigkeit zur PKR-vermittelten Apoptose in Ad dVA-permissiven Zellen stark eingeschränkt. Unsere Ergebnisse befürworten grundsätzlich den Einsatz PKR-sensitiver Adenoviren in der Virus-vermittelten Onkolyse, unterstreichen aber zugleich die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen zur Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen.

The efficiency of viruses in cancer therapy is enhanced by proteins that mediate the fusion of infected cells with their neighbors. It was reported that replication-competent adenovirus particles can spread between nuclei within fusion-generated syncytia. To assess this conjecture, we generated fusogenic adenoviruses that express a balanced ratio of the F and H glycoproteins of measles virus. The viruses displayed enhancedcytotoxicity but largely unchanged replication efficiencies compared to a nonfusogenic virus. Most notably, thevirus genomes did not spread through fusion-generated multinuclear cells. Hence, adenovirus replication insyncytia remains largely restricted to initially transduced nuclei., Adenovirus-Vektoren können zur Expression von Fusionsproteine eingesetzt werden, um neue Strategien zur Beseitigung maligner Tumoren zu entwickeln. Dazu ist zunächst zu klären, wie eine Fusion infizierter Zellen die Replikation und Zytotoxizität onkolytischer Adenoviren beeinflusst. Um diese Fragen zu beantworten, wurden in dieser Arbeit adenovirale Vektoren hergestellt (1st Generations-Vektoren), die beide Masernvirusproteine, F und H, gleichzeitig exprimieren. Die Infektion von permissiven Zellen mit diesen Vektoren verursacht die Erzeugung von Synzytien. Dabei bleibt die Replikation der Adenoviren im Kontext einer von der Fusion erhöhten Zytotoxizität ungestört, und die Expression von adenoviralen- und trans-Genen wurde von der Synzytienbildung nicht beeinträchtigt. Sowohl frühe als auch späte adenovirale Proteine wurden von allen Kernen eines Synzytiums importiert. Um eine mögliche Infektion benachbarter Kerne durch eine intrasynzytielle adenovirale Ausbreitung zu untersuchen, wurde eine FISH-Analyse mit adenoviralen DNA-Sonden durchgeführt. Es wurde beobachtet, dass die Replikation während des Infektionsverlaufs nur in einem einzigen Kern des Synzytiums erfolgt. Die Anwendung des MLP-Promoters zur Expression von F- und H-Protein ermöglicht schließlich eine von der Replikation abhängige Expression der Fusionsproteine und somit eine selektive Steuerung der Zytotoxizität. Diese Arbeit zeigt, dass fusionsfähige Adenoviren zur Expression ihrer Genprodukte und zur Replikation ohne Einschränkung in der Lage sind. Ihre erhöhte Zytotoxizität kann dabei durch geeignete Wahl des Promoters auf Tumorzellen fokussiert werden. Zellfusion hat damit das Potenzial, onkolytische Adenoviren in ihrer Wirkung wesentlich zu verstärken.

Within this work the physiological function of the first protein histidine phosphatase (PHP) discovered in mammals should be investigated. For that reason an appropriate model system for changing the cellular expression rate of PHP in the cell was developed to carry out functional studies. Furthermore, new substrates of PHP were searched for that might give information about the phosphatases functional properties. First, the expression of PHP in embryonic rat neurons was downregulated with the help of antisense technology. It could be demonstrated that the antisense oligonucleotides saved the neurons from dying by staurosporine-induced apoptosis. Although this protection could be achieved with different antisense oligonucleotides directed against various sections of the PHP-sequence, it could not be achieved with mismatch-oligonucleotides. Therefore, the protective effect was specific and one could assume that PHP is involved in the regulation of apoptosis in neuronal cells. Unfortunately, it was not possible to show the protective effect of the antisense oligonuceotides and the downregulation of PHP simultaneously in the same cells. Hence no direct evidence existed that the 20-30% decrease in apoptosis was attributed to the reduced amount of PHP. Nevertheless, it was striking that as investigations with fluorescence-marked oligonuceotides demonstrated only 20-30% of the neurons contained antisense oligonucleotides after treatment. This percentage correlated with the decrease of staurosporine-induced damage and supported the assumption that PHP is involved in the regulation of apoptosis. To investigate this further, a recombinant adenovirus containing the PHP-gene was constructed. Cells infected by this virus (Ad5-PHP) were able to overexpress PHP. This was also achieved in SY5Y cells, a cell line of neuronal origin. After 24 h of infection these cells showed a change in morphology, they became small and round and seemed not to tolerate the PHP-overexpression, which resulted by the infection. Investigations of apoptosis demonstrated that cells infected with Ad5-PHP were significantly more damaged than control cells infected by an adenovirus not containing the PHP-gene. Therefore, the cell death was not traced back to the virus infection itself but to the overexpression of PHP. For the first time it had been possible to reveal a function of PHP: overexpression of this enzyme leads to apoptosis in neuronal cells. In these cells PHP is involved in the regulation of programmed cell death. Further, it could be shown within this work that the beta-subunit of the heterotrimeric G-protein is a new physiological substrate of PHP. G-beta is phosphorylated at histidine-266 by nucleoside-diphosphate-kinase isoform B and is dephosphorylated by PHP. This dephosphorylation is specific for PHP. It was not observed with alkaline phosphatase. Additionally, the finding that G-beta and PHP are co-localized in tissues of various organs such as the heart, brain and lung as well as in different regions of the brain such as the cortex, cerebellum, striatum and hippocampus indicated the physiological relevance of this dephosphorylation reaction., Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit sollte die erste im Säugetier entdeckte Protein-Histidin-Phosphatase (PHP) weiter charakterisiert und ihre physiologische Funktion in der Zelle näher untersucht werden. Aus diesem Grund wurde versucht, ein geeignetes Modellsystem zu entwickeln, mit dessen Hilfe man die Expressionsrate des Enzyms zuverlässig verändern konnte, um funktionelle Untersuchungen durchführen zu können. Des Weiteren wurde nach einem neuen Substrat der PHP gesucht, mit dessen Hilfe man ebenfalls Rückschlüsse auf die Funktion des Enzyms ziehen konnte. Zuerst wurde die Expression der PHP in embryonalen Neuronen mittels Antisense-technologie herabreguliert. Es zeigte sich, dass die Zugabe der Antisense-Oligonukleotide die Zellen bei einer durch Staurosporin hervorgerufenen, apoptotischen Schädigung vor dem Zelltod bewahrt. Dieser Schutz konnte mit unterschiedlichen Antisense-Oligonukleotiden, die gegen verschiedene Stellen der PHP-Sequenz gerichtet waren, gezeigt werden. Der Effekt war somit spezifisch und es war davon auszugehen, dass die PHP an der Regulation der Apoptose in neuronalen Zellen beteiligt ist. Da es aber nicht möglich war, die schützende Wirkung der Oligonukleotide und eine gleichzeitige Herabregulierung der PHP-Expression auf Proteinebene zu zeigen, gab es keinen direkten Beweis dafür, dass der 20-30%ige Rückgang der Apoptose in den mit Antisense-Oligonukleotiden und Staurosporin behandelten Zellen tatsächlich auf eine geringere PHP-Menge innerhalb der Neurone zurückzuführen war. Auffällig war allerdings, dass, wie Untersuchungen mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden zeigten, auch nur 20-30% der Neurone überhaupt mit den Antisense-Oligonukleotiden transformiert werden konnten. Dieser Prozentsatz korrelierte mit dem Rückgang der Schädigung nach Staurosporinzugabe und unterstützte somit die Annahme, dass die PHP an der Regulation des Zelltods beteiligt ist. Um diesem Hinweis weiter nachzugehen, wurde im Folgenden ein rekombinanter Adenovirus hergestellt, in dessen Genom man die genetische Information der PHP integrierte. Zellen, die mit diesem Virus (Ad5-PHP) infiziert wurden, waren anschließend in der Lage die PHP stabil überzuexprimieren. Dies gelang auch in SH-SY5Y-Zellen, die neuronalen Ursprungs sind. Infizierte man diese Zellen mit dem Virus, so konnte man schon nach 24 h bei einem Teil von ihnen Veränderungen der Zellmorphologie feststellen. Sie wurden klein und kugelig und schienen die aus der Infektion resultierende Überexpression der PHP, nicht zu vertragen. Untersuchungen auf Apoptose zeigten, dass von den mit Ad5-PHP infizierten Zellen nach 3 Tagen signifikant mehr geschädigt waren, als das bei Vergleichskulturen, die zur Kontrolle mit einem Adenovirus, dem das PHP-Gen nicht einkloniert worden war, der Fall gewesen war. Der Tod der Zellen war also nicht auf die Virusinfektion als solche, sondern auf die Überexpression der PHP, die man mittels Westernblot auch während des gesamten Versuchs zeigen konnte, zurückzuführen. Somit war es das erste Mal möglich gewesen, eine Funktion der PHP aufzudecken: Bei Überexpression des Enzyms sterben neuronale Zellen apoptotisch ab. Die PHP ist in diesen Zellen an der Regulation des programmierten Zelltods beteiligt. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die beta-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins ein neues, physiologisch relevantes Substrat der PHP ist. G-beta wird durch die Nukleosid-Diphosphat-Kinase B (NDPK B) an Histidin266 phosphoryliert und durch die PHP dephosphoryliert. Diese Dephosphorylierung ist spezifisch für die PHP. Mit der alkalischen Phosphatase konnte sie nicht beobachtet werden. Für eine physiologische Relevanz der Dephosphorylierungsreaktion spricht zudem, dass G-beta und die PHP in den Geweben unterschiedlicher Organe wie Herz, Hirn oder Lunge und auch in den verschiedenen Gehirnregionen wie Kortex, Striatum, Cerebellum und Hippokampus kolokalisiert sind.

The early region 1a oncogene of adenovirus 5 codes for proteins that can activate transcription of viral and cellular genes. This study describes the construction of three deletions and one point mutation that together span the entire coding region of the second exon of E1A. The exon-2 mutants were tested for their ability to activate transcription from the adenovirus early region 3 promoter (E3) in transient expression assays. Dl1116 (dl aa 205-221) did not affect transactivation of E3 in pKCAT-23. Sub1117 (dl exon-2 aa) and dl1115 (dl aa 188-204) were unable to activate transcription. Pm1131 (SER-219 to stop) had a reduced transactivating efficiency but was still able to stimulate transcription. These results define the 3' boundary of a transactivation domain on the E1A proteins as being between positions 188 and 204. Results obtained in our lab define the 5' boundary as being between 138-147 (Jelsma et al., 1988). The mutants that could not transactivate were tested for their ability to block wildtype E1A transactivation of the E3 promoter in assays similar to those described by Glenn and Ricciardi (1987). Dl1115 and sub1117 appeared to block transactivation by WT E1A. In transient expression assays, the fatty acid sodium butyrate was found to stimulate transcription of the CAT gene, when added to the medium of HeLa cells transfected with pKCAT-23. This suggests that sodium butyrate is transactivating the Ad 5 E3 promoter. Thesis Master of Science (MS)