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Tfap2a gehört zur Familie der AP-2-Transkriptionsfaktoren. Heterozygote Mutationen von TFAP2A im Menschen führen zum Branchio-Okulo-Fazialen-Syndrom (BOFS) und sind mit Nierenanomalien assoziiert. Molekulare Mechanismen, die zu diesen BOFS-assoziierten Nierenanomalien führen, sind noch unbekannt. In diesem Projekt wurde die Expression von Mitgliedern der AP-2-Familie in neugeborenen und erwachsenen Wildtyp-Mäusen analysiert. Tfap2a wurde in der Ureterknospe und der distalen Region des S-förmigen Körpers in den Nieren neugeborener Mäuse exprimiert. Die Expression blieb in ausgereiften distalen Tubuli und Sammelrohren erhalten. Tfap2b, ein zweites Mitglied der AP-2-Familie, das in der Niere exprimiert wird und mit Zystenbildung assoziiert ist, wurde im aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife sowie in den distalen Tubuli und dem in der Nierenrinde liegenden Sammelrohr exprimiert. Um die Rolle von Tfap2a in der Niere zu untersuchen, wurden Mäuse mit einer sammelrohrspezifischen Deletion von Tfap2a (Tfap2a-KO) erzeugt. Phänotypische und morphologische Analysen ergaben, dass Tfap2a-KO-Mäuse mäßig reduzierte Nierengewichte und eine fortschreitende Dilatation der äußeren medullären Sammelrohre aufwiesen. Einzelkern- und RNA-Sequenzierung der Nieren adulter Mäuse zeigte eine deregulierte Expression von Genen, die mit der Organisation von Aktinfilamenten, Zelladhäsion, Wnt-Signalen und anderen Signalwegen der Nierenentwicklung in Verbindung stehen. In einem isolierten Modell von kultivierten Sammelrohrzellen mit einer Deletion von Tfap2a waren ähnliche Signalwege dereguliert. Insgesamt deutet diese Studie darauf hin, dass Tfap2a für die Differenzierung des Sammelrohrepithels und die Regulierung des Durchmessers des Tubuluslumens erforderlich ist. Dies ermöglicht Einblicke in die molekularen Grundlagen der beim BOFS beobachteten Nierenfehlbildungen., The transcriptional regulator Tfap2a is part of the AP-2 transcription factor family. Heterozygous mutations of TFAP2A in humans lead to branchio-oculo-facial syndrome (BOFS) and are associated with renal anomalies. Molecular mechanisms leading to BOFS-associated renal anomalies are still unknown. In this project, expression patterns of AP-2 family members were analyzed in newborn and adult wildtype mice. Tfap2a was expressed in the ureteric bud and distal region of the S-shaped body in kidneys of newborn mice. Expression was maintained in mature distal tubules and collecting ducts. Tfap2b, a second AP-2 family member expressed in the kidney and associated with cyst formation, was found in the ascending limb and showed overlapping expression with Tfap2a in distal tubules and the cortical collecting duct. To investigate the role of Tfap2a in the kidney, mice with a collecting duct-specific deletion of Tfap2a (Tfap2a-KO) were generated by crossing mice carrying a Cre-recombinase under the Hoxb7 promotor and mice with floxed Tfap2a alleles. Phenotypic and morphological analyses revealed that Tfap2a-KO mice displayed moderately reduced kidney weights and a progressive dilation of outer medullary collecting ducts. Single-nucleus and bulk RNA sequencing of kidneys of three months old Tfap2a-KO mice and littermate controls indicated deregulated expression of genes associated with actin filament organization, cell adhesion, Wnt signaling, and other kidney developmental pathways. Genes deregulated in Tfap2a-deficient mice included several genes previously implicated in the development of congenital anomalies of the kidney and urinary tract. In an isolated model of cultured collecting duct cells carrying a Tfap2a knockout similar pathways were deregulated. Taking together, this study indicates that Tfap2a is required for collecting duct epithelium differentiation and tubular lumen diameter regulation, providing insights into the molecular basis of renal defects observed in BOFS.

Eukaryontische Zellen besitzen ein Zytoskelett, ein zelluläres Netzwerk aus Biopolymeren. Unter diesen Biopolymeren sind die Mikrotubuli weitgehend konserviert. Diese aus Tubulin aufgebauten Filamente sind dynamisch und wechseln zwischen Phasen des Wachstums und der Schrumpfung. Die genauen Mechanismen, die die dynamische Instabilität der Mikrotubuli bestimmen, werden noch erforscht. Die Allgegenwart von Mikrotubuli wirft die Frage auf, wie sie in verschiedenen thermischen Umgebungen konservierte Funktionen ausführen können. Um dieser Fragestellung nachzugehen, habe ich verwandte Froscharten mit unterschiedlich temperierten Lebensräumen untersucht: Xenopus laevis (16-22 °C), Xenopus borealis (19-23 °C) und Xenopus tropicalis (22-30 °C). Um zu untersuchen, ob sich die biochemischen Eigenschaften von Tubulin und die Dynamik der Mikrotubuli bei den drei Arten an die Temperatur angepasst hat, habe ich die Methoden der Tubulin-Affinitätsreinigung und die temperaturgesteuerte TIRF-Mikroskopie zur Rekonstitution der Mikrotubuli-Dynamik kombiniert. Dabei habe ich festgestellt, dass bei einer Temperatur von 25°C die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikrotubuli im Bezug zur thermischen Nische der einzelnen Arten negativ korreliert. Die Verwendung der Arrhenius-Gleichung zum Vergleich der Aktivierungsenergie der Mikrotubuli-Polymerisation für jede Spezies ergab, dass die freie Energie des Tubulins umso höher ist, je kälter die thermische Nische der Spezies ist. Die Mikrotubuli von X. laevis und X. borealis zeigten eine längere Lebensdauer und wurden häufiger zerstört als die von X. tropicalis. Die Tubuline von X. laevis und X. borealis sind phosphoryliert, im Gegensatz zu X. tropicalis. Die Ergebnisse zeigen, dass sich Xenopus Tubulin und die Dynamik der Mikrotubuli an die Temperatur angepasst haben. Kalt lebende Arten kommen mit der niedrigeren Energie des Milieus zurecht, durch verbessertes Wachstum und Stabilität., Eukaryotic cells hold a cytoskeleton, a cellular network of biopolymers. Among the filaments of the cytoskeleton, microtubules are widely conserved. Built from tubulin, those filaments are dynamic, alternating between phases of growth and shrinkage. The biochemical properties of tubulin shape the dynamic behavior of microtubules, which is crucial for many cellular processes. The precise mechanisms determining microtubule dynamic instability are still under investigation. The ubiquity of microtubules raises the question of how they can perform conserved functions within various thermal environments. To address this, I turned to closely related frog species living at different temperatures, Xenopus laevis (niche: 16-22°C), Xenopus borealis (19-23°C) and Xenopus tropicalis (22-30°C). To probe whether the biochemical properties of tubulin and microtubule dynamics adapted to temperature across those three species, I combined tubulin affinity purification and temperature-controlled TIRF microscopy of in vitro reconstitution of microtubule dynamics. I found that at 25°C, the microtubule growth velocity inversely correlates with the thermal niche of each species. Adjusting temperature to each species’ endogenous condition modulates the growth rate differences across species. Using the Arrhenius equation to compare the activation energy of microtubule polymerization for each species suggested that the colder the thermal niche of the species, the higher the free energy of its tubulin. Microtubules from the cold-adapted species X. laevis and X. borealis have longer lifetimes and rescue more often than those of X. tropicalis, both at 25°C and at each species’ endogenous condition. X. laevis and X. borealis tubulins are phosphorylated, contrary to X. tropicalis. My results show that Xenopus tubulin and microtubule dynamics have adapted to temperature. Cold-living species cope with the lower energy of the milieu by facilitating growth and stability.

Die Fähigkeit Nukleinsäuren in lebenden Organismen nachzuweisen und zu visualisieren, ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Prozesse. Die Forschungsgruppe von Prof. Dr. Oliver Seitz hat zu diesem Zweck fluorogene FIT-Hybridisierungssonden entwickelt, die die besondere Eigenschaft der Cyaninfarbstoffe Thiazolorange und Chinolinblau nutzen, stärker zu fluoreszieren, wenn sie in die beengte Umgebung eines Nukleinsäureduplex aus Sonde und spezifischer Zielsequenz eingebracht werden. Obwohl FIT-Sonden eine gute Fluoreszenzverstärkung und Spezifität aufweisen, wäre eine weitere Verbesserung ihrer Helligkeit und des Signal-Hintergrund-Verhältnisses wünschenswert. Um dies zu erreichen, wurde in dieser Arbeit ein Ansatz untersucht, bei dem FIT-Sonden mit zwei Fluorophoren desselben Typs ausgestattet werden (FIT2-Strategie). Dies sollte sowohl die Helligkeit der Sonde erhöhen, als auch die Fluoreszenz im Einzelstrang und bei Hybridisierung mit fehlgepaarter RNA durch eine Mischung aus kontaktvermittelter Fluo-reszenzlöschung und strahlungsfreiem Energietransfer verringern. Verschiedene Sonden-längen, Farbstoffabstände und -positionen wurden untersucht und es konnte bestätigt werden, dass FIT2-Sonden eine höhere Extinktionskoeffizienten, größere Fluoreszenzver-stärkung und eine bessere Selektivität aufweisen als einfach markierte Sonden. Außerdem behalten sie ihre Fähigkeit zur Unterscheidung von Match- und Mismatch-Zielen in visko-sem Zelllysat besser bei. Zudem konnte gezeigt werden, dass das FIT2-Konzept durch Hinzufügen eines hybridisie-rungsunempfindlichen Cyanin 7 Farbstoffs zu den Sonden dahingehend erweitert werden kann, dass eine ratiometrische Detektion der hybridisierten Sonde möglich ist und Hellig-keitsunterschiede aufgrund von lokalen Schwankungen der Sondenkonzentration bei der Bildgebung lebender Zellen korrigiert werden können. Mit diesen qFIT2-Sonden konnten Jurkat und CCRF-CEM T-Zellen in einem Mikroskopie-basierten Experiment unterschieden werden., The ability to detect and visualize nucleic acids in living organisms is crucial for under-standing cellular processes. For this purpose, the research group of Prof. Dr. Oliver Seitz has introduced fluorogenic forced intercalation (FIT) hybridization probes, which exploit the unique property of the cyanine dyes thiazole orange and quinoline blue to exhibit increased fluorescence when placed in the constrained environment of a nucleic acid du-plex formed between probe and specific target sequence. Although FIT probes demon-strate solid fluorescence enhancement and specificity, further improvement of their abso-lute brightness and signal-to-background ratio would be desirable. To achieve this, the present thesis investigated an approach that equips FIT probes with two identical fluorophores (FIT2 strategy). This should on the one hand increase probe brightness, while simultaneously reducing fluorescence in the single strand and when hy-bridized to mismatched RNA, through a combination of contact-mediated quenching and non-radiant energy transfer. Various probe lengths, dye-dye distances and positions were screened, and it could be confirmed that FIT2 probes have higher extinction coefficients, greater fluorescence enhancement and better selectivity than their mono-dye counter-parts. Moreover, they better retain their ability to discriminate match and mismatch tar-gets in viscous cell lysate. Finally, it was demonstrated that the FIT2 concept can be extended by adding a hybridiza-tion-insensitive Cyanine 7 dye to the probes, allowing ratiometric detection of hybridized probe and correction of brightness differences due to local fluctuations in probe concen-tration during live-cell imaging. Using these qFIT2 probes, Jurkat and CCRF-CEM T-cells could be distinguished in a microscopy-based experiment.

Die Interleukin 1β (IL-1β) vermittelte Signaltransduktion ist für die akute Entzündung von entscheidender Bedeutung, muss aber gleichzeitig streng reguliert werden. Wie setzt das intrazelluläre IL-1β-Signalnetzwerk den extrazellulären Nachweis von IL-1β effizient in eine präzise und angemessene zelluläre Reaktion um? Welche Kontrollmechanismen kommen zum Einsatz, um eine angemessene Antwort zu gewährleisten und eine Hypo- oder Hyperantwort zu verhindern? Diese Arbeit charakterisiert die IL-1β-vermittelte Signalwegdynamik in EL4-Zellen mithilfe der Immunpräzipitations-Massenspektrometrie (IP-MS), konkret von MyD88, IRAK4 und IRAK1. Statistischer Analysen identifizierten das Interaktom dieser Proteine nach 15-, 30- und 60-minütiger IL-1β-Stimulation, sowie Proteine, die potenziell an der Runterregulierung des IL-1β-Signalwegs beteiligt sind. Um zu verstehen, wie das IL-1β-Signalwegnetzwerk die Translationsmaschinerie in EL4 Zellen beeinflusst, um eine angemessene Reaktion zu gewährleisten, untersuchte ich den IL-1β-abhängigen Proteinumsatz mittels gepulste stabile Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in der Zellkultur (pSILAC) in Kombination mit Azidohomoalanin (AHA)- Klickchemie und MS nach IL-1β-Stimulation. Das Ergebnis aller Proteomik-Untersuchungen war die Identifizierung des TNFα-induzierten Proteins 3 (Tnfaip3) interagierendes Protein 1 (TNIP1) als potenziellen Kandidaten für die Herunterregulierung des IL-1β-Signalwegs. Nach IL-1β-Stimulation kolokalisiert TNIP1 mit allen Myddosomen-Proteinen sowie mit der Deubiquitinase Tnfaip3. Mittels CRISPR/Cas9 erzeugte ich eine TNIP1-KO-EL4 Zelllinie. Nach IL-1β Stimulation zeigten TNIP1-KO-Zellen vermehrt phosphoryliertes p65, aber verringertes phosphoryliertes JNK sowie eine langfristig verringerte IL-2-Sekretion. Daher ist TNIP1 nicht nur an der Herunterregulierung des NF-κB-Signalwegs beteiligt, sondern aktiviert auch den MAPK-Signalweg., Interleukin 1β (IL-1β)-mediated signal transduction is crucial for acute inflammation, but at the same time needs tight regulation. The IL-1β-mediated signal transduction is encoded by the spatial and temporal dynamics of downstream signaling networks. How does the intracellular IL-1β signaling network efficiently convert the extracellular detection of IL-1β into a precise and proportionate cellular response? What control mechanisms apply in order to ensure a proportionate response and pre- vent a hypo- or hyper response? This study characterizes the IL-1β mediated signaling dynamics using immunoprecipitation purification mass spectrometry (IP-MS). specifically, of MyD88, IRAK4, and IRAK1. Statistical analyses identified the interactome of these proteins after 15-, 30-, and 60-minute of IL-1β stimulation, as well as proteins potentially involved in IL-1β signaling downregulation using pathway annotation analysis. Further, in order to understand how the IL-1β signaling network affects the translational machinery in EL4 cells to ensure a proportionate response, , I investigated IL-1β-dependent protein turnover in EL4 cells. Specifically, I applied pulsed stable isotope labeling by amino acids in the culture (pSILAC) combined with azidohomoalanine (AHA)-click chemistry and MS after 30-, 60-, 120- and 240-min of IL-1β stimulation. The result of these proteomics approaches was the identification of TNFα induced protein 3 (Tnfaip3) interacting protein 1 (TNIP1) as a potential candidate in IL-1β signal downregulation. TNIP1 co-localizes with all myddosome proteins and the deubiquitinase Tnfaip3 after IL-1β stimulation. I generated a TNIP1 KO EL4 cell line using CRISPR/Cas9. After IL-1β stimulation, TNIP1 KO cells show increased levels of phosphorylated p65, but decreased levels of phosphorylated JNK as well as decreased levels of long-term IL-2 secretion. Therefore, TNIP1 is not only involved in downregulatory NF-κB signaling but activates MAPK pathway.

Biofilme sind Zusammenschlüsse von Mikroorganismen, die eingebettet in einer selbstproduzierten Matrix vor äußeren Umwelteinflüssen geschützt sind und eine erhöhte Toleranz gegenüber Antiinfektiva aufweisen. Im Bereich der Humanmedizin werden 65-80 % aller bakteriellen Infektionen mit Biofilmen assoziiert. Problematisch ist die fehlende Biofilmanalytik in der Routinediagnostik, die auch von der Europäischen Gesellschaft für klinische Mikrobiologie und Infektionskrankheiten gefordert wird. So fehlen standardisierte Methoden für den mikroskopischen Nachweis einer Biofilm-assoziierten Infektion, die in situ Quantifizierung von Bakterien auf Implantaten und die Prüfung der Antibiotikaempfindlichkeit von Bakterien in Biofilmen. Mit den in dieser Arbeit etablierten Methoden wurden diese verschiedenen Schwerpunkte im Bereich der bakteriellen Biofilmanalytik beleuchtet. Basierend auf der an der Hochschule Lausitz entwickelten VideoScan-Technologie wurden fluoreszenzmikroskopische Methoden für die Untersuchung von Biofilmen entwickelt. Es wurde ein Modul geschaffen, welches qualitative und quantitative Aussagen über die allgemeine Fähigkeit von Bakterien zur Biofilmbildung treffen kann. Mit Anwendung dieser Methode konnte der Zusammenhang zwischen den genotypischen und phänotypischen Merkmalen von 187 klinischen E. coli-Isolaten und deren Biofilmbildung untersucht werden. Ein weiteres Modul erlaubte die Untersuchung der mit E. coli besiedelten Materialien Glas, Stahl und Titan. Insgesamt 44 Materialstücke (Coupons) wurden auf die Anzahl adhärenter Bakterien, die besiedelte Fläche und die maximal gebildete Biofilmdicke untersucht. Das dritte und letzte Modul fand Anwendung in der Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von S. aureus während der Biofilmbildung und unterschiedlich reifer S. aureus-Biofilme. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die etablierte Methode eine umfangreiche Analyse von Biofilmen für verschiedene Fragestellungen ermöglicht., Biofilms are associations of microorganisms embedded in a self-produced matrix that are protected from external environmental influences and exhibit increased tolerance to anti-infectives. In human medicine, 65-80% of all bacterial infections are associated with biofilms. The lack of biofilm analysis in routine diagnostics, which is also demanded by the European Society for Clinical Microbiology and Infectious Diseases, is problematic. There is a lack of standardized methods for microscopic detection of biofilm-associated infection, in situ quantification of bacteria on implants, and testing of antibiotic susceptibility of bacteria in biofilms. With the methods established in this work, these different focus areas in the field of bacterial biofilm analysis were regarded. Based on the VideoScan technology developed at the Lausitz University of Applied Sciences, fluorescence microscopic methods for the investigation of biofilms were developed. A module for qualitative and quantitative analysis of the general ability of bacteria to form biofilms was developed. Using this method, the relationship between the genotypic and phenotypic characteristics of 187 clinical E. coli isolates and their biofilm formation could be studied. Another module allowed the study of E. coli colonized materials glass, steel and titanium. A total of 44 pieces of material (coupons) were examined for the number of adherent bacteria, the colonized area and the maximum biofilm thickness. The third and final module was used to investigate the antibiotic sensitivity of S. aureus during biofilm formation and differentially mature S. aureus biofilms. Within this work it could be shown that the established method allows a comprehensive analysis of biofilms for different questions.

Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes. They play a fundamental role in hemostasis, but there is rising evidence that they are also involved in immunological processes. Despite absence of a nucleus, human platelets are capable of de novo protein synthesis and contain a fully functional proteasome system, which is, in nucleated cells, involved in processes like cell cycle progression or apoptosis by its ability of protein degradation. The physiological significance of the proteasome system in human platelets is not yet fully understood and subject of ongoing research. Therefore, this study was conducted with the intention to outline the role of the proteasome system for functional characteristics of human platelets. For experimentation, citrated whole blood from healthy donors was obtained and preincubated with proteasome inhibitors. In addition to the commonly used bortezomib, the potent and selective proteasome inhibitor carfilzomib was selected as a second inhibitor to rule out agent-specific effects and to confirm that observed changes are related to proteasome inhibition. Irreversibly induced platelet activation and aggregation were not affected by proteasome blockade with bortezomib up to 24 hours. Conversely, proteasome inhibition led to enhanced threshold aggregation and agglutination up to 25 %, accompanied by partial alleviation of induced VASP phosphorylation of approximately 10-15 %. Expression of different receptors were almost unaffected. Instead, a significant increase of PP2A activity was observable in platelets after proteasome blockade, accompanied by facilitated platelet adhesion to coated surfaces in static experiments or flow chamber experiments. Carfilzomib, used for the first time in functional experimentation with human platelets in vitro, led to a dose-dependent decrease of proteasome activity with accumulation of poly ubiquitylated proteins. Like bortezomib, carfilzomib treatment resulted in enhanced threshold aggregation with attenuated VASP phosphorylation. As the main conclusion of this thesis, proteasome inhibition enhances the responsiveness of human platelets, provided by an alleviation of platelet inhibitory pathways and by an additional increase of PP2A activity, resulting in facilitated platelet adhesion under static and flow conditions. The proteasome system appears to be involved in the promotion of inhibitory counterregulation in platelets. The potential of proteasome inhibitors for triggering thromboembolic adverse events in patients must be clarified in further studies, in addition to their possible use for targeting platelet function to improve the hemostatic reactivity of platelets., Thrombozyten sind kernlose Zellfragmente, welche aus Megakaryozyten gebildet werden. Sie spielen eine fundamentale Rolle in der Hämostase, aber es gibt immer mehr Hinweise, dass Thrombozyten auch in immunologischen Prozessen involviert sind. Trotz Fehlen eines Zellkerns haben humane Thrombozyten die Fähigkeit zur de novo Proteinsynthese und besitzen außerdem ein voll funktionstüchtiges Proteasomsystem, welches in kernhaltigen Zellen über den Proteinabbau an Prozessen wie dem Fortschreiten des Zellzyklus oder der Apoptose beteiligt ist. Die physiologische Bedeutung des Proteasomsystems in humanen Thrombozyten ist nicht vollständig geklärt und ist aus diesem Grund Gegenstand aktueller Forschung. Daher war es Ziel dieser Studie, die Rolle des Proteasomsystems für die funktionellen Eigenschaften humaner Thrombozyten zu erforschen. Für die Experimente wurde Citrat-Vollblut von gesunden Spendern gewonnen und mit Proteasom-Hemmstoffen vorinkubiert. Es wurde neben dem gängigen Bortezomib der potente und selektive Proteasom-Inhibitor Carfilzomib als zweiter Inhibitor eingesetzt, um substanzspezifische Effekte auszuschließen und zu bestätigen, dass die beobachteten Veränderungen auf der Proteasom-Inhibition beruhen. Die irreversibel induzierte Thrombozytenaktivierung und -aggregation wurde durch die Hemmung des Proteasoms mit Bortezomib bis zu 24 Stunden nicht beeinflusst. Allerdings führte die Proteasom-Hemmung zu einer verstärkten Schwellenwertaggregation und -agglutination um bis zu 25 % sowie zu einer partiellen Abschwächung der induzierten VASP-Phosphorylierung um etwa 10-15 %. Die Expression verschiedener Rezeptoren blieb nahezu unbeeinflusst. Stattdessen konnte unter Proteasom-Inhibition eine erhöhte Enzymaktivität der PP2A beobachtet werden, begleitet von einer erleichterten Thrombozytenadhäsion an beschichteten Oberflächen bei statischen Versuchen ober bei Flusskammerversuchen. Carfilzomib, welches erstmals für funktionelle Experimente mit menschlichen Thrombozyten in vitro eingesetzt wurde, führte zu einer dosisabhängigen Abnahme der Proteasom-Aktivität mit einer Akkumulation von poly ubiquitylierten Proteinen. Wie Bortezomib mündete die Behandlung mit Carfilzomib in einer verstärkten Schwellenwertaggregation und abgeschwächter VASP-Phosphorylierung. Die wichtigste Schlussfolgerung dieser Arbeit ist, dass die Inhibition des Proteasoms die Reaktivität humaner Thrombozyten erhöht, gekennzeichnet durch eine Abschwächung der hemmenden Signalwege der Thrombozyten und durch eine zusätzliche Erhöhung der PP2A-Enzymaktivität, was zu einer erleichterten Thrombozytenadhäsion unter statischen Verhältnissen und unter Flussbedingungen führt. Das Proteasomsystem scheint an der Förderung der hemmenden Gegenregulation in Thrombozyten beteiligt zu sein. Das Potenzial von Proteasom Inhibitoren, thromboembolische Nebenwirkungen bei Patienten auszulösen, muss in weiteren Studien geklärt werden, ebenso wie ihr möglicher Einsatz für die gezielte Beeinflussung der Thrombozytenfunktion zur Verbesserung der hämostatischen Reaktivität der Thrombozyten.

Strumpellin is a member of the highly conserved pentameric WASH complex, which stimulates the Arp2/3 complex on endosomes and induces the formation of a branched actin network. The WASH complex is involved in the formation and stabilisation of endosomal retrieval subdomains and transport carriers, into which selected proteins are packaged and subsequently transported to their respective cellular destination, e.g. the plasma membrane. Up until now, the role of Strumpellin in platelet function and endosomal trafficking has not been researched. In order to examine its role, a conditional knockout mouse line was generated, which specifically lacked Strumpellin in megakaryocytes and platelets. Conditional knockout of Strumpellin resulted in only a mild platelet phenotype. Loss of Strumpellin led to a decreased abundance of the αIIbβ3 integrin in platelets, including a reduced αIIbβ3 surface expression by approximately 20% and an impaired αIIbβ3 activation after platelet activation. The reduced surface expression of αIIbβ3 was also detected in megakaryocytes. The expression of other platelet surface glycoproteins was not affected. Platelet count, size and morphology remained unaltered. The reduction of αIIbβ3 expression in platelets resulted in a reduced fibrinogen binding capacity after platelet activation. However, fibrinogen uptake under resting conditions, although slightly delayed, as well as overall fibrinogen content in Strumpellin-deficient platelets were comparable to controls. Most notably, reduced αIIbβ3 expression did not lead to any platelet spreading and aggregation defects in vitro. Furthermore, reduced WASH1 protein levels were detected in the absence of Strumpellin. In conclusion, loss of Strumpellin does not impair platelet function, at least not in vitro. However, the data demonstrates that Strumpellin plays a role in selectively regulating αIIbβ3 surface expression. As a member of the WASH complex, Strumpellin may regulate αIIbβ3 recycling back to the platelet surface. Furthermore, residual WASH complex subunits may still assemble and partially function in the absence of Strumpellin, which could explain the only 20% decrease in αIIbβ3 surface expression. Nonetheless, the exact mechanism still remains unclear., Strumpellin ist Teil des hoch konservierten, pentameren WASH-Komplexes, der den Arp2/3-Komplex auf Endosomen aktiviert und somit die Bildung eines verzweigten Aktinnetzwerkes ermöglicht. Der WASH-Komplex beteiligt sich an der Bildung und Sta-bilisierung von endosomalen Retrieval-Subdomänen und Transportvesikel. In letztere werden Proteine verpackt und anschließend zu ihrem Bestimmungsort innerhalb der Zelle, z.B. der Zellmembran, transportiert. Die Rolle von Strumpellin in der Thrombozytenfunktion und im endosomalen Transport wurde bislang noch nicht untersucht. Hierfür wurde eine konditionale Knockout-Mauslinie generiert, die weder in Megakaryozyten noch in Thrombozyten Strumpellin aufwies. Der konditionale Knockout von Strumpellin hatte nur einen milden Thrombozytenphänotyp zur Folge. Der Verlust von Strumpellin resultierte in einem verminderten Gesamt-proteingehalt von αIIbβ3-Integrin in Thrombozyten, einschließlich einer ca. 20-prozentigen Reduktion der Oberflächenexpression von αIIbβ3 und einer verringerten αIIbβ3-Aktivierung nach Thrombozytenaktivierung. Die reduzierte Oberflächenexpression von αIIbβ3 konnte auch in Megakaryozyten nachgewiesen werden. Die Expression anderer Oberflächenglykoproteine war nicht betroffen. Thrombozytenzahl, -größe und -morphologie blieben unverändert. Die reduzierte αIIbβ3-Expression in Thrombozyten führte zu einer verminderten Fibrinogenbindungskapazität nach Thrombozytenaktivierung. Die Fibrinogenaufnahme unter ruhenden Bedingungen, trotz initialer Verzögerung, und der Gesamtproteingehalt von Fibrinogen waren hingegen vergleichbar mit Kontrollproben. Interessanterweise verursachte die reduzierte αIIbβ3-Expression keine in vitro Spreading- und Aggregationsdefekte der Thrombozyten. Ein verminderter WASH1-Proteingehalt konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Abschließend lässt sich sagen, dass der Verlust von Strumpellin die Thrombozytenfunktion, zumindest in vitro, nicht beeinträchtigt. Die Daten zeigen jedoch, dass Strumpellin eine selektive Rolle in der Regulierung der αIIbβ3-Oberflächenexpression spielt. Als WASH-Komplexuntereinheit könnte Strumpellin möglicherweise das Recycling von αIIbβ3 zurück zur Thrombozytenoberfläche regulieren. Zudem könnten verbleibende WASH-Komplexuntereinheiten trotz fehlendem Strumpellin weiterhin einen funktions- fähigen Komplex bilden. Dies könnte unter anderem die nur 20-prozentige Reduktion der αIIbβ3 Oberflächenexpression erklären. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch nicht bekannt.

The conversion of many drugs into toxic or less toxic metabolites depends on the first-pass effect of the liver. Toxic metabolites are associated with drug-induced liver injury, often causing liver failure. Thus, therapies often have to be interrupted despite a promising drug effect. The development of an improved drug metabolism model consisting of liver-derived CYP3A4-overexpressing cells and tumour cells should be used to study drugs in vitro for their efficacy on tumour cells considering the first-pass effect. Two different co-culture system approaches were tested (transwell insert-based and liver cell supernatant transfer) with HepG2 CYP3A4 cells, originally derived from a tumor characterized by genetic instability, serving as an in vitro liver cell model for establishment. PANC-1 cells (pancreatic cancer) or MCF-7 cells (breast cancer) were used as prototypical tumour cell lines. For cell treatment, three PANC-1 or MCF-7 active drugs MG-132 (MG), Taxol (TX) and Tamoxifen (TAM), were used as these drugs are inactivated (MG and TX) or activated (TAM) by the liver first-pass effect. Three widely used cytotoxicity assays (XTT-, CellTiter-Glo™ 2.0-, and trypan blue exclusion assay) were used to determine acute cytotoxicity to both liver and tumour cells. For co-culture validation, HepG2 CYP3A4 cells were replaced by CYP3A4-overexpressing immortalized primary-like hepatocytes, the FH3 CYP3A4 cells, representing the human liver cell model more closely. Finally, in a pilot project, primary colon carcinoma cells (pCC-cells) were tested along with HepG2 CYP3A4 and MG. The use of co-cultures with HepG2 CYP3A4 showed, that first-pass metabolism of MG resulted in reduced cytostatic effects in PANC-1 cells. The TX-induced cytotoxic effect on PANC-1 and MCF-7 cell lines is only slightly attenuated by the first-pass effect. Activation of TAM with FH3 CYP3A4 liver cells in indirect co-culture with transwell inserts most efficiently enhanced the cytotoxic effect on MCF-7 cells. In contrast, the use of HepG2 CYP3A4 proved to be insufficient. PCC-cells were affected by MG in MC in a dose-dependent manner. Using co-culture systems with HepG2 CYP3A4 cells, colon cancer cells were clearly protected from MG up to a concentration of 2 μM. In conclusion, first-pass effect could be simulated in vitro in MG- and TX-treated PANC-1 cells and TX-treated MCF-7 cells as well as on MG-treated pCC-cells using HepG2 CYP3A4 cells. Obtained results with PANC-1 and MCF-7 could be validated with FH3 CYP3A4 cells. However, demonstration of the first-pass effect using different end-point measurement methods yielded different results and further studies are needed for definite conclusions., Die Umwandlung vieler Arzneimittel in toxische oder weniger toxische Metabolite hängt vom Leber First-Pass-Effekt ab. Toxische Metabolite werden mit arzneimittelinduzierten Leberschäden assoziiert, die häufig zu Leberversagen führen. Oft müssen Therapien trotz vielversprechender Wirkung unterbrochen werden. Ein Co-Kultur (CC) Modell, bestehend aus CYP3A4-überexprimierenden Leberzellen und Tumorzellen, wurde entwickelt, um die Arzneimittelwirksamkeit auf Tumorzellen in vitro zu untersuchen unter Berücksichtigung des First-Pass-Effekts. HepG2 CYP3A4-Zellen, welche ursprünglich aus einem Tumor stammen, der sich durch genetische Instabilität auszeichnet, dienten als in-vitro-Leberzellmodell zur Etablierung zweier verschiedener CC-Systeme (Transwell-Insert-basiert und Leberzell-Überstand-Transfer). PANC-1-Zellen (Bauchspeicheldrüsenkrebs) oder MCF-7-Zellen (Brustkrebs) wurden als Tumorzelllinien verwendet. Für die Zellbehandlung wurden drei PANC-1- bzw. MCF-7-wirksame Stoffe MG-132 (MG), Taxol (TX) und Tamoxifen (TAM) verwendet, welche durch den First-Pass-Effekt inaktiviert (MG und TX) bzw. aktiviert (TAM) werden. Drei Zytotoxizitätstests (XTT-, CellTiter-Glo™ 2.0- und Trypanblau-Ausschluss-Assay) wurden herangezogen, um die akute Zytotoxizität für Leber- und Tumorzellen zu bestimmen. Zur Validierung der CC wurden HepG2 CYP3A4-Zellen durch CYP3A4-Überexprimierende immortalisierte primäre Hepatozyten, den FH3 CYP3A4-Zellen ersetzt, welche als primäre Zellen das menschliche Leberzellmodell wesentlich besser repräsentieren. In einem Pilotprojekt wurden primäre Kolonkarzinomzellen (pCC-Zellen) zusammen mit HepG2 CYP3A4 und MG getestet. Unter Verwendung einer CC mit HepG2 CYP3A4 konnte eine reduzierte zytostatische Wirkung von MG auf PANC-1-Zellen gezeigt werden. Die TX-induzierte zytotoxische Wirkung auf PANC-1- und MCF-7-Zellen wird durch den First-Pass-Effekt nur leicht abgeschwächt. Die Aktivierung von TAM mit FH3 CYP3A4-Zellen in CC mit Transwell-Einsätzen verstärkte die zytotoxische Wirkung auf MCF-7-Zellen am effizientesten. Im Gegensatz dazu erwies sich die Verwendung von HepG2 CYP3A4 als unzureichend. PCC-Zellen wurden in Monokultur durch MG dosisabhängig beeinträchtigt. Bei Verwendung von CC-Systemen mit HepG2 CYP3A4-Zellen waren pCC-Zellen bis zu einer Konzentration von 2 μM eindeutig vor MG geschützt. Zusammenfassend konnte der First-Pass-Effekt in vitro in MG- und TX-behandelten PANC-1-Zellen und TX-behandelten MCF-7-Zellen sowie in MG-behandelten pCC-Zellen mit HepG2 CYP3A4-Zellen simuliert werden. Die mit PANC-1 und MCF-7 erzielten Ergebnisse konnten mit FH3 CYP3A4-Zellen validiert werden. Der Nachweis des First-Pass-Effektes unter Verwendung verschiedener Endpunkt-Messmethoden ergab unterschiedliche Ergebnisse, so dass für eindeutige Schlussfolgerungen weitere Studien erforderlich sind.

Zink ist ein essentielles Spurenelement (SpE). Bei einem Mangel können schwerwiegende gesundheitliche Auswirkungen auftreten. Aktuellen Schätzungen zufolge sind etwa 20% der weltweiten Bevölkerung von dem Risiko einer Zink-Unterversorgung betroffen, dabei bestehen jedoch geografische Unterschiede. Für die Bevölkerung in Entwicklungs- und Schwellenländern ist das Risiko einer Zink-Unterversorgung wesentlich höher als für die in Industrieländern. In letzteren sind hauptsächlich bestimmte Bevölkerungsgruppen betroffen, darunter alte Personen. In verschiedenen Studien wurde mit zunehmendem Alter eine Abnahme des Gesamtzinkgehaltes des Serums gezeigt. Zur Behandlung eines Zinkmangels bedarf es zunächst einer entsprechenden Diagnose. Bisher etablierte Biomarker sind gut geeignet, um den Zinkstatus von Populationen zu erfassen. Sie weisen jedoch Mängel auf, wenn es um den Zinkstatus von Individuen geht, sodass für diesen Anwendungsbereich weiterhin Forschungsbedarf besteht. In diesem Zusammenhang wurde die freie Zinkkonzentration im Serum als vielversprechender Biomarker erwogen. Als freies Zink wird der Zinkanteil beschrieben, der nicht fest an Proteine gebunden vorliegt, sondern in Wechselwirkung steht mit niedermolekularen Liganden. Es gibt Hinweise darauf, dass das freie Zink den biologisch aktiven Anteil an Zink darstellt, der zur Interaktion mit Zellen zur Verfügung steht. Daher könnte die freie Zinkkonzentration im Serum besser geeignet sein, den Zinkstatus eines Individuums widerzuspiegeln, als die gesamte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher ein Fluoreszenzsonden-basierter Assay zur Bestimmung der freien Zinkkonzentration in humanen und murinen Serumproben etabliert. Die freie Zinkkonzentration der untersuchten Serumproben lag im piko- bis nanomolaren Bereich. In den Seren der verschiedenen untersuchten Probengruppen zeigte sich zwischen der freien und der gesamten Zinkkonzentration kein linearer Zusammenhang oder nur ein schwach linearer. In mehreren Probengruppen war die freie Zinkkonzentration der Seren von Frauen bzw. weiblichen Mäusen signifikant niedriger, als die der Seren von Männern bzw. männlichen Mäusen. Beim Gesamtzinkgehalt der Serumproben trat hingegen kein geschlechtsspezifischer Unterschied auf. Die ermittelten Daten deuten darauf hin, dass es sich bei der freien Zinkkonzentration im Serum um einen Parameter handelt, der unabhängig ist vom Gesamtzinkgehalt im Serum. Anhand der bisherigen Daten kann jedoch noch keine Aussage darüber getroffen werden, ob die freie Zinkkonzentration im Serum als Biomarker geeignet ist den Zinkstatus von Individuen widerzuspiegeln. Dennoch scheint es vielversprechend, diesen Parameter sowohl hinsichtlich seiner Eignung als Biomarker, als auch seiner physiologischen Relevanz weiterführend zu untersuchen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Proben einer Fütterungsstudie mit Mäusen analysiert. Ziel der Studie war es, den Einfluss der SpE-Versorgung auf altersbedingte Veränderungen der SpE-Homöostase und SpE-abhängiger physiologischer Prozesse zu untersuchen. Hierfür erhielten erwachsene und alte Mäuse entweder eine adäquate SpE Versorgung, oder eine, die für mehrere SpE gleichzeitig (Zink, Selen, Kupfer, Eisen) suboptimal war, oder eine altersadaptierte, die einen erhöhten Gehalt an Zink und Selen aufwies. Mit letzterer sollte untersucht werden, ob altersbedingten Veränderungen entgegengewirkt werden kann, indem eine erhöhte Versorgung mit den SpE erfolgt, deren Gehalt im Serum mit zunehmendem Alter abnimmt. Als ein zentrales Organ der Zink Homöostase wurde die Leber untersucht. Dafür wurde ein Fluoreszenzsonden-basierter Assay zur Bestimmung der freien Zinkkonzentration in homogenisierten murinen Lebergewebeproben etabliert. Die damit ermittelten Daten zeigen, dass die freie Zinkkonzentration im Lebergewebe tendenziell die Zink-Versorgung der Mäuse widerspiegelt und die freie Zinkkonzentration im Lebergewebe weiblicher Mäuse signifikant höher ist als die im Lebergewebe männlicher. Beim Gesamtzinkgehalt des Lebergewebes traten keine derartigen Effekte der Zink-Versorgung oder des Geschlechts auf. Das Alter der Mäuse hatte keinen Einfluss auf die freie Zinkkonzentration im Lebergewebe. Die Funktionsfähigkeit des Immunsystems ist von Zink abhängig und unterliegt zudem altersbedingten Veränderungen. Als Bestandteil des Immunsystems wurden daher isolierte Splenozyten untersucht. Es wurde der prozentuale Anteil an B-Zellen, T Helferzellen, zytotoxischen T-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen an den isolierten Splenozyten bestimmt, die zelluläre freie Zinkkonzentration der verschiedenen Zelltypen, sowie der relative Gehalt der pro- bzw. anti-inflammatorischen Zytokine Interleukin (IL) 2, IL-10, IL 17, Interferon-γ und Tumornekrosefaktor-α im Überstand nach Stimulation mit Phytohämaglutinin (PHA). Es zeigte sich altersbedingt eine Abnahme des Anteils an T Helferzellen, ein Anstieg des Anteils an dendritischen Zellen, eine Abnahme der zellulären freien Zinkkonzentration von B-Zellen und dendritischen Zellen sowie eine Zunahme des relativen IL-10 Gehaltes im Überstand nach Stimulation der isolierten Splenozyten mit PHA. Die altersadaptierte SpE Versorgung, mit einem erhöhten Zink- und Selengehalt, hat diesen beobachteten altersbedingten Veränderungen des Immunsystems nicht entgegengewirkt. Dies deutet darauf hin, dass die zugrunde liegenden Mechanismen nicht durch eine erhöhte ernährungsbedingte Zink- und Selenzufuhr moduliert werden können., Zinc is an essential trace element (TE). Insufficient supply can lead to severe health effects. According to current estimations, about 20% of the world’s population are at risk of an insufficient zinc supply. Thereby geographic differences occur. In developing countries and emerging countries the population is at substantially higher risk of zinc deficiency, compared to industrial countries. In the latter, mostly people from specific population groups are at risk. Among them are elderly people, as studies have shown a decrease in the total zinc concentration of the serum with increasing age. To treat zinc deficiency, it hast to be diagnosed first. Biomarkers established so far are well suited to evaluate the zinc status of populations. However, they have their limitations when it comes to individuals. A good biomarker for this application area is still missing. In this context, the serum free zinc concentration has been suggested as a possible biomarker for the zinc status of individuals. The term free zinc describes the zinc pool that is loosely bound to low molecular weight fractions. Data in the literature implictates that free zinc represents the zinc that is biologically active and available for interaction with cells. Hence, the serum free zinc concentration might be a better parameter to reflect an individual’s zinc status than the total zinc concentration. Therefore, in the present work a fluorescent-probe based assay was established for determining the free zinc concentration in human and murine serum samples. The determined free zinc concentrations of the analyzed serum samples were in the pico- to nanomolar range. The free and total zinc concentrations in the sera of the different sample-groups analyzed either showed no linear correlation or a weak linear correlation. In several sample-groups analyzed, the free zinc concentration in sera from females was significantly lower than in sera from males. The data obtained support the meaning of the serum free zinc concentration as an independent parameter besides the total zinc concentration. However, based on the current data it cannot be evaluated yet, if the free zinc concentration in serum is a well-suited biomarker for an individual’s zinc status. Still it seems promising to further investigate this parameter, with regard to its suitability as a biomarker as well as its physiological relevance. In the context of the present work, samples from a feeding study with mice were analyzed. The aim of the study was to investigate the influence of TE-supply on age-related alterations in TE-homeostasis and TE-dependent physiological processes. Adult and old mice were treated with a TE-supply either adequate, suboptimal in several TEs (zinc, selenium, copper, iron) simultaneously or age-adjusted. The latter had an elevated content of zinc and selenium and aimed to investigate, whether age-related alterations can be prevented by an elevated supply of TEs, whose serum concentration decreases with increasing age. As a central organ of the body’s zinc-homeostasis, the liver was examined. For this, a fluorescent-probe based assay was established for determining the free zinc concentration in homogenized murine liver tissue. A tendency of the free zinc concentration in the liver tissue to reflect the zinc-supply of the mice was shown. In addition, the free zinc concentration in liver tissue samples from female mice was significantly higher than in samples from male mice. The total zinc content of the liver tissue showed no such effects of zinc supply or sex. The age of the mice did not affect the free zinc concentration of the liver tissue. The functionality of the immune system is dependent on zinc, in addition shows age-related alteration. Therefore, as part of the immune system, isolated splenocytes were examined. The percentage of B-cells, T helper cells, cytotoxic T-cells, macrophages and dendritic cells was determined, as well as the respective cellular free zinc concentration and the relative content of several pro- and anti-inflammatory cytokines (interleukin (IL)-2, IL-10, IL-17, interferon-γ and tumor necrosis factor α) in the supernatant after stimulation with phytohaemagglutinin (PHA). A decrease in the percentage of T-helper cells, an increase in percentage of dendritic cells, a decrease in the cellular free zinc concentration of B-cells and dendritic cells as well as an increase in relative IL-10 content in the supernatant after stimulation with PHA was shown in relation to age. The age-adjusted TE-supply showed no effect on these age-related alterations of the immune system. This implicates that the underlying mechanisms are not modulated by an enhanced nutritional supply of zinc and selenium.

This decade saw the development of new high-end light microscopy approaches. These technologies are increasingly used to expand our understanding of cellular function and the molecular mechanisms of life and disease. The precision of state-of-the-art super resolution microscopy is limited by the properties of the applied fluorescent label. Here I describe the synthesis and evaluation of new functional fluorescent probes that specifically stain gephyrin, universal marker of the neuronal inhibitory post-synapse. Selected probe precursor peptides were synthesised using solid phase peptide synthesis and conjugated with selected super resolution capable fluorescent dyes. Identity and purity were defined using chromatography and mass spectrometric methods. To probe the target specificity of the resulting probe variants in cellular context, a high-throughput assay was established. The established semi-automated and parallel workflow was used for the evaluation of three selected probes by defining their co-localization with the expressed fluorescent target protein. My work provided NN1Dc and established the probe as a visualisation tool for essentially background-free visualisation of the synaptic marker protein gephyrin in a cellular context. Furthermore, NN1DA became part of a toolbox for studying the inhibitory synapse ultrastructure and brain connectivity and turned out useful for the development of a label-free, high-throughput protein interaction quantification assay., Neuentwickelte, hochauflösende Fluoreszenzmikroskopieverfahren sind prinzipiell geeignet, molekulare Mechanismen und zelluläre Vorgänge im niedrigen Nanometerbereich aufzulösen. Die maximal erreichbare Auflösung wird unter anderem von der eingesetzten Fluoreszenzmarkierung beeinflusst. In dieser Arbeit beschreibe ich die Synthese neuartiger, funktioneller, fluoreszierender Proben und evaluiere deren Eigenschaft Gephyrin, einen universalen Marker der neuronalen inhibitorischen Postsynapse, zu visualisieren. Hierzu wurden Peptide mittels Festphasenpeptidsyntese hergestellt und mit fluoreszierenden Farbstoffen konjugiert, die für hochauflösende Mikroskopieverfahren geeignet sind. Der Syntheseerfolg und die Reinheit der Stoffe wurde mittels massenspektrometrischer und chromatographischer Methoden bestimmt. In einem Hochdurchsatzverfahren wurden die Proben in einem zellulären Kontext untersucht, spezifisch Gephyrin zu markieren. In einem semi-automatisierten, parallelen Verfahren wurden drei ausgewählte Proben synthetisiert und deren Kolokalisation mit dem fluoreszierenden Zielprotein in transfizierten HEK-Zellen untersucht. Aus dieser Arbeit ist NN1DC hervorgegangen, eine peptidische Sonde zur Visualisierung von Gephyrin. Diese Probe weist verbesserte Färbeeigenschaften wie eine höhere Spezifität und Sensitivität, verglichen mit bisher bekannten peptidischen Gephyrinsonden, auf. Darüber hinaus kann NN1DA als hochaffiner Binder von Gephyrin zur Entwicklung neuer gephyrinbindender Moleküle in einem high-througput Verfahren genutzt werden.

Mitochondria are cellular organelles that fulfil a number of essential biological roles, including the production of cellular useable energy (in form of adenosine triphosphate, ATP) and the biosynthesis of other crucial macromolecules. These fundamental molecular processes are orchestrated by a multitude of approximately 1,500 mitochondrial proteins and their dynamic interactions, described as interactome. Analysing the interactome of proteins within a living cell sheds light on life at a molecular basis, explains how interactions adapt to changes and illuminates how protein-protein interactions are malfunctioning in diseases. Mitochondria are closely associated to various diseases; however, the lack of protein identification and structural information makes it challenging to grasp the full potential of their interactome for an integrated understanding of mitochondrial functions. This has led to the development of many bioanalytical methods to determine the three-dimensional structure of proteins, assessing their functions and finally analysing their interactome. Crosslinking mass spectrometry (CLMS) is a comparatively new tool that generates in situ structural information and allows protein-protein interaction analysis on a proteome-wide level. This is done by introducing crosslinkers that covalently connect amino acids in spatial proximity to each other. After crosslinking, the proteins are proteolytically digested and the resulting peptides are analysed by mass spectrometry. The CLMS method has a large impact on traditional structural biological applications due to its scalability to analyse also large protein complexes and their protein-protein interactions networks in their native environment. The complexity of the biological systems that have been subjected to in situ CLMS has increased with the depth of analysis and the development of enrichable and MS-cleavable cross-linkers nowadays. On the way to in vivo crosslinking, cellular organelles like mitochondria, or virus or intact cells are subjected to proteome-wide CLMS analysis. However, the detection and identification of underrepresented crosslinked peptides still presents the major analytical and computational challenge in large-scale CLMS studies. To address this challenge first, crosslinked peptides using a non-cleavable (disuccinimidyl suberate, DSS) and a MS-cleavable crosslinker (disuccinimidyl sulfoxide, DSSO) in human mitochondria, were enriched experimentally by multidimensional fractionation, sequential digestion and targeted LC-MS/MS acquisition methods. Second, the challenge of structural data interpretation was approached by using high-throughput comparative modelling, analyzing long-distance crosslinks in a systematic way and ultimately revealing structural insights into in situ protein dynamics. Third, the computational challenge of data analysis, as all possible combinations of peptide pairs resulting from their digestion have to be examined during database search, was tackled by the development of a novel iterative search approach. Usually, exclusively high abundant proteins are included in the database of large-scale CLMS studies, but this does not necessarily represent the ideal database for crosslink identification. Proteins that are absent or crosslinked at an underrepresented rate will add noise to the database and diminish crosslink identification. Finally, yet important, the investigation of a novel iterative search strategy based on an optimization of the database used for crosslink identification, addressed the challenge of identifying the minority of crosslinks between proteins and yielded in novel insights into protein-protein interactions in human mitochondria., Mitochondrien sind zelluläre Organellen, die eine Vielzahl an essentiellen biologischen Funktionen erfüllen, welche die Produktion von zellulär nutzbarer Energie (in Form von Adenosinetriphosphat, kurz ATP) und die Biosynthese anderer wichtiger Markomoleküle beinhalten. Diese fundamentalen, molekularen Prozesse sind inszeniert von einer Fülle von schätzungsweise 1500 mitochondrialen Proteinen und deren dynamischen Interaktionen, welche als Interaktom beschrieben werden. Die Analyse des proteinären Interaktoms in lebenden Zellen offenbart Einblicke, wie Leben auf molekularer Basis funktioniert, erläutert wie sich Interaktionen auf umgebende Änderungen anpassen und beleuchtet wie Protein-Protein-Interaktionen im Fall von Krankheiten gestört sind. Besonders Mitochondrien sind eng mit verschiedensten Krankheitsbildern assoziiert. Die Ermangelung an Proteinidentifikation und strukturellen Informationen zu mitochondrialen Proteinen stellt eine Herausforderung dar, das volle Potential des Interaktoms für das ganzheitliche Verständnis der mitochondrialen Funktionen ausschöpfen zu können. Das hat zu der Entwicklung von verschiedenen, bioanalytischen Methoden geführt, die zur Bestimmung der dreidimensionalen Proteinstruktur, zur Untersuchung der Proteinfunktionen und schlussendlich zur Analyse des Interaktoms beitragen. Quervernetzende Massensprektrometrie (crosslinking mass spectrometry, kurz CLMS) ist ein vergleichsweise neuartiges Werkzeug, welches in situ strukturelle Informationen generiert und die Protein-Protein-Interaktionsanalyse auf einem Proteom-weiten Level ermöglicht. Dies geschieht durch die Verwendung von chemischen Quervernetzern (sogenannten Crosslinkern), welche räumlich naheliegende Aminosäuren kovalent miteinander verbinden. Nach dem chemischen Verbinden werden die Proteine proteolytisch verdaut und die resultierenden Peptide werden mittels Massenspektrometrie analysiert. Die CLMS-Methode hat einen starken Einfluss auf traditionelle, strukturbiologische Anwendungen aufgrund ihrer Skalierbarkeit sogar große Proteinkomplexe und deren Protein-Protein-Interaktionen in ihrer natürlichen Umgebung zu analysieren. Die Komplexität der biologischen Systeme, die bereits in situ CLMS-Untersuchungen unterzogen wurden, steigt heutzutage stetig mit der verbesserten, analytischen Tiefe und der Entwicklung von anreicherbaren sowie massen-spektrometrisch-spaltbaren Crosslinkern an. Auf dem Weg zur Untersuchung in lebenden Organismen (in vivo Crosslinking) wurden bereits zelluläre Organellen wie Mitochondrien, oder Viren oder sogar intakte Zellen einer Proteom-weiten CLMS-Analyse unterzogen. Dennoch stellt die Detektion und Identifikation von unterrepräsentierten, querverbundenen Peptiden in großangelegten CLMS-Analysen immer noch die hauptsächliche, analytische sowie rechengestützte Herausforderung dar. Diese Herausforderung wird erstens adressiert, indem die verbundenen Peptide, aus der Reaktion mit einem nicht-spaltbaren (disuccinimidyl suberate, DSS) sowie einem massenspektrometrisch-spaltbaren Crosslinker (disuccinimidyl sulfoxide, DSSO) in menschlichen Mitochondrien, experimentell angereichert werden. Dies geschieht mit Hilfe einer multidimensionalen Fraktionierung und eines sequentiellen, proteolytischen Verdaus, in Verbindung mit gezielten massenspektrometrischen Akquisemethoden. Zweitens wird die Herausforderung der strukturellen Dateninterpration durch vergleichende (komparative) Modellierung im Hochdurchsatzverfahren angegangen, was die systematische Analyse von Crosslinks mit unnatürlich langen Distanzen ermöglicht und neue, strukturelle Erkenntnisse zu in situ Proteindynamiken liefert. Drittens wird die Herausforderung der rechenbetonten Datenanalyse durch die Entwicklung einer neuartigen, sich wiederholenden (iterativen) Suchstrategie adressiert. Bei der Datenanalyse müssen alle denkbaren Kombinationen von Peptidepaaren, die sich aus dem proteolytischem Verdau ergeben, in der Protein-Datenbank berücksichtigt werden. Normalerweise werden hierfür ausschließlich hochabundante Proteine in die Datenbank-Suche inkludiert, jedoch stellen diese nicht zwangsläufig die bestmögliche Datenbank für die Identifikation von Crosslinks dar. Proteine, die nicht oder nur zu einem unterrepräsentativen Anteil quervernetzt wurden, fügen der Datenbank ein unnötiges Hintergrundrauschen hinzu und vermindert so die Identifikation von Crosslinks. Schlussendlich ist die Entwicklung der neuartigen, iterativen Suchstrategie, basierend auf der Optimierung der Datenbank zur Crosslink-Identifikation, von Bedeutung, weil diese sich der Herausforderung stellt, die Minderheit der Crosslinks zwischen unterschiedlichen Proteinen zu identifizieren. Dies führte letztendlich zu neuen Einblicken in die Protein-Protein-Interaktion in humanen Mitochondrien.

Lanthipeptide sind ribosomal exprimierte und posttranslational modifizierte Peptide (RIPPs), deren verbindendes Strukturmotiv spezielle intramolekulare Thioetherbrücken darstellen, die (Methyl-)Lanthionin und (Methyl-)Labionin genannt werden. Abhängig von Aufbau und Struktur der Synthetasen werden Lanthipeptide in vier Klassen eingeteilt. Während die mono- und bifunktionalen Synthetasen der Klassen I und II weitestgehend charakterisiert sind, ist über Struktur und Mechanismus der trifunktionalen Synthetasen der Klassen III und IV bisher kaum etwas bekannt. Curvocidin ist ein neuartiges Klasse IV-Lanthipeptid, das von dem extremophilen Bakterium Thermomonospora curvata gebildet wird. Es ist mit einer Länge von 21 Aminosäuren und drei Methyl-Lanthioninbrücken ein relativ kleines Lanthipeptid mit einer verhältnismäßig geringen Zahl an posttranslationalen Modifikationen. Auch das Gencluster ist mit nur fünf Genen relativ klein. Aus diesen Gründen eignet sich das System Curvocidin hervorragend als Modell für die intensive Untersuchung der trifunktionalen Synthetasen der Klasse III und IV. Durch Klonierung und Aufreinigung der rekombinanten Curvocidin-Synthetase und deren Substrat, dem rekombinanten Curvocidin Vorläufer-Peptid, konnte die Funktion des Enzyms in vitro analysiert werden. Ausgehend von den Ergebnissen wurde ein Modell erstellt, das den iterativen Syntheseprozess der drei Methyl-Lanthioninbrücken abbildet. Darüber hinaus konnten spezifische Aminosäuren in der Synthetase-Primärstruktur identifiziert werden, die eine essentielle Rolle bei der Katalyse einnehmen. Für ein eingehendes Verständnis der Enzymfunktion ist ein detailliertes Strukturmodell erforderlich. Bisher ist keine Struktur einer trifunktionalen Lanthionin-Synthetase bekannt. Durch umfangreiche Optimierungen konnten große Mengen an hochreiner Curvocidin-Synthetase aufgereinigt werden. Damit wurden durch Hochdurchsatz-Testierungs-Methoden (screening) die besten Bedingungen für eine Kristallisation des Enzyms ermittelt. Mithilfe der Röntgen-Proteinkristallographie konnte das erste Strukturmodell einer trifunktionalen Lanthionin-Synthetase erstellt werden. Trotz Cokristallisation sind Substrat, Cofaktoren und Mg(2+)- wie auch Zn(2+)-Ionen nicht in der Elektronendichtekarte sichtbar., Lanthipeptides are ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) that contain specific intramolecular thioether bridges called (methyl-)lanthionine or (methyl)labionin. These modifications are formed by specific lanthionine-synthetases which are categorized into four distinct classes depending on their organization and structure. The mono- and bifunctional synthetases of classes I and II are largely characterized. However, there is little known about the structure and mechanism of the lanthionine-synthetases of classes III and IV. Curvocidine is a novel class IV lanthipeptide produced by the extremophile bacterium Thermomonospora curvata. It comprises 21 amino acids and three methyllanthionine bridges, therefore representing a relatively small lanthipeptide with a low degree of post-translational modification. Also the gene cluster consisting of only five genes is relatively small. Thus, the Curvocidine system is well suited to serve as a model for an intensive study of class III and IV lanthionine-synthetases. By means of cloning and isolating recombinant Curvocidine synthetase and the respective substrate, recombinant Curvocidine precursor peptide, we were able to analyse the enzyme function in vitro. Based on these results a model is proposed illustrating an iterative synthesis process. Moreover, specific amino acids in the synthetase sequence were identified that are crucial to the catalytic function. A more sophisticated insight into the enzyme’s catalytic mechanism requires a detailled structure model. As of yet there is no such structure of a trifunctional lanthionine-synthetase available. By means of extensive optimization a large quantity of highly pure protein was isolated and used for screening for optimal cristallization conditions. Using X-ray protein cristallography we were able to achieve the first structure model of a trifunctional lanthionin-synthetase. Despite efforts of co-cristallization, the substrate, co-factors as well as Mg(2+)-and Zn(2+)-ions are not visible in the electron density map.

RNA helicases are key players in the regulation of gene expression. They act by remodeling local RNA secondary structures as well as RNA-protein interactions to enable the dynamic association of RNA binding proteins to their targets. The putative RNA helicase DHX30 is a member of the family of DEAH-box helicases with a putative role in the ATP-dependent unwinding of RNA secondary structures. Mutations in the DHX30 gene causes the autosomal dominant neuronal disease “Neurodevelopmental Disorder with severe Motor Impairment and Absent Language” (NEDMIAL;OMIM#617804). In this thesis, a strategy was established that enabled the large-scale purification of enzymatically active DHX30. Through enzymatic studies performed in vitro, DHX30 was shown to act as an ATP-dependent 3’ → 5’ RNA helicase that catalyzes the unwinding of RNA:RNA and RNA:DNA substrates. Using recombinant DHX30, it could be shown that disease-causing missense mutations in the conserved helicase core caused the disruption of its ATPase and helicase activity. The protein interactome of DHX30 however, was unchanged indicating that the pathogenic missense-mutations do not cause misfolding of DHX30, but rather specifically affect its catalytic activity. DHX30 localizes predominantly in the cytoplasm where it forms a complex with ribosomes and polysomes. Using a cross-linking mass spectrometry approach, a direct interaction of the N-terminal double strand RNA binding domain of DHX30 with sites next to the ribosome’s mRNA entry channel and the subunit interface was uncovered. RNA sequencing of DHX30 knockout cells revealed a strong de-regulation of mRNAs involved in neurogenesis and nervous system development, which is in line with the NEDMIAL disease phenotype. The knockdown of DHX30 results in a decreased 80S peak in polysome gradients, indicating that DHX30 has an effect on the translation machinery. Sequencing of the pool of active translating mRNAs revealed that upon DHX30 knockout mainly 5’TOP mRNAs are downregulated. These mRNAs are coding for proteins of the translational machinery and translation initiation factors. This study identified DHX30 as a factor of the translation machinery that selectively impacts the expression of a subset of proteins and provides insight on the etiology of NEDMIAL., RNA-Helikasen sind Schlüsselfaktoren bei der Regulierung der Genexpression. Sie remodellieren RNA-Sekundärstrukturen und RNA-Protein Interaktionen und dadurch die dynamische Interaktion von RNA-bindenden Proteinen mit deren Substraten. Die putative RNA-Helikase DHX30 ist Mitglied der DEAH-box Helikasen, welche in Abhängigkeit von ATP in der Lage sind, RNA-Sekundärstrukturen aufzulösen. Mutationen im DHX30 Gen verursachen die autosomal-dominante neuronale Krankheit “Neurodevelopmental Disorder with Severe Motor Impairment and Absent Language” (NEDMIAL; OMIM#617804). In dieser Arbeit wurde eine Aufreinigungs-Strategie etabliert, um im präparativen Maßstab enzymatisch-aktives DHX30 Protein zu gewinnen. Mit dem aufgereinigten Protein wurden enzymatische Experimente durchgeführt, wodurch DHX30 als ATP abhängige RNA-Helikase charakterisiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass es in der Lage ist RNA:RNA sowie RNA:DNA Substrate in einer 3’ → 5’ Richtung zu entwinden. Mithilfe des rekombinanten Proteins konnte weiter gezeigt werden, dass krankheitsverursachende Mutationen im hoch-konservierten Helikase-Kern von DHX30 zur Beeinträchtigung der ATPase und Helikase-Aktivität des Proteins führen. Des Weiteren ergab sich, dass das Protein-Interaktom der DHX30 Mutanten sich im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert, was impliziert, dass die Mutationen nicht zu einer Missfaltung des Proteins, sondern dessen katalytische Aktivität inhibieren. DHX30 lokalisiert hauptsächlich im Cytoplasma und bildet dort einen Proteinkomplex mit Ribosomen und Polysomen. Mittels eines cross-linking mass spectrometry-Experiments konnte eine direkte Interaktion von DHX30 mit Stellen der ribosomalen mRNA Eintrittsstelle und dem Interface der ribosomalen Untereinheiten identifiziert werden. Die RNA Sequenzierung von DHX30-deletieren Zellen zeigte eine starke Deregulierung von mRNAs welche für die Entwicklung des Nervensystems und in der Neurogenese eine Rolle spielen, was mit dem Krankheits-Phänotyp von NEDMIAL korreliert. Weiter konnte gezeigt werden, dass es in DHX30-deletierten Zellen zur Abnahme von 80S Ribosomen in Polysomen-Gradienten kommt, was auf eine Funktion von DHX30 während der Translation schließen lässt. Durch das Sequenzieren aktiv translatierender mRNAs zeigte sich, dass der KO von DHX30 zur Abnahme von 5‘TOP mRNAs führt. Diese mRNAs kodieren für Proteine der Translations-Maschinerie und für Translations-Initiations Faktoren. Diese Studie identifiziert DHX30 als Faktor der Translations-Maschinerie, der selektiv die Expression einer mRNA-Untergruppe beeinflusst und Einblicke in die Ätiologie von NEDMIAL liefert.

RNA-bindende Proteine sind zentrale Regulatoren der Genexpression, aber ihre Funktionen bei der Koordinierung von Zellschicksalsentscheidungen sind unzureichend verstanden. In dieser Studie haben wir RNA interactome capture angewandt, um die globalen Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während der Auflösung der Pluripotenz und neuronaler Differenzierung zu bestimmen. Wir haben entdeckt, dass 30-40% der RNA-bindenden Proteine sehr dynamisch während der Zellschicksalentscheidungen sind, die Abundanzdynamiken dieser Proteine aber nicht hauptursächlich dafür zu sein scheinen. Basierend auf unseren Daten haben wir ZAP (ZC3HAV1) als einen Faktor identifiziert, der mit Pluripotenz assoziiert ist. Um die Rolle von ZAP in der Stammzellbiologie zu analysieren, haben wir PAR-CLIP, SLAMseq und einen Differenzierungsassay angewandt. Unsere Daten haben gezeigt, dass ZAP mehr als 2,000 mRNA-Transkripte innerhalb des murinen Stammzelltranskriptoms in Abhängigkeit von CG-Dinukleotiden bindet. Zieltranskripte sind angereichert mit Genfunktionen in Zell-Zell-Interaktionen, Gewebemorphogenese und Pluripotenzregulation und werden in Abwesenheit von ZAP stabilisiert. Auβerdem haben wir herausgefunden, dass Depletion von ZAP zu flacherer und breiterer Koloniemorphologie von Stammzellen bei gleichzeitiger Fehlexpression von hunderten von Genen inklusive Lineage-Faktoren führt. Desweiteren führt Abwesenheit von ZAP zu erhöhter Geschwindigkeit bei der Auflösung der Pluripotenz. Zusammengefasst stellen wir die These auf, dass ZAP ein multi-modaler Regulator der Pluripotenz ist. ZAP agiert als positiver Regulator während Aufrechterhaltung der Pluripotenz, während es am Anfang der Pluripotenzauflösung pluripotenz-fördernde Faktoren herunterreguliert. Schlussendlich demonstriert diese Studie, wie die Erforschung von Dynamiken des RNA-gebundenen Proteoms während Zellschicksalsentscheidungen neue Wege öffnet, um die Funktion von RNA-bindenden Proteinen im entwicklungsbiologischen Kontext zu analysieren., RNA-binding proteins are key regulators of gene expression, but their functions in coordinating cell fate transitions are poorly understood. In this study, we applied RNA interactome capture to determine the global dynamics of the RNA-bound proteome during dissolution of pluripotency and neuronal differentiation. We discovered that 30-40% of RNA-binding proteins are highly dynamic during cell fate transitions and that these dynamics do not appear to be predominantly governed by alterations in their abundance. Based on our data, we identified ZAP (ZC3HAV1) as a factor highly associated with pluripotency. In order to dissect the role of ZAP in mESC biology, we applied a variety of approaches including PAR-CLIP, SLAMseq and pluripotency exit reporter assays. We found that ZAP binds more than 2,000 mRNAs in the mESC transcriptome in a CG dinucleotide-dependent manner. Targets are enriched for transcripts encoding cell-cell adhesion, tissue morphogenesis and pro-pluripotency regulators and stabilized in absence of ZAP. Furthermore, we found that ZAP depletion leads to flattened and spreading stem cell colony morphology, concomitant misexpression of hundreds of transcripts including lineage factors and accelerated early dissolution of pluripotency. In conclusion, we propose that ZAP is a multi-modal stem cell RNA-binding protein acting as a positive regulator in maintenance of pluripotency while aiding downregulation of pro-pluripotent factors at the onset of differentiation. Ultimately, this study demonstrates how exploration of RNA-bound proteome dynamics during cell fate transitions can open paths to dissecting functions of RNA-binding proteins in a developmental context.

Die Verwendung von nukleinsäuretemplatgesteuerten Reaktionen stellt einen innovativen Ansatz zur Therapie von Krankheiten dar, deren Ursprung in einer genetischen Veränderung von Zellen liegt. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit erfolgte eine Weiterentwicklung der RNA-templatgesteuerten Acyltransferreaktion nach Seitz et al. hinsichtlich des Aufbaus von aromatischen Amidbindungen, wie sie in vielen niedermolekularen Wirkstoffen vorkommen. Als Modellverbindungen dienten die Bcr-Abl-Tyrosinkinaseinhibitoren Nilotinib, Ponatinib und GZD824, die durch zentrale Benzanilidmotive charakterisiert sind und zur Therapie der chronischen myeloischen Leukämie eingesetzt werden. Das konzipierte Reaktionssystem beruht auf dem Mechanismus der nativen chemischen Ligation, weswegen die Bcr-Abl-Inhibitoren durch die Einführung einer Thiolgruppe modifiziert werden mussten. Es wurde gezeigt, dass diese Modifikation in den meisten Fällen nur zu einer geringen Beeinträchtigung der biologischen Aktivität führt. Der RNA-templatgesteuerte Aufbau der Benzanilidstrukturen konnte sowohl mit PNA- als auch mit DNA-verknüpften Inhibitorfragmenten basierend auf Ponatinib und GZD824 erzielt werden. In Gegenwart eines komplementären RNA-Templats erfolgte die benachbarte Hybridisierung der reaktiven Konjugate, infolgedessen ein Benzoyltransfer von einem thioestermodifizierten Donor auf ein ortho-Mercaptoanilinderivat als Akzeptor stattfand. Mit PNA/PNA-Reaktionssystemen wurde auch in Abwesenheit des RNA-Templats eine signifikante Produktbildung beobachtet, was auf hydrophobe Wechselwirkungen der Konjugate zurückgeführt wurde. Unter Verwendung von DNA/DNA- bzw. PNA/DNA-Konjugatpaaren blieb die templatunabhängige Produktbildung hingegen ausreichend gering. Die entsprechenden Reaktionssysteme wurden hinsichtlich der erzielten Produktausbeuten optimiert, wobei sowohl die Linkerlänge bzw. -struktur der reaktiven Konjugate als auch die Templatarchitektur variiert wurde., The use of nucleic acid-templated reactions represents an innovative approach to the therapy of diseases that originate in genetic alterations of cells. In this work, the RNA-templated acyl transfer reaction invented by Seitz et al. was extended towards the formation of aromatic amide bonds which occur in a variety of small molecule drugs. The Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors nilotinib, ponatinib, and GZD824 were used as model compounds, as they are characterized by central benzanilide motifs and find application in the treatment of chronic myeloid leukemia. The designed reaction system is based on the mechanism of native chemical ligation which required the modification of the Bcr-Abl inhibitors by introducing a thiol group. It was shown that thiolation affected the biological activity only moderately. The RNA-templated formation of the benzanilide structures was achieved with both PNA- and DNA-linked inhibitor fragments of ponatinib and GZD824. The presence of a complementary RNA template enabled adjacent binding of the reactive conjugates, triggering a rapid benzoyl transfer from a thioester-linked donor to an ortho-mercaptoaniline derivative as an acceptor. With PNA/PNA reaction systems, significant product formation was observed in absence of the RNA template, which was attributed to hydrophobic interactions between the conjugates. However, the template-independent product formation remained low when DNA/DNA or PNA/DNA conjugate pairs were used. The product yields of the corresponding reaction systems were optimized by varying the linker length and structure of the conjugates as well as the template architecture.

Chemotherapien verursachen DNA-Schäden in Krebszellen, was zur Apoptose der meisten Zellen führt. Die überlebenden Zellen können in eine Therapie-induzierte Seneszenz (TIS) eintreten, die zum Zellzyklusarrest führt. Zellen in TIS weisen einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) auf – eine erhöhte Proteinproduktion, die proteotoxischen Stress bedingt. Verbliebene seneszente Zellen könnten jedoch wieder in den Zellzyklus eintreten und ihr SASP kann entzündungsfördernd wirken. Da seneszente Zellen besonders auf Proteinabbau angewiesen sind, um eine zu hohe Proteotoxizität zu vermeiden, zielten wir auf Proteindegradierungswege mit einer sekundären Therapie ab, um TIS Zellen zu eliminieren. Mittels Bcl2-überexprimierender Lymphome aus dem transgenen Eμ-myc Maus-Modell, die nach Chemotherapie in Seneszenz eintreten, und des Vergleichs mit Lymphomen, die aufgrund einer genetischen Läsion nicht seneszent werden können. identifizierten wir eine verringerte proteasomale Aktivität in TIS, die mit Kennzeichen von proteotoxischem Stress korrelierte. Dabei hängt die daraus folgende Empfindlichkeit von TIS Zellen für proteasomale Hemmung von NF-κB regulierter SASP Produktion ab. Die Kombination aus proteasomaler Hemmung durch Bortezomib und einem Autophagieblocker zeigte einen additiven Effekt auf den Zelltod von TIS Zellen. Diese Ergebnisse konnten in vivo anhand verbesserten Überlebens durch TIS-nachfolgende Sekundärtherapie von mit Lymphomen inokulierten Mäusen bestätigt werden. Schließlich konnte das Prinzip der Seneszenz-spezifischen Beseitigung von Tumorzellen unter Einsatz von Bortezomib in zwei humanen Lymphomzelllinien untermauert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass seneszente Zellen auf eine intakte Proteinabbau-Maschinerie angewiesen sind und auf Veränderungen in proteasomaler Aktivität empfindlich reagieren. Diese Angreifbarkeit könnte in einer neuartigen, synthetisch lethalen Strategie ausgenutzt werden, um maligne Zellen effektiv zu eliminieren., Chemotherapy causes DNA damage in cancer cells, causing apoptosis in most, but not all cells. Surviving cells can undergo therapy-induced senescence (TIS), an emergency mechanism that arrests the cell cycle. Cells in TIS exhibit a senescence-associated secretory phenotype (SASP) - a massive increase in protein production leading to proteotoxic stress. Sustained senescent cells might reenter the cell cycle, and their SASP can stimulate dangerous inflammation. Aiming to eliminate remaining TIS cells, we reasoned that they need to reduce their excessive protein burden and avoid proteotoxicity and we therefore targeted protein degradation pathways with a secondary treatment. Using Bcl2-overexpressing lymphomas from the Eμ-myc mouse transgenic model, which become senescent after chemotherapy, and comparing them to lymphomas that do not become senescent due to a genetic impairment, we found reduced proteasomal activity in TIS, correlating to hallmarks of proteotoxic stress, such as accumulation of protein aggregates and oxidized proteins. The consequential sensitivity of TIS cells to proteasome inhibition was dependent on NF-κB governed SASP production. Very significantly, combining proteasome inhibition by bortezomib with autophagy inhibition had an additive effect on susceptibility to rapid death after TIS. These findings were confirmed by in vivo treatments improving survival of mice carrying lymphomas that had been treated into TIS. Lastly, the senescent-specific clearance of cells by bortezomib following TIS induction was confirmed using two human, lymphoid cell lines, supporting the proof-of-principle. This study suggests that senescent cells are highly dependent on protein disposal and are hypersensitive to changes in proteasome activity. This vulnerability might be exploited in a novel synthetic lethality strategy to fully eliminate malignant cells.

Antibody conjugates have taken a great leap forward as tools in basic and applied molecular life sciences that was enabled by the development of chemoselective reactions for the site‐specific modification of proteins. Antibody‐oligonucleotide conjugates combine the antibody's target specificity with the reversible, sequence‐encoded binding properties of oligonucleotides like DNAs or peptide nucleic acids (PNAs), allowing sequential imaging of large numbers of targets in a single specimen. In this report, we use the Tub‐tag® technology in combination with Cu‐catalyzed azide‐alkyne cycloaddition for the site‐specific conjugation of single DNA and PNA strands to an eGFP‐binding nanobody. We show binding of the conjugate to recombinant eGFP and subsequent sequence‐specific annealing of fluorescently labelled imager strands. Furthermore, we reversibly stain eGFP‐tagged proteins in human cells, thus demonstrating the suitability of our conjugation strategy to generate antibody‐oligonucleotides for reversible immunofluorescence imaging., Protein‐oligonucleotide conjugates. We present a novel strategy for the efficient and site‐specific generation of nanobody‐oligonucleotide conjugates in a 1 : 1 stoichiometry by Tub‐tag‐mediated conjugation. We show a proof‐of‐concept that these conjugates can readily be used for reversible staining in confocal fluorescence microscopy.

Im ersten Teil der Arbeit wurde die Verwendung von Präkursor microRNA-21(pre-miR21)-spezifischen Peptidnukleinsäure(PNA)-Sonden zur Inhibierung der Dicer-vermittelnden miRNA-Reifung untersucht. Im Gegensatz zur Arbeitshypothese wurde bei der Behandlung von Zellen mit den pre-miR21-spezifischen PNA-Sonden jedoch keine Änderung des miR-21 Niveau beobachtet. Um die Hybridisierung der Sonde an die Zielsequenz nachzuweisen, wurden fluorogene Hybridisierungssonden zur erzwungenen Interkalation (FIT-Sonden), unter Verwendung des Interkalationsfarbstoffes Thiazolorange (TO), entwickelt. Wie vorläufige Ergebnisse zeigen, könnte die TO-PNA Sonde für die Unterscheidung von Zellen mit hohem miR-21-Gehalt nützlich sein, aber eine weitere Verbesserung der Sonde ist noch erforderlich. Im nächsten Teil der Arbeit wurden neuartige FIT-Sonden für die Analyse der Dicer-vermittelnden miR-21-Reifung entwickelt. Um die gleichzeitige Detektion der entstehenden pre-miR21 und der antisense miR-21 (as-miR21) in Echtzeit zu ermöglichen, wurden die Verwendung von spektral unterscheidbaren FIT-Sonden auf Quinolinblau(QB)-und TO-Basis getestet. Das entwickelte Sonden-Paar ermöglichte die Analyse der rhDicer-Reaktion. Dabei wurde entdeckt, dass die rhDicer-Reaktion an der in vitro transkribierten pre-miR21 unspezifisch spaltet. Zusätzlich wies die kürze as-miR21 spezifische TO-Sonde (7nt) eine Sensitivität gegenüber der Anwesenheit des Ago-2 Proteins auf. In der Zukunft könnten die entwickelten Sonden für schnelle in vitro Screenings neuer Dicer-und Ago-2-Inhibitoren angewendet werden. Im zweiten Teil der Dissertation wurde die Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren (small molecular inhibitors, SMIs) getestet. Zusammenfassend könnten die zwei identifizierten SMIs für die Inhibierung der miR-122-Reifung genutzt werden, allerdings bleibt die Spezifität der SMIs fraglich und mögliche off-target-Effekte können nicht ausgeschlossen werden. MicroRNAs (miRNAs) represent small non-coding RNA molecules that mostly negatively regulate gene expression. To yield mature miRNAs, primary miRNA precursors go through two consequent cleavages by Drosha and Dicer RNAse. This work describes the development of tools for inhibition und monitoring the dicer-mediated miRNA processing. Here, peptide nucleic acid (PNA) based probes, targeting the precursor miR-21 (pre-miR21), were designed for inhibition the dicer-mediated miR-21 maturation. In contrast, no change in miR-21 level was observed after cell treatment with the pre-miR21 specific PNA probes. To detect the probe/target hybridization state, the fluorogenic forced intercalation (FIT) PNA probes, bearing thiazole orange dye (TO), were developed. As preliminary results show, the FIT PNA probe might be useful for discrimination of high miR-21 abundant cells, but further probe improvement is still required. To monitor the pre-miR21 cleavage, the combination of the two spectrally distinguishable FIT PNA probes, bearing quinoline blue (QB) and TO fluorophore, was developed to allow the rapid and simultaneous detection of pre-miR21 and antisense mature miR-21 (as-miR21). The probe set was successfully used for detection of the modelled dicer reaction. However, the monitoring of rhDicer reaction have revealed that rhDicer cleaves the in vitro transcribed pre-miR21 nonspecifically. Additionally, the short as-miR21 specific TO PNA probe (7nt) was responsive to the presence of Ago-2 protein. In future, the developed probes can be applied for the fast in vitro screening of new Dicer and Ago-2 inhibitors. In the second part of this work, an alternative approach, small molecular inhibitors (SMIs), was tested. Two identified pre-miR122-targeting SMIs might be used for inhibition of the miR-122 maturation, although, a specificity of these SMIs remains questionable and possible off target effects cannot be excluded.

Ion-mobility spectrometry shows great promise to tackle analytically challenging research questions by adding another separation dimension to liquid chromatography-mass spectrometry. The understanding of how analyte properties influence ion mobility has increased through recent studies, but no clear rationale for the design of customized experimental settings has emerged. Here, we leverage machine learning to deepen our understanding of field asymmetric waveform ion-mobility spectrometry for the analysis of cross-linked peptides. Knowing that predominantly m/z and then the size and charge state of an analyte influence the separation, we found ideal compensation voltages correlating with the size exclusion chromatography fraction number. The effect of this relationship on the analytical depth can be substantial as exploiting it allowed us to almost double unique residue pair detections in a proteome-wide cross-linking experiment. Other applications involving liquid- and gas-phase separation may also benefit from considering such parameter dependencies.

Die Untersuchung von Proteininteraktionen ist unerlässlich um die komplexen Mechanismen der epigenetischen Kontrolle von Zugänglichkeit zum Chromatin und dessen Struktur zu verstehen. Zellspezifizierung während der Entwicklung von Organismen kann nur durch strikte Regulation von Chromatin gewährleistet werden, was auch für den Schutz von Zellenidentitäten im späteren Lebensverlauf wichtig ist. Die Modifizierung von Histon-Proteinen, welche integrale Komponenten des Chromatins sind, fördert entweder positive oder negative Genregulation. Eine Vielzahl von Chromatin regulierenden Proteinen hat jedoch keine enzymatische Aktivität für Histon- Modifikationen, so dass sie nur such Interaktionen mit anderen Proteinen regulatorisch einwirken können. Der Nematode Caenorhabditis elegans eignet sich als ein in vivo System, um die Schutzmechanismen der Zellen basierend auf Chromatinfaktoren zu untersuchen, indem systematisch Protein-Interaktionsnetzwerke bestimmt werden. Diese Dissertation beschriebt zunächst die Etablierung eines optimierten Verfahrens für die quantitative Analyse ohne Markierung von Proteinen in C. elegans, die mittels CRISPR mit einem Epitop fusioniert wurden. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden fünf Chromatin regulierende Proteine, die eine wichtige Rolle beim Schutz von Zellidentitäten spielen, charakterisiert. Es wurden in vivo Proteininteraktions-Netzwerke erstellt und dabei neue funktionsrelevante Interaktionspartner identifiziert. Darüber hinaus wurde eine vertiefende Analyse der Interaktionen des Chromatinfaktors MRG- 1 durchgeführt, das homolog zum humanen MRG15 ist. MRG-1 besitzt eine sogenannte Chromodomäne, um an methylierte Histone zu binden. Diese Studie zeigt, dass die Untersuchung der Proteininteraktionen von epigenetischen Faktoren in einem in vivo System ein bedeutendes Verfahren ist, um wichtige biologische Mechanismen der Schutzfunktion von Zellen zu entschlüsseln. Elucidating protein-protein interactions has been instrumental to understand the complex mechanisms underlying epigenetic regulations to control chromatin accessibility and structure. Proper development and cell fate specification are established under strict chromatin regulation to safeguard cellular identities throughout an organism's life. Modifications of histone proteins as an integral component of chromatin can promote either positive or negative gene regulation. However, many chromatin-regulation proteins lack enzymatic activity and depend on protein-protein interaction to cooperate with other factors to regulate chromatin through histone modifications. The nematode Caenorhabditis elegans can be used as an in vivo system to study chromatin regulators that safeguard cell identity and offers an attractive model system for mapping in vivo protein interactions. The presented thesis includes establishment of an optimized protocol for a quantitative approach based on label-free interaction proteomics to accurately identify interactions of chromatin-regulating proteins, which were epitope-tagged using CRISPR in C. elegans. This protocol was utilized to reveal the interaction partners of five bait proteins involved in essential chromatin regulation mechanisms during cell fate maintenance. The present study generated an in vivo protein interaction network identifying new interactions of high functional relevance. Moreover, in-depth protein-protein interaction analysis of the chromodomain protein MRG-1, homolog of human MRG15, detected a strong association with the Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO), besides previously described and novel interactions with other proteins. In summary, in vivo interactome mapping of epigenetic regulators is a powerful approach that can reveal crucial biological insights into how cell fate decisions are regulated.

In response to the antidiuretic hormone arginine-vasopressin (AVP), inducing elevated levels of the second messenger 3’,5’-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and the activation of the cAMP-dependent protein kinase (protein kinase A, PKA), the water channel aquaporin-2 (AQP2) is redistributed from intracellular vesicles into the plasma membrane of renal collecting duct principal cells. Its insertion into the plasma membrane induces the water reabsorption from primary urine and fine-tunes body water homeostasis. Dysregulation of this process causes or is associated with water balance disorders, such as diabetes insipidus (DI) (Olesen and Fenton, 2021; Christ-Crain and Gaisl, 2021). The mechanisms which control the AQP2 localization are not completely understood. The main part of this thesis describes the discovery of a hitherto unknown role of aurora kinase A (AURKA) in the control of the AQP2 localization. Two AURKA-selective inhibitors, aurora-A inhibitor I and alisertib, inhibited the cAMP-dependent AQP2 redistribution in two cell models by effects on the actin cytoskeleton. Novel derivatives of aurora-A inhibitor I provided insights into the structure–activity–relationship (SAR) of the inhibitor. Filamentous (F-) actin containing stress fibers can either serve as transport tracks for AQP2-bearing vesicles en route to the plasma membrane (Nedvetsky et al., 2007; Sasaki, Yui and Noda, 2014) or as a physical barrier by blocking the vesicles’ access to the plasma membrane (Klussmann et al., 2001; Tamma et al., 2001; Simon et al., 1993). Aurora-A inhibitor I induced the depolymerization of the actin transport tracks by activating the actin-depolymerizing protein cofilin-1 (CFL1). In contrast, alisertib promoted the formation of the actin barrier. Alisertib did not affect the CFL1 activity and must thus control the actin cytoskeleton and the AQP2 localization via different mechanisms. The second part builds on published work on the antimycotic drug fluconazole, which elicits antidiuretic effects by inducing the AQP2 redistribution to the plasma membrane of renal principal cells in the absence of AVP (Vukićević et al., 2019). The antimycotic drug tebuconazole was identified as another interesting candidate to modulate the AQP2 localization, which is of potential interest for treating certain forms of DI. In the third part, the molecular phenotype of a novel heterozygous mutation of the AQP2 gene, causing autosomal dominant nephrogenic DI (NDI), was characterized. The mutation led to an intracellular retention of AQP2 and an increase in the complex glycosylation of the protein. This thesis contributes to a better understanding of the molecular mechanisms underlying the AVP-induced AQP2 redistribution. Further, it opens new perspectives for the treatment of water balance disorders with modulators of the AQP2 localization., In Antwort auf das antidiuretische Hormon Arginin-Vasopressin (AVP), welches den Anstieg des Second Messengers 3’,5’-zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) und die Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA) bewirkt, wird das Wasserkanalprotein Aquaporin-2 (AQP2) von intrazellulären Vesikeln in die Plasmamembran der Hauptzellen des renalen Sammelrohrs umverteilt. Seine Insertion in die Plasmamembran induziert die Wasserrückresorption aus dem Primärharn und dient der Feinregulation der Wasserhomöostase im Körper. Die Fehlregulation dieses Prozesses ist Ursache von oder assoziiert mit Störungen des Wasserhaushalts, wie z.B. dem Diabetes insipidus (DI) (Olesen and Fenton, 2021; Christ-Crain and Gaisl, 2021). Die Mechanismen, die der Kontrolle der AQP2-Lokalisation dienen, sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Der Hauptteil dieser Arbeit beschreibt die Entdeckung einer bislang unbekannten Rolle der Aurorakinase A (AURKA) in der Kontrolle der AQP2-Lokalisation. Zwei AURKAselektive Inhibitoren, Aurora-A inhibitor I und Alisertib, inhibierten die cAMP-abhängige AQP2-Umverteilung in zwei Zellmodellen durch Effekte auf das Aktin-Zytoskelett. Neuartige Derivate von Aurora-A inhibitor I ermöglichten Einblicke in die Struktur–Wirkungs–Beziehung (SAR) des Inhibitors. Filamentöses (F-) Aktin-enthaltende Stressfasern können entweder als Transportschienen für AQP2-tragende Vesikel auf dem Weg zur Plasmamembran dienen (Nedvetsky et al., 2007; Sasaki, Yui and Noda, 2014) oder aber als physische Barriere den Zugang der Vesikel zu der Plasmamembran blockieren (Klussmann et al., 2001; Tamma et al., 2001; Simon et al., 1993). Aurora-A inhibitor I induzierte die Depolymerisierung der Aktin-Transportschienen, indem es das Aktin-depolymerisierende Protein Cofilin-1 (CFL1) aktivierte. Im Gegensatz dazu förderte Alisertib die Bildung der Aktin-Barriere. Alisertib beeinflusste nicht die CFL1-Aktivität, weshalb davon ausgegangen werden muss, dass es das Aktin-Zytoskelett und die AQP2-Lokalisation durch andere Mechanismen kontrolliert. Der zweite Teil baut auf publizierten Erkenntnissen über das Antimykotikum Flukonazol auf, welches antidiuretische Effekte aufweist, indem es die AQP2-Umverteilung in die Plasmamembran renaler Hauptzellen unabhängig von AVP induziert (Vukićević et al., 2019). Das Antimykotikum Tebukonazol wurde als weiterer interessanter Kandidat für die Modulation der AQP2-Lokalisation identifiziert. Dies ist von potentiellem Interesse für die Behandlung bestimmter Formen von DI. Im dritten Teil wurde der molekulare Phänotyp einer neuen heterozygoten AQP2-Genmutation charakterisiert, welche Ursache für einen autosomal dominanten nephrogenen Zusammenfassung XDI (NDI) ist. Die Mutation führte zu einer intrazellulären Retention von AQP2 und einer Erhöhung der komplexen Glykosylierung des Proteins. Diese Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen bei, denen die AVP-vermittelte AQP2-Umverteilung unterliegt. Darüber hinaus eröffnet sie neue Perspektiven für die Behandlung von Störungen des Wasserhaushalts mithilfe von Modulatoren der AQP2-Lokalisation.

Im Zellkern eukaryotischer Zellen werden Gene in mRNAs transkribiert, welche umfangreich prozessiert und aus dem Zellkern exportiert werden. Im Zytoplasma erfolgt die Translation der mRNAs in Proteine, ein Prozess, welcher viel Energie benötigt und daher mittels vielfältiger Mechanismen streng reguliert wird. Ein Beispiel hierfür stellt die Klasse der TOP-mRNAs dar, eine RNA-Spezies, welche hauptsächlich Transkripte von Genen umfasst, die selbst in die Translation involviert sind. Die prominentesten Vertreter dieser Klasse sind die Proteine der kleinen und großen ribosomalen Untereinheiten. TOP-mRNAs zeichnen sich durch ein gemeinsames Sequenz-Motiv am Anfang Ihrer 5’-UTR aus, welches aus einem Pyrimidinstrang besteht und unmittelbar nach dem Cap mit einem Cytosin beginnt. Dieses allen TOP-RNAs gemeinsame Motiv ermöglicht die zeitgleiche Translationskontrolle dieser RNA-Klasse. So kann die Translation der TOP-mRNAs unter Stressbedingungen wie z.B. Nährstoffmangel koordiniert inhibiert werden, wodurch Energie eingespart wird. Bereits lange wird nach einem Regulator gesucht, der an dieses TOP-Motiv bindet und die koordinierte Regulation ermöglicht. Man kann sich hier einen Inhibitor oder auch einen Aktivator vorstellen. Verschiedene Proteine wurden bereits in Erwägung gezogen. In dieser Arbeit wurde das Protein TIAR mittels Massenspektrometrie als TOP-interagierender Faktor identifiziert und dessen Bindungseigenschaften mit dem TOP-Motiv durch Shift Assays untersucht. Hierbei konnten Minimalkonstrukte verschiedener Organismen sowie RNA-TOP – Sequenzen identifiziert werden, welche sich für Strukturanalysen eignen würden. Als weiterer TOP-interagierender Faktor wurde über verschiedene sequenzielle Reinigungsschritte das Protein 14-3-3ε identifiziert. Weiterhin wurden die TOP-Motiv-bindenden Proteine LARP1 und LARP7 auf Ihre Bindungseigenschaften mit Ihren Zielsequenzen untersucht. Während gezeigt werden konnte, dass LARP1 einen inhibierenden Einfluss auf TOP-RNAs hat, wurde in weiteren Shift-Assays die Bindungseigenschaften von LARP7 mit 7SK untersucht, wobei ebenfalls ein minimales LARP7–Konstrukt sowie 7SK-Konstrukte für Strukturanalysen identifiziert werden konnten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass verschiedene Substanzen wie tRNA und Arginin einen starken Einfluss auf die LARP7-7SK – Interaktion ausüben, welcher in weiteren Studien berücksichtigt werden sollte., In the nucleus of eucaryotic cells, genes are transcribed into mRNA which are heavily processed and exported into the cytoplasm. There they are translated into proteins, a process requiring large amounts of energy so this process is strongly regulated. One example is the class of TOP RNAs consisting mainly of transcripts encoding for proteins involved in translation. Some well-known examples include the proteins of the large and small ribosomal subunits. TOP RNAs share a common motif at the start of their 5’ UTR comprising a sequence entirely made of Pyrimidines immediately following the cap. This motif common to all TOP RNAs enables translational control of this class of RNAs in a timely coordinated manner. In this way, during conditions of stress like nutrient starvation, translation of TOP RNAs can be inhibited to save energy. The search for a regulator which binds to the TOP motif and enables coordinated regulation started long ago. In principle the regulator could activate or inhibit translation. Different proteins have been considered to be the regulator so far. In this thesis the protein TIAR was identified as TOP interacting factor using mass spectrometry. Its binding properties regarding the TOP motif have been evaluated using EMSA. RNA and proteins of different organisms were evaluated to identify minimal binding partner constructs for further structural analysis. Using different sequential purification approaches, the 14-3-3ε protein was also identified as TOP binding factor. Furthermore, the TOP binding proteins LARP1 and LARP7 and their target RNA sequences have been evaluated in regard to their binding properties. It could be shown that LARP1 has an inhibiting effect on translation of TOP RNAs. Using EMSA, minimal binding constructs of LARP7 and 7SK could be established which can be considered for further structural analysis. Also, it could be shown that certain substances like tRNA and Arginine influence the interaction of LARP7 and 7SK, an observation which should be considered in further experiments.

Proteins play a crucial role for the functioning of the cell, may it be by conveying structural integrity, being involved with molecular transport and signal transduction, or by catalysing metabolic reactions. The cell’s proteome is modular, so while many proteins carry out their functions acting either on their own, many do so as part of higher-order complexes. Since a protein’s function is tightly coupled to its individual molecular structure, by studying protein structures the mechanisms behind their function can be understood. A tool to assess protein structure is crosslinking and mass spectrometry (CLMS) in which chemical crosslinks are first introduced into a protein, and these crosslinks are then detected by chromatography-coupled mass spectrometry. Here, the observed crosslinks provide information on molecular distance relationships within the structures of proteins and their complexes which helps to describe these. A main motivation of the work presented in this thesis was to develop the CLMS approach to investigate more complex biological entities, i.e., proteome-wide studies focussing on protein-protein interactions in their native cellular environment. Some pioneering studies had attempted this in the past but their output remained rather limited in comparison to analyses of purified protein complexes. Major challenges needed to be overcome in the detection and identification of crosslinked peptides to make this conceptual leap. These challenges are mostly of technical nature and include: (1) the low abundance of crosslinked peptide analytes within a sample spanning a wide dynamic range and with a large underlying chemical heterogeneity, (2) the enormous combinatorial complexity from considering all theoretically possible peptide pairs of a crosslinked proteome during the crosslink search, and (3) the lack of consensus over reliable error control procedure for detecting protein-protein interactions in experiments of such scale. In this thesis, I tackle each of these challenges. I demonstrate how leveraging liquid- and gas-phase fractionation and/or enrichment of crosslinks, respectively, addresses methodological hurdles related to the high sample heterogeneity and its wide dynamic range, as well as to the combinatorial complexity encountered in proteome-wide CLMS. First, addressing the low abundance of crosslinked peptides, I show the effective combination of size-exclusion-based peptide pre-fractionation with a differential ion mobility separation dimension coupled in between reversed-phase liquid chromatography and the mass spectrometer. The gains from following this approach are shown for samples of moderate up to cellular complexity. Second, to reduce crosslinked peptide identification ambiguity, I demonstrate how the analyte retention behaviour during multidimensional fractionation involving two modes of offline-ion-exchange plus online-reversed-phase chromatography can be leveraged via deep learning to complement mass spectrometric information, leading to an increase in crosslink identification yields at constant confidence. Third, by using protein co-elution profiling as an independent benchmark to existing error control procedures, I show how error rates can be reliably estimated for protein-protein interaction studies by CLMS. In this study, many known protein interactions in the model organism Escherichia coli could be confirmed while others could extend existing knowledge on essential protein complexes. To this end, I verified the interaction between the RNA polymerase and the uncharacterized protein YacL by affinity-purification and mass spectrometry and further confined YacL’s interaction site on RNA polymerase by means of photo-crosslinking. The contributions towards proteome-wide CLMS presented in this thesis on aspects of sample separation - on the protein- and the peptide-level - and efficient use of information derived from it, as well as the establishment of an approach to reliably control for error rates on protein-protein interaction-level, represent important steps towards unlocking the full potential of CLMS for high-confidence proteome-wide studies at protein residue-resolution., Proteine spielen eine zentrale Rolle für das Funktionieren der Zelle, beispielsweise durch das Vermitteln struktureller Integrität, während molekularer Transportprozesse und Signalkaskaden oder bei der Katalyse metabolischer Reaktionen. Die Gesamtheit aller Proteine einer Zelle - das Proteom - ist modular organisiert, sodass zwar einige Proteine unabhängig von Anderen agieren können, viele andere aber nur eingebunden in höher geordneten Komplexen funktionieren. Da die Struktur eines Proteins in direktem Zusammenhang mit dessen Funktion steht, ermöglicht das Erforschen von Proteinstrukturen deren Funktion mechanistisch zu verstehen. Ein Ansatz Proteinstrukturen zu untersuchen stellt die Kombination aus Quervernetzung und Massenspektrometrie (CLMS) dar. Hierbei werden zuerst chemische Quervernetzungen (crosslinks) in ein Protein eingeführt, welche anschließend per Flüssigchromatographiegekoppelter Massenspektrometrie detektiert werden. Die so gefundenen crosslinks liefern Information zu molekularen Distanzbeziehungen innerhalb einer Proteinstruktur bzw. zwischen den Proteinen von Proteinkomplexen mit deren Hilfe ebendiese Strukturen und Interaktionen beschrieben und modelliert werden können. Die wesentliche Motivation für die in dieser Dissertation enthaltenen Arbeiten war es den CLMS Forschungsansatz für die Untersuchung komplexerer biologischer Systeme, wie beispielsweise des gesamten zellulären Proteoms, weiterzuentwickeln, um so Protein-Protein-Interaktionen in deren nativer Umgebung erforschen zu können. Frühere Forschungsanstrengungen widmeten sich zwar bereits diesem Versuch, ergaben aber vergleichsweise wenig neue Erkenntnisse. Große analytische Herausforderungen in Detektion und Identifikation quervernetzter Peptide müssen zuerst für diesen konzeptionellen Sprung überwunden werden. Diese Herausforderungen sind größtenteils technischer Natur und umfassen: (1) die niedrige Häufigkeit quervernetzter Peptide in Proben mit großem Dynamikbereich und hoher chemischer Heterogenität, (2) die enorme kombinatorische Komplexität der Datenbanksuche, resultierend aus der paarweisen Kombination aller theoretisch möglichen Peptide eines quervernetzten Proteoms und (3) das Fehlen eines Konsenses über ein verlässliches Verfahren zur Fehlerkontrolle in proteomweiten Protein-Protein-Interaktionsstudien (PPI-Studien). In dieser Dissertation widme ich mich der Bewältigung jeder dieser Herausforderungen. Ich zeige, wie die Verwendung von Flüssig- und Gasphasen-Frakionierung und -Anreicherung von quervernetzten Peptiden dazu genutzt werden kann, um die oben genannten methodischen Hürden in CLMS-basierten proteom-weiten PPI-Studien anzugehen. In der ersten Arbeit liegt der Fokus auf der Adressierung der niedrigen Häufigkeit quervernetzter Peptide. Hier zeige ich die effiziente Kombination zweier Anreicherungsverfahren quernetzter Peptide: die vorgeschaltete Größenausschluss-Chromatographie und differentielle Ionenmobilitätsspektrometrie, gekoppelt zwischen Umkehrphasen-Flüssigchromatograph und Massenspektrometer. Der Gewinn an crosslink-Identifikationen durch Verwendung dieses Verfahrens wird anhand von Proben moderater bis hin zu zellulärer Komplexität demonstriert. Die zweite Arbeit widmet sich der Reduktion von Ambiguität bei der Identifikation quervernetzter Peptide. Hier nutze ich multidimensionale Fraktionierung, bestehend aus zwei komplementären vorgeschalteten Ionenaustausch- und der Massenspektrometrie-gekoppelten UmkehrphasenChromatographie für die Trennung einer komplexen Probe, abgeleitet vom quervernetzten hochmolekularen Proteom von Escherichia coli. Die Ergänzung der massenspektrometrischen Information um das Retentionsverhalten quervernetzter Peptide aus diesem Vorgehen mittels maschinellen Lernens führt zur verbesserten Identifikation von crosslinks. Dies ermöglicht letztlich mehr Quervernetzungen bei konstanter statistischer Konfidenz in einem CLMSDatensatz identifizieren zu können. Die dritte Arbeit dieser Thesis zielt darauf ab, ein verlässliches Verfahren zur Fehlerkontrolle von CLMS-basierten PPI-Studien zu etablieren. Hierbei bediene ich mich des SEC-MS Verfahrens (Größenausschlusschromatographie komplexer Proteinproben unter nativen Bedingungen gefolgt von massenspektrometrischer Proteinidentifikation in den erhaltenen Fraktionen), in dem das Co-Elutionsverhalten von Proteinen und deren Komplexe während nativer Fraktionierung per Größenausschluss-Chromatographie untersucht wird. Diese Methodik gewährt einen unabhängigen Vergleichspunkt zu den PPIs, welche aus dem CLMS Ansatz unter Verwendung verschiedener bestehender Fehlerkontrollverfahren resultieren. In dieser Studie konnte ich viele bereits bekannte Proteininteraktionen im Modellorganismus Escherichia coli bestätigen und bestehendes Wissen essenzieller Proteinkomplexe erweitern. Weiterhin konnte ich die Interaktion zwischen RNA-Polymerase und dem nicht charakterisierten Protein YacL mittels Affinitätsbasierter Reinigung und Massenspektrometrie bekräftigen. Durch zusätzliches Photo-Crosslinking und Massenspektrometrie konnte ich schließlich den Interaktionsbereich zwischen YacL und RNA-Polymerase noch weiter räumlich eingrenzen. Die in dieser Dissertation präsentierten Beiträge zu proteom-weiten CLMS Studien umfassen Aspekte der Probenaufbereitung auf Protein- und Peptid-Ebene, sowie die effiziente Verwendung der daraus resultierenden Information, als auch die Etablierung eines Verfahrens zur verlässlichen Fehlerkontrolle auf Protein-Protein-Interaktions-Level. Diese Erkenntnisse werden zukünftig dabei helfen, das volle Potenzial der chemischen Quervernetzung und Massenspektrometrie-Methodik für konfidente proteom-weite PPI-Studien mit AminosäureAuflösung auszuschöpfen.

Bacteria thrive and survive in many different environments, and as a result, they have developed robust mechanisms to adapt rapidly to alterations in their surroundings. The protection against osmotic forces is provided by mechanosensitive channels: their primary function is to maintain the integrity of the cell upon a hypoosmotic shock. The mechanosensitive channel of small conductance (MscS) is not only the smallest common structural unit of a diverse family that allows for a tailored response in osmoregulation; it is also the most intensively studied homologue. Mechanosensitive channels directly sense elevated membrane tension levels generated by increased pressure within the cell and open transiently. Escherichia coli has six paralogues that differ in their gating properties and the number of additional transmembrane (TM) helices. These TM helices, termed sensor paddles, are essential for sensing, as they directly contact the surrounding membrane; however, the role of the additional TM helices is still unclear. Furthermore, lipids occupy hydrophobic pockets far away from the membrane plane. A recent gating model for MscS states that increased membrane tension triggers the expulsion of lipids out of those pockets, modulating different conformational states of MscS. This model focuses on bound lipids, but it is still unclear to what extent the direct interaction with the membrane influences sensing and how relevant it is for the larger paralogues. In the herein described work, structural studies on two larger paralogues, the medium-sized channel YnaI and the large channel YbiO were realised using electron cryomicroscopy (cryo-EM). Lipids were identified in YnaI in the pockets in a similar position and orientation as in MscS, suggesting a conserved sensing mechanism. Moreover, the copolymer diisobutylene/maleic acid (DIBMA) allowed the extraction of artificially activated YnaI from plasma membranes, leading to an open-like form of this channel. This novel conformation indicated that the pore helices bend at a GGxGG motif during gating, which is unique among the Escherichia coli paralogues, concomitant with a structural reorganisation of the sensor paddles. Thus, despite a high similarity of their closed states, the gating mechanisms of MscS and YnaI are surprisingly different. Furthermore, the comparison of MscS, YnaI, and YbiO accentuates variations and similarities between the differently sized family members, implying fine-tuning of channel properties in the pore regions and the cytosolic lateral entry sides into the channel. Structural analyses of MscS reconstituted into different systems showed the advantages and disadvantages of certain polymers and detergents. The novel DIBMA copolymer and the more conventional amphiphilic polymers, so-called Amphipols, perturb contacting transmembrane helices or lead to their denaturation. Due to this observation, the obtained structures of YnaI must also be cautiously considered. The structures obtained in detergents resulted in unaffected channels; however, the applicability of detergents for MscS-like channels is limited by the increased required sample concentration. The role of lipids for gating MscS in the absence of a membrane was examined by deliberately removing coordinated lipid molecules from MscS using different amounts and kinds of detergent. The effects on the channel were inspected by cryo-EM. These experiments showed that closed MscS adopts the open conformation when it is enough delipidated by incubation with the detergent n-dodecyl-β-D-maltoside, and adding lipids to the open channel reverses this process. The results agree with the state-of-the-art model that the amount of lipid molecules in the pockets and grooves is responsible for the conformational state of MscS. Furthermore, incubation with the detergent lauryl maltose neopentyl glycol, which has stabilising and delipidating characteristics, resulted in a high-resolution structure of open MscS exhibiting an intricate network of ligands. Based on this structure, an updated gating model is proposed, which states that upon opening, lipids from the pockets migrate into the cytosolic membrane leaflet, while lipids from the periplasmic leaflet enter the grooves that arise between the sensor paddles., Bakterien gedeihen und überleben in vielen unterschiedlichen Umgebungen. Daher haben sie robuste Mechanismen entwickelt, um sich rasch an Veränderungen in ihrer Umgebung anzupassen. Den Schutz vor osmotischen Kräften gewährleisten mechanosensitive Kanäle: Ihre Hauptfunktion besteht darin, die Unversehrtheit der Zelle bei einem hypoosmotischen Schock zu erhalten. Der mechanosensitive Kanal geringer Leitfähigkeit (mechanosensitive channel of small conductance, MscS) stellt nicht nur die kleinste gemeinsame Struktureinheit einer Familie von Kanälen dar, die eine maßgeschneiderte Antwort auf hypoosmotischen Stress ermöglicht; er ist auch das intensivste untersuchte Familienmitglied. Mechanosensitive Kanäle registrieren erhöhte Membranspannungen, die durch steigenden Druck innerhalb der Zelle entstehen, und öffnen vorübergehend. In Escherichia coli gibt es sechs paraloge Kanäle, die sich in ihren Öffnungs-Eigenschaften und der Anzahl zusätzlicher transmembranen Helices unterscheiden. Diese Helices, die als sensor paddles bezeichnet werden, sind für das Erfassen ansteigender Membranspannung unerlässlich, da sie direkt mit der umgebenden Membran in Kontakt stehen; die Rolle der zusätzlichen transmembranen Helices ist jedoch noch nicht geklärt. Außerdem sitzen Lipide in hydrophoben Taschen weit entfernt von der Membran. Ei kürzlich vorgeschlagenes Öffnungs-Modell für MscS besagt, dass eine erhöhte Membranspannung zum Ausstoß der Lipide aus diesen Taschen führt, wodurch verschiedene Konformationszustände von MscS moduliert werden. Dieses Modell konzentriert sich auf die Rolle der Lipide, aber es ist noch immer unklar, inwieweit die direkte Wechselwirkung mit der Membran das Wahrnehmen der Membranspannung beeinflusst und welche Bedeutung sie für die größeren paralogen Kanäle hat. In der vorliegenden Arbeit wurden Strukturstudien an zwei größeren paralogen Kanälen, dem mittelgroßen Kanal YnaI und dem großen Kanal YbiO, mittels Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM) durchgeführt. In YnaI wurden Lipide in den Taschen in ähnlicher Position und Ausrichtung wie in MscS gefunden, was auf einen konservierten Mechanismus zur Wahrnehmung der Membranspannung schließen lässt. Darüber hinaus ermöglichte das Copolymer Diisobutylen/Maleinsäure (DIBMA) die Isolation von artifiziell aktiviertem YnaI aus Plasmamembranen, was zur Struktur einer anscheinend offenen Form dieses Kanals führte. Diese neuartige Konformation deutet darauf hin, dass sich die Porenhelices während des Öffnens im Bereich eines GGxGG-Motiv biegen, das unter den paralogen Kanälen von Escherichia coli einzigartig ist und mit einer strukturellen Reorganisation der sensor paddles einhergeht. Trotz der großen Ähnlichkeit ihrer geschlossenen Zustände sind die Öffnungs-Mechanismen von MscS und YnaI also überraschend unterschiedlich. Darüber hinaus zeigte der Vergleich von MscS, YnaI und YbiO Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den unterschiedlich großen Familienmitgliedern. Diese Erkenntnissse deuten auf eine Feinabstimmung der Kanaleigenschaften im Bereich der Pore und an den zytosolischen seitlichen Eingängen der Kanäle hin. Strukturanalysen von MscS, in verschiedene Systeme rekonstituiert, zeigten die Vor- und Nachteile von ausgewählten Polymeren und Detergenzien. Das neuartige DIBMA-Copolymer und herkömmlichere amphiphile Polymere, die sogenannten Amphipole, stören die kontaktierenden transmembranen Helices oder führen zu deren Denaturierung. Im Zuge dieser Beobachtung müssen auch die erhaltenen Strukturen von YnaI vorsichtig betrachtet werden. Die in Detergenzien erhaltenen Strukturen zeigen unbeeinträchtigte Kanäle; die Anwendbarkeit von Detergenzien für MscS-ähnliche Kanäle wird jedoch durch die erhöhte erforderliche Proteinkonzentration eingeschränkt. Die Rolle der Lipide für das Öffnen von MscS wurde in Abwesenheit einer Membran untersucht, indem koordinierte Lipidmoleküle mit verschiedenen Mengen und Arten von Detergenzien bewusst von MscS entfernt wurden. Die Auswirkungen auf den Kanal wurden mittels Kryo-EM untersucht. Dabei zeigte sich, dass die geschlossene Form von MscS in die offene Konformation übergeht, wenn es durch Inkubation mit dem Detergenz n-Dodecyl-β-D-Maltosid ausreichend delipidiert wird, und dass die Zugabe von Lipiden zum offenen Kanal diesen Prozess wieder umkehrt. Die Ergebnisse stimmen mit dem Öffnungs-Modell überein, das besagt, dass die Menge der Lipidmoleküle in den Taschen und Furchen für den Konformationszustand von MscS verantwortlich ist. Darüber hinaus führte die Inkubation mit dem Detergenz Laurylmaltose-neopentylglykol, das sowohl stabilisierende als auch delipidierende Eigenschaften hat, zu einer hochaufgelösten Struktur des offenen MscS, die ein ausgeprägtes Netzwerk von Liganden zeigt. Auf der Grundlage dieser Struktur wird ein aktualisiertes Öffnungs-Modell vorgeschlagen, das besagt, dass bei der Öffnung Lipide aus den Taschen in die zytosolische Lipidschicht der Membran wandern, während Lipide aus der periplasmatischen Lipidschicht in die Furchen gelangen, die zwischen den sensor paddles entstehen.

Antikörper, die gegen eine klinisch relevante Gruppe von Rezeptoren innerhalb der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) gerichtet sind, darunter CD40 und CD95 (Fas/Apo-1), benötigen ebenfalls eine Bindung an Fc-Gamma-Rezeptoren (FcγRs), um eine starke agonistische Wirkung zu entfalten. Diese FcγR-Abhängigkeit beruht weitgehend auf der bloßen zellulären Verankerung durch die Fc-Domäne des Antikörpers und benötigt dabei kein FcγR-Signalling. Ziel dieser Doktorarbeit war es, das agonistische Potenzial von αCD40- und αCD95-Antikörpern unabhängig von der Bindung an FcγRs durch die Verankerung an Myelomzellen zu entfalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Antikörpervarianten (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) gegen die TNFRSF-Mitglieder CD40 und CD95 genetisch mit einem einzelkettig kodierten B-Zell-aktivierenden Faktor (scBaff) Trimer als C-terminale myelom-spezifische Verankerungsdomäne fusioniert, welche die Fc-Domäne-vermittelte FcγR-Bindung ersetzt. Diese bispezifischen Antikörper-scBaff-Fusionsproteine wurden in Bindungsstudien und funktionellen Assays mit Tumorzelllinien untersucht, die einen oder mehrere der drei Baff-Rezeptoren exprimieren: BaffR, Transmembran-Aktivator und CAML-Interaktor (TACI) und B-Zell-Reifungsantigen (BCMA). Zelluläre Bindungsstudien zeigten, dass die Bindungseigenschaften der verschiedenen Domänen innerhalb der Antikörper-scBaff-Fusionen gegenüber der Zielantigene vollständig intakt blieben. In Ko-Kulturversuchen von CD40- und CD95-responsiven Zellen mit BaffR-, BCMA- oder TACI-exprimierenden Verankerungszellen zeigten die Antikörper-Fusionsproteine einen starken Agonismus, während in Ko-Kulturen mit Zellen ohne Expression von Baff-interagierenden Rezeptoren nur eine geringe Rezeptorstimulation beobachtet wurde. Die hier vorgestellten αCD40- und αCD95-Antikörper-scBaff-Fusionsproteine zeigen also Myelom-spezifische Aktivität und versprechen im Vergleich zu herkömmlichen CD40- und CD95-Agonisten geringere systemische Nebenwirkungen., Antibodies that target a clinically relevant group of receptors within the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF), including CD40 and CD95 (Fas/Apo-1), also require binding to Fc gamma receptors (FcγRs) to elicit a strong agonistic activity. This FcγR dependency largely relies on the mere cellular anchoring through the antibody's Fc domain and does not involve the engagement of FcγR signaling. The aim of this doctoral thesis was to elicit agonistic activity from αCD40 and αCD95 antibodies in a myeloma cell anchoring-controlled FcγR-independent manner. For this purpose, various antibody variants (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) against the TNFRSF members CD40 and CD95 were genetically fused to a single-chain-encoded B-cell activating factor (scBaff) trimer as a C-terminal myeloma-specific anchoring domain substituting for Fc domain-mediated FcγR binding. These bispecific antibody-scBaff fusion proteins were evaluated in binding studies and functional assays using tumor cell lines expressing one or more of the three receptors of Baff: BaffR, transmembrane activator and CAML interactor (TACI) and B-cell maturation antigen (BCMA). Cellular binding studies showed that the binding properties of the different domains within the fusion proteins remained fully intact in the antibody-scBaff fusion proteins. In co-culture assays of CD40- and CD95-responsive cells with BaffR, BCMA or TACI expressing anchoring cells, the antibody fusion proteins displayed strong agonism while only minor receptor stimulation was observed in co-cultures with cells without expression of Baff-interacting receptors. Thus, the herein presented αCD40 and αCD95 antibody fusion proteins display myeloma cell-dependent activity and promise reduced systemic side effects compared to conventional CD40 and CD95 agonists.

The multifunctional enzyme type 1 (MFE-1) plays a crucial role in the fatty acid metabolism. It is a monomeric enzyme that catalyzes three reactions in the β-oxidation pathway: the isomerization, the hydrogenation, and the dehydrogenation. These three reactions occur at two different active sites. The MFE-1 consists of a total of five domains A, B, C, D and E. The first active site is located in the crotonase part which is formed by domain A, while domain C (in the HAD part) hosts the second active site. Isomerization and hydrogenation are carried out at the first active site, while the third reaction (dehydrogenation) occurs at the second active site. To date, the detailed mechanistic functions as well as the basic structure-dynamics relations are not known in detail. Moreover, no crystal structures of MFE-1 with embedded substrates in the second active site or intermediates from the first active site have been shown so far. This dissertation addresses these issues by the investigation of various MFE-1 constructs through molecular dynamics simulations in the form of classical and accelerated MD. Regarding the first active site, two residues are proposed to be essential for the catalytic functionality of MFE-1. Therefore, in the first step, these two residues, the glutamates E103 and E123, were investigated. Their protonation state, which was previously unknown, was determined and their function was investigated in relation to the mechanism concerning the hydrogenation reaction. In addition to the protonation state, within the scope of this dissertation hitherto undiscovered conformational as well as distance dependencies could be identified for the first time. Furthermore, the MFE-1 has been investigated for fundamental dynamic structure-function relations using dynamic cross correlation and normal mode analysis. Based on these domain-dynamics-structure relations, correlations of MFE-1 were revealed which possibly indicate potential substrate channeling to enable the substrate transport from the first to the second active site. Previously no structural model with an embedded substrate in the second active site was available. For this reason, an MFE-1 model with a substrate in the second active site was generated by docking. These calculations provide essential insights into the mechanism of MFE-1 that were undiscovered so far. Additionally, the results serve as a model and fundamental basis for future investigations on its mechanistic properties., Das multifunktionale Enzym Typ 1 (MFE-1) spielt eine entscheidende Rolle im Fettsäurestoffwechsel. Es ist ein monomeres Enzym, das drei Reaktionen des β-Oxidationsweges katalysiert: die Isomerisierung, die Hydrierung und die Dehydrierung. Diese drei Reaktionen laufen an zwei verschiedenen aktiven Zentren ab. Das MFE-1 besteht aus insgesamt fünf Domänen A, B, C, D und E. Das erste aktive Zentrum befindet sich im Crotonase-Abschnitt, der von der Domäne A gebildet wird, während die Domäne C (im HAD-Abschnitt) das zweite aktive Zentrum beherbergt. Die Isomerisierung und Hydrierung laufen im ersten aktiven Zentrum ab, während die dritte Reaktion (Dehydrierung) im zweiten aktiven Zentrum stattfindet. Bis heute sind die detaillierten mechanistischen Funktionen sowie die grundlegenden Struktur-Dynamik-Beziehungen nicht im Detail bekannt. Außerdem wurden bisher keine Kristallstrukturen von MFE-1 mit eingebetteten Substraten im zweiten aktiven Zentrum oder Zwischenprodukten aus dem ersten aktiven Zentrum gezeigt. In dieser Dissertation werden diese Fragen durch die Untersuchung verschiedener MFE-1-Konstrukte mittels Molekulardynamiksimulationen in Form von klassischer und beschleunigter MD angegangen. Für das erste aktive Zentrum stehen dabei zwei Aminosäuren im Fokus, die für die katalytische Funktionalität von MFE-1 essenziell sind. Daher wurden im ersten Schritt der Protonierungszustand, der bisher unbekannt war, beider Aminosäuren (Glu103 und Glu123) berechnet. Darüber hinaus wurde die Funktion der Glutamate in Bezug auf den Mechanismus hinsichtlich der Hydrierungsreaktion untersucht. Neben dem Protonierungszustand konnten im Rahmen dieser Dissertation erstmals bisher unentdeckte Konformations- sowie Abstandsabhängigkeiten identifiziert werden. Außerdem wurde das MFE-1 mittels dynamic Cross Correlation und Normalmodenanalyse auf grundlegende dynamische Struktur-Funktions-Beziehungen untersucht. Basierend auf diesen Dynamik-Struktur-Beziehungen wurden Domänen-Korrelationen aufgedeckt, die möglicherweise auf ein potentielles Substrat-Channelling hinweisen, um den Substrattransport vom ersten zum zweiten aktiven Zentrum zu ermöglichen. Zuvor war kein 3D-Modell mit einem eingebetteten Substrat im zweiten aktiven Zentrum verfügbar. Aus diesem Grund wurde ein MFE-1-Modell mit einem Substrat im zweiten aktiven Zentrum durch Docking erstellt. Diese Berechnungen liefern wesentliche Einblicke in den Mechanismus von MFE-1, die bisher unentdeckt waren. Darüber hinaus dienen die Ergebnisse als Modell und grundlegende Basis für künftige Untersuchungen der mechanistischen Eigenschaften.

Als Reaktion auf DNA-Schäden aktivieren Zellen den NF-κB-Signalweg, der die apoptotischen Reaktionen reguliert. Die Signalwege, die die zytoplasmatischen NF-κB-Dimere als Reaktion auf eine breite Palette von Immun- und Entzündungssignalen aktivieren, sind umfassend untersucht worden; die molekularen Mechanismen, die die Kern-DNA mit der zytoplasmatischen Aktivierung von NF-κB verbinden, sind jedoch relativ wenig bekannt. Hier haben wir mithilfe genomweiter siRNA-Screens systematisch Regulatoren und wesentliche Komponenten identifiziert, die für die durch DNA-Schäden ausgelöste Aktivierung des NF-κB-Signalwegs erforderlich sind. Von den identifizierten Komponenten konnten wir nachweisen, dass TSG101 die NF-κB-Aktivierung durch DNA-Schäden reguliert. Wir konnten zeigen, dass TSG101 mit PARP1 interagiert und dessen katalytische Aktivität kontrolliert. Die Ausrichtung auf TSG101 führt dazu, dass PARP1 in DNA-Läsionen gefangen wird und die durch DNA-Schäden ausgelöste NF-κB-Aktivierung vermindert wird. In Abwesenheit von TSG101 fehlen den Zellen PAR-abhängige zelluläre Reaktionen und sie sind für die durch DNA-Schäden ausgelöste Apoptose sensibilisiert. Die signalinduzierte Verarbeitung von p100 ist ein wesentlicher Schritt für die Aktivierung des nicht-kanonischen NF-κB-Wegs. Trotz seiner Bedeutung für die Immunantwort, die Entwicklung und verschiedene bösartige Erkrankungen wurden die Komponenten des Ubiquitin-Proteasom-Systems, die die Verarbeitung von p100 regulieren, nie mit endogenen Systemen analysiert. In dieser Studie haben wir mit Hilfe eines CRISPR-Cas9-basierten Knock-out-Screening-Systems nicht-redundante E3-Ligasen identifiziert, die für die signalinduzierte p100-Verarbeitung erforderlich sind. Außerdem haben wir das TWEAK-induzierte Ubiquitinom mittels Massenspektrometrie charakterisiert. In response to DNA damage, cells activate the NF-κB pathway that regulates the apoptotic responses. The signaling pathways that activate the cytoplasmic NF-κB dimers in response to a wide range of immune and inflammatory signals have been investigated extensively; however, the molecular mechanisms that link the nuclear DNA with cytoplasmic activation of NF-κB is relatively less known. Here we systematically identified regulators and essential components required for the DNA damage-induced activation of the NF-κB pathway using genome-wide siRNA screens. Amongst the identified components, we validated that TSG101 regulates the NF-κB activation by DNA damage. We showed that TSG101 interacts with PARP1 and controls its catalytic activity. Targeting TSG101 consequently achieves trapping of PARP1 in DNA lesions and diminishes the DNA damage-induced NF-κB activation. In the absence of TSG101, cells lack PAR-dependent cellular responses and are sensitized to DNA damage-induced apoptosis. The signal-induced processing of p100 is an essential step for the activation of the non-canonical NF-κB pathway. Despite of its importance in immune responses, development, and several malignancies, the ubiquitin-proteasome system components regulating p100 processing were never analyzed using endogenous systems. In this study, utilizing a CRISPR Cas9 based knock out screening system we identified non-redundant E3 ligases required for the signal-induced p100 processing. We also characterized the TWEAK-induced ubiquitinome via mass spectrometry.

Ionenkanäle spielen eine wichtige Rolle in vielen physiologischen Prozessen. Während manche Kanäle hochspezifisch für eine Ionensorte sind, sind andere Kanäle weniger selektiv. Tetramere Ionenkanäle weisen eine gemeinsame Grundarchitektur auf, von der nur ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) abweichen, deren Struktur im Vergleich zu den anderen invertiert ist. Eine Untergruppe der iGluRs stellen α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid Rezeptoren (AMPARs) dar, welche im Zentralnervensystem von Wirbeltieren die Mehrheit der exzitatorischen Neurotransmission übernehmen. Eine einzelne posttranskriptionelle Veränderung (Glutamin zu Arginin) an der Spitze des Selektivitätsfilters (SF, Q/R Stelle) von AMPAR-Typ 2 (GluA2) macht den Kanal quasi undurchlässig für Ca2+. Das Ziel dieser Arbeit war das Erstellen einer GluA2-Kanalchimäre mit Hilfe des bakteriellen Kanals NaK. Mutation rund um die Q/R Stelle wurden nicht toleriert von der Chimäre, während C-terminale Mutationen des SF stabil waren und für strukturelle Studien verwendet wurden. Die Entfernung einer Aminosäure im Vergleich zum NaK Wildtyp erzeugte eine Begradigung des SF und eine Erweiterung der wassergefüllten Ausbuchtung. Überraschenderweise kristallisierten die NaK Chimären überwiegend in zweifach symmetrischer Anordnung. Vor allem im SF kam es zu ausgeprägter lokaler Asymmetrie, unabhängig von der Ionenzusammensetzung. Um die Flexibilität des SF näher zu untersuchen, wurden Aminosäuren von NaK in GluA2 integriert und mithilfe von Patch-clamp Elektrophysiologie untersucht. Gleichsam wie in NaK, wurden Mutationen an der Filterspitze nicht toleriert, wohingegen die C-terminale Hälfte problemlos ausgetauscht werden konnte. Die funktionelle Integrität der NaK Chimäre wurde mithilfe von Einzelkanalmessungen in Bilayern überprüft. Zusätzlich wurden, auf Basis der gelösten Strukturen, Molekulardynamiksimulationen durchgeführt, welche einen dynamischen Einblick in den Permeationsmechanismus erlauben. Ion channels play an important role in many physiological processes, for example the generation of action potentials. While some channels display high selectivity for one ion species, others are more promiscuous. All tetrameric cation channels share the same principal architecture, but the transmembrane domain of ionotropic glutamate receptors (iGluRs) is inverted relative to the other members. A subfamily of iGluRs, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors (AMPARs), mediates the vast majority of excitatory neurotransmission in the vertebrate central nervous system. In AMPA-type 2 iGluRs (GluA2), a single post-transcriptional modification (glutamine to arginine) at the tip of the selectivity filter (SF, Q/R site) renders the channel Ca2+ impermeable. The aim of this thesis was therefore to create an AMPAR pore mimic by using the bacterial channel NaK. Unfortunately, mutations around the Q/R site abolished expression of the NaK-GluA2 chimera, while C-terminal mutations of the SF were stable and could be used for structural studies. The shortening of the SF by one amino acid caused a straightening and opened an extended water-filled vestibule. Strikingly, most of the tested chimeras exhibited twofold symmetry with strong local asymmetry in the mutated part of the SF independent of the ion type present. For functional tests, residues from NaK wt were also swapped into GluA2. N-terminal mutations abolished the current response, whereas C-terminal mutations behaved wt-like. Single-channel bilayer experiments confirmed the functional integrity of the NaK-GluA2 chimera. Additionally, extensive molecular dynamics simulations, based on the solved structures, were carried out alongside. In summary, it could be demonstrated that the SF of the non-selective NaK-GluA2 chimera is highly flexible and accommodated all tested ions. Ion binding is accompanied by local asymmetric rearrangements, possibly creating an energetically simple way to allow permeation.

Ein vielversprechender Ansatz zur Verhinderung von Infektionen mit Influenzavirus ist die kompetitive Inhibition der Virusanhaftung an die Wirtszellen durch Behinderung der Bindung des viralen Hemagglutinin (HA) an sialylierte Glykanrezeptoren. Allerdings erschwert die hohe Variabilität des HA die Entwicklung von universellen Sialinsäure (SA)-basierten Virostatika. In dieser Arbeit wurde der antivirale Effekt von mit SA funktionalisierten Polyglycerolen (PGs) auf Influenza A Viren (IAV) evaluiert. SA-basierte PGs waren nur bei der Inhibition einer geringen Anzahl an IAV Stämmen effektiv. Um die molekulare Basis für diese Beschränkung zu ergründen, wurden mittels Serienpassagen IAV Mutanten selektiert, die gegen sialyliertes PG resistent waren. Es entwickelten sich drei unabhängige resistente Virusvarianten, die einen einfachen bzw. doppelten Aminosäuren-Austausch in der HA RBS aufwiesen. Durch Hemagglutinations-Elution, Einzel-Virus Kraft-Untersuchungen und Glykanarray Analysen konnte eine verringerte Rezeptorbindungsstabilität sowie ein verändertes Rezeptorbindeprofil für diese Virusvarianten gezeigt werden. Interessanterweise wurden drei unterschiedliche Fälle von Virusbindung und Inhibition beobachtet: 1) Virales HA wurde vom PG gebunden und die Virusreplikation inhibiert, 2) virales HA wurde vom PG gebunden ohne Inhibition der Virusreplikation und 3) Virales HA wurde nicht vom PG gebunden und es gab keine Inhibition. Diese Ergebnisse suggerieren, dass es eine Mindestanforderung an die Affinität oder Avidität für eine effektive kompetitive Inhibition von HA gibt. Durch modifizierte PGs, die Sialyllaktose statt SA und einen Amidlinker enthielten, konnte das Potential von PGs als breite IAV Inhibitoren demonstriert werden. Zusammenfassend bieten die Ergebnisse dieser Arbeit wertvolle Einblicke in die Entwicklung von Resistenzen in IAV gegen Inhibitoren des HA-Attachment und in das strategische Design von sialylierten mutlivalenten Inhibitoren gegen IAV. A promising approach to block influenza virus infections is competitive inhibition of virus attachment to host cells by interfering with binding of the viral surface protein hemagglutinin (HA) to sialylated glycan receptors. However, the high structural and genetic variability of the viral HA has hampered the development of universal sialic acid (SA)-based antivirals. Here, the antiviral effect of biocompatible Polyglycerols (PGs) functionalized with SA on influenza A virus (IAV) was evaluated. PG compounds were only effective at inhibiting a narrow spectrum of IAV strains. To elucidate the molecular basis for this restriction, PG-resistant IAV mutants were selected using serial passaging. Three independent resistant variants developed with single or double amino acid changes mapping to the HA RBS. By employing hemagglutination elution, single-virus force measurements and glycan array analyses, a reduced receptor binding stability as well as an altered receptor binding profile of mutant viruses was shown. Intriguingly, three different cases of virus binding and inhibition were observed using Cy3-labeled compound: 1) viral HA was bound by the compound and resulted in inhibition of replication, 2) viral HA was bound by the compound but replication was not inhibited and 3) viral HA was not bound by the compound and no inhibition occurred. These results suggest that there is an affinity or avidity requirement for effective competitive inhibition of HA attachment. The suitability of PGs as IAV inhibitors with potential for broad activity was demonstrated by a modified PG incorporating sialyllactose instead of SA and an amide linkage covering an extended spectrum of inhibited IAV strains. Taken together, results described in this thesis provide valuable insights into the development of resistance against inhibitors of HA attachment in IAV and into the strategic design of sialylated, multivalent inhibitors aiming at broad activity against influenza viruses.