Strukturelle und biochemische Charakterisierung der Biosynthese des Klasse IV-Lanthipeptids Curvocidin

Lanthipeptide sind ribosomal exprimierte und posttranslational modifizierte Peptide (RIPPs), deren verbindendes Strukturmotiv spezielle intramolekulare Thioetherbrücken darstellen, die (Methyl-)Lanthionin und (Methyl-)Labionin genannt werden. Abhängig von Aufbau und Struktur der Synthetasen werden Lanthipeptide in vier Klassen eingeteilt. Während die mono- und bifunktionalen Synthetasen der Klassen I und II weitestgehend charakterisiert sind, ist über Struktur und Mechanismus der trifunktionalen Synthetasen der Klassen III und IV bisher kaum etwas bekannt. Curvocidin ist ein neuartiges Klasse IV-Lanthipeptid, das von dem extremophilen Bakterium Thermomonospora curvata gebildet wird. Es ist mit einer Länge von 21 Aminosäuren und drei Methyl-Lanthioninbrücken ein relativ kleines Lanthipeptid mit einer verhältnismäßig geringen Zahl an posttranslationalen Modifikationen. Auch das Gencluster ist mit nur fünf Genen relativ klein. Aus diesen Gründen eignet sich das System Curvocidin hervorragend als Modell für die intensive Untersuchung der trifunktionalen Synthetasen der Klasse III und IV. Durch Klonierung und Aufreinigung der rekombinanten Curvocidin-Synthetase und deren Substrat, dem rekombinanten Curvocidin Vorläufer-Peptid, konnte die Funktion des Enzyms in vitro analysiert werden. Ausgehend von den Ergebnissen wurde ein Modell erstellt, das den iterativen Syntheseprozess der drei Methyl-Lanthioninbrücken abbildet. Darüber hinaus konnten spezifische Aminosäuren in der Synthetase-Primärstruktur identifiziert werden, die eine essentielle Rolle bei der Katalyse einnehmen. Für ein eingehendes Verständnis der Enzymfunktion ist ein detailliertes Strukturmodell erforderlich. Bisher ist keine Struktur einer trifunktionalen Lanthionin-Synthetase bekannt. Durch umfangreiche Optimierungen konnten große Mengen an hochreiner Curvocidin-Synthetase aufgereinigt werden. Damit wurden durch Hochdurchsatz-Testierungs-Methoden (screening) die besten Bedingungen für eine Kristallisation des Enzyms ermittelt. Mithilfe der Röntgen-Proteinkristallographie konnte das erste Strukturmodell einer trifunktionalen Lanthionin-Synthetase erstellt werden. Trotz Cokristallisation sind Substrat, Cofaktoren und Mg(2+)- wie auch Zn(2+)-Ionen nicht in der Elektronendichtekarte sichtbar.
Lanthipeptides are ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) that contain specific intramolecular thioether bridges called (methyl-)lanthionine or (methyl)labionin. These modifications are formed by specific lanthionine-synthetases which are categorized into four distinct classes depending on their organization and structure. The mono- and bifunctional synthetases of classes I and II are largely characterized. However, there is little known about the structure and mechanism of the lanthionine-synthetases of classes III and IV. Curvocidine is a novel class IV lanthipeptide produced by the extremophile bacterium Thermomonospora curvata. It comprises 21 amino acids and three methyllanthionine bridges, therefore representing a relatively small lanthipeptide with a low degree of post-translational modification. Also the gene cluster consisting of only five genes is relatively small. Thus, the Curvocidine system is well suited to serve as a model for an intensive study of class III and IV lanthionine-synthetases. By means of cloning and isolating recombinant Curvocidine synthetase and the respective substrate, recombinant Curvocidine precursor peptide, we were able to analyse the enzyme function in vitro. Based on these results a model is proposed illustrating an iterative synthesis process. Moreover, specific amino acids in the synthetase sequence were identified that are crucial to the catalytic function. A more sophisticated insight into the enzyme’s catalytic mechanism requires a detailled structure model. As of yet there is no such structure of a trifunctional lanthionine-synthetase available. By means of extensive optimization a large quantity of highly pure protein was isolated and used for screening for optimal cristallization conditions. Using X-ray protein cristallography we were able to achieve the first structure model of a trifunctional lanthionin-synthetase. Despite efforts of co-cristallization, the substrate, co-factors as well as Mg(2+)-and Zn(2+)-ions are not visible in the electron density map.