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茉莉花（マツリカ、Jasminum sambac）は、アラビアからインドにかけて分布するモクセイ科の熱帯性常緑低木である。乾燥した花は香りが強く、食品、化粧品に利用されるとともに、伝統医学において下痢、発熱、結膜炎などの治療に用いられている。我々はメディシナルフラワーの機能性解析研究を行っており、スクリーニングの結果から、茉莉花の花部エキス（JSFE）が、リポポリサッカライド（LPS）刺激マウスマクロファージ様RAW264 細胞においてプロスタグランジンE２（PGE２）および一酸化窒素（NO）を抑制することを見出した。そこで本研究では、JSFEの抗炎症作用を解明することを目的として、活性成分の単離・同定を行った。まずJSFEを水に懸濁後、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、ブタノールで順次分画し、各分画のPGE2 および NO 抑制能を調べたところ、酢酸エチル画分が毒性を示さずPGE２および NO を顕著に抑制した。さらに各種クロマトグラフィーを繰り返すことで、酢酸エチル画分から quercetin (1)、kaempferol (2)、benzyl β-D-glucopyranoside (3)を単離同定した。1-3のうち、1および2はPGE２および NO を抑制し、その作用は1の方が強かった。一方、3は抑制作用を示さなかった。これらの結果より、1および2が JSFE の抗炎症作用に寄与することが示唆された。, Jasminum sambac (L.) Aiton, commonly known as Arabian jasmine, is a small shrub with fragrant and white flowers that is native to India. The flowers are used in various applications such as cosmetics, food, and folk medicine. In our preliminary screening of medicinal flowers, a methanolic extract of J. sambac flower (JSFE) was found to inhibit prostaglandin E2 (PGE2) and nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated murine macrophage-like RAW264 cells. This study aimed to isolate active compounds having anti-inflammatory potential from JSFE. To identify the active compounds that suppress PGE2 and NO production, JSFE was suspended in water and successively partitioned using hexane, dichloromethane (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and n-butanol (n-BuOH). Comparative analysis revealed that the EtOAc fraction inhibited PGE2 and NO production without causing cytotoxicity. Bioassay-guided separation of the EtOAc fraction isolated three compounds: quercetin (1), kaempferol (2), and benzyl β-D-glucopyranoside (3). Among the isolated compounds, 1 and 2 inhibited PGE2 and NO production without causing cytotoxicity, and the inhibitory potency of 1 was higher than that of 2. In contrast, 3 did not show significant inhibition. These results suggest that 1 and 2 can be attributed to the anti-inflammatory potential of JSFE.

ギプス固定解除後や日常の不活動によって，筋などに損傷が認められないにも関わらず疼痛が出現することが明らかになっている。この疼痛には神経成長因子（NGF）の関与が認められているものの，どこから産生されているか明らかではない。また，マクロファージも疼痛への関与が報告されており，マクロファージはNGFを産生することから，マクロファージがNGF産生ならびに疼痛発生に与える影響について調べた。ギプス固定3日前から固定期間中に繰り返しマクロファージ枯渇剤を投与し，その間の皮膚ならびに筋の機械痛覚閾値の変化と，筋におけるNGFタンパク量や後根神経節のNGF陽性細胞数を調べた。その結果，マクロファージ枯渇剤を投与した動物でも皮膚・筋機械痛覚閾値の低下が認められ，筋におけるNGFタンパク量や後根神経節のNGF陽性細胞数に差は認められなかった。これらのことから不活動による疼痛発生にマクロファージは影響を及ぼしていないと結論した。

甲医博第985号

本研究では、種々の病態バイオマーカーとして期待されている循環血中の細胞外小胞（Extracellular Vesicles：EVs）の質的・量的な変動の生理的意義の解明を目的としており、病態形成時のマクロファージの形質変化に着目した。その結果、血中EVsは、血液を介して全身のマクロファージの形質変化を誘導しており、種々の病態形成に起因するEVsに含まれるmiRNAカーゴ等の変化が、マクロファージの感染防御を規定することが示唆された。また、その血中EVsの変化は、EVsの産生源である血小板の質的・動的変動に影響されることが考えられた。In this study, we aimed to elucidate the physiological significance of qualitative and quantitative fluctuations of extracellular vesicles (EVs) in circulating blood, which are expected as biomarkers for various pathological conditions, and focused on the changes in the phenotype of macrophages. The results suggested that blood EVs induce phenotypic changes in macrophages via blood, and changes in miRNA cargo of EVs, which caused by the formation of various pathological conditions, regulate macrophage infection protection. In addition, it was considered that the changes in blood EVs were affected by the qualitative and quantitative fluctuations of platelets, which are the sources of EVs., 科学研究費助成事業研究成果報告書 研究種目：若手研究, 研究期間：2019～2021, 課題番号：19K16545 研究分野：免疫学, 研究者番号：10805881. 10p.

More than 100 years have passed since Elie Metchnikoff discovered macrophage. Over the recent decade, attracting information about macrophage polarization have been reported. This is because many molecules have been identified as markers of macrophage polarization. Additionally, mechanistic insights have been demonstrated by experiments with various stimuli-induced macrophage polarization. Historically and simply, macrophages are divided into M1 (classically activated) and M2 (alternatively activated). However, some of them are not specific yet. Studies in the field of cardiology revealed the plasticity of macrophages and their subsets are divided into details: Mhem, MHb, Mox and M4 macrophages. M2 macrophages were further divided in M2a, M2b, M2c and M2d. There appears to be more phenotypes of macrophages. However, there still lack studies in dermatological field. This review summarizes the spectrum of macrophage activation and finding about various roles of macrophages in the dermatological field.

細菌性エンドトキシンに対するマクロファージの感受性は，血小板あるいは血小板由来の可溶性画分の添加により低下し，一酸化窒素 (NO) および炎症性サイトカインの産生が減少した．このようなマクロファージ機能の抑制にはNF-κBシグナル経路の負の制御，特にNO産生低下には一酸化窒素合成酵素の発現抑制及びアルギナーゼの発現増強の関与が示された．また，エンドトキシンに対する感受性の高感度測定法の開発を試みた．分化型単球様細胞株を利用する方法及びNF-κB応答配列の導入細胞を利用したレポーターアッセイ法を開発した．これらにより高感度及び短時間での測定が可能となった．Susceptibility of macrophages to bacterial endotoxin was reduced in the presence of platelets or proteins derived from platelets, and these cells produced lowered levels of nitric oxide (NO) and inflammatory cytokines. The suppression of these macrophage functions was found to involve the negative regulation of the NF-κB signaling pathway; especially increased expression of nitric oxide synthase and decreased expression of arginase in relation to the suppression of NO synthesis. Furthermore, we attempted to develop novel sensitive methods for the evaluation of macrophage susceptibility to endotoxin. We have developed two methods, in which we utilized differentiated human monocytic cells or a reporter cell line containing NF-κB-responsive elements., 科学研究費助成事業研究成果報告書 研究種目：基盤研究(C)（一般）, 研究期間：2017～2019, 課題番号：17K08393 研究分野：免疫学，生物系薬学, 研究者番号：00143503. 8p.

甲医博第920号

鉄過剰症は輸血依存患者の生命予後を悪化させる重要な問題である。輸血後鉄過剰症では、マクロファージに対するヘム鉄負荷が病態の中心となる。著者らは、ヘム鉄によって誘導されるマクロファージの細胞死が鉄依存性細胞死・フェロトーシスに合致することを見出し、Transfusion and Apheresis Scienceに論文報告した。論文の要点を、著者の見解を含めて紹介する。, Iron overload is a major issue for transfusion- dependent patients. Macrophages and heme iron play a central role in iron overload due to transfusion. We found that hemin-induced macrophage cell death is consistent with ferroptosis, an iron-dependent non-apoptotic cell death. Our results were recently published in "Transfusion and Apheresis Science". In the present report, I summarize the paper with my personal insight.

ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞(SHED)は, 乳歯歯髄組織に存在している間葉系幹細胞であり, SHED が放出する分泌因子には, 組織修復能と免疫調整能があることが報告されている. 本研究は, 骨粗鬆症に対するSHED の有効性について検討を行った.交換期のため脱落した乳歯からSHED を分離し, 継代培養を行った後に, 培養上清を回収し実験に用いた. 11 週齢C3H/HeJ 雌マウスに対し卵巣摘出(OVX)を施行, OVX 直後から週2回, 無血清培地(SF-MEM 群)あるいはSHED 培養上清(SHED-CM 群)を腹腔内に投与した.投与開始4 週後に, 大腿骨の状態をμCT で観察した. さらに, 腹腔内液におけるマクロファージ分画と, 末梢血中のIL-17 およびIFN-γ 産生細胞数についFACS 解析を行った.大腿骨における骨量は, SHED-CM 群ではSF-MEM 群と比較し有意に高い値を示した. IL-17 およびIFN-γ 産生細胞数は, SHED-CM 群では有意に減少していた. また腹腔内液中のマクロファージは, SHED-CM 群ではM2 マクロファージの有意な増加を認めた. さらに, 中和抗体を用いてM2 マクロファージの発現を抑制したところ, SHED-CM の投与にも関わらず,IL-17 およびIFN-γ 産生細胞数と骨量は, SF-MEM 群と有意差は確認されなかった.OVX による骨粗鬆症において, SHED-CM は, 骨吸収抑制効果を有することが明らかになった. このSHED-CM による骨吸収抑制効果は, M2 マクロファージとIL-17 およびIFN-γ産生細胞の活性が関わっていることが示唆された., (主査) 教授 八若 保孝, 教授 田村 正人, 教授 網塚 憲生, 准教授 吉村 善隆, 歯学研究科(口腔医学専攻)

学位論文, お茶の水女子大学人間文化創成科学研究科博士(学術)学位論文･平成31年3月22日授与(甲号第301号)

【序文】小児頻回再発型ネフローゼ症候群ではシクロスポリン(CsA)治療が再発予防に有効であるが，その長期投与は慢性腎陣害を惹起する．腎障害発症の明確な機序は不明であり，今回CsAによる尿細管間質障害発症の機序を考察した．特にM2型マクロファージに着目し，間質障害にマクロファージがどのように寄与するか検討した．【方法】CsAを2年以上投与された頻回再発型ネフローゼ症候群11症例を対象とし,CsAを投与されていない頻回再発型ネフローゼ症候群6症例をコントロールとした．腎生検組織を用いて，免疫抗体法にて,CD68 (汎マクロファージマーカー),CD86 (M1型マクロファージマーカー),CD163 (M2型マクロファージマーカー）を染色し，各々のマクロファージ数をカウントした．同様にα-smooth muscle action (α-SMA), I型コラーゲン, connective tissue growth factor (CTGF)を染色した． α-SMA陽性領域Ⅰ型コラーゲン陽性領域の面積を計測し，線維化の程度の指標とした． また，各症例のステロイド（プレドニゾロン; PSL)投与量を算出し，マクロファージ数，間質線維化の程度との相関を検討した．【結果】CsA投与群と非投与群で,糸球体病変に差異はみられなかったが，間質では,CsA投与群でCD68陽性CD1631場性のM2型マクロファージの浸潤が顕著であった.CD163陽性細胞は, 間質のα-SMA, I型コラーゲンの発現領域に一致して局在した．間質の線維化の程度は，PSL投与量(r=0.74,P

ニコチンによるマクロファージからの炎症性サイトカイン産生促進機能について検討した。U937細胞にP.gingivalis(Pg)由来LPSのみを添加して培養した場合と比べPg由来LPSと二コチンの両方を添加した場合は、pro-IL-1β mRNAの発現がニコチンの濃度依存的に促進され、その濃度が10^-3Mで最大となった。Pg由来LPSと10^-3Mニコチンの併用効果が認められる培養時間は2～4時間であった。U937細胞におけるIL-1β、NLRP3およびcaspase-1いずれの産生量も、Pg由来LPSのみを添加した時と比べ、Pg由来LPSとニコチンを併用添加した時に、その産生が増加した。さらに、NLRP3においては、ニコチン単独添加においてもその産生の促進が認められた。

マクロファージは，細菌感染やがん細胞の発生の際に活性化する細胞であり，一酸化窒素（NO）などの炎症性物質を産生し，生体を防御する働きをもつ。しかし，炎症性物質の過剰産生は，リウマチなど多くの疾患の原因となるため，これを抑える抗炎症物質が広く機能性食品や化粧品，医薬品として利用されている。本研究では，エミュー（Dromaius novaehollandiae）の皮下脂肪から得られるエミューオイルが，マクロファージによって産生されるNOに与える影響を調べた。マウス由来培養マクロファージ（RAW264.7）をリポポリサッカリド（LPS）で刺激すると，NOの産生量は6倍に増加した。一方，エミューオイルを添加した培養液で培養したRAW264.7では，この増加はエミューオイルの存在下で抑制された。また，RAW264.7をLPSで刺激するとNO合成酵素（NOS）の発現量が2倍に増加した。このNOSの発現量の増加は，エミューオイルで培養したRAW264.7では抑制された。したがって，エミューオイルはLPSによるマクロファージのNOS過剰発現を抑制し，NOの産生量を減少させることが明らかとなった。すなわち，エミューオイルには，過剰な炎症性物質の産生を抑制する効果があることが示唆された。, Macrophage, which is the cells activated by bacterial infection and growth of cancer cells, produces inflammatory mediators such as nitric oxide (NO) and plays a role in protecting the body. But overproduction of the inflammatory mediators causes various diseases such as rheumatoid arthritis. Therefore, the compounds suppressing the overproduction of inflammatory mediators are widely applied to functional foods, cosmetics and pharmaceuticals. In this study, we examined the effects of emu oil, obtained from emu (Dromaius novaehollandiae), on the production of NO by macrophage. When a cultured cell line of mouse macrophage (RAW267.4) was stimulated by lipopolysaccharide (LPS), NO production was increased by 6-times. Addition of emu oil to the culture medium inhibited the LPS-induced NO production. A stimulation of RAW264.7 by LPS increased twice the expression level of NO synthase (NOS). Emu oil decreased the LPS-induced increase in NOS. These results suggest that emu oil reduced the LPS-induced NO production by inhibiting the expression of NOS in RAW264.7. It is likely that emu oil possesses the ability to reduce the production of anti-inflammatory mediators by macrophage.

蜂蜜は蜜蜂により産生される天然成分で、食用としてだけではなく、健康維持や創傷、風邪、皮膚炎の治療薬として世界で広く利用されている。我々は、これまでにナイジェリア産の蜂蜜が免疫作用を示すことを報告してきたが、日本国産蜂蜜については、まだ免疫機能への十分な解明がなされていない。そこで、日本国産蜂蜜による免疫機能として、サイトカインの遺伝子発現に及ぼす影響を、ソバ、クリ、シロハナマメ、クロガネモチ、シロハナセンダングサ、ミカン、トチ、ビワ、フカ、レンゲ、アカシア、百花蜂蜜について、in vitro、in vivo系で検討した。in vitro系において、マクロファージ細胞株であるRaw264.7細胞のIL-1β mRNA発現は、クリ、シロハナマメ、ミカン、トチ、ビワ、アカシア蜂蜜において有意な増加が認められ、CXCL2 mRNA発現は、クリ、シロハナマメ、トチ蜂蜜において有意な増加が認められた。次に、腹腔細胞数、細胞分画、表面抗原陽性細胞比率への影響を、IL-1β、CXCL2 mRNA発現の増加が見られたクリ、シロハナマメ、トチ蜂蜜について、in vivo系で検討した。マウスの腹腔総細胞数は、クリ、シロハナマメ蜂蜜において有意な増加、トチ蜂蜜において増加傾向が確認され、好中球の比率の増加が認められた。さらに、腹腔細胞の表面抗原陽性細胞比率をFACS解析で測定したところ、クリ、シロハナマメ、トチ蜂蜜においてGr-1、TLR2抗原の有意な増加、シロハナマメ、トチ蜂蜜でCD11b抗原の有意な増加、クリ蜂蜜でCD11b抗原の増加傾向が認められた。CD14、TLR4、F4/80抗原は有意な差は認められなかった。以上の結果により、日本国産蜂蜜はTLR2を介しマクロファージを活性化し、IL-1βを増強し、その結果、好中球のケモカインであるCXCL2 が産生され、好中球が誘導されることが示唆された。, Honey is natural edible product collected by Apis mellifera. Honey is not only for food, widely used in the world for the health maintenance, cold, dermatitis and treatment of wound. We previously reported that honey in Nigeria indicates the immunological effect. But Japanese honey have not been yet fully investigated on the immune function. Therefore, we investigated the effect on the immune function in vitro and in vivo systems using twelve Japanese honeys. In the in vitro system, six kinds and three kinds of honeys significantly enhanced IL-1β and CXCL2 mRNA expressions. In the in vivo system, two kinds of honeys significantly increased peritoneal cells and percentage of neutrophils in mice. Furthermore, two kinds of honeys significantly increased percentage of Gr-1, TLR2 and CD11b surface antigens positive cells in peritoneal cells.Percentage of CD14, TLR4 and F4/80 surface antigens positive cells were not significantly increased. These results suggest that neutrophil was induced by production of CXCL2 via augmentation of IL-1β mRNA through the activation of macrophage mediated with TLR2 by Japanese honey., 1, KJ00009329060, P, 論文, Article

Impairment of macrophage phagocytosis is a major cause of chronic inflammation. Bisphosphonates (BPs) are widely used as anti-osteoclastic agents. The effects of BPs on monocyte-macrophage lineage cells are being increasingly reported; however, the detailed effects of BPs on macrophage phagocytic activity are still unclear.We examined the effects of four BPs: clodronate as a non-nitrogen containing BP (non-N-BP), and pamidronate, alendronate, and zoledronate as nitrogen-containing BP (N-BP), on macrophage phagocytic activity.The uptake of high fluorescence-labeled polystyrene beads by the human monocytic cell line THP-1 was investigated by flow cytometry.All three N-BPs suppressed the phagocytosis of macrophages more potently than the non-N-BP, clodronate.Pamidronate and zoledronate were more potent than alendronate.BP induced the apoptosis of THP-1.Pamidronate and zoledronate induced apoptosis more effectively than clodronate. The method described to observe phagocytosis was simple and quantitative, and might be useful in screening for the effects of drugs, such as N-BP and non-N-BP, on phagocytic activity.

杜仲葉は乾燥重量の22.5% が単糖・オリゴ糖で、18.5% が細胞壁構成多糖類（ペクチン様多糖：ヘミセルロース：セルロース＝51：27：22）である。ペクチン様多糖画分はアラビナン、ガラクタン、あるいはアラビノガラクタンを側鎖として有するラムノガラクツロナンが主要多糖であり、ヘミセルロース画分は酸性アラビノキシランとキシログルカンが主要で、一部中性糖側鎖の少ないラムノガラクツロナンが含まれている１）。先に調製したこのペクチン様多糖およびヘミセルロース性多糖を用い、免疫賦活活性をマクロファージの活性化（NO 産生）を指標として検索した。その結果、ガラクツロン酸直鎖に結合したラムノース残基に、アラビナン、ガラクタンあるいはアラビノガラクタンの中性糖側鎖を有するいわゆるペクチン様多糖がマクロファージを強く刺激する可能性が示唆された。, 弘前大学教育学部紀要. 110, 2013, p.101-106

疣贅状黄色腫(Verruciform Xanthoma, VX)はShaferによって初めて報告された中高年成人の歯肉歯槽粘膜に好発する比較的まれな良性の病変である。今回、我々は下顎歯肉前歯部に生じた疣贅状黄色腫の1例を経験し、その概要に考察を加えて報告する。患者は58歳の男性。右側下顎前歯部歯肉に5×5mm程度の腫瘤に気付き、精査のため朝日大学附属病院を紹介来院した。口腔内所見では、右側下顎側切歯部に乳頭状の腫瘤と同部歯肉の発赤・腫脹を認めたが、圧痛や硬結は認めなかった。良性腫瘍の臨床診断の下、摘出生検を施行した。組織診では、乳頭状に肥厚した角化を伴う重層扁平上皮の増生がみられ、上皮脚の延長と歯肉固有層の乳頭部に限局した多数の泡沫細胞を認めた。これらの泡沫細胞は免疫組織化学的にCD68に陽性を示し、一方S-100タンパクには陰性を示したことから、炎症性細胞由来のマクロファージの集簇による疣贅状黄色腫と診断した。現在、経過観察中であるが、再発は認められない。

破骨細胞の馴化培地中に存在する細胞外微小胞におけるマイクロRNA(miRNA)の発現について検討した。著者らの先行研究において破骨細胞形成に重要と思われたlet-7e、miR-21、miR-33、miR-155、miR-210、miR-223、miR-378、miR-1224の発現を、RT-PCR法を用いて調べた。その結果、破骨細胞の細胞外微小胞にはmiR-378、miR-210、miR-21が極めて高レベルに発現していたが、miR-33やmiR-1224の有意な発現は認めなかった。以上より、破骨細胞は細胞内miRNAのうちの特定のmiRNAを含む微小胞を細胞外に分泌することが示唆された。, Bone is one of the most important oral tissues. Osteoclasts play important roles in bone tissue engineering. Previously, we profiled microRNA (miRNA) expression during osteoclastogenesis using microarrays. miRNAs are small, noncoding RNAs that are involved in various biological processes, including cellular differentiation, proliferation, apoptosis, and organ development. Recently, the presence of miRNAs in extracellular microvesicles was reported. It is not known whether osteoclasts secrete extracellular microvesicles containing miRNAs. We investigated miRNA expression in extracellular microvesicles in conditioned medium of cultured osteoclasts using RT-PCR. Specifically, we investigated eight miRNAs deemed important for osteoclastogenesis in our previous study: let-7e, miR-21, miR-33, miR-155, miR-210, miR-223, miR-378, and miR-1224. Of these, the expression levels of miR-378, miR-210, and miR-21 were very high, while no significant miR-33 or miR-1224 expression was detected. These results suggest that osteoclasts secrete extracellular microvesicles containing specific miRNAs, but that they do not contain the entire set of intracellular miRNAs.

ジャングルハニーは，ナイジェリアの熱帯雨林に生息する野生の蜜蜂が長期にわたり樹木や花から集めてきた蜂蜜である．ナイジェリアではこの蜂蜜が健康や美容の他，風邪，皮膚炎，火傷の治療薬，疾患予防薬として利用されてきた．そのため，生体への免疫作用に対する効果があると考えられる．我々は，ジャングルハニーによる好中球数の増加，好中球機能の増強， 活性酸素産生による抗腫瘍作用を報告している．しかし，ジャングルハニーによる免疫作用についての詳細な機構はまだ解明されていない．そこで，ジャングルハニーによる抗体産生機能 への影響とその機構について検討した． 抗体産生機能については，SRBC(Sheep red blood cell)を抗原とし，抗体産生誘導期と発現期 に及ぼす影響についてPFC(Plaque forming cell)法により検討した．抗体産生誘導期では，ジャングルハニーの腹腔内投与及び経口投与により，コントロール［PBS(-) 投与群］と比べ，ジャングルハニー投与群で抗体産生細胞であるPFC数の有意な増加が認められたが，発現期では有意な差は認められなかった．また，脾臓細胞数はジャングルハニーの腹腔内投与により，有意な増加が認められた．貪食細胞陽性比率は，ジャングルハニー投与による影響は認められなかった．腹腔マクロファージのMHC class II, CD86，脾臓細胞のTCR, CD28, CD3, CD4 の陽性細胞比率は，ジャングルハニー投与群で差は認められなかったが，脾臓細胞のCD19陽性細胞比率のみ有意な増加が認められた．IL-1mRNA発現比率は，腹腔細胞，腹腔マクロファージ及び肺胞マクロファージにおいて，ジャングルハニーにより有意な増加が認められた．IL-6mRNA発現比率は，腹腔細胞と腹腔マクロファージにおいて有意な増加が認められた．NF-BmRNA発現比率は，ジャングルハニーにより有意な増加が認められた．また，脾臓細胞のIL-4mRNA発現比率もジャングルハニーにより有意な増加が認められた．脾臓細胞の増殖は，ジャングル ハニーにより有意な増加が認められたが，脾臓細胞の非付着細胞とB細胞の細胞増殖は，ジャ ングルハニーによる変化は認められなかった．ジャングルハニーによる抗体産生機能，サイトカイン産生の増強及び脾臓細胞の増加がLPSの受容体であるTLR4を認識している可能性について，TLR4欠損マウスを用いて抗体産生機能への影響を検討した．PFC数は，野生型マウスと同様にジャングルハニー投与で有意な増加が認められた．ジャングルハニーの有効成分に関しては，ジャングルハニー全分画をHPLCで6つの分画(Fr.1～6) に分け，各分画の抗体産生機能とサイトカインmRNA発現への影響について検討した．PFC 数は，Fr.2投与群で有意な増加が認められ，その他の分画で増加は認められなかった．IL-1とIL-6mRNA発現比率は，Fr.2により有意な増加が認められ，分子量約206～393の熱に安定な物質であった． 以上より，ジャングルハニーはマクロファージを活性化し，NF-Bを介してIL-1とIL-6mRNA発現を増強させ，マクロファージから産生されたIL-1がTh2細胞に作用し，IL-4の産生を増強させ，CD19陽性細胞が増加し，IL-6を介してB細胞の初期段階に作用し，抗体産生細胞へと分化させ，抗体産生機能を増強させた可能性が示唆された．

免疫学的監視理論に基づけば、我々の体内では常に癌の芽とも言うべき異常細胞が常にどこかで一定の割合で発生しており、その異常細胞を免疫担当細胞が早期に殺傷するため、そう簡単には、癌の発症に至らないと考えられている。この時、癌細胞を正常細胞より識別し、殺傷する免疫担当細胞群には、キラーT細胞、ナチュラルキラー細胞そして抗腫蕩マクロファージ(Mφ)が重要な役割を果たしており、これらの殺し屋細胞達は、抗腹蕩エフェクター細胞群と呼ばれている。それぞれの細胞は、各々独自の異常細胞認識機構を介して、異常細胞を殺傷することが明かとされ、各々の細胞は異なる研究スピードで解析されている。これらの抗腫蕩エフェクター細胞群の中で最も研究の立ち後れているのが抗腫瘍Mφである。我々はこの抗腫瘍Mφについて、活性化メカニズムを細胞内シグナル制御の観点、特にチロシンリン酸化/脱リン酸化のシグナル伝達システム解析という観点から研究しようと試みた。そこで、研究の端緒としてリンパ球の抗原認識において非常に重要な役割を持つCD45 をまず研究標的とした。

The P2Y14 receptor is activated by UDP-glucose （UDPG）, which is a well-known glycosyl donor that participates in the biosynthesis of carbohydrates, and is widely expressed in immune cells. During inflammation and mechanical stress, damaged cells release nucleotides, including ATP and UDPG, as danger signals that act as P2Y receptor agonists. These nucleotide-induced signals participate in the regulation of immune responses. In this study, to investigate P2Y14 expression further, we performed flow cytometric analysis using an anti-P2Y14 monoclonal antibody. The results indicated that P2Y14 is expressed in murine immune cells, including T cells, B cells, monocytes, granulocytes, and CD11bhigh macrophages. Interestingly, the expression levels of P2Y14 differed between immature and mature monocytes, and in CD11bhigh macrophages, P2Y14 was gradually downregulated as peritonitis was terminated. The expression of CD11b is reduced by the efferocytosis of apoptotic neutrophils during peritonitis, and the induced CD11blow macrophages, which emerge in the resolution of peritonitis, play an important role in the termination of inflammation. Consistent with this observation, we revealed that administration of UDPG to mice with induced peritonitis increased the number of CD11blow macrophages. As P2Y14 is expressed in CD11bhigh macrophages but not in CD11blow macrophages, UDPG may participate in the conversion to the CD11blow phenotype. These data suggest a novel regulatory pathway of the inflammatory response via P2Y14 expressed on macrophages., 弘前医学. 63, 2012, p.96-104

骨粗鬆症治療薬ビスホスホネート(BP)がC.albicansに対する炎症性サイトカイン産生に及ぼす影響をマウスマクロファージ様細胞であるJ774.1細胞を用いて調べた。BPの一種であるアレンドロネートはC.albicansの刺激によるJ774.1細胞のIL-6産生は増強したが、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)産生には影響を及ぼさなかった。一方、アレンドロネートを加えて培養した後にToll様受容体リガンドでJ774.1細胞を刺激した場合は、アレンドロネートによってMCP-1の産生が抑制された。この異なる結果は、宿主細胞を刺激する微生物の種類や構成成分の違いがアレンドロネートのサイトカイン産生増強作用に大きく影響することを示していると考えられる。BP関連顎骨壊死は窒素含有BP服用者で起こり、非含有BP服用者では報告されていない。この理由の一つに、窒素含有BPが微生物感染に対する宿主の炎症性サイトカイン産生を増強することが考えられた。

C.albicansの感染に伴っておこる宿主応答を明らかにする手がかりとして、産生が誘導されるサイトカインをin vitroの実験系で調べた。微生物感染の場で、いかなる種類のサイトカインが産生されるかは感染後の病態の進行とその治療を考える上で重要な要因になる。C.albicansの菌体は、マウスマクロファージ様細胞であるJ.774.1細胞からのIL-6および単球走化性タンパク質-1(MCP-1)の産生を誘導することが明らかになった。しかし、至適培養条件下における産生量はMCP-1がIL-6よりも約200倍以上も高い値を示した。実際のC.albicansの感染においてもMCP-1の高い産生が起きている可能性がある。MCP-1が細胞性免疫に対して抑制的に作用するのであれば、MCP-1産生誘導は、C.albicans病原因子の一つとなると考えられる。また、IL-6産生誘導が低いことが示されたが、そのため宿主が、C.albicansを殺菌・排除することが困難になると考えられた。

HMGB1 is a non-histone chromosomal protein, a secretory protein binding to the receptor for advanced glycation end products in cancer cells and monocyte-lineage immune cells. HMGB1 enhances proliferation, motility, invasion, and survival of cancer cells. HMGB1 associated with DNA repair of anti-cancer drug-induced DNA damage. Importantly, HMGB1 is released from necrotic cancer cells and induces re-growth of the remnant cancer cells. In contrast, HMGB1 induces apoptosis in monocyte-lineage immune cells and inhibits tumor-infiltrating macrophages and dendritic cells, lymph node sinus macrophages, liver Kupffer cells to attenuate anti-cancer immune responses and anti-metastatic organ defense.

マウスを用いて、歯周組織に歯科矯正学的メカニカルストレスを負荷することによって生じる牽引側および圧迫側歯根膜組織の変化について、熱ショックタンパクHSP70およびp-HSP70の発現を免疫組織化学的に検討した。HSP70は時間の経過と共に陽性反応が増強した。p-HSP70は、HSP70の発現より遅れて陽性反応の増強を示した。HSP70がホメオスタシスの維持や傷害を受けた細胞の修復、またそのリン酸化したp-HSP70として、牽引側歯根膜組織における骨芽細胞活性化による同部への骨添加傾向へのシフトが正常に行われるよう分子シャペロンとして働き、タンパク質のフォールディングなどの立体構造形成を助けていることが示唆された。

インターフェロン誘起作用を有し、マクロファージ遊走能を促進する効果を持つことが知られているMacrophage Activating Chinese Mixed Herbs（MACH）の、ブロイラー鶏の大腸菌性蜂窩織炎およびひなのブドウ球菌症に対する防御効果を検証した。鶏をMACH添加飼料給餌群と普通の市販飼料給餌群に分け、実験1では蜂窩織炎野外例より分離された大腸菌を43日齢のブロイラー鶏の大腿部皮膚に掻傷を作出し、その上に塗布した。実験2ではブドウ球菌症野外例より分離された黄色ブドウ球菌（SA）を14日齢の雛の大腿部と胸部筋肉内に接種した。実験1では大腸菌感染による死亡率、蜂窩織炎発現羽数はMACH添加飼料給餌鶏で抑制され、掻傷の治癒機転についてもMACHが効果的に作用していることが示された。実験2では、ブドウ球菌症によるひなの死亡率、病変発現羽数はMACH添加飼料群と市販飼料群との間で差が認められず、浮腫性皮膚炎はMACH添加飼料群において重度であった。組織学的にはMACH添加群では接種部位におけるマクロファージ数が増加しており、マクロファージの遊走能促進効果が示唆された。MACHは掻傷からの大腸菌の侵入といった局所感染の防御において有用であり、また、軽度病変の発現を抑える効果を示すことが示唆された。しかし、重度病変の発現を抑えるまでには至らず、その効能は日齢や攻撃菌の病原性により差が出るのではないかと考えられた。これらのことから、 植物多糖体であるMACHは、抗菌剤を用いることのできない出荷時や無薬飼育法における感染防御に対して、あるいは抗菌剤と併用することで、日常の健康管理に有用な添加物質になる可能性が考えられた。, The protective effect of Macrophage Activating Chinese Mixed Herbs (MACH)，known to have interferon-inducing activity and to promote migration of macrophages，was investigated pathologically for Escherichia coli (E. coli) cellulitis and staphylococcosis in chickens. Chickens used for this study were fed diets with or without MACH. In experiment 1，three E. coli strains isolated from the field case of cellulitis were applied to scratches made on the thighs of 52-day-0ld broiler chickens. In experiment 2，Staphylococcus aureus (SA) isolated from the field case of chicken staphylococcosis was inoculated intramuscularly in thighs and thoraxes of 14-day-0ld chicks. In experiment 1，chickens infected with E. coli had lower mortality and morbidity when fed MACH. MACH also enhanced wound healing. In experiment 2，chickens infected with SA exhibited no difference between groups fed diets with or without MACH. Dermatitis lesions were more severe in MACH groups. Histologically， macrophage counts increased at the inoculation site，which suggests that macrophage migration may be promoted. This suggested that MACH was useful for cutaneous protection from invasion of E.coli， and effective against development of mild lesions. However，it was，not potent enough to suppress the development severe lesions，and its effect may vary with age and pathogen. MACH may thus be useful for routine health management as an additive substance with or without antibiotics.

蛍光性顆粒周囲細胞（FGP cells）がラットおよびヒト脳の細血管壁に認められる。この細胞の持つ顆粒が蛍光顕微鏡下で黄色の自然蛍光を有し、Virchow-Robin腔に分布するなどからfluorescent granular perithelial (FGP) cells （蛍光性顆粒周囲細胞）と名付けた。さらに、その細胞の微細構造を観察すると、若齢期では顆粒が電子密度の高い充実性の構造をしているが、加齢により空胞化し、高齢では泡状を呈する。FGP細胞は免疫組織化学的には、マクロファージの表層抗原を持ち、スカベンジャー受容体陽性細胞でもある。これらのことから、血液脳関門(blood-brain barrier) の機能に深く関わり、脳内のスカベンジャー細胞としての役割を担っていることが明らかになった。現在、この蛍光性顆粒周囲細胞（FGP細胞）はMato cell (間藤細胞) と呼ばれている。, The fluorescent granular perithelial cells (FGP cells) of rats and humans were found in the perivascular space around fine cerebral blood vessels. Their profiles and intracellular inclusions varied with the age. Immunohistochemical studies indicated that scavenger receptors are expressed only in FGP cells, and some surface markers of macrophage are also detected. These results indicate involvement of FGP cells in the blood-brain barrier and scavenger functions in the central nervous system. This FGP cells are named as Mato cells.

初めに歯周病と糖尿病の特徴について述べ、歯周病の病因と診断に関わる問題点について整理し、糖尿病と歯周病に関係する代謝・免疫機構について考察した。これまで分子レベルでの歯周病診断および治療は確立していないが、分子レベルの診断に基づくオーダーメイド医療の可能性について解説した。今後はゲノムワイド解析による歯周病・糖尿病のリスク遺伝子について検討する必要がある。

慢性根尖性歯周炎の主病巣は線維芽細胞と血管芽細胞の過剰増殖より成る肉芽組織で、感染根管からの感染による慢性増殖性炎を原病巣としている。今回、b-FGF、IL-1α、TGF-α、TGF-β1、HGF、TNF-α、EGF、PDGFとこれらのレセプターのFGFR(Bek)、IL-1R、TGFβRI、TGFβR II、HGFR、TNFR、EGFR、PDGFRαについて、60例の慢性根尖性歯周炎を病理組織学的にI型からVI型に分け、各病型における各増殖因子とレセプターの発現の特徴を免疫組織化学的に検索した。続いて、感染根管から採取した細菌の培養菌(Wb)と純培養したActinomyces naeslunndii ATCC12104(An)をラットの頬粘膜に接種し、50日間にわたる実験的感染病巣における経時的動態を検索した。各種病型は、I型(膿瘍の形成を伴う病型、15例)、II型(病巣のほとんどが肉芽腫より成り多数の好中球の浸潤を伴う病型、10例)、III型(II型と同様の肉芽腫性病変で好中球の浸潤のない病型、10例)、IV型(歯根肉芽腫の一型で線維成分が多く肉芽組織の少ない病型、15例)、V型(IV型よりも線維成分が多く肉芽組織が30%以下の病型、5例)、VI型(硬化性根尖性歯周炎の病型、5例)とした。慢性根尖性歯周炎のIII型はI型の治癒型であり、II型はその一過程にある病型かあるいはIII型からI型への再燃過程にあり、IV型やV型はVI型へ向う病巣であることがそれぞれ示唆された。一方、実験的感染病巣はいずれも膿瘍が生じ、肉芽組織性膿瘍膜が形成されたが、An接種群では広範な肉芽組織を形成し、Mφや増殖因子の発現細胞はWB接種群よりも明らかに多かったことから、慢性根尖性歯周炎の肉芽腫性変化に根管内細菌の主要細菌と目されているActinomycesの関わりが深いことも伴わせて示唆された。The mechanism of granuloma formation due to chronic apical periodontitis This study is focused on the chronic apical periodontitis consists of granulation tissue formed by proliferation of fibroblasts and angioblasts during chronic proliferative inflammation due to infected root canal. The overgrowth of fibroblasts and angioblasts is considered directly caused by the expression of several growth factors and receptors. The relationship between the expression of growth factors [basic fibroblast growth factor(bFGF), Interlukin-1α(1L-1α), transforming growth factor-α and -β1(TGF-α and -β1), hepatocyte growth factor(HGF), tumor necrosis factor-α(TNF-α), epidermal growth factor(EGF), platelet derived growth factor(PDGF)] and their receptors(FGFR, IL-1R, TGF-R I and -RI II , HGFR, TNFR, EGFRand PDGFR)was analyzed by immunohistochemical study. The rat lesion induced by bacterial injection obtained from a human root canal was also analyzed. The chronic apical periodontitis(60 cases)were classified into six types lesions based on histopathological findings as follows; Type I(abscess formation; 15 cases), Type II(leukocyte infiltration; 10 cases), Type III(granulation without abscess or inflammatory cells infiltration; 10 cases), Type IV(granulation with fibrous tissue;15cases), Type V(fibrous tissue lesser granulation; 5 cases), and Type VI(scar tissue; 5 cases). Immunohistochemistry demonstrated that CD68-positive macrophages comprise an overwhelming majority of the inflammatory cells in the granulation tissue of chronic apical periodontitis, and these cells are the principal source of IL-1α, TGF-α, TGFβ1, b-FGF and PDGF. IL-1R, TGFβRI, TGFβRII, FGFR and PDGFR were expressed by fibroblasts, vascular endothelial cells and lymphocytes. The experimental infection of bacteria from a human root canal demonstrated that abscess formation occurs during several days after bacterial infection into rat buccal mucosa and CD68 positive macrophages infiltrate accompanying the abscess formation. Based on these findings, it was suggested that chronic apical periodontitis, classified into Type I to Type III, was suggested to comprise transforming types during the healing. Type IV was regarded as a healing type with scar tissue formation progressing in Type V. The granulation tissue, the foci of Type I, Type II and Type III and/or Type IV is considered to be the major lesion, which forms granuloma as a function of IL-1α, b-FGF, PDGF, IL-1R, FGFR and PDGFR producing.

The aim of this study was to investigate whether a total of twenty benzo[b]cyclohept[e][1,4]oxazines and their S-analogs, and 2-aminotropone derivatives affect the function of activated macrophages. These compounds inhibited the production of pro-inflammatory substances such as nitric oxide (NO) by lipopolysaccharide (LPS)-activated mouse macrophage-like RAW264.7 cells to different extents. Among them, benzo[b]cyclohept[e][1,4]oxazin-6(11H)-one [5] and 7-bromo-2-(4-hydroxyanilino)tropone [16] showed the highest inhibitory effects at concentrations that did not affect cellular viability (selectivity index=74.89 and 54.15, respectively). Western blot and RT-PCR analyses showed that [16] inhibited the expression of both inducible NO synthase (iNOS) and cyclooxygenase (COX)-2 at both protein and mRNA levels, whereas [5] inhibited only iNOS protein expression. Electron-spin resonance (ESR) spectroscopy revealed that both [5] and [16] scavenged nitric oxide (generated from NOC-7) and superoxide anion (generated by HX-XOD reaction) only at much higher concentration. These data suggest that [16] but not [5] exerts its anti-inflammatory action against macrophages via the inhibition of iNOS and COX-2 protein expressions., 7p.