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A eficiência e eficácia dos resultados obtidos pelas organizações é reflexo da melhoria das condições tecnológicas e das exigências de competitividade nos mais diversos segmentos. Independentemente do processo produtivo, existe uma grande demanda de responsabilidade para com o meio ambiente e a relação que a empresa tem com o meio externo. A água possui um papel fundamental tanto para com preservação da vida quanto para a atividade industrial e são visíveis os problemas de escassez do recurso hídrico. A indústria têxtil, além de ser um segmento muito antigo, desempenha um papel muito importante no cenário econômico brasileiro. Entretanto, o setor gera grandes quantidades de efluentes, que se despejados de maneira inadequada, acabam comprometendo o ecossistema aquático. Sendo assim, o objetivo deste trabalho é presentar as estratégias de aplicação de enzimas no tratamento de efluentes do segmento têxtil. Para melhor conhecimento desta temática, inicialmente realizou-se uma revisão bibliográfica narrativa para a fundamentação teórica. Na sequência, utilizou-se de uma abordagem sistemática do problema, com a análise de estudos de casos referentes a aplicabilidade das enzimas no setor têxtil para o tratamento e descoloração de efluentes. Desta forma, pôde-se responder à questão norteadora de pesquisa. Os principais resultados mostram que as enzimas, inclusive as sintetizadas a partir de fungos, constituem uma importante alternativa para o tratamento e descoloração de efluentes. Várias enzimas são empregadas com esse objetivo, porém, a mais utilizada e promissora neste estudo, foi a lacase. Assim, observou-se que um maior conhecimento catalítico para sua utilização vantajosa na promoção de reações enzimáticas mais efetivas pode vir a colaborar com o progresso desta área acadêmica.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) The genus Polygala spp. occurs naturally in Brazil. The presence of alkaloids, flavonoids, terpenes, among others were reported in species of this genus. The anti-inflammatory, anxiolytic, trypanocidal and antimicrobial activities stand out. Endophytic microorganisms do not cause apparent damage to their hosts and can be isolated from healthy plant tissues and superficially disinfected. Endophytes have been considered a source of natural products, including those with antimicrobial activity for the control of pathogens. Considering the growing microbial resistance, bioprospection of new antimicrobials are necessary. This study aimed to characterize phenotypically, through micro and macroscopic analyzes, two endophytic bacterial isolates (UNK3 and ROXO16) of Polygala paniculata, and to evaluate them for the production of antimicrobials and enzymes for the control of clinical pathogens. Phenotypic analyzes showed typical colonies of actinomycetes with slow growth, irregular borders with smooth or rough surface and Gram positive bacilli of different shapes, being short or long. The evaluation of antimicrobial activity revealed that the UNK3 isolate has relative activity against Pseudomonas aeruginosa ATCC-27853, Escherichia coli ATCC 11775. Staphyloccocus aureus ATCC 29213, Salmonella (clinically) and Candida albicans ATCC 10231. It was observed activity for S. aureus, P. aeruginosa and C. albicans and negative for E coli and Salmonella. An analysis of the bipartition of the extract with ethyl acetate, followed by the antimicrobial evaluation by the disk diffusion method, revealed that the UNK3 set started the production of bioactive substances on the third day; E. coli, Salmonella, on the sixth day for P. aeruginosa, and for S. aureus on the ninth day. ROXO16 isolate, the onset of activity was on the third day against E. coli, P. aeruginosa and Salmonella and negative for S. aureus and C. albicans. Qualitative enzymatic analysis consolidated that the UNK3 isolate had cellulolytic, amylolytic, pectinolytic and proteolytic activity, while the ROXO16 isolate produced cellulase and protease. Using the OSMAC methodology, it was determined that endophytic microorganisms present an increase in the production of metabolites, the modification of the carbon source and the nitrogen source resulted in greater bioactivity and even against new microorganisms, than those incubated under normal conditions. introduce you. The results obtained so far demonstrate the promising potential of the endophytic bacteria UNK3 and ROXO16 from P.6 paniculata for the production of antimicrobials and also for future industrial applications. Keywords: Antimicrobials, Endophytes, Metabolites, Polygalaceae, Enzymatic potential, microbial resistance O gênero Polygala spp. ocorre naturalmente no Brasil, e apresenta de compostos alcalóides, flavonóides, terpenos, entre outros relatadas em espécies deste gênero, com propriedades farmacológicas, incluindo a antimicrobiana. Microrganismos endofíticos não causam danos aparentes aos seus hospedeiros, podendo ser isolados de tecidos vegetais sadios. Devido a crescente resistência microbiana, a prospecção de novos antimicrobianos e necessária. Este estudo objetivou caracterizar fenotipicamente, analisando micro e macroscópicamente, dois isolados bacterianos endofíticos (UNK3 e ROXO16) de Polygala paniculata, e avaliá-los quanto à produção de antimicrobianos e enzimas para o controle de patógenos clínicos. As colônias isoladas apresentavam crescimento lento, bordas irregulares, superfície lisa ou rugosa, e morfologia de bacilos longos/curtos e Gram positivos. Os isolados foram genotipicamente identificados como pertencentes ao gênero Bacillus. O isolado UNK3 apresentou atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa ATCC-27853, Escherichia coli ATCC 11775, Staphyloccocus aureus ATCC 29213, Salmonella (isolada clinicamente) e Candida albicans ATCC 10231. O isolado ROXO16 apresentou atividade antimicrobiana contra S. aureus, P. aeruginosa e C. albicans. A avaliação da atividade antimicrobiana por difusão em disco usando os extratos obtidos por bipartição com acetato de etila revelou que o isolado UNK3 iniciou a produção de substâncias bioativas no terceiro dia de cultivo contra os patógenos E. coli, Salmonella; no sexto dia contra P. aeruginosa, e no nono dia para S. aureus. Já o isolado ROXO16 apresentou atividade no terceiro dia contra E. coli, P. aeruginosa e Salmonella, e ausência de atividade para S. aureus e Candida albicans. Na análise qualitativa enzimática o isolado UNK3 teve atividade celulolítica, amilolítica, pectinolítica e proteolítica, enquanto o isolado ROXO16 produziu celulase e protease. Utilizando a metodologia OSMAC (One Strain Many Compounds), na qual foram alteradas as fontes de carbono e nitrogênio, os endofíticos apresentaram maior bioatividade contra os microrganismos avaliados neste estudo, do que cultivados em condições de fermentação sem alterações. Os resultados obtidos até o momento demonstram o potencial promissor das bactérias endofíticas Bacillus sp. UNK3 e ROXO16 de P. paniculata para a produção de antimicrobianos no controle de patógenos clínicos, e também para futuras aplicações industriais. 134206/2019-3

Submitted by Helena Bejio (helena.bejio@unioeste.br) on 2022-05-17T21:49:24Z No. of bitstreams: 2 Tese-Final-MatheusLeonardiDamasceno.pdf: 1490592 bytes, checksum: bb37ceb058babdb5a657e4d534e95643 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Made available in DSpace on 2022-05-17T21:49:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese-Final-MatheusLeonardiDamasceno.pdf: 1490592 bytes, checksum: bb37ceb058babdb5a657e4d534e95643 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2021-10-06 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES The hypothesis of this study is that there are alternatives to improve the use of forage as the main food for beef cattle herds. The use of unmanned aerial vehicles (UAVs) are tools that can help in forage planning and fibrolytic enzymes can be used in order to increase the digestibility of forages. Thus, the objective was to evaluate the use of UAVs as a tool for forage monitoring and the supply of fibrolytic enzymes to increase fiber digestibility in pasture beef cattle diets. To evaluate the UAV as an alternative for forage evaluation, images were collected at different flight heights and image overlays. These data were later submitted to analysis of variance and prediction models were created. The fibrolytic enzymes were evaluated in beef cattle kept on pasture receiving protein-energy supplement. Two fibrolytic enzymes were evaluated, being supplied either individually or combined to form a fibrolytic enzyme blend. Regarding the results obtained in the evaluation of the UAV, no effects of the flight height on the results obtained in up to 72 meters were observed. Front/side image overlay does not influence the results observed by UAV in forage monitoring. Regarding the study of fibrolytic enzymes, there was no effect on the intake, digestibility and nitrogen metabolism of cattle kept on pasture receiving protein-energy supplement. In fact, there are alternatives to improve the use of forage as the main feed for beef cattle. The use of UAVs is an excellent alternative to assist in forage planning. However, fibrolytic enzymes do not alter the intake and forage digestibility of beef cattle supplemented on pasture. A hipótese deste estudo é que há alternativas para melhorar a utilização de forragem como alimento principal de rebanho de bovinos de corte. A utilização de veículos aéreos não tripulados (VANTs) são ferramentas que podem auxiliar no planejamento forrageiro e as enzimas fibrolíticas podem ser utilizadas com o intuito de aumentar a digestibilidade das forrageiras. Desta maneira, o objetivo foi avaliar o uso de VANTs como ferramenta para monitoramento de forragem e o fornecimento de enzimas fibrolíticas para aumentar a digestibilidade da fibra em dietas de bovinos de corte a pasto. Para avaliação do VANT como alternativa na avaliação de forragens, foram coletadas imagens em diferentes alturas de voo e sobreposições de imagens. Estes dados posteriormente foram submetidos a análise de variância e foram criados modelos de predição. Já as enzimas fibrolíticas, foram avaliadas em bovinos de corte mantidos a pasto recebendo suplemento proteico-energético. Foram avaliadas duas enzimas fibrolíticas (β-glucanase e xilanase), sendo fornecidas tanto individual, quanto unidas formando um blend enzimático fibrolítico. Com relação aos resultados obtidos na avaliação do VANT, não foram observados efeitos da altura de voo sobre os resultados obtidos em até 72 metros. A sobreposição frontal/lateral de imagens não influencia nos resultados observados por VANT no monitoramento de forragens. Com relação ao estudo das enzimas fibrolíticas, não houve efeito sobre o consumo, digestibilidade e metabolismo de nitrogênio de bovinos mantidos a pasto recebendo suplemento proteico- energético. De fato, há alternativas para melhorar a utilização de forragens como alimento principal para bovinos de corte. A utilização de VANTs são uma excelente alternativa para auxiliar no planejamento forrageiro. No entanto, as enzimas fibrolíticas não alteram o consumo e a digestibilidade de forragem de bovinos de corte suplementados a pasto.

[eng] Biocatalysis gained importance in the latter half of the 20th century and its application in the pharmaceutical, food and chemical industries continues to expand nowadays. Enzymes catalyze chemical reactions in a highly selective manner, achieving high molecular complexity without the need of protection and deprotection steps and usually under mild reaction conditions. Particularly important classes of enzymes are aldolases, which catalyze stereoselectively carbon-carbon bond formation between a nucleophilic donor and an electrophilic acceptor. The aldol adducts are usually typified as β- hydroxycarbonyl compounds, a structural element that is frequently found in the framework of complex molecules. For this reason, advances in this field are focused on finding new aldolases with unprecedented activities and engineering those available for improved substrate tolerance and stereoselectivity. In this thesis, we exploited the potential capacities of two Class II aldolases that utilize 2-oxoacids and aldehydes as substrates, to furnish different chiral molecules that are used as building blocks in organic chemistry. These are YfaU (2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase, EC 4.1.2.53), which was used as a robust biocatalyst in previous investigations in our group, and KPHMT (ketopantoate hydroxymethyltransferase, EC 2.1.2.11), which was employed with synthetic applications for the first time in this present work. In chapter 3.1 MBP-YfaU and KPHMT were applied to the synthesis of 2- substituted 3-hydroxycarboxylate esters (i.e., Roche ester, 3-hydroxy-2- methylpropanoate), which are an important class of chiral building blocks widely used in organic synthesis. To do this, KPHMT from E. coli was cloned, expressed, and characterized (e.g., metal cofactor, nucleophile substrates, tolerance to formaldehyde). Then, a panel of different 2-oxoacids was synthetized, and based on molecular models, four variants of KPHMT were constructed to increase the substrate scope of this catalyst. Finally, the aldol addition of different 2-oxoacids to formaldehyde catalyzed by KPHMT and MBP-YfaU wild-type and variants was deeply studied and it was determined that they generated stereocomplementary aldol adducts. Oxidative decarboxylation and esterification of the aldol adducts led to the formation of Roche ester derivatives with high isolated yields and excellent enantiomeric excesses. In chapter 3.2 KPHMT was used in the synthesis of compounds bearing quaternary carbon centers. To this end, 3,3-disubstituted 2-oxoacid nucleophiles and a panel of selected aldehydes were used as substrates. Based on molecular models, residue V214 was targeted for site directed mutagenesis and five new variants that were useful for the synthesis of these congested compounds were produced. Different methodologies on the aldol adducts rendered 2-oxolactones (including a bicyclic lactone), 3-hydroxyacid derivatives and ulosonic acid type products, all of them bearing gem-dialkyl, gem-cycloalkyl and spirocyciclic quaternary centers. In chapter 3.3 preliminary studies for the application of KPHMT and MBP- YfaU to the synthesis of nucleoside analogues were performed. As substrates we selected 2-oxoacids and D-glyceraldehyde derivatives, including O- protected D-glyceraldehde and α,α-disubstituted-α-hydroxy aldehydes. The subsequent oxidative decarboxylation of the aldol adducts rendered diverse lactones and carboxylic acids. These products with different substituents at C2 and at C4 can be used as precursors for the synthesis of nucleoside analogues., [cat] La biocatàlisi va guanyar importància durant la segona part del segle XX i la seva aplicació en les indústries farmacèutica, química i alimentària es continua expandint avui dia. Els enzims catalitzen reaccions químiques de manera selectiva, produint molècules d’alta complexitat, usualment en condicions suaus de reacció. Les aldolases són un tipus d’enzims que catalitzen de manera estereoselectiva la formació d’enllaços carboni-carboni entre un donador (nucleòfil) i un acceptor (electròfil). Els adductes aldòlics són classificats com a compostos β-hidroxicarbonílics, elements estructurals que formen part de molècules complexes. Els progressos en aquest camp es focalitzen en trobar noves aldolases amb activitats no descrites, o en modificar les ja conegudes per tal d’incrementar la tolerància per diferents substrats o per millorar l’estereoquímica dels productes obtinguts. En aquesta tesi, ens vam centrar en investigar les capacitats de dues aldolases de Classe II, que usen 2-oxoacids i aldehids com a substrats, per sintetitzar diferents molècules quirals que són usades com a elements fonamentals en química orgànica. Aquestes són la YfaU (2-keto-3-deoxy- L-rhamnonate aldolase, EC 4.1.2.53), que va ser usada com a biocatalitzador en investigacions prèvies en el nostre grup d’investigació, i la KPHTM (ketopantoate hydroxymethyltransferase, EC 2.1.2.11), que ha estat usada amb aplicacions sintètiques per primer cop en aquest treball. En el capítol 3.1, la MBP-YfaU i la KPHMT van ser aplicades per la síntesi d’esters carboxílics substituits al C2 i amb un grup hidroxil al C3 (un exemple és l’ester de Roche, 3-hidroxi-2- metilpropanoat). Per fer-ho, la KPHMT d’E. coli va ser clonada, expressada i caracteritzada. També es van sintetitzar diferents 2-oxoacids i es van dissenyar quatre variants de la KPHMT per tal d’incrementar la varietat de substrats acceptats per aquest catalitzador. Finalment, es va estudiar la addició aldòlica dels diferents 2-oxoacids al formaldehid catalitzada per la KPHMT o per la MBP-YfaU i es va determinar que les dues aldolases son estereocomplementaries. La descarboxilació i l’esterificació dels adductes aldòlics van permetre generar derivats d’esters de Roche amb bons rendiments i bons excessos enantiomèrics. En el capítol 3.2 la KPHMT va ser usada en la síntesi de compostos que contenen un carboni quaternari. Per fer-ho, es van sintetitzar diferents 2-oxoacids disubstituits en el C3 i un panell d’aldehids que van ser usats com a substrats. A més, oel residu V214 de l’enzim va ser seleccionat per ser mutat i es van construir cinc noves variants que van ser útils per la síntesi d’aquests compostos. Les diferents metodologies aplicades sobre els adductes aldòlics van generar 2- oxolactones, derivats de 3-hidroxiacids, i productes semblants a l’àcid ulosonic, tots ells amb centres quaternaris del tipus gem-dialquil, gem-cycloalquil i espirocíclics. En el capítol 3.3 es van fer estudis preliminars per l’aplicació de la KPHMT i la MBP-YfaU per la síntesi d’anàlegs de nucleòsids. Com a substrats es van usar els 2-oxoacids disponibles de capítols anteriors i es van sintetitzar derivats del D-gliceraldehid (incloent D-gliceraldehid O- protegit i aldehids α-hidroxi-α,α-disubstituïts). La descarboxilació dels adductes aldòlics van generar diferents lactones i àcids carboxílics amb diferents substituents als carbonis 2 i 4, que poden ser usats com a precursors per la síntesi d’anàlegs de nucleòsids.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The Norcoclaurine Synthase enzyme is known to be the Pictet-Spenglerase responsible for catalyzing the condensation of dopamine and 4-hydroxyphenylacetaldehyde, leading to the formation of s-norcoclaurine, the first metabolite in the biosynthesis of benzylisoquinoline alkaloids. Recently, the Norcoclaurine Synthase has shown great promiscuity towards many aldehyde and ketone substrates, raising great interest in further understandings. In this work, we computationally investigate the structural aspects of this enzyme regarded to the substrate (S)-citronellal, a long-chain aliphatic aldehyde that contrasts with the natural aldehyde, 4-hydroxyphenylacetaldehyde. Furthermore, we also investigated the mechanism of a condensation reaction between dopamine and (S)citronellal catalyzed by the Norcoclaurina Synthase. For that, we employed molecular docking methodologies, classical molecular dynamics simulation, and density functional theory. We demonstrate through molecular docking and molecular dynamics simulations that the preferential enzyme-substrate binding mode presents the dopamine more deeply anchored in the active site, interacting with the amino acid LYS122 in a conformation considered active, meaning it will favor the occurrence of the reaction. Also, the (S)citronellal occupies the cavity entrance, having part of its chain solvent-exposed, which may be indicative of the promiscuity of the enzyme concerning the carbonylated compounds. From a mechanistic aspect, through density functional theory and cluster methodology, we showed that the reaction path has three fewer intermediates than the previously published one. Furthermore, we also found that the conformational constraints experienced by the substrates considerably alter the activation energy barrier for the cyclization step. A enzima Norcoclaurina Sintase é conhecida por ser a Pictet-Spenglerase responsável por catalisar a condensação da dopamina e do 4-hidroxifenilacetaldeído, levando à formação da s-norcoclaurina, o primeiro metabólito na biossíntese dos alcalóides benzilisoquinolínicos. Recentemente, estudos mostraram que a Norcoclaurina Sintase possui alta promiscuidade frente a muitos aldeídos e cetonas, despertando grande interesse para seu uso. Neste trabalho, investigamos computacionalmente os aspectos estruturais dessa enzima em relação ao substrato (S)citronelal, um aldeído alifático de cadeia longa que contrasta com o aldeído natural, o 4-hidroxifenilacetaldeído. Além disso, investigamos também o mecanismo de reação de condensação entre a dopamina e o (S)citronelal catalisado pela Norcoclaurina Sintase. Para tanto, empregamos metodologias de ancoramento molecular, simulação de dinâmica molecular clássica e teoria do funcional da densidade. Demonstramos através do ancoramento molecular e de simulações de dinâmica molecular que o modo de ligação preferencial enzima-substrato apresenta a dopamina mais profundamente ancorada no sítio ativo, interagindo com o amino ácido LYS122 em uma conformação considerada ativa, o que significa que irá favorecer a ocorrência da reação, enquanto que o (S)citronelal ocupa a entrada da cavidade, tendo uma parte de sua cadeia exposta ao solvente, o que pode ser um indicativo da promiscuidade da enzima em relação aos compostos carbonilados. Do ponto de vista mecanístico, utilizando a teoria do funcional da densidade e a metodologia de cluster, mostramos que o caminho da reação possui três intermediários a menos em relação ao previamente publicado. Além disso, também descobrimos que as restrições conformacionais experimentadas pelos substratos alteram consideravelmente a barreira de energia de ativação para a etapa de ciclização.

Several oil spills in seas and oceans have occurred in recent decades, mainly affecting estuaries and mangroves. Environmental accidents involving petroleum, its derivatives and the waste generated have been a growing concern, as petroleum hydrocarbons are considered toxic organic contaminants that are difficult to degrade. Biotechnological advances have led researchers to adopt bioremediation and phytoremediation as potentially effective alternatives for contaminated soils and sediments, and the use of enzymes has been adopted as a strategy beyond the use of plants and microorganisms in bioremediation. This study consists of a literature review based on books, articles, theses, dissertations and websites, in order to gather and evaluate enzymatic processes in phytoremediation and phytoremediation in environments impacted by petroleum activities. En las últimas décadas se han producido varios vertidos de petróleo en mares y océanos, que han afectado principalmente a estuarios y manglares. Los accidentes ambientales relacionados con el petróleo, sus derivados y los desechos generados han sido una preocupación creciente, ya que los hidrocarburos del petróleo se consideran contaminantes orgánicos tóxicos y de difícil degradación. Los avances biotecnológicos han llevado a los investigadores a adoptar la biorremediación y la fitorremediación como alternativas potencialmente efectivas para suelos y sedimentos contaminados, y el uso de enzimas se ha adoptado como una estrategia más allá del uso de plantas y microorganismos en la biorremediación. Este estudio consiste en una revisión de la literatura a partir de libros, artículos, tesis, disertaciones y sitios web, con el fin de recopilar y evaluar procesos enzimáticos en fitorremediación y fitorremediación en ambientes impactados por actividades petroleras. Diversos vazamentos de petróleo em mares e oceanos ocorreram nas últimas décadas, afetando principalmente estuários e manguezais. Acidentes ambientais envolvendo o petróleo, seus derivados e os resíduos gerados têm sido uma preocupação crescente, por conta dos hidrocarbonetos do petróleo ser considerados contaminantes orgânicos tóxicos e de difícil degradação. Os avanços biotecnológicos têm levado os pesquisadores a adotar a biorremediação e fitorremediação como alternativas potencialmente eficazes para solos e sedimentos contaminados e o uso enzimas têm sido adotado como uma estratégia além do uso de plantas e microrganismos na biorremediação. Este estudo consiste em uma revisão bibliográfica baseada em livros, artigos, teses, dissertações e sites, com o intuito de reunir e avaliar os processos enzimáticos na fitorremediação e fitorremediação em ambientes impactados por atividades do petróleo.

[eng] The advancements in nanotechnology enabled the development of new diagnostic tools and drug delivery systems based on nanosystems, which offer unique features such as large surface area to volume ratio, cargo loading capabilities, increased circulation times, as well as versatility and multifunctionality. Despite this, the majority of nanomedicines do not translate into clinics, in part due to the biological barriers present in the body. Synthetic nano- and micromotors could be an alternative tool in nanomedicine, as the continuous propulsion force and potential to modulate the medium may aid tissue penetration and drug diffusion across biological barriers. Enzyme-powered motors are especially interesting for biomedical applications, owing to their biocompatibility and use of bioavailable substrates as fuel for propulsion. This thesis aims at exploring the potential applications of urease-powered nanomotors in nanomedicine. In the first work, we evaluated these motors as drug delivery systems. We found that active urease- powered nanomotors showed active motion in phosphate buffer solutions, and enhanced in vitro drug release profiles in comparison to passive nanoparticles. In addition, we observed that the motors were more efficient in delivering drug to cancer cells and caused higher toxicity levels, due to the combination of boosted drug release and local increase of pH produced by urea breakdown into ammonia and carbon dioxide. One of the major goals in nanomedicine is to achieve localized drug action, thus reducing side-effects. A commonly strategy to attain this is the use moieties to target specific diseases. In our second work, we assessed the ability of urease-powered nanomotors to improve the targeting and penetration of spheroids, using an antibody with therapeutic potential. We showed that the combination of active propulsion with targeting led to a significant increase in spheroid penetration, and that this effect caused a decrease in cell proliferation due to the antibody’s therapeutic action. Considering that high concentrations of nanomedicines are required to achieve therapeutic efficiency; in the third work we investigated the collective behavior of urease-powered nanomotors. Apart from optical microscopy, we evaluated the tracked the swarming behavior of the nanomotors using positron emission tomography, which is a technique widely used in clinics, due to its noninvasiveness and ability to provide quantitative information. We showed that the nanomotors were able to overcome hurdles while swimming in confined geometries. We observed that the nanomotors swarming behavior led to enhanced fluid convection and mixing both in vitro, and in vivo within mice’s bladders. Aiming at conferring protecting abilities to the enzyme-powered nanomotors, in the fourth work, we investigated the use of liposomes as chassis for nanomotors, encapsulating urease within their inner compartment. We demonstrated that the lipidic bilayer provides the enzymatic engines with protection from harsh acidic environments, and that the motility of liposome-based motors can be activated with bile salts. Altogether, these results demonstrate the potential of enzyme-powered nanomotors as nanomedicine tools, with versatile chassis, as well as capability to enhance drug delivery and tumor penetration. Moreover, their collective dynamics in vivo, tracked using medical imaging techniques, represent a step-forward in the journey towards clinical translation., [spa] Recientes avances en nanotecnología han permitido el desarrollo de nuevas herramientas para el diagnóstico de enfermedades y el transporte dirigido de fármacos, ofreciendo propiedades únicas como encapsulación de fármacos, el control sobre la biodistribución de estos, versatilidad y multifuncionalidad. A pesar de estos avances, la mayoría de nanomedicinas no consiguen llegar a aplicaciones médicas reales, lo cual es en parte debido a la presencia de barreras biológicas en el organismo que limitan su transporte hacia los tejidos de interés. En este sentido, el desarrollo de nuevos micro- y nanomotores sintéticos, capaces de autopropulsarse y causar cambios locales en el ambiente, podrían ofrecer una alternativa para la nanomedicina, promoviendo una mayor penetración en tejidos de interés y un mejor transporte de fármacos a través de las barreras biológicas. En concreto, los nanomotores enzimáticos poseen un alto potencial para aplicaciones biomédicas gracias a su biocompatibilidad y a la posibilidad de usar sustancias presentes en el organismo como combustible. Los trabajos presentados en esta tesis exploran el potenical de nanomotores, autopropulsados mediante la enzima ureasa, para aplicaciones biomédicas, y investigan su uso como vehículos para transporte de fármacos, su capacidad para mejorar penetración de tejidos diana, su versatilidad y movimiento colectivo. En conjunto, los resultados presentados en esta tesis doctoral demuestran el potencial del uso de nanomotores autopropulsados mediante enzimas como herramientas biomédicas, ofreciendo versatilidad en su diseño y una alta capacidad para promover el transporte de fármacos y la penetración en tumores. Por último, su movimiento colectivo observado in vivo mediante técnicas de imagen médicas representan un significativo avance en el viaje hacia su aplicación en medicina.

Resumo O uso de história e filosofia da ciência no ensino-aprendizagem é comumente negligenciado, linear e/ou descontextualizado nos livros didáticos. Isso aconteceria com a história do conceito de enzimas? Este trabalho busca investigar essa questão. Para a fundamentação teórica, foi realizada breve revisão bibliográfica, investigando-se como o conceito de enzimas é apresentado em nove livros didáticos, seguindo três categorias de análise. Encontrou-se, de forma geral, falta de interconexão nos assuntos de bioquímica, sendo as enzimas usualmente apresentadas apenas pelo modelo “chave-fechadura”, que hoje não é representativo da complexidade do fenômeno. Além disso, foram observados limites conceituais decorrentes da ausência ou deficiência na contextualização histórica presente no material didático. Abstract The use of the history and philosophy of science in teaching and learning is commonly neglected, linear, and/or out of context in textbooks. This article investigates whether this also occurs with the concept of enzymes. A brief review of the literature establishes the theoretical foundation to investigate how the concept of enzymes is presented in nine textbooks, following three different lines of analysis. A general lack of interconnection was seen in biochemistry topics, with enzymes usually only presented via the “lock-and-key” model, which does not best represent their complexity. Furthermore, conceptual limitations resulting from a lack of historical contextualization (partial or complete) were also observed.

[ES] La presente tesis doctoral se centra en el diseño, síntesis y caracterización de varios nanodispositivos híbridos orgánico-inorgánicos, utilizando como soporte nanopartículas de sílice mesoporosa equipadas con enzimas y puertas moleculares, los cuales muestran capacidades comunicativas además de la evaluación de diferentes estrategias de comunicación. El primer capítulo incluye un resumen de diferentes conceptos sobre los que se fundamentan los estudios realizados tales como nanotecnología, materiales de sílice mesoporosa, materiales con puertas moleculares que reaccionan a estímulos específicos, partículas Janus y biocomputación. Finalmente, se incluyen conceptos básicos acerca de la comunicación química, materiales y estrategias empleados hasta ahora y ejemplos representativos. A continuación, en el segundo capítulo, se presentan los objetivos generales de esta tesis doctoral que son abordados en los siguientes capítulos experimentales. El tercer capítulo muestra un sistema de biocomputación para liberación basado en nanopartículas Janus de oro-sílice mesoporosa capaces de comunicarse con el entorno procesando la información e imitando la función lógica booleana propia de un demultiplexer y que resulta en la liberación controlada de la carga. Se muestra que dicho nanodispositivo puede llevar a cabo sus funciones en medios complejos como en células cancerígenas. En el cuarto capítulo, se presenta un modelo circular de comunicación dentro de una red de tres nanopartículas diferentes basado en el intercambio jerárquicamente programado de mensajes químicos. La parte mesoporosa del nanodispositivo 1 (S1βgal) es cargada con la especie fluorescente [Ru(bpy)3]Cl2 y tapada con cadenas de oligo(etilenglicol) que contienen puentes disulfuro y que funcionan como puertas moleculares, mientras que la enzima β-galactosidasa es unida a la parte del oro. En la nanopartícula 2 (S2galox), la enzima galactosa oxidasa es inmovilizada en la cara del oro mientras que la sílice mesoporosa es cargada con 4-(bromometil)benzoato de metilo y los poros tapados con un derivado de arilboronato autoinmolante sensible a H2O2 que forma un complejo huéspedanfitrión con β-ciclodextrina. Finalmente, el nanodispositivo 3 (S3est) es funcionalizado con la enzima esterasa en la parte del oro, cargada con la especie reductora hidroclururo de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) en la parte mesoporosa y tapada con una nanoválvula supramolecular que responde a pH (βciclodextrina:benzimidazol). En el quinto capítulo, se muestra un modelo interactivo de comunicación química entre una nanopartícula Janus abiótica y un organismo vivo (Saccharomyces cerevisiae). En particular, el nanodispositivo está basado en nanopartículas funcionalizadas con glucosa oxidasa en la parte del oro, cargadas con el genotóxico fleomicina y tapadas con la puerta molecular sensible a pH (βciclodextrina:benzimidazol). El microorganismo usado en el estudio es una levadura modificada que expresa GFP bajo el control del promotor del gen RNR3; la transcripción de dicho gen es inducida con la exposición a agentes que dañan el ADN. La ruta de comunicación interactiva empieza con la adición de sacarosa (estímulo de entrada) la cual es hidrolizada en glucosa por la invertasa localizada en el espacio periplásmico de las levaduras y que difunde al nanodispositivo donde es trasformada en el correspondiente ácido por la glucosa oxidasa de la parte del oro. La bajada local de pH da lugar a la apertura de la nanoválvula sensible a pH del nanovehículo y con ello a la liberación de fleomicina (mensaje de vuelta) que induce la expresión de GFP (señal de salida) en las levaduras. En el sexto capítulo, proponemos una estrategia para establecer una comunicación lineal entre dos microorganismos diferentes que no interactúan entre ellos mediada por un nanodispositivo que actúa como traductor químico. Finalmente, las conclusiones generales de la presente tesis doctoral son expuestas en el capítulo siete. El estudio de las capacidades comunicativas de los nanodispositivos mesoporosos funcionalizados con enzimas permite la construcción de estrategias de cooperación entre diferentes entidades que permiten funcionalidades que van más allá que aquellas llevadas a cabo por agentes individuales., [CA] La present tesi doctoral es centra en el disseny, síntesi i caracterització de diversos nanodispositius híbrids orgànic-inorgànics, utilitzant com a suport nanopartícules de sílice mesoporosa equipades amb enzims i portes moleculars, i que mostren capacitats comunicatives a més de l’avaluació de diferents estratègies de comunicació. El primer capítol inclou un resum de diferents conceptes sobre els quals es fonamenten els estudis realitzats com ara nanotecnologia, materials de sílice mesoporosa, materials amb portes moleculars que reaccionen a estímuls específics, partícules Janus i biocomputació. Finalment, s’inclouen conceptes bàsics sobre la comunicació química, materials i estratègies utilitzades fins ara i exemples representatius. A continuació, en el segon capítol, es presenten els objectius generals d’aquesta tesi doctoral que són abordats en els següents capítols experimentals. El tercer capítol mostra un sistema de biocomputació per alliberament basat en nanopartícules Janus d’or-sílice mesoporosa capaços de comunicar-se amb l’entorn processant la informació i imitant la funció lògica booleana pròpia d’un demultiplexer i que resulta en l’alliberament controlat de la càrrega. Es mostra que aquest nanodispositiu pot dur a terme les seves funcions en mitjans complexos com en cèl·lules canceroses. En el quart capítol, es presenta un model circular de comunicació dins d’una xarxa de tres nanopartícules diferents basat en l’intercanvi jeràrquicament programat de missatges químics. La part mesoporosa del nanodispositiu 1 (S1βgal) es carrega amb l’espècie fluorescent [Ru(bpy)3]Cl2 i es tapa amb cadenes d’oligo(etilenglicol) que contenen ponts disulfur i que funcionen com portes moleculars, mentre que l’enzim β-galactosidasa s’immobilitza a la part de l’or. A la nanopartícula 2 (S2galox), l’enzim galactosa oxidasa s’immobilitza a la cara de l’or mentre que la sílice mesoporosa es carrega amb 4-(bromometil)benzoat de metil i els porus són tapats amb un derivat d’arilboronat autoimmolant sensible a H2O2 que forma un complex hoste-amfitrió amb β-ciclodextrina. Finalment, el nanodispositu 3 (S3est) es funcionalitza amb l’enzim esterasa en la part de l’or, es carrega amb l’espècie reductora hidroclurur de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) a la part mesoporosa i es tapa amb una nanoválvula supramolecular que respon a pH (β-ciclodextrina:benzimidazol). En el cinqué capítol, es mostra un model interactiu de comunicació química entre una nanopartícula Janus abiòtica i un organisme viu (Saccharomyces cerevisiae). En particular, el nanodispositiu està basat en nanopartícules funcionalitzades amb glucosa oxidasa en la part de l’or, carregades amb el genotòxic fleomicina i tapades amb la porta molecular sensible a pH (βciclodextrina:benzimidazol). El microorganisme utilitzat en l’estudi és un rent modificat que expressa GFP sota el control del promotor del gen RNR3; la transcripció d’aquest gen és induïda amb l’exposició a agents que danyen l’ADN. La ruta de comunicació interactiva comença amb l’addició de sacarosa (estímul d’entrada) la qual és hidrolitzada en glucosa per la invertasa localitzada en l’espai periplasmàtic dels rents i que difon al nanodispositiu on és transformada en el corresponent àcid per la glucosa oxidasa de la part de l’or. La baixada local de pH dona lloc a l’obertura de la nanoválvula sensible a pH del nanovehicle i amb això l’alliberament de fleomicina (missatge de tornada) que indueix l’expressió de GFP (senyal de sortida) en el rent. En el sisé capítol, proposem una estratègia per establir una comunicació lineal entre dos microorganismes diferents que no interactuen entre ells facilitada per un nanodispositiu que actua com a traductor químic. Finalment, les conclusions generals de la present tesi doctoral són exposades en el capítol set. L’estudi de les capacitats comunicatives dels nanodispositius mesoporosos funcionalitzats amb enzims permet la construcció d’estratègies de cooperació entre diferents entitats que permeten funcionalitats que van més enllà que aquelles dutes a terme per agents individuals. Esperem que els resultats obtinguts inspiren aplicacions futures en diferents àrees com ara biomedicina, nanorobots, materials que imiten la naturalesa i tecnologies de la informació., [EN] This PhD Thesis is focused on the design, synthesis and characterization of several hybrid organic-inorganic nanodevices using mesoporous silica nanoparticles equipped with enzymes and molecular gates which display communication capabilities as well as the design and evaluation of different communication strategies. The first chapter includes an overview of the different concepts which lay the foundations of the presented studies such as nanotechnology, mesoporous silica materials, stimuli-responsive gated materials, Janus particles and biocomputing. Basic concepts of chemical communication, materials and enabling technologies employed so far and representative examples in this field are also included. Next, in the second chapter, the general objectives of this PhD Thesis that are addressed in the following experimental chapters are presented. The third chapter shows a biocomputing delivery system based on Janus gold-mesoporous silica nanoparticles capable of chemically communicating with the environment and processing the information mimicking a demultiplexer Boolean logic function which results in a programmed cargo release. Finally, it is shown that such nanodevice is operative in complex media such as cancer cells. In the fourth chapter, it is presented a circular model of communication within a network of three different nanoparticles based on the hierarchically programmed exchange of chemical messages. The mesoporous face of nanodevice 1 (S1βgal) is loaded with the fluorescent dye [Ru(bpy)3]Cl2 and capped with disulfidecontaining oligo(ethylene glycol) chains acting as gatekeepers, whereas the enzyme β-galactosidase is attached to the gold face. In nanoparticle 2 (S2galox), the enzyme galactose oxidase is immobilized on the Au face, while the mesoporous silica is loaded with methyl 4-(bromomethyl)benzoate and the mesopores capped with a H2O2-sensitive self-immolative arylboronate derivative which forms a host-guest complex with β-cyclodextrin. Finally, the nanodevice 3 (S3est) is functionalized with the enzyme esterase on the Au face, loaded with the reductive species tris(2- carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) in the mesoporous face and capped with a pH-responsive supramolecular nanovalve (β-cyclodextrin:benzimidazole). In the fifth chapter, it is showed an interactive model of chemical communication between an abiotic Janus nanoparticle and a living organism (Saccharomyces cerevisiae). In particular, the nanodevice is based on Janus goldmesoporous silica nanoparticles functionalized with glucose oxidase on the Au face, loaded with the genotoxin phleomycin and capped with a pH-responsive (βcyclodextrin:benzimidazole) gatekeeper. The microorganism used in the studies is an engineered budding yeast that expresses GFP under the control of the RNR3 promoter; RNR3 gene transcription is induced upon exposure to DNA-damaging agents. The interactive communication pathway starts with the addition of sucrose (input) which is hydrolyzed into glucose by invertase located in periplasmic space of yeasts and diffuses to the nanodevice where it is transformed into the corresponding acid by glucose oxidase on the Au face. The local drop in pH leads to uncapping of the pH-sensitive nanovalve in the nanocarrier and the release of phleomycin (feedback messenger) that induces GFP expression (output) in yeasts. In the sixth chapter, we propose a strategy to establish linear communication between two different non-interacting microorganisms mediated by a nanodevice which acts as a chemical “nanotranslator”. Finally, the general conclusions from this PhD Thesis are presented in chapter seven. The study of communication capabilities of enzyme-functionalized mesoporous nanodevices enables the construction of strategies of cooperation between different entities allowing sophisticated functionalities that go beyond those carried out by individual agents. We hope that the obtained results inspire future applications in different areas such as biomedicine, nanorobots, life-like materials and information technologies., The authors wish to thank the Spanish Government (projects RTI2018-100910-B-C41 and RTI2018-101599-B-C22 (MCUI/AEI/FEDER, UE), CTQ2017-87954-P), the Generalitat Valenciana (PROMETEO 2018/024), the Comunidad de Madrid (IND2017/BMD7642) and CIBER-BBN (NANOCOMMUNITY project) for support.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2021 Resumen: La ubiquitinación es un tipo de modificación postraduccional característico de organismos eucariotas, que requiere de la acción conjunta de las enzimas E1 activadora, E2 conjugadora y E3 ligasa para mediar la transferencia de ubiquitina a una proteína sustrato. TRIM7 es una E3 ligasa que recientemente ha adquirido interés por su rol en diversas patologías, y pertenece a la familia de proteínas TRIM, caracterizadas por un motivo conservado tripartito (TRIM) N-terminal y una región C-terminal variable que puede mediar el reconocimiento de sustratos. Inicialmente, fue identificada como una proteína que interacciona a través de su dominio C-terminal B30.2 (TRIM7B30.2) con glucogenina-1 (GN1). Dicha proteína es responsable de la iniciación de la biosíntesis del glucógeno, por lo que las mutaciones que afectan al gen que la codifica se traducen en un trastorno extremadamente raro denominado glucogenosis tipo XV. El presente trabajo se centró en caracterizar a TRIM7B30.2 por cristalografía de rayos X, y describir detalles sobre las regiones relevantes para la interacción con GN1. La estructura de TRIM7B30.2 reveló un plegamiento de tipo sándwich-β formado por dos láminas β antiparalelas característico de este tipo de dominios, además de presentar una cavidad con carga positiva en la cara cóncava de dicho plegamiento. Adicionalmente, se logró identificar a residuos clave que delimitan la zona involucrada en la interacción con GN1, además de obtener indicios de que el extremo C-terminal de esta última es necesario para su reconocimiento por TRIM7B30.2 y la proteína TRIM7 entera. Otra parte de este estudio se dedicó a conocer el impacto de la mutación patológica Ala16Pro sobre GN1 de conejo, que presenta una alta homología con la proteína humana, mediante el uso de un amplio conjunto de técnicas bioquímicas y biofísicas. El análisis reveló un cambio estructural significativo que ocasionó una disminución de la afinidad por su sustrato y, en consecuencia, de la actividad de la proteína; además de una marcada pérdida de estabilidad. Por último, se buscó conocer si GN1 y sus mutantes patológicas Ala16Pro y Thr83Met, son sustrato de su actividad E3 ligasa; y si esto podría tener un rol relevante en la glucogenosis tipo XV. Los resultados de la reacción in vitro mostraron que la transferencia de ubiquitina no ocurre bajo las condiciones empleadas, sin embargo, se encontró que TRIM7 interacciona con la mutante patológica GN1 Ala16Pro pese al cambio estructural de la proteína, lo que podría implicar a TRIM7 en la vía de degradación de esta mutante, y por ello el estudio será continuado en cultivos celulares. Abstract : Ubiquitination is a common post translational modification in eukaryotes, which involves an E1 activating enzyme, an E2 conjugating enzyme, and an E3 ligase enzyme; in a process that mediates the transfer of ubiquitin to a substrate protein. TRIM7 is an E3 ligase member of the TRIM protein family, characterized by an N-terminal tripartite motif (TRIM) and a variable C-terminal region that can mediate substrate recognition, that has been recently linked to diverse pathological processes. TRIM7 was initially identified as a glycogenin-1 (GN1) interacting protein, and this interaction involves the C-terminal B30.2 domain of TRIM7 (TRIM7B30.2). GN1 is the protein that initiates glycogen biosynthesis, and mutations in the gene that encodes for this enzyme are involved in the onset of an extremely rare disease known as type XV glycogen storage disease. This work was mainly focused on the characterization of TRIM7B30.2, through the use of X-ray crystallography, and the details of the region involved in the interaction with GN1. The structure of TRIM7B30.2 revealed the characteristic B30.2 domain fold consisting of two β-sheets arranged as a distorted β-sandwich, and a positively charged cavity in the hypervariable region of this domain. Besides, key residues that define the zone of interaction with GN1 were identified, and evidence for the requirement of the latter’s C-terminal region in the binding was found. This study was also focused on the effect of the pathogenic Ala16Pro mutation on rabbit GN1, which displays a high sequence homology with the human protein; and to this end, a wide range of biophysical and biochemical techniques were applied. The analysis revealed a significant structural change which resulted in a decrease in substrate affinity and protein activity, besides a considerable loss of stability. Finally, the thesis was oriented towards analyzing the potential E3 ligase activity of TRIM7 on GN1 and the pathological mutants Ala16Pro and Thr83Met, and its possible functional role on type XV glycogen storage disease. The results have shown that in vitro, TRIM7 does not transfer ubiquitin to GN1 or the mutants in this experimental setup. However, it was found that despite the structural change caused by the mutation, TRIM7 still interacts with the Ala16Pro mutant of human GN1, which might implicate the intervention of TRIM7 in the degradation pathway of this mutant, and for this reason, this study will be continued in cell cultures. 2023-08-30 Fil: Muñoz Sosa, Christian Javier. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Carrizo Garcia, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Carrizo Garcia, María Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Genti de Raimondi, Susana Del Valle. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Genti de Raimondi, Susana del Valle. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Carbonio, Raul Ernesto. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Fisicoquímica; Argentina. Fil: Carbonio, Raul Ernesto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Fisicoquímica de Córdoba; Argentina. Fil: Romero, Jorge Miguel. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Ermácora, Mario Roberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; Argentina.

The pirarucu, Arapaima gigas is a native, carnivorous fish species from the Amazon basin. As carnivorous fish have low amylase activity, exogenous enzymes can improve the digestibility of carbohydrates in aquaculture feeds. We evaluated the digestibility of increasing levels of an enzymatic complex in diets of pirarucu juveniles (65.2 ± 0.4 g). The experimental design was randomized with four treatments [diets containing 0.25, 0.50, 0.75, and 1 g kg-1 on-top inclusion of an enzyme complex (Allzyme® SSF®, USA), and a control, with three replications at a density of 5 fish per unit, and a 30-day duration. We quantified apparent digestibility of dry matter, crude protein, and crude energy through nutrient and chromium oxide content in diets and feces. Enzymatic activity, hepatic glycogen and total protein were determined in liver and anterior intestine samples. The diet with 1 g kg-1 of enzyme-complex resulted in an increase in apparent digestibility of crude protein, gross energy, and dry matter, hepatic glycogen, total proteins in liver and in intestine, showing the efficiency of the enzyme complex in pirarucu feeding. A higher accumulation of dry matter, crude energy, and ethereal extract in the carcass indicated weight increase in the fish treated with enzymatic complex. A decrease in the endogenous enzymatic activity (protease, lipase and amylase) suggested an improved efficacy of the digestive process. Our results indicate that the inclusion of 1 g kg-1 enzyme complex in the diet of juvenile pirarucu can be recommended to achieve greater digestibility of nutrients and improvement in productive performance. RESUMO O pirarucu, Arapaima gigas é um peixe carnívoro nativo da bacia amazônica. Como peixes carnívoros possuem baixa atividade de amilase, enzimas exógenas melhoram a digestibilidade de carboidratos em rações para aquacultura. O objetivo deste estudo foi avaliar a digestibilidade de níveis crescentes de complexo enzimático em dietas para juvenis de pirarucu (65,2 ± 0,4 g). O desenho experimental foi randomizado com quatro tratamentos [dietas contendo 0,25, 0,50, 0,75 e 1 g kg-1 de complexo enzimático adicionado (Allzyme® SSF®, EUA)] e um controle, com três réplicas com densidade de cinco peixes por unidade e 30 dias de duração. A digestibilidade aparente da matéria seca, proteína bruta e energia bruta foi calculada por quantificação de nutrientes e óxido de cromo nas dietas e fezes. A atividade enzimática, o glicogênio hepático e a proteína total foram determinados a partir de amostras do fígado e intestino anterior. A dieta com 1 g kg-1 de complexo enzimático resultou em um aumento da digestibilidade aparente de proteina bruta, energia bruta, matéria seca, glicogênio hepático e proteínas totais no fígado e intestino, mostrando a eficácia do complexo enzimático na dieta dos pirarucus. A acumulação mais alta de matéria seca, energia bruta e extrato etéreo na carcaça indicou o aumento de peso dos peixes tratados com complexo enzimático. A redução da atividade enzimática endógena (protease, lipase e amilase) sugeriu um aumento da eficácia do processo digestivo. Nossos resultados indicam que a inclusão de 1 g kg-1 do complexo enzimático na dietas de juvenis de pirarucu pode ser recomendada para obter maior digestibilidade de nutientes e performance produtiva.

Covalent inhibitors are assuming central importance in drug discovery projects, especially in this pandemic scenario. Many research groups have focused their attention on inhibiting viral proteases or human proteases such as cathepsin L (hCatL). The inhibition of these critical enzymes may impair viral replication. However, molecular modeling of covalent ligands is challenging since covalent and noncovalent ligand-bound states must be considered in the binding process. In this work, we evaluated the suitability of free energy perturbation (FEP) calculations as a tool for predicting the binding affinity of reversible covalent inhibitors of hCatL. Our strategy relies on the relative free energy calculated for both covalent and noncovalent complexes and the free energy changes have been compared with experimental data for eight nitrile-based inhibitors, including three new inhibitors of hCatL. Our results demonstrate that the covalent complex can be employed to properly rank the inhibitors. Nevertheless, a comparison of the free energy changes in both noncovalent and covalent states is valuable to interpret the effect triggered by the formation of the covalent bond on the interactions played by functional groups distant from the warhead. Overall, FEP can be employed as a powerful predictor tool in developing and understanding the activity of reversible covalent inhibitors.

O crescente aumento demográfico associado à demanda por insumos e energia é uma preocupação mundial. Várias estratégias estão sendo desenvolvidas visando mitigar os efeitos do consumo de recursos não-renováveis, uma delas é o uso de biomassas vegetais, que surgem como uma alternativa limpa, sustentável e abundante. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de aplicação industrial de subprodutos das cadeias produtivas de biomassas amazônicas como o açaí, tucumã do Amazonas e tucumã do Pará. Ensaios de caracterização química destas biomassas amazônicas permitiram compreender a composição e a grande biodisponibilidade de moléculas de interesse biotecnológico, como polissacarídeos, lignina, proteínas e lipídios. Baseado na composição rica em nutrientes, a casca de tucumã do Amazonas in natura e a fibra da polpa de tucumã do Pará, foram avaliadas quanto ao seu potencial como fonte de carbono na indução de enzimas lignocelulolíticas utilizando cinco fungos conhecidos pela sua produção de (hemi)celulases, são eles: Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Chrysoporthe cubensis, Trichoderma deliquescens e Ceratocystis fimbriata. Os resultados mostraram que ambas as biomassas são excelentes fontes de carbono, no entanto os extratos enzimáticos mais completos em termos de atividade enzimática e quantidade de enzimas foi produzido pelos fungos C. cubensis e T. deliquescens cultivados na casca de tucumã do Amazonas. Além disso, ensaios de hidrólise enzimática das biomassas foram realizados utilizando os extratos enzimáticos brutos de C. cubensis e T. deliquescens e o coquetel comercial CellicCTec 2. Os melhores resultados de liberação de glicose foram alcançados na hidrólise da fibra polpa de tucumã do Pará processada pelos coquetéis de C. cubensis e T. deliquescens. As análises experimentais permitiram concluir que a biodisponibilidade das biomassas aqui estudadas pode ser a chave para o desenvolvimento regional sustentável, pois permite que os recursos naturais sejam completamente aproveitados de forma racional e consciente, mas também gerando retorno econômico e desenvolvimento social. Palavras-chave: Açaí. Tucumã do Amazonas. Tucumã do Pará. Caracterização química. Hidrólise enzimática The growing demographic increase associated with the demand for inputs and energy is a global concern. Several strategies are being developed to mitigate the effects of consumption of non- renewable resources, one of them is the use of plant biomass, which appears as a clean, sustainable and abundant alternative. The objective of this work was to evaluate the potential of industrial application of by-products from the production chains of Amazonian biomass such as açaí, tucumã from Amazonas and tucumã from Pará. Chemical characterization tests of these Amazonian biomasses allowed us to understand the composition and great bioavailability of molecules of biotechnological interest, such as polysaccharides, lignin, proteins, lipids and minerals. Based on the nutrient rich composition, fresh Amazon tucumã bark and Pará tucumã pulp fiber were evaluated for their potential as a carbon source in the induction of lignocellulolytic enzymes using five fungi known for their production of (hemi)cellulases, they are: Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Chrysoporthe cubensis, Trichoderma deliquescens and Ceratocystis fimbriata. The results showed that both biomasses are excellent sources of carbon, however, the most complete enzyme extracts in terms of enzyme activity and amount of enzymes was observed by the fungus C. cubensis and T. deliquescens cultivated on fresh Amazon tucumã bark. In addition, biomass enzymatic hydrolysis assays were performed using crude enzymatic extracts of C. cubensis and T. deliquescens and the commercial cocktail CellicCTec 2 in both biomasses. The best results of glucose release were achieved in the hydrolysis of tucumã from Pará Pulp fiber processed by cocktails of C. cubensis and T. deliquescens. Experimental analyzes allowed us to conclude that the bioavailability of the biomasses studied here can be the key to sustainable regional development, as it allows natural resources to be fully utilized in a rational and conscious way, but also generating economic return and social development. Keywords: Açaí. Amazon Tucumã. Pará Tucumã. Chemical characterization. Enzymatic hydrolysis

ilustraciones, gráficas, tablas Los residuos agrícolas son precursores de la materia orgánica del suelo. Su descomposición en campo permite el ingreso de carbono y otros nutrientes al sistema, sin embargo, también puede favorecer la proliferación de patógenos. Entre las alternativas al manejo de los residuos se encuentran la quema, y su incorporación al suelo. Sin embargo, el impacto de las consecuencias de estas estrategias sobre la comunidad microbiana y su potencial funcional, es limitado. En este estudio se buscó determinar el efecto de la aplicación de cuatro estrategias de manejo de residuos sobre la estructura y función de las comunidades microbianas asociadas a los ciclos biogeoquímicos de carbono, nitrógeno y fósforo. Se implementó un ensayo en campo con un diseño de bloques incompletos al azar, haciendo toma de muestras de suelo en cuatro tiempos, durante un ciclo de cultivo, incluso desde la preparación del terreno previo a la siembra. Se caracterizó el suelo mediante análisis físico-químicos y enzimáticos, se describieron las comunidades microbianas usando secuenciación NGS, y se determinaron parámetros biológicos (productividad y el estado fitosanitario) del cultivo de arroz. Se identificó un efecto del manejo del tamo del arroz y el tiempo de muestreo sobre la estructura y función de la comunidad microbiana especialmente en los tiempos de degradación y floración. Este estudio evidenció que las estrategias del uso del tamo ya sea en cobertura o incorporado con o sin la ayuda de microorganismos, son una opción adecuada para la disposición final del tamo de arroz. (Texto tomado de la fuente) Agricultural residues are precursors of soil organic matter. Its decomposition in the field allows the entry of carbon and other nutrients into the system; however, it can also favor the proliferation of pathogens. Among the alternatives to waste management are, burning and, its incorporation into the soil. However, the impact of the consequences of these strategies on the microbial community and their functional potential is limited. This study sought to determine the effect of the application of four rice straw management strategies on the structure and function of the microbial communities associated with the biogeochemical cycles of carbon, nitrogen, and phosphorus. A field trial was implemented with a random incomplete block design, taking soil samples four times, during a cultivation cycle, even from the preparation of the land prior to sowing. The soil was characterized by physicochemical and enzymatic analyzes, the microbial communities were described using NGS sequencing. Also, biological parameters (productivity and phytosanitary status) of the rice crop were determined. An effect of rice straw management and sampling time on the structure and function of the microbial community was identified, especially in degradation and flowering times. This study showed that the strategies of using the straw, either in mulch or incorporated in the soil with or without microorganisms, are an adequate option for the final disposal of the rice straw. Doctorado Doctor en Ciencias - Biología Ecología Microbiana

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Bactérias do gênero Pseudomonas apresentam um arsenal formidável de enzimas que permitem que hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) sejam utilizados como única fonte de carbono. Dentre essas enzimas, a 1,2-dihidroxinaftaleno dioxigenase de Pseudomonas sp. C18 (DoxG), uma extradiol dioxigenase Fe+2-dependente, catalisa a conversão do 1,2-dihidroxinaftaleno em 2-hidroxi-2H-cromeno-2-carboxilato via uma dioxigenação. Uma reação que não encontra correspondência em síntese clássica. Essa enzima destaca-se por possuir um sítio ativo volumoso que a dota de promiscuidade, sendo capaz de clivar, além de uma série de catecóis, bifenis policlorados (BPCs). Essa formidável capacidade contrasta com a fácil oxidação do cofator Fe+2 pelo oxigênio presente no ar, processo observado durante a lise e purificação da enzima que leva a sua inativação. Nosso objetivo foi determinar quais fatores influenciam a reativação da enzima, bem como as estratégias para aprimorar sua estabilidade e atividade catalítica. A DoxG foi expressa e purificada em condições aeróbicas. A caracterização foi feita pela determinação de sua massa monomérica via eletroforese e experimentos de espalhamento dinâmico de luz consistentes com um estado octamérico com massa de aproximadamente 270 kDa em solução aquosa. A velocidade de reconstituição da holoenzima mostrou ser um processo sensível a vários fatores: (1) a incubação com o íon Fe2+ mostrou-se a forma mais eficiente de reativação; (2) a velocidade de reativação depende da concentração do íon Fe2+; (3) o pH de 5,75 propiciou a forma mais rápida de reativação, sendo que em meios mais alcalinos a disponibilidade do cofator foi limitada e em meios mais ácidos o processo foi afetado negativamente pela protonação de resíduos do sítio ativo que se complexam ao cofator; (4) embora a força iônica com NaCl ou KCl não afetou a reativação, sais ou tampões com ânions capazes de se ligar ao Fe+2 (ex. sulfato) afetaram a disponibilidade do mesmo; (5) a reativação de 90% da enzima requereu duas horas e meia de incubação com o íon Fe2+. Além desses pontos, observou-se que o íon Mn+2 não pôde substituir o íon Fe+2 como cofator, no entanto, conferiu maior estabilidade a DoxG. Estudos de inativação térmica demonstraram que na presença de Mn+2, a enzima não perdeu sua atividade consideravelmente após ser incubada por quarenta minutos a 60 °C. Os estudos de atividade enzimática mostraram que a DoxG foi capaz de catalisar a clivagem do catecol, 3-metilcatecol e 2,3-dihidroxibifenil, sendo que a eficiência catalítica (kcat/Km) para a clivagem do 2,3-dihidroxibifenil foi 1000 vezes maior do que para o catecol e 10 vezes maior do que para o 3-metilcatecol. Bacteria of the genus Pseudomonas have a formidable arsenal of enzymes allowing them to use polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) as the sole carbon source. Among these enzymes, the 1,2-dihydroxynaphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. C18 (DoxG), a Fe+2-dependent dioxygenase extradiol, catalyzes the conversion of 1,2-dihydroxynaphthalene to 2-hydroxy-2H-chromene-2-carboxylate via a dioxygenation. A reaction with no match in classical synthesis. This enzyme exhibits a large active site endorsing its promiscuity, which is able to cleave, in addition to a series of catechols, the polychlorinated biphenyls (BPCs). This formidable capacity contrasts with the facile oxidation of the Fe+2 cofactor by the oxygen present in the air, a process that occurs throughout the lysis and purification of the enzyme and leads to its inactivation. Our goal is to determine the factors to efficient enzyme reactivation, as well as strategies to improve its stability and catalytic activity. Therefore, DoxG was expressed and purified under aerobic conditions. Characterization was done by its monomeric mass determined by electrophoresis and by its oligomeric state estimated using dynamic light scattering, which was consistent with an octamer in aqueous solution showing a molecular mass of about 270 kDa. The rate of holoenzyme reconstitution was sensitive to several factors: (1) incubation with Fe2+ was the most efficient form of reactivation; (2) the reactivation rate depends on concentration of the Fe2+; (3) the pH of 5.75 provided the fastest reactivation. In more alkaline media the availability of the cofactor was limited and in more acidic media the process was negatively affected by protonation of active-site residues involved in the complexation of the cofactor; (4) although the ionic strength using NaCl or KCl did not affect the reactivation, salts or buffers with anions capable of binding Fe+2 (e.g. sulfate) affected its availability; (5) reactivation of 90% of the enzyme required two and a half hours of incubation with Fe2+. In addition, it was observed that Mn+2 could not replace the Fe+2 as cofactor, however, it provided greater stability to DoxG. Thermal inactivation studies showed that in the presence of Mn+2, the enzyme did not lose its activity considerably after being incubated for forty minutes at 60 °C. The enzyme activity studies showed that DoxG was able to catalyze the cleavage of catechol, 3-methylcatechol, and 2,3-dihydroxybiphenyl. The catalytic efficiency (kcat/Km) for cleavage of 2,3-dihydroxybiphenyl was 1000-fold and 10-fold greater than catechol and 3-methylcatechol, respectively.

Orientador: Fabio Marcio Squina, Roberto Ruller Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O etanol de segunda geração, produzido a partir dos polissacarídeos da biomassa lignocelulósica, apresenta-se como uma alternativa promissora para tornar a matriz energética brasileira sólida e, em grande parte, renovável. A biomassa é composta basicamente por celulose, hemicelulose e lignina. Celulose e hemicelulose devem ser hidrolisadas a açúcares monoméricos fermentescíveis para produzir etanol. Entretanto, a tarefa de propor um processo enzimático de hidrólise eficiente e de baixo custo com a finalidade de sacarificar a biomassa é desafiadora, pois os polissacarídeos que a compõem são complexos e recalcitrantes. Embora as hemiceluloses representem cerca de 30% dos açúcares do bagaço da cana-de-açúcar, uma das biomassas mais promissoras para a produção de etanol de segunda geração no Brasil, ainda poucos estudos são direcionados ao estudo da sacarificação dessa fração de polissacarídeos. Hemicelulases são glicosídeo hidrolases que catalisam a hidrólise dos polissacarídeos hemicelulósicos, e que em atuação sinérgica com celulases promove a hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar de maneira mais eficiente que as classes de enzimas isoladamente. A primeira parte dessa dissertação apresenta a caracterização bioquímica e biofísica de uma arabinofuranosidase GH51 do micro-organismo Bacillus subtilis 168. ?-L-arabinofuranosidases são hemicelulases que hidrolisam terminais não redutores de polissacarídeos contendo arabinose. A AbfA mostrou-se robusta, atuando numa ampla faixa de temperatura, e capaz de liberar monômeros de arabinose hidrolisando 1,5-?-L-arabinoheptaose a partir da extremidade não-redutora. A análise dos dados de SAXS combinada com simulações de dinâmica molecular mostrou que a AbfA em solução é hexamérica, com cada subunidade contendo uma molécula com domínio catalítico em enovelado na forma de barril (?/?)8 seguido por um domínio acessório ?-sandwich. Esses dados evidenciam que a estrutura quaternária pode ser importante para o desempenho de atividade das arabinofuranosidases da família 51. A segunda parte da dissertação aborda uma avaliação da influência dos domínios de ligação a carboidratos na atividade de xilanases mesofílicas e termofílicas. Xilanases são hemicelulases que catalisam a hidrólise de ligações endo-1,4-?-D-xilosídicas na molécula de xilano. Fusões gênicas uniram end-to-end um CBM6 de Clostridium thermocellum aos domínios catatalíticos xilanásicos das enzimas GH10 termofílica (de Thermotoga petrophila) e GH11 mesofílica (de Bacillus subtilis 168). O CBM6 alterou o padrão de hidrólise das quimeras termofílicas e aumentou a constante de eficiência da quimera mesofílica, quando comparadas as enzimas nativas respectivas. Além disso, na hidrólise da biomassa da cana-de-açúcar a xilanase quimérica mesofílica suplementou o coquetel comercial Accellerase 1500, liberando mais açúcares redutores. Dessa forma a fusão ao CBM6 mostrou-se uma alternativa para construir enzimas com melhor desempenho cinético Abstract: The second generation ethanol, produced from lignocellulosic biomass polysaccharides, presents itself as a promising alternative to make the Brazilian energy matrix solid and largely renewable. Biomass is composed mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose and hemicellulose must be hydrolyzed in fermentable monomeric sugars to produce ethanol. However, the task of proposing a process for enzymatic hydrolysis efficient and low cost in order to saccharify the biomass is challenging because its polysaccharides are complex and recalcitrant, so it requires the presence of several different catalytic activities for hydrolysis. Although hemicelluloses represent about 30% of sugars from sugarcane bagasse, one of the most promising biomass for the production of second generation ethanol in Brazil, few studies are directed to the saccharification study of this polysaccharidic fraction. Hemicellulases are glycoside hydrolases that catalyze the hydrolysis of hemicellulosic polysaccharides and works synergistically with cellulases promoting the hydrolysis of sugarcane bagasse more efficiently than each one class of enzymes alone. The first part of this dissertation presents the biochemistry and biophysics characterization of a GH51 arabinofuranosidase from microorganism Bacillus subtilis 168. ?-Larabinofuranosidases are hemicellulases that hydrolyze linkages in terminal nonreducing ends of polysaccharides containing arabinose. The AbfA showed itself robust, working in a wide temperature range, and able to release arabinose monomers hydrolyzing 1,5-?-L-arabinoheptaose from the non-reducing end. The analysis of SAXS data in combination with molecular dynamics simulations showed that AbfA solution is hexameric, with each subunit containing a molecule with catalytic domain coiled in the form of barrel (?/?)8 followed by a ?-sandwich domain accessory. These results evidence and corroborate data that the quaternary structure may be important for the activity of GH51 arabinofuranosidases family. The second part of the thesis adresses an evaluation of the influence of carbohydratebinding modules, non-catalytic domains of polysaccharides recognition, in the activity of mesophilic and thermophilic xylanases. Xylanases are hemicellulases that catalyze the hydrolysis of endo-1 ,4-?-D-xylosidic linkages in xylan molecule. Gene fusions joined end-to-end a CBM6 from Clostridium thermocellum to catalytic xylanasic domains of enzymes thermophilic GH10 (from Thermotoga petrophila) and mesophilic GH11 (from Bacillus subtilis 168). The CBM6 changed the hydrolysis pattern of thermophilic chimeras increased the efficiency constant of mesophilic chimera, when compared to the respective native enzymes. Furthermore, in the sugarcane biomass hydrolysis mesophilic chimeric xylanase supplemented the commercial cocktail Accellerase 1500, releasing more reducing sugars. In conclusion, the CBM6 fusion proved itself an alternative to construct enzymes with better kinetic performance Mestrado Bioquímica Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Ricardo Antunes de Azevedo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A presença de metais pesados no ambiente é atualmente, um dos principais problemas de contaminação ambiental, uma vez que, os metais liberados no ambiente contaminam o solo e entram na cadeia alimentar através das plantas, causando efeitos tóxicos a curto e a longo prazo aos animais e seres humanos. No caso do metal pesado Níquel (Ni), foi constatado que a sua presença nas plantas pode diminuir o crescimento, reduzir a taxa de fotossíntese e provocar alterações, tanto nas atividades enzimáticas quanto metabólicas.Pouca informação está disponível na literatura, com referência a resposta antioxidante das plantas à expressão a esse metal. Neste sentido, os objetivos deste trabalho foram realizar diferentes ensaios para avaliar o efeito fitotóxico do Ni em plântulas de C. juncea. Neste estudo foram analisados parâmetros bioquímicos relativos à atividade das enzimas antioxidantes, Catalase (CAT), Superóxido Dismutase (SOD) e Glutationa Redutase (GR). Constatou-se que, não houve alteração da atividade GR e CAT nas raízes. Entretanto, atividades destas enzimas apresentaram aumento significativo na parte aérea. O aumento na atividade da GR, na parte aérea, pode ser explicado pelo fato de ser o ciclo Halliwell-Asada o principal mecanismo que age na desintoxicação de Espécies Ativas de Oxigênio. Quanto à atividade da SOD, quando comparados ambos tecidos, foi constatado que na parte aérea foi pouco alterada, entretanto, a atividade da SOD foi estimulada nas raízes na presença do Ni. Para aumentar a precisão dos resultados, quantificou-se pela técnica de Fluorescência de Raios X, a concentração de NiCl2 e o seu efeito na absorção de nutrientes nas plântulas de crotalaria. Nesta análise, observou-se o acúmulo do metal nas raízes e baixa translocação para a parte aérea. Também foi analisada a concentração de Malonaldeído (MDA) na parte aérea de plântulas de C. juncea, sendo constatada, a ocorrência de peroxidação lipídica na presença do Ni. Finalmente, determinou-se o efeito do Ni sobre as concentrações de aminoácidos solúveis em raízes e na parte aérea, como estratégia desta planta para superar o efeito do Ni , não tendo sido observadas variações significativas nas concentrações dos mesmos com os diferentes tratamentos com Ni. Palavra¿Chave: Aminoácidos, Atividade Enzimática, Crotalária, Fitotoxicidade, Níquel, Poluição Ambiental Abstract: The contamination of the environment with heavy metals has become a world-wide problem. Heavy metals can have direct effects on human health and decreases agricultural yields. In the presence of Nickel (Ni), plant growth and the net photosynthetic rate have been shown to be significantly reduced, even at low concentrations. Moreover, Ni can also inhibit the activity of several groups of enzymes and metabolism. The effects of the Ni on the activies of the antioxidant enzymes and metabolism were investigated in C.juncea seedlings. Enzymatic assays for Catalase (CAT) Glutathione Reductase (GR) and Superoxide Dismutase (SOD) were carried out. Response patterns for CAT and GR were similar with low values in the roots and increased activity in the shoots. A significant increase in CAT and GR activity in the shoots suggests that these enzymes play a role in the detoxification process, of reactive oxygen species (ROS) produced by the induced Ni stress, possibly by subquesent dismutase. On the other hand, the activity of SOD was stimulated in the roots, and decreased in the shoots. To gain insight into the response of C. juncea seedlings to the oxidative damage induced by excess Ni, were conducted studies of Malondialdehyde (MDA). It was evident that Ni induced an increase an lipid peroxidation in the shoots during the studied period. The Ni concentration in shoots and roots was determined for C. juncea and demonstrated an increase in the concentration of Ni in the roots, however the shoots did not present an accumulation. Further experiments were carried out on total free amino acids. It was observed that Ni treatment did not cause any change in the accumulation of total free amino acids in the roots. The results suggest that in C. juncea seedlings did not exhibit any major variation following Ni treatment. Key words: Antioxidant enzymes, Amino acids, C. juncea, Nickel, Environmental Pollution Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Nelson Horacio Pezoa Garcia Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A fermentação das sementes de cacau é uma atividade indispensável para o desenvolvimento dos precursores do aroma de chocolate. Durante essa etapa a polpa que envolve as sementes é metabolizada por microrganismos, produzindo, principalmente, etanol e ácido acético, que são absorvidos pelos cotilédones causando a morte da semente e promovendo alterações físico-químicas importantes na constituição do sabor. Entre essas, pode-se ressaltar a formação de aminoácidos e açúcares redutores livres, oxidação de antocianinas, e complexação de aminoácidos com compostos fenólicos formando quinonas, contribuindo assim para a redução do amargor e adstringência das amêndoas. Diante da necessidade do melhoramento do sabor do cacau, este trabalho visa a utilização da enzima polifenoloxidase (PPO) provinda da polpa de pinha (Annonna squamosa L.), que atua na fase primária da fermentação e da enzima protease, na forma comercial, denominada "Protezyn Flavour", a fim de reduzir a concentração de compostos responsáveis pelo amargor e adstringência e aumentando a disponibilidade de aminoácidos livres para as reações de desenvolvimento de sabor. As enzimas foram adicionadas após 48 horas e 96 horas do processo fermentativo, tempos em que as condições de pH e temperatura se tornaram mais favoráveis. A enzima protease foi adicionada nas concentrações de 0,5% e 0,75% em relação ao teor de proteína presente na semente,. A polpa de pinha madura rica em PPO foi adicionada nas concentrações de 5,0% e 7,5% em relação à massa total de sementes de cacau com polpa mucilaginosa. Foram realizadas oito fermentações de sementes de cacau em duplicata: três com adição de polpa de pinha madura, três com adição da enzima protease e duas sem aplicação de enzima, sendo que em uma destas adicionou-se água na mesma proporção das soluções com enzima protease. As fermentações foram realizadas todas simultaneamente em caixas de isopor com capacidade aproximadamente de 6 litros e com orifícios, no fundo, de 0,5cm de diâmetro, espaçados a cada 2,5cm para o escoamento do mel e em uma sala climatizada com temperatura média de 33°C e umidade relativa ao redor de 65%, condições similares àquelas das regiões onde se cultiva e fermenta o cacau. Os nibs foram secados e moídos para depois serem desengordurados. Foram realizadas análises no pó de cacau desengordurado para a quantificação de fenóis totais, taninos, antocianidinas, flavan-3-ois e aminoácidos livres. Os experimentos tratados com PPO tiveram redução de 18,64 e 20,07% de fenóis totais. Houve aumento na concentração de aminoácidos livres na faixa de 43,8-79,74%. A torração foi efetuada sobre os nibs com granulometria entre 3-6 mm, em lotes de 250 g, em forno elétrico rotativo à temperatura de 150°C na camisa do aparelho. Foram utilizados três tempos de torração para cada experimento: 36, 38 e 40 minutos. Os nibs torrados foram refinados (liquor) para a formulação da mistura para realização dos testes sensoriais. Os tratamentos com adição de 0,5% da enzima comercial "Protezyn flavour" e adição de 5,0% de polpa de pinha, após 96 horas de fermentação, foram considerados os melhores, de acordo com os resultados analíticos. Abstract: The fermentation of cocoa beans is an indispensable activity for the development of the precursors of chocolate flavor. During this stage the pulp that surrounds the beans is metabolized by microrganisms, producing, mainly, ethanol and acetic acid which are absorbed by the cotyledons resulting in the death of the seed, with several physical-chemical changes that will have important an influence on the flavor. Among these the synthesis of amino acids and tree reducing sugars, anthocyanin oxidation and of amino acid complexation with fenolics compounds, giving rise to quinones. Ali of these contribute to the reduction of the bittemess and astringency of the beans. In order to improve of the cocoa flavor, this work deals with the use of the enzyme polyphenoloxidase (PPo) extracted trom ripe custard apple (Annona squamosa L.) pulp, which acts in the primary phase of fermentation, and of the commercial enzyme protease, known as " Protezyn Flavour ", with the aim of reducing the concentration of compounds responsible for the bittemess and astringency, and of increasing the availability of free amino acids for the reactions of flavor development. The enzymes were added after 48 hours and 96 hours of the fermentation processoThe enzyme protease was added in the concentrations of 0.5% and 0.75% of the bean protein content. The ripe custrad apple pulp, rich in the enzyme PPO, was added in the concentrations of 5.0% and 7.5% of the total weight of wet beans. Eight fermentations were carried out: three with the addition of ripe custard apple pulp, three with the addition of the enzyme protease and two with no enzyme application, and in one of these fermentations water was added in the same proportion as the solutions with the enzyme protease. The fermentations were carried out simultaneously in fiberglass boxes with a capacity for 6 liters, with holes in the botton, spaced at 2.5cm for the drainage of exsudates. The boxes were placed in an acclimatized room with a meam temperature of 33°C and reiative humidity of 65%, conditions similar in those of the areas where cocoa is cultivated and fermented. The nibs were dried and ground and then defatted. Analyses were carried out on the defatted cocoa powder for the quantification of total phenols, tannins, anthocyanidins, flavan-3-ols and free amino acids. The experiments with PPO showed a reduction of form 18.64 and 20.07% in total phenols. There was na increase in the concentration of free amino acids in the range from 43.80 -79.74%. Roasting was effected on nibs in the range of size from 3 to 6 mm, in portions of 250 g, in a rotative electric oven at a temperature of 150°C. For each experiment three different times of roasting were applied: 36, 38 and 40 minutes. The roasted cocoa nibs were ground and refined for the formulation of the mixture used in the sensory tests. According to the analyses the best results were obtained with the treatments with the addition of 0.5% of the enzyme protease and 5.0% of the ripe custard apple pulp, allowing for 96 hours of fermentation. Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Hiroshi Aoyama Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Quatro isoformas APl, AP2Al, AP2A2 e AP2B da fosfatase ácida (E.C. 3.1.3.2.) de fígado de cação (Rhizoprionodon lalandei) foram detectadas e parcialmente purificadas através de bath em Hidroxiapatita, cromatografias em colunas de SP-Sephadex, DEAE-Sephadex, Sephacryl S200 e Concanavalina A-Sepharose 4B. As isoformas AP2Al, AP2A2 e AP2B foram parcialmente purificadas cerca de 68_ 57 e 34 vezes, com atividades específicas de 5,6_ 4,7 e 2,8 !lmol min-l . mg-l respectivamente. Neste estágio de purificação, estas isoformas mostraram-se altamente instáveis. A isoforma APl foi parcialmente purificada cerca 20 vezes, com atividade específica de 1,66 !lmol min-1. mg-l. A massa molecular relativa da isoforma APl, determinada por HPLC da Shimadzu (coluna Shim pack diol 150), foi de 58 kDa. Esta isoforma mostrou-se mais estável que as isoformas AP2. As propriedades cinéticas da fração APl foram estudadas. A enzima apresentou alta atividade em pH 4,7 - 5,0_ a temperatura ótima obtida foi de 65°C. A hidrólise a 37°C e pH 5,0 foi linear até 45 minutos e a energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pela equação de Arrhenius, foi de 39,37 kJ.mor1. Um valor da Km de 0,97 mM foi obtido utilizando-se pnitrofenilfosfato como substrato. Dentre os substratos testados, a isoforma API apresentou maior especificidade pelo PPi. Utilizando-se pNPP como substrato vários compostos foram testados como potenciais inibidores. Molibdato (O,lmM) e NaF (5mM) inibiram 100%, pCMB (lmM) e NaF (1mM) inibiram cerca de 80%, o-vanadato (0,1 mM) e tartarato (5mM) , cerca de 500/0. Baseado no estudo de inibidores a isoforma APl da fosfatase ácida de cação apresenta características mais similares as fosfatases ácidas de Imamíferos de alta massa molecular Abstract: Four isoforms API, AP2AI, AP2A2 and AP2B of acid phosphatase (E.C. 3.1.3.2.) were detected and partially purified from shark (Rhizoprionodon Ia/andei) liver through bath Hydroxyapatite, cromatography columns of SP-Sephadex, DEAE-Sephadex, Sephacryl S-200 and Concanavalin A-Sepharose 4B.The fractions AP2AI, AP2A2 and AP2B were purified 68.3; 57.3 and 34.2-fold, with specific activities of 5.6; 4.7 and 2.8 Jlmol min-1.mg-l respectively. The fraction APl was partially purified 20-fold, with specific activity of 1,66 Jlmol min-1.mg-l. The relative molecular mass ofthis fraction, determined by HPLC (Shim pack diol 150 column), was 58 kDa. At this stage of purification the fraction APl has shown to be more stable than the isoforms AP2. The kinetic properties of the API fraction were determined using pnitrophenyl phosphate (pNPP) as substrate. High activities were observed at pH around 4.7 - 5.0, and temperature of 65° C, at temperature of 37°C, pH 5.0 the hidrolysis was linear up to 45 minutes. The activation energy value of 39,37 kJ.mor1 for the hidrólysis ofpNPP, was calculated from the Arrhenius equation. An apparent Km value of 0.97 mM was determined for pNPP. From the substrates tested, inorganic pyrophosphate was the best substrate, whit a 5-fold lower Km and 2-fold higher specificity constant, when compared with pNPP. Several compounds were tested as potential inhibitors, with pNPP as substrate. Molybdate (O.lmM) and fluoride (5mM) inhibited 100%; p-CMB (lmM) and NaF (ImM) inhibited about 80%, and o-vanadate (0.1 mM) and tartrate (5mM), about 50%. Based on inhibitors studies the API isoform of acid phosphatase purified from shark liver presents more similar characteristics the fosfatases acid of mammals of high molecular mass Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Nelson Horacio Pezoa Garcia Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A tendência atual na procura por produtos com redução do valor calórico e dos teores de açúcares pelos consumidores, sejam eles dependentes de dietas restritivas devido a questões de saúde ou por opção, tem impulsionado o crescimento da indústria alimentícia nesse setor, com o comprometimento na formulação de produtos com qualidades sensoriais e nutricionais diferenciadas. Com base nisso, a finalidade deste trabalho foi promover enzimaticamente a redução de sacarose e glicose em suco de manga, e posterior produção de geléia sem adição de açúcares, mantendo a frutose naturalmente presente, e rica em sólidos da fruta. Para esse fim, foi processado suco simples de manga, variedade Keitt, e realizada sua caracterização química e microbiológica. Primeiramente foi realizado um estudo do tratamento do suco com as enzimas invertase, para hidrolisar a sacarose em frutose e glicose, e glicose oxidase, para promover a oxidação da glicose. Dessa forma, o suco com maior teor de frutose em relação aos outros dois açúcares pode ser consumido por indivíduos portadores de diabetes. Os ensaios foram realizados utilizando planejamento fatorial composto central, com cinco níveis para as variáveis independentes, sendo estas concentração de invertase (p/p) e concentração de glicose oxidase (v/p); as condições tempo de tratamento e temperatura, bem como agitação do sistema foram pré-determinadas e fixadas. Os resultados obtidos mostraram uma inversão de sacarose de até 100%, enquanto que a oxidação da glicose, após os inúmeros ensaios realizados, atingiu uma porcentagem máxima de 8%, devido provavelmente à baixa atividade da enzima glicose oxidase no suco de manga. Um segundo objetivo foi produzir geléia de manga rica em sólidos da fruta e sem adição de açúcares (sacarose, xarope de glicose ou outros), comparando com geléia convencional sob os aspectos físicos, químicos, sensoriais e microbiológicos. As geléias foram obtidas através de processos diferentes, sendo cocção a vácuo e processo contínuo. Os resultados da caracterização química e física das duas geléias mostraram concordância com os trabalhos encontrados na literatura e dentro das faixas estabelecidas de padrão de qualidade de geléia, principalmente os parâmetros pH, acidez e teor de sólidos solúveis, necessários para a formação do gel. ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital. Abstract: The new trend of searching for products with reduced caloric values and sugar contents by consumers dependent on restrictive diets, either for health related reasons or by personal option, has stimulated the growth of the food industry in this sector, with the commitment to formulate products of sensory and nutritional quality. Based on this context, the objective of this work was to promote sucrose and glucose reduction in mango juice and the production of mango jelly without the addition of sucrose and glucose, maintaining the natural fructose and rich in fruit solids. To accomplish this, whole mango juice (cv. Keitt) was processed and characterized chemically and microbiologically. First, a study of the nzymatic treatment of the juice with invertase was carried out, this enzyme hydrolyzing sucrose into fructose and glucose, and also with glucose oxidase, which promotes glucose oxidation. The idea was to produce juice with a greater proportion of fructose than other sugars, which may be eaten by diabetic individuais. The trials were planned using a central composite design, with five levels for each independent variable, namely, invertase concentration (w/w) and glucose oxidase concentration (v/w). Treatment time and temperature, as well as stirring, were predetermined and fixed. The results showed up to 100% of sucrose inversion, while glucose oxidation achieved a maximum levei of 8%, probably because of low glucose oxidase activity in mango juice. A second objective was to produce a mango jelly rich in fruit solids and without the addition of the commonly used sugars (sucrose, glucose syrup), which was compared to a conventional jelly with respect to physical, chemical, sensorial and microbiological aspects. The jellies were produced by different processes, namely, open-air process for the conventional jelly and a continuous method for the jelly without added sugars. The results of the chemical and physical characterization of both the jellies were compatible with articles found in the specialized literature and within the ranges established as standards for jelly quality, mainly in terms of the parameters pH, acidity and soluble solids content, essential for gel formation. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations. Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Stephen Hyslo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A difusão de toxinas do sítio de inoculação de veneno é atribuída à ação de enzimas como colagenases, elastases, hemorraginas e hialuronidases que degradam os componentes da lâmina basal e da matriz extracelular. Neste trabalho avaliamos a atividade hialuronidásica de vários venenos animais e investigamos algumas propriedades da enzima encontrada no veneno da cascavel sul americana Crota/us durissus terrificus. A atividade hialuronidásica foi medida por um método turbidimétrico usando-se ácido hialurônico como substrato e também por detecção in situ após SDS PAGE. A hialuronidase foi parcialmente purificada por gel filtração em coluna de Sephacryl S200 HR. O perfil de eluição foi monitorado a 280nm e as frações foram testadas para atividade enzimática. A capacidade de antisoros em neutralizar a enzima foi avaliada medindo-se a atividade residual após co-incubação durante 30 min à 37°C. De modo geral, os venenos investigados possuíam atividade hialuronidásica, com níveis mais altos em venenos de artrópodes [15.3+-4.7 ¿ 166+-19.2 unidades (TRU ou "turbidity reducing units")/mg] do que em serpentes (O - 7.0+-1.7 TRU/mg; média+-E.P.M.; n=3-6). Houve variação dentro e entre espécies e subespécies, conforme observado com os venenos botrópicos e crotálicos, respectivamente. Assim, a atividade hialuronidásica de diferentes amostras de veneno de C. d. terrificus variou de 4.5:tO.5 à 13.2:t4.8 unidades TRU/mg, (n=3-6), enquanto a de C. d. cascavella e C. d. collilineatus era de 25.7:t1.2 e 6.8:t1.1 TRU/mg, respectivamente. A hialuronidase mostrou pH ótimo de 4,0, e atividade máxima na presença de 50-100 mM de NaCI. A enzima perdeu atividade acima de 37°C, e também perdeu 50% de atividade durante as primeiras 6 h em solução (acetato de sódio 0,1 M, pH 6,0, contendo 0,15 NaCI), mas depois se manteve relativamente constante até 24 h, independente da temperatura de incubação (4°C, 25°C, 37°C). A cromatografia do veneno de C. d. terrificus por gel filtração resultou em um pico de atividade hialuronidásica com peso molecular >30.000, o que foi confirmado por eletroforese (SDS-PAGE) seguido por detecção de atividade in situo Com esta técnica, apenas uma banda de atividade foi observada com os diferentes lotes de veneno e o peso molecular foi estimado em -75.000. A atividade da enzima foi inibida de forma dose-dependente por antisoros comerciais (anti-botrópico, anti-crotálico, anti-elapídico e anti-escorpiônico), sendo o anti-escorpiônico o menos eficaz; em altas doses, todos inibiram a atividade em >90%. Estes resultados indicam que há variação nos ní.veis de atividade hialuronidásica no veneno de C. d. terrificus, mas que existe apenas uma isoforma. As propriedades desta enzima se assemelharam às de outras hialuronidases de venenos. A neutralização da atividade enzimática por diferentes antisoros comerciais indicou que há identidade imunológica entre hialuronidases de diferentes venenos Abstract: Animal venoms contain enzymes capable of degrading basement membrane and extracellular matrix components. We examined the collagenase, elastase and hyaluronidase activities of several venoms and some of the properties of hyaluronidase in Crotalus durissus terrificus (South American rattlesnake) venom. Collagenase and elastase were assayed colorimetrically. Hyaluronidase activity was measured turbidimetrically and by in situ detection following SDS-PAGE. The enzyme was also partially purified by gel filtration on Sephacryl S200 HR. Neutralization of hyaluronidase by antisera was tested by measuring the residual activity afier co-incubation. Arthropod and snake venoms showed similar levels of collagenase; elastase activity varied from O - O.713 ~nm/mg/24 h. The hyaluronidase content of arthropod venoms [15.3+-4.7 to 166:!:19.2 units/mg; mean +-SEM] was higher than in snake venoms (37°C and after 6 h in solution (-50% reduction) at 4°C, 25°C and 37°C. Commercial antisera neutralized the enzyme. These propertiesof C. d. terrificus hyaluronidase were similar to those of other venom hyaluronidases Mestrado Mestre em Farmacologia

Orientadores: Marlene Rita de Queiroz, Neide Botrel Gonçalves Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Agrícola Resumo: A água de coco verde é extremamente perecível após a colheita dos frutos e sua qualidade está diretamente relacionada às condições do ambiente de armazenagem. Portanto, são necessárias tecnologias que permitam a conservação do coco verde por um período superior a trinta dias para que o fruto possa ser exportado e comercializado mantendo a água em condições apropriadas para o consumo ao natural. O presente trabalho teve o objetivo de desenvolver revestimentos biodegradáveis para prolongar a conservação do coco verde, variedade Anão Verde, propiciando maior tempo para a sua comercialização e consumo da água, sem alterar suas qualidades sensoriais e nutritivas. Cocos foram revestidos com biofilmes a base de quitosana, gelatina e carboximetilcelulose (CMC), nas seguintes formulações: quitosana (B1); gelatina + CMC (B2); quitosana + gelatina (B3); CMC (B4); gelatina (B5) e controle [água] (B6). Depois os frutos foram armazenados a 12 ± 2 ºC, com UR de 80%, por até 40 dias. Amostras foram retiradas a cada 10 dias para as análises físicas, fisíco-químicas, químicas, bioquímicas, microbiológicas e fisiológicas. Para a análise sensorial do fruto e da água foram retiradas amostras no início e aos 26, 33 e 40 dias de armazenamento. As características físicas, físico-químicas e químicas foram mais influenciadas pelo tempo de armazenamento do que pelos tratamentos de biofilmes. O tempo de armazenamento causou redução do volume e aumento da turbidez da água, redução do pH, dos teores de sólidos solúveis, de glicose, frutose e vitamina C, aumento da acidez total titulável, dos minerais, dos compostos fenólicos, da atividade da peroxidase e fenilalanina amônia-liase, mas não teve efeito sobre os teores de sacarose, de Na e Mn. Os biofilmes e o tempo de armazenamento influenciaram a acidez total titulável, teores de glicose e frutose, teores de N e de compostos fenólicos e a atividade da polifenoloxidase, porém as águas dos tratament os (B1), (B3) e (B5) apresentaram poucas alterações destas variáveis no decorrer do armazenamento. A presença de coliformes a 45 ºC e 35 ºC, aeróbios mesófilos, fungos filamentosos e leveduras na água foi menor nos frutos revestidos com (B1) e (B3). A contaminação foi maior na água dos frutos revestidos com (B5) e (B6). No entanto os índices de contaminação da água de todos os tratamentos foram considerados aceitáveis para o consumo. As análises fisiológicas mostraram diferenças emtre os biofilmes, sendo a concentração de O2 maior nas microcâmaras contendo frutos revestidos com quitosana e menor nas do controle. A concentração de CO2 foi maior nas microcâmaras contendo frutos do controle. As concentrações de CO2 e de O2 diminuíram nas microcâmaras ao final do armazenamento. A concentração de etileno foi muito pequena, abaixo do limite de detecção. A aceitação dos frutos diminuiu com o tempo de armazenamento, assim como a intenção de compra e expectativa em relação à água. Frutos revestidos com (B1), (B3) e (B5) tiveram maior aceitação ao final do tempo de armazenamento. A aceitação e a intenção de compra da água também diminuíram com o período de armazenamento. Frutos revestidos com gelatina não apresentaram boa aceitação da água. A água dos frutos revestidos com quitosana manteve a aceitação de sabor até 40 dias de armazenamento. Entre os biofilmes testados, o de quitosana apresentou o melhor desempenho, contribuindo para a manutenção das características nutricionais e sensoriais da água de coco e proporcionando maior aceitação do consumidor e melhor aparência do fruto por 40 dias de armazenamento, o que permite indicar este revestimento para fins de exportação Abstract: The green coconut water is extremely perishable after harvest and its quality is directly related to storage ambient conditions. Therefore, technologies to allow the preservation of green coconut by a larger period than thirty days are need so that the fruit can be exported and commercialized maintaining the water in adequate conditions for in natura consumption. The present study had the objective of developing biodegradable coatings to prolong the conservation of green coconut, Anão Verde variety, to obtain larger time for its commercialization and consumption of water, without changing its sensorial and nutritional qualities. Coconuts were covered with bio-films made from chitosan, gelatin and carboxymethylcellulose (CMC), using the follow formulations: chitosan (B1); gelatin + CMC (B2); chitosan + gelatin (B3); CMC (B4); gelatin (B5) and control [water] (B6). Then the fruits were stored for up to 40 days at 12° ± 2°C and RH of 80%. Samples were removed every 10 days for physical, physicochemical, chemical, biochemical, microbiological and physiological analyses. For the fruit and water sensorial analysis, samples were removed in the beginning and at 26, 33 and 40 days of storage. The physical, physico-chemical and chemical characteristics were more affected by storage time than by the treatments with the bio-films. The storage time promoted the decrease of water volume and the increase of water turbidity, reduction of pH and soluble solid contents, glucose, frutose and vitamin C, increase of the total titratable acidity, minerals contents, phenolic compounds contents and the activity of peroxidase and phenylalanine ammonia-lyase but had no effect on the sucrose content and on some of minerals, such as Na and Mn. The bio-films and storage time affected the total titratable acidity, glucose, fructose contents, N and phenolic compounds contents and the polyphenoloxidase activity, although the water from the fruits coated with (B1), (B3) and (B5) showed little alteration respect to these variables during the storage time. The presence of coliforms at 45 ºC and 35 ºC, mesophilic aerobics, filamentous fungi and yeasts in the water was lower on the fruits coated with (B1) and (B3). Contamination was highest in the water of fruits coated with (B5) and (B6). However, all the water contamination indexes were considered to be within the acceptable levels for consumption. The physiological analyses showed differences among bio-films: the concentration of O2 was larger inside the microchambers containing fruits coated with chitosan and smaller on that containing fruits of the control. The concentration of CO2 was larger inside microchamber containing fruits of the control. The concentrations of CO2 and O2 inside microchambers decreased at the end of storage time. The ethylene concentration was very small, below the detection limit. The acceptance of the fruits decreased with storage time, as did the purchasing intention and expectation respect to the water. Fruits coated with (B1), (B3) and (B5) showed the greater acceptance at the end of the storage time. The acceptance and the purchasing intention of the water also decreased with storage period. Fruits coated with bio-films of gelatin did not present good acceptance of water. The water of the fruits coated with chitosan maintained the flavor acceptance up to 40 storage days. Among the bio-films tested, the chitosan presented the best performance, contributing to maintain the nutritional and sensorial characteristics of the coconut water and providing larger consumer acceptance and better appearance of the fruit for 40 days of storage, indicating this coconut coating for the exportation ends Doutorado Tecnologia Pós-Colheita Doutor em Engenharia Agrícola

Orientador : Hiroshi Aoyama Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O objetivo central do presente trabalho foi avaliar a estabilidade conformacional da fosfatase ácida de sementes quiescentes de soja. Através de estudos de desnaturação térmica, verificou-se uma temperatura de transição (TM) de 65 oC que mostra uma resistência incomum frente à temperatura. Observaram-se efeitos da concanavalina A (lectina) e de molibdato (inibidor) no perfil de desnaturação enzimática com alterações na TM. A desnaturação enzimática por dodecilsulfato de sódio (SDS) foi muito pouco significativa em presença do fosfoenolpiruvato (PEP) como substrato. Essa insensibilidade ao agente desnaturante pode ser explicada pela alta afinidade apresentada pela fosfatase em relação ao substrato em questão. A desnaturação térmica da enzima em presença do PEP revelou que este substrato produz uma mudança significativa no perfil de desnaturação, induzindo uma diminuição na temperatura de transição (TM) que representa um efeito antagônico àquele observado na desnaturação por SDS. A análise de aminoácidos revelou informações valiosas que explicam propriedades como o pI relativamente baixo (5,0), e o número expressivo de resíduos ácidos pode estar relacionado à estabilidade conformacional da enzima. Os estudos sistemáticos da desnaturação reversível por uréia e cloreto de guanidínio (GuaCl) foram realizados utilizando-se a fluorescência como técnica de monitoramento. O cálculo da Estabilidade Conformacional (deltaG H2O) foi feito tomando-se os deslocamento nos comprimentos de onda de máxima emissão de fluorescência como parâmetro e o valor obtido foi de 2,48 kcal/mol -1. Os cálculos de centro de massa foram tomados em função da concentração do agente desnaturante em ambos os casos. A análise de carboidratos, realizada por HPLC revelou a presença de manose, glicosamina e galactosamina e a remoção da fração de carboidratos não foi possível mesmo após tratamento com 300 mU das endoglicosidases endo-H, endo-F e endo-F1 Abstract: The central aim of the present work was to evaluate the conformational stability of an isoform of soybean seeds acid phosphatase. Through thermal denaturation studies, the transition temperature (TM) value determined (65 oC), indicated an unusual resistance of the enzyme under high temperatures. Effects of strongly binding compounds such as concanavalin A (lectin) and molybdate (inhibitor) on the denaturation profile and transition temperature values were also observed. Enzymatic denaturation by sodium dodecyl sulfate (SDS) was insignificant in presence of phosphoenolpyruvate (PEP) which might be explained by the high affinity of the enzyme for this substrate. Thermal denaturation studies in presence of PEP showed both a significant change on the denaturation profile and a reduction on the transition temperature value. Aminoacid analysis contributed to important informations that are in accordance with some properties of the enzyme such as the relatively low isoelectric point (pI): 5.0. Furthermore, the expressive number of acid residues seems to be related to the conformational stability of the polypeptidic chain. Systematic studies of reversible denaturation by urea and guanidinium chloride (GuaCl) were carried out using fluorescence as a monitoring technique. Conformational Stability calculations were made based on the wavelengths corresponding to the maximum fluorescence emission as a parameter and the value obtained was 2.48 kcal.mol-1. Calculations of the centre of mass were made as a function of the denaturating agent concentration in both cases. Carbohydrate analysis was carried out by using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) revealed mannose, glucosamine and galactosamine as main carbohydrates in the glycoconjugated structure. Carbohydrate removal was not possible even after treatment with 300 mU/mL of the endo-beta-N-acetylglucosaminidases-H, F and F1 Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular