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Orientador: Prof. Dr. Celso Garcia Auer Coorientadores: Dra. Juliana Degenhardt, Prof. Dr. Álvaro Figueredo dos Santos, Profa. Dra. Giovana Bomfim de Alcantara Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Florestal. Defesa : Curitiba, 13/12/2021 Inclui referências Área de concentração: Silvicultura Resumo: O híbrido Pinus elliottii var. elliottii (PEE) x Pinus caribaea var. hondurensis (PCH) vem se destacando pela produção de madeira e resina. Visando dar suporte ao melhoramento genético do híbrido, este trabalho teve como objetivos (I) otimizar um protocolo de clonagem baseado na embriogênese somática, (II) otimizar um protocolo de criopreservação de massas embriogênicas e (III) verificar a patogenicidade de fungos endofíticos encontrados em sementes imaturas do híbrido. Para a embriogênese somática foram analisados o efeito do genótipo na indução da embriogênese somática. Na fase de maturação, foram avaliadas diferentes composições de meio e estresses abióticos, e analisado o efeito de antibiótico na taxa de crescimento das massas embriogênicas. Na criopreservação, foram testadas duas soluções crioprotetoras, PSD e PVS3, avaliando a concentração de PSD e o tempo de exposição ao PVS3 das massas embriogênicas. Para os fungos endofíticos, foram realizados experimentos para avaliar a patogenicidade em sementes, plântulas in vitro e mudas de Pinus elliottii var. elliottii. A iniciação de massas embriogênicas mostrouse dependente do genótipo, com uma taxa de indução de 5,45 %. Nos experimentos de maturação, não foi observada formação de embriões somáticos. No que diz respeito a criopreservação, os dois protocolos mostraram-se aplicáveis às massas embriogênicas do híbrido. No experimento em que massas embriogênicas foram tratadas com o crioprotetor PVS3, após 90 dias, o tempo de exposição não influenciou no crescimento das massas submetidas a criopreservação. A utilização de antibióticos no meio de proliferação, não afetou estatisticamente a taxa de crescimento das massas embriogênicas. Dentre os fungos endofíticos isolados, Fusarium spp. e Diplodia pinea foram patogênicos em sementes, plântulas in vitro e em mudas de Pinus elliottii var. elliottii. A espécie Sporothrix pallida foi relatada pela primeira vez associada ao gênero Pinus. Abstract: The hybrid Pinus elliottii var. elliottii (PEE) x Pinus caribaea var. hondurensis (PCH) is of great interest for the production of wood and resin. Aiming to support the genetic breeding program, the objectives of this work were (I) to optimize a somatic embryogenesis protocol, (II) to optimize a cryopreservation of embryogenic masses protocol and (III) to evaluate the pathogenicity of endophytic fungi isolated from immature seeds of the hybrid. For somatic embryogenesis, the effect of genotype on initiation of somatic embryogenesis was evaluated. In the maturation phase, several compositions of medium and abiotic stresses were evaluated, and the effect of antibiotics on the growth rate of embryogenic masses was also evaluated. In cryopreservation, two cryoprotectant solutions were tested, PSD and PVS3 and the concentration of PSD and the time of exposure to PVS3 of the embryogenic masses were evaluated. Regarding the endophytic fungi, we carried out experiments to evaluate the pathogenicity in seeds, in vitro seedlings and seedlings of Pinus elliottii var. elliottii. We observed that the initiation of embryogenic masses was genotype dependent, with an initiation rate of 5.45%. Regarding the maturation experiments, the development of somatic embryos was not observed. In the cryopreservation experiments, both protocols proved to be applicable to the embryogenic masses of the hybrid. In the experiment in which embryogenic masses were treated with the cryoprotectant PVS3, after 90 days, the exposure time did not influence the growth of the masses submitted to cryopreservation. The use of antibiotics in the proliferation medium did not affect the growth rate of embryogenic masses. Among the isolated endophytic fungi, Fusarium spp. and Diplodia pinea were pathogenic for seeds, in vitro seedlings and seedlings of Pinus elliottii var. elliottii. The species Sporothrix pallida was reported for the first time associated with the genus Pinus.

O armazenamento celular e tecidual para uso em terapia regenerativa e desenvolvimento de pesquisas, torna-se uma questão importante à medida que a expectativa de vida aumenta. Este trabalho se propôs avaliar os efeitos de campos magnéticos estáticos unidirecionais durante o processo de criopreservação inicial de células e de tecido pulpar de dentes terceiros molares humanos hígidos. Foram obtidas polpas dentárias (n=39) de terceiros molares extraídos, que foram divididas para avaliação celular (n=3) de viabilidade e avaliação tecidual (n=36) para obtenção de células do tecido pulpar. Para avaliação celular, células isoladas e expandidas, compuseram os grupos: Grupo I: controle, células submetidas à criopreservação inicial por método convencional; Grupo II: controle, células submetidas à criopreservação inicial lenta; Grupo III: células submetidas à criopreservação inicial lenta, associado a 150mT; Grupo IV: células submetidas à criopreservação inicial lenta, associado a 290mT; Grupo V: células submetidas à criopreservação inicial lenta, associado a 360mT. Durante a criopreservação as células foram suspensas em meios de congelamento contento 0, 3 e 10% de DMSO (dimetilsulfóxido): GI-II III-IV-V 0%, GI-II-III-IV-V 3% e GI-II-III-IV-V 10%. Para avaliação tecidual as amostras criopreservadas inicialmente em método convencional, formaram os grupos: Grupo I: polpas submetidas à criopreservação inicial sem campo magnético (GI); Grupo II: polpas submetidas à criopreservação inicial associada a 150mT (GII); Grupo III: polpas submetidas à criopreservação inicial associada a 290mT (GIII); Grupo IV: polpas submetidas à criopreservação inicial associada a 360mT (GIV). Amostras das avaliações celular e tecidual, após criopreservação inicial, foram armazenadas em nitrogênio líquido por 7 dias. Após o processo de descongelamento a viabilidade celular foi mensurada por trypan blue e a eficiência de obtenção de células a partir da polpa criopreservada, por observação óptica diária. Os resultados foram semelhantes para as taxas de viabilidade imediatamente após descongelamento celular para GI-II-III-IV-V 0%, GI-II-III-IV-V 3% e GI-II-III-IV-V 10% (p>0.05). Enquanto a viabilidade após 96h de subcultivo celular, os valores de GI-II-III-IV-V 0% foram inferiores aos de GI-II-III-IV-V 3% e GI-II-III-IV-V 10% (p0.05). After 96h of culture, the proliferation rate was higher for the groups exposed to the freezing medium with 3% and 10% DMSO, than DMSO free groups (p

Frente à importância da preservação dos recursos genéticos algais depositados em coleções de referência para o apoio de programas de melhoramento, faz-se necessário o desenvolvimento de metodologias para a conservação de microalgas em estado metabolicamente inativo por longos períodos. Neste contexto, objetivou-se com o presente trabalho estabelecer protocolos otimizados de criopreservação para espécies de microalgas com arquiteturas celulares distintas (colonial cenobial, cocóide unicelular e colonial palmeloide), determinando-se os parâmetros ótimos para o congelamento, incluindo a fase de crescimento algal, além do tipo e da concentração de agentes crioprotetores. Foram testados três agentes químicos crioprotetores: dois agentes com alta permeabilidade celular, Glicerol e Dimetilsulfóxido (DMSO), e um agente não-permeável, Polietilenoglicol 400 (PEG 400). A otimização das variáveis foi realizada empregando-se delineamento composto central rotacional (DCCR) 22. Para a maioria das cepas unicelulares cocóides analisadas o congelamento durante a fase de desaceleração do crescimento algal (6º dia de cultivo) na presença do crioprotetor DMSO 7% (v/v) resultou nas taxas mais elevadas de viabilidade celular após a criopreservação (até 94%). Por outro lado, as taxas mais altas de recuperação da viabilidade celular de algas cenobiais (62,6%) foram obtidas mediante congelamento durante a fase de crescimento algal exponencial (3º dia de cultivo) na presença dos agentes glicerol e PEG 400 combinados na concentração de 5% (v/v) cada. Comportamento distinto também foi observado para as cepas palmelóides analisadas, com as taxas de recuperação mais elevadas (78,8%) tendo sido obtidas mediante congelamento durante a fase de desaceleração do crescimento algal (6º dia de cultivo) na presença da combinação de agentes crioprotetores, glicerol (5% v/v) + PEG 400 (5% v/v). Os resultados obtidos sugerem que a morfologia apresentada pelo talo algal pode ser um bom indicador para a escolha do agente crioprotetor a ser utilizado para a criopreservação. In view of the importance of preserving algal genetic resources deposited in reference collections for the support of enhancement programs, it is necessary to develop methodologies for the conservation of microalgae in a metabolically inactive state for long periods. In this context, the objective of this work was to establish optimized cryopreservation protocols for microalgae species with distinct cellular architectures (cenobial colonial, unicellular coccoid and palmeloid colonial), determining the optimal parameters for freezing, including the algal growth phase, and also the type and concentration of cryoprotective agents. Three cryoprotectants were tested: two agents with high cell permeability, Glycerol and Dimethylsulfoxide (DMSO), and a non-permeable agent, Polyethylene Glycol 400 (PEG 400). The optimization of the variables was carried out using a central composite rotational design (CCRD) 22. For most of the single-celled coccoid strains analyzed, the freezing during the deceleration phase of algal growth (6th day of culture) in the presence of 7% DMSO cryoprotectant v/v) resulted in the highest rates of cell viability after cryopreservation (up to 94%). On the other hand, the highest rates of cellular viability of the cenobial algae (62.6%) were obtained by freezing during the exponential algal growth phase (3rd day of cultivation) in the presence of combined glycerol and PEG 400 agents in the concentration of 5% (v / v) for each one. Different behavior was also observed for the analyzed palmeloid strains, with the highest recovery rates (78.8%) being obtained by freezing during the deceleration phase of algal growth (6th day of culture) in the presence of the combination of cryoprotectants, glycerol (5% v/v) + PEG 400 (5% v/v). The results obtained suggest that the morphology presented by the algal stem can be a good indicator for the choice of cryoprotectant to be used for cryopreservation.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A criobiologia e as tecnologias da reprodução podem contribuir para a preservação dos recursos genéticos animais, através da aplicação de programas de conservação da vida selvagem e dos animais domésticos. Estes programas pretendem evitar a extinção de espécies ou raças e conservar gâmetas ou embriões de animais de elevado valor genético. Na medicina humana, cada vez mais a criopreservação é procurada por mulheres em risco de perder a função ovárica, devido a infertilidade precoce causada por tratamentos cirúrgicos, radioterapia ou quimioterapia. Contudo a criopreservação de oócitos ainda apresenta uma baixa taxa de sucesso. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da utilização de diferentes combinações de crioprotetores (CPAs), etilenoglicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) e 1,2-propanediol (PROH) na criopreservação de oócitos bovinos e sua consequente repercussão na maturação dos oócitos, na viabilidade mitocondrial e no desenvolvimento embrionário posterior. Para isso, foram realizadas duas experiências onde se testam três protocolos de vitrificação: EG+DMSO+sucrose, EG+PROH+sucrose e DMSO+PROH+sucrose. Na experiência 1, os oócitos maturados foram submetidos ao processo completo de vitrificação/aquecimento. Na experiência 2, para estudar o efeito do choque osmótico e da toxicidade dos CPAs independentemente do efeito do frio, realizaram-se os mesmos procedimentos da experiência 1, à exceção da imersão em azoto líquido. Um grupo controlo, sem tratamento ou vitrificação, decorreu em ambas as experiências. Os oócitos foram inseminados com sémen descongelado e, após cultura, foram avaliadas as taxas de embriões. O estadio de maturação e o potencial de membrana interna mitocondrial foram avaliados após a vitrificação/aquecimento na experiência 1 e após o choque osmótico na experiência 2. A técnica de vitrificação (P=0,004) foi superior no grupo EG+DMSO relativamente aos grupos DMSO+PROH (P=0,002) e EG+PROH (P=0,01). Contudo, os três grupos de CPAs obtiveram taxas de clivagens inferiores ao controlo (P

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária A raça Puro Sangue Lusitano (PSL) é uma raça equina autóctone portuguesa sobre a qual não existe muita informação relativamente ao modo como o sémen se comporta e suporta as técnicas de criopreservação. Assim, constituíram objetivos deste trabalho (utilizando semén proveniente de animais desta raça) se existiam diferenças entre diferentes métodos: • de quantificação da concentração espermática (Spermacue, Minitube ® vs. Câmara de Neubauer); • de aferição da mobilidade espermática (avaliação subjetiva da mobilidade vs. avaliação com recurso ao sistema CASA); • de criopreservação (manual e com recurso a uma máquina de criopreservação automática) e protocolos de centrifugação do sémen. Avaliou-se ainda o número total de espermatozóides (spz) e mobilidade espermática durante a estação reprodutiva e fora dela. Foram avaliados 327 ejaculados de 29 garanhões PSL, tendo-se concluído que a variação do nº total de spz durante a época reprodutiva e fora dela apresenta diferenças significativas (p=0,006) e a mobilidade total não se encontraram diferenças significativas (p

Introdução: Os avanços nas técnicas de reprodução assistida têm possibilitado a preservação da fertilidade em mulheres que desejam adiar a maternidade ou naquelas que têm seu potencial reprodutivo ameaçado. Nesse contexto, a introdução da vitrificação de oócitos foi um avanço significativo na tecnologia reprodutiva, e vem mostrando resultados similares aos obtidos com oócitos frescos. Objetivo: O presente estudo tem como objetivo rever as principais indicações para a criopreservação de oócitos. Métodos: Foi feita uma revisão narrativa da literatura, pautada nos descritores e nos termos mais utilizados para vitrificação de oócitos, tendo como base LILACS, SciELO e PubMed. Resultados e conclusão: Baseado no atual nível de evidência, a criopreservação de oócitos não deve mais ser considerada técnica experimental. Foram observadas algumas indicações para vitrificação de oócitos entre elas destacam–se: mulheres saudáveis que desejam postergar a gestação, mulheres que serão submetidas a tratamentos gonadotóxicos e cirurgias ovarianas extensas, programas de ovodoação e vitrificação com o propósito de flexibilizar os protocolos de reprodução assistida.Palavras chave: Criopreservação, Preservação da fertilidade, Vitrificação, Oócitos, Infertilidade ABSTRACTIntroduction: Advances in assisted reproductive techniques have allowed preservation of fertility among women who wish to postpone maternity or have their reproductive potential threatened. In this context, the introduction of oocyte vitrification has evidenced to be a remarkable technological progress, and has shown similar results to those obtained with fresh oocytes. Objective: The present study aims to review the main indications of oocyte cryopreservation. Methods: A narrative review of the literature was carried out, based on the descriptors and terms most used for oocyte vitrification, based on LILACS, SciELO and PubMed. Results and conclusion: Based on the current level of evidence, oocyte cryopreservation should no longer be considered an experimental technique. Patients are accessing and receiving oocyte cryopreservation for a wide range of indications, among them the following stand out: healthy women who wish to postpone pregnancy, women who will undergo gonadotoxic treatments and extensive ovarian surgery, ovodoation and vitrification programs with the purpose of making assisted reproduction protocols more flexible.Keywords: Cryopreservation, Fertility preservation, Vitrification, Oocyte, Infertility

O objetivo deste estudo foi comparar a eficiência do sistema automatizado (curva de resfriamento controlada eletronicamente) de congelação de sêmen bovino versus o sistema convencional (curva não controlada) por meio dos parâmetros de qualidade e viabilidade espermática no período pós-descongelação. O sêmen de quatro touros azebuados adultos foram criopreservados simultaneamente em meio tris, gema e glicerol 7%. A avaliação computadorizada do sêmen descongelado detectou os seguintes parâmetros: MP 56,50±22,25%; VAP 34,77±4,25µm/s; VSL 28,17±4,25 µm/s; VCL 58,45±6,85µm/s; STR 82,00±2,31%; LIN 49,50±3,32%, para o sistema automatizado e MP. 57,00±13,11%; VAP 25,75±1,66µm/s; VSL 23,32±1,99µm/s; VCL 63,32±1,79µm/s; STR 82,25±3,59µm/s; LIN 50,00±4,97µm/s para o sistema convencional. Os valores médios das avaliações de integridade de membrana plasmática e integridade acrossomal foram de 54,72±12,55% e 36,13±22,20% para o sistema automatizado e 53,22±13,22% e 47,26±5,74% para o sistema convencional, respectivamente. Com os parâmetros avaliados foi possível identificar que não houve diferença estatística entre os sistemas de criopreservação. Desta forma, a escolha do método de criopreservação do sêmen bovino para utilização direta na propriedade fica a critério do técnico responsável, que deverá se basear na realidade de cada propriedade. Para tanto, sempre se deve considerar que o sistema convencional pode trazer mais variações que o sistema automatizado que, apesar do custo do equipamento, pode garantir repetibilidade nos resultados e consequente qualidade do sêmen bovino criopreservado. The objective of this study was to compare the efficiency of bovine semen cryopreservation using the controlled-rate freezing machine versus the conventional method (uncontrolled curve) by the parameters of sperm quality and viability in post-thaw period. Semen from four adult crossbreed bulls was cryopreserved in Tris-yolk-glycerol medium. The computer assisted analysis of thawed semen detected the following results: PM 56.50±22.25%; VAP 34.77±4.25µm/s; VSL 28.17±4.25µm/s; VCL 58.45±6.85µm/s; STR 82.00±2.31%; LIN 49.50±3.32%, to automated system and PM 57.00±13.11%; VAP 25.75±1.66µm/s; VSL 23.32±1.99µm/s; VCL 63.32±1.79µm/s; STR 82.25±3.59µm/s; LIN 50.00±4.97µm/s to conventional cryopreservation system. The results of plasma membrane and acrosome integrity evaluation were 54.7±12.55% and 36.13±22.20% for the automated system and 53.22±13.22% and 47.26±5.74% for the conventional system, respectively. The parameters evaluated demonstrated that there was no statistical difference between the cryopreservation systems. Thus, the choice of the bovine semen cryopreservation method to be used on a farm is a responsibility of the technician, and should be based on the reality of each farm. Therefore, it is always necessary to consider that the conventional system of bovine semen cryopreservation can vary more than the automated system, which, despite the cost of the equipment, can ensure repeatability of the results and consequent quality of cryopreserved bovine semen.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Passiflora ligularis Juss. é uma espécie endêmica da América do Sul com importantes propriedades medicinais. A propagação sexuada de P. ligularis apresenta não-uniformidade, dormência prolongada e sua conservação em bancos convencionais de armazenamento é limitada pela perda do potencial germinativo. Objetivou-se com este trabalho obter plantas via embriogênese somática a partir de embriões zigóticos, caracterizando a origem dos embriões somáticos, e avaliar a influência do tempo de exposição ao crioprotetor PVS2 na mobilização de reservas e no metabolismo antioxidante durante a germinação de embriões zigóticos criopreservados de P. ligularis. Os resultados demonstram que a maior freqüência de formação de embriões somáticos foi observada no meio de cultura suplementado com 27,2 μM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético + 4,5 uM 6-benziladenina. A independência completa dos embriões somáticos dos tecidos adjacentes foi confirmada histologicamente pela ausência de continuidade vascular, após 60 dias. Verificou-se um aumento na atividade das principais enzimas para o ciclo do glioxilato, malate sintase (Msy) e isocitrato liase (ICL) juntamente com alterações no metabolismo antioxidante após exposição de embriões zigóticos a 60 min de PVS2 antes da criopreservação, acelerando a germinação em P. ligularis. Este estudo descreve uma rota de micropropagação completa para P. ligularis e, além disso, mostra a origem precisa de células embriogênicas. A técnica de vitrificação PVS2 foi utilizada com sucesso para criopreservar embriões zigóticos P. ligularis. Passiflora ligularis Juss. is an endemic species from South America with important medicinal properties. The sexual propagation of P. ligularis present non-uniformity, extended dormancy and your conservation in conventional storage banks is limited by the loss of germination potential. The objectives of this work are obtain plants via somatic embryogenesis from zygotic embryos, characterizing the origin of somatic embryos, and evaluate the influence of exposure time to the cryoprotectant PVS2 on the mobilization of reserves and on antioxidant metabolism during the germination of cryopreserved P. ligularis zygotic embryos. The results demonstrate that the highest frequency of somatic embryo formation was observed on a culture medium supplemented with 27.2 µM 2,4-diclorophenoxyacetic acid + 4.5 µM 6-benzyladenine. The complete independence of somatic embryos from the adjacent tissues was histologically confirmed by the absence of vascular continuity, after 60 days. It was verified an increase in the activity of key enzymes for the glyoxylate cycle, malate synthase (Msy) and isocitrate lyase (ICL), and changes in antioxidant metabolism after exposure of zygotic embryos to 60 min of PVS2 before cryopreservation, accelerating the germination in P. ligularis. This study describes a complete micropropagation route for P. ligularis and moreover shows the precise origin of embryogenic cells. The PVS2 vitrification technique was successfully used to cryopreserve P. ligularis zygotic embryos.

O objetivo deste estudo foi avaliar as características morfológicas do concentrado autólogo de plaquetas (CAP) no cão, após refrigeração e congelamento. Foram empregados 31 cães (20 fêmeas e 11 machos), de diferentes raças e idades, que se apresentaram no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) para tratamento ortopédico com indicação de terapia celular. Foram coletados nove mL de sangue da veia jugular, dos quais sete foram depositados em tubos de 8,5 mL contendo ACD-A como anticoagulante para a obtenção do CAP e, dois mL em um tubo com EDTA para a contagem de plaquetas, determinação do volume plaquetário médio (MPV) e da amplitude de distribuição plaquetária (PDW). O sangue foi centrifugado a 191g durante seis minutos (única centrifugação) para a obtenção do CAP. Na amostra fresca foram avaliadas a contagem plaquetária, o MPV, o PDW e morfologia celular. A avaliação morfológica foi realizada a partir da contagem de 200 plaquetas sob microscopia óptica que foram classificadas quanto à sua forma em inativas (forma discóide), incertas (perda da forma discóide sem presença de pseudópodes) e ativadas (com emissão de pseudópodes). Quatro amostras de cada animal foram encaminhadas para conservação, sendo uma refrigerada a 4°C por sete dias, outra por 30 dias e mais duas armazenadas em freezer a -80°C no mesmo intervalo de tempo, utilizando dimetil sulfóxido (DMSO) 6% como crioprotetor. Após este período, as amostras foram descongeladas em banho Maria a 37°C, e como as refrigeradas, foram submetidas às mesmas análises laboratoriais da amostra fresca. Verificou-se diferença entre as amostras fresca e conservadas quanto à contagem plaquetária, a concentração celular, ao MPV e ao PDW (P0,05). Os resultados obtidos levam a concluir que a criopreservação com DMSO 6% a -80°C por sete dias é uma opção favorável para a manutenção das concentrações plaquetárias e das características morfológicas do CAP em cães. The objective of this study was to evaluate the morphological characteristics of autologous platelet concentrate (APC) in the dog, after refrigeration and freezing. Thirty-one dogs (20 females and 11 males) of different races and ages were submitted to the Veterinary Hospital of the Federal University of Minas Gerais (UFMG) for orthopedic treatment with indication of cellular therapy. 9 mL of jugular vein blood were collected, seven mL were deposited in 8.5 mL tubes containing ACD-A as anticoagulant to obtain APC and two mL in one tube with EDTA for platelet count, mean platelet volume (MPV) and platelet distribution width (PDW). The blood was centrifuged at 191 g for 6 minutes (single centrifugation) to obtain APC. In the fresh sample, the platelet count, MPV, PDW and cell morphology were evaluated. The morphological evaluation was performed by counting 200 platelets under optical microscopy that were classified as inactive (discoid form), uncertain (loss of discoid shape without pseudopodia) and activated (with pseudopod emission). Four samples of each animal were sent for storage, one refrigerated at 4 ° C for seven days, one for 30 days and two stored in a freezer at -80 ° C in the same time interval using 6% dimethyl sulfoxide (DMSO) as cryoprotectant. After this period, the samples were thawed in a 37°C water bath and, as the refrigerated ones, were subjected to the same laboratory analysis as the fresh sample. There was a difference between fresh and preserved samples for platelet count, cell concentration, MPV and PDW (P0.05). The results obtained lead to the conclusion that cryopreservation with 6% DMSO at -80 ° C for seven days is a favorable option for the maintenance of platelet concentrations and the morphological characteristics of APC in dogs.

O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de crioprotetores na criopreservacao de sementes de Cattleya granulosa Lindl. Foi utilizado delineamento inteiramente casualizado com um controle e cinco tratamentos com 10 repeticoes. Os tratamentos foram: C– controle (sem solucao crioprotetora); T1-glicerol; T2-sacarose; T3-glicerol+sacarose; T4- PVS2 (Plant vitrification solution) e T5-PVS2+1% de floroglucinol. As sementes foram imersas em nitrogenio liquido a -196 oC. Apos 15 dias, foram retiradas do nitrogenio. Uma parte foi submetida ao teste de tetrazolio para avaliar a viabilidade do embriao e outra foi semeada em frascos de vidro contendo meio de cultura para germinacao in vitro. A germinacao das sementes foi avaliada apos 60 dias por meio da formacao de protocormos. Aos 180 dias, foi avaliada a altura das plântulas e massa seca. As sementes conservadas em PVS2 e PVS2 + floroglucinol foram as que apresentaram maior viabilidade apos a criopreservacao, com 59% e 60% respectivamente.

O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da adição de insulina e IGF-I no diluidor para criopreservação de sêmen bovino sobre as características espermáticas e fertilidade. Foram realizados dois estudos. No estudo 1, foi avaliada a adição de diferentes concentrações de insulina e IGF-I em diluidores comerciais (Botubov® e Triladyl®). Foram realizados dois experimentos, cada um foram utilizados três ejaculados de quatros touros (n=12). Cada ejaculado foi dividido em sete frações para a diluição nos seguintes tratamentos: CON: somente diluidor; IGF100: diluidor adicionado de IGF-I 100 ng/mL; IGF200: IGF-I 200 ng/mL; INS150: Insulina 150 µUI/mL; INS200: Insulina 200 µUI/mL; ASS1: IGF-I 100 ng/mL + Insulina 150 µUI/mL; ASS2: IGF-I 200 ng/mL + Insulina 200 µUI/mL. No experimento 1 o diluidor base foi o Botubov®, enquanto no experimento 2 foi o Triladyl®. O sêmen foi criopreservado por sistema automatizado. Em ambos os experimentos o sêmen foi avaliado pós-criopreservação quanto à motilidade espermática, integridade das membranas plasmática (H342 e PI) e acrossomal (FITC-PSA) e potencial de membrana mitocondrial (JC-1). As concentrações de 150 µUI/mL de insulina e de 100 ng/mL de IGF-I apresentaram os melhores resultados, sendo que INS150 preservou melhor as características espermáticas do que os grupos controle e IGF. No estudo 2, foi avaliado o impacto da suplementação de insulina e IGF-I em sêmen de touros de alta e baixa congelabilidade sobre a qualidade espermática e taxa de prenhez. Foram realizados dois experimentos. No experimento 1, foram utilizados quatro ejaculados de 10 touros de alta (n=40) e de 10 touros de baixa (n=40) congelabilidade, que foram divididos em três frações, sendo acrescentados os tratamentos: Controle: somente diluidor Triladyl®; IGF: diluidor + IGF-I (100 ng/mL) e INS: diluidor + Insulina (150 µUI/mL). Pós-criopreservação, o sêmen foi avaliado quanto a motilidade (CASA), integridade de membrana plasmática (Live:Dead sperm Viability kit), integridade do acrossomo (FITC-PSA), peroxidação lipídica (BODIPY) e estabilidade das membranas (Merocianina 540). Notou-se que a insulina preservou melhor motilidade subjetiva, total, progressiva, velocidade de trajeto, integridade das membranas plasmática e acrossomal, reduziu peroxidação lipídica e desordem das membranas, principalmente no sêmen de touros de baixa congelabilidade. No experimento 2, foi verificado o efeito da adição de insulina ao diluidor de criopreservação sobre a taxa de prenhez. Dois ejaculados de três touros de alta (n=6) e de três touros de baixa (n=6) congelabilidade foram utilizados. Cada ejaculado foi dividido em duas frações: Controle: somente diluidor Triladyl® e INS: diluidor Triladyl® adicionado de Insulina (150 µUI/mL). Foram submetidas à inseminação artificial em tempo fixo (IATF) 1022 vacas, destas 509 receberam sêmen de alta congelabilidade, sendo 252 controles e 257 com insulina, e 513 receberam sêmen de baixa congelabilidade, sendo 261 controle e 252 com insulina. A taxa de prenhez não foi influenciada pela adição da insulina e nem pela congelabilidade do sêmen. Dessa forma, pode-se concluir que a insulina na concentração de 150 µUI/mL preserva a cinética espermática e integridade das membranas, diminui a peroxidação lipídica e aumenta a estabilidade das membranas; contudo não influencia na taxa de prenhez por IATF. The aim of the study was to evaluate the effects of the addition of insulin and IGF- I to the semen extender for cryopreservation on bovine sperm characteristics and fertility. Two studies were carried out. In study 1, the addition of different concentrations of insulin and IGF-I in commercial extenders (Botubov® and Triladyl®) was evaluated. Two experiments were conducted, three ejaculates from four bulls were used (n = 12) in both experiments. Each ejaculate was divided into seven fractions for dilution in the following treatments: CON: only extender; IGF100: extender added IGF-I 100 ng/mL; IGF200: IGF-I 200 ng/mL; Ins150: Insulin 150 µUI/mL; Ins200: Insulin 200 µUI/mL; Ass1: IGF-I 100 ng/mL + Insulin 150 µUI/mL; Ass2: IGF-I 200 ng/mL + Insulin 200 µUI/mL. In experiment 1, the base extender was Botubov®, while in experiment 2, it was Triladyl®. The semen was frozen by an automated system. In both experiments, semen was evaluated post-cryopreservation for sperm motility, integrity of plasma (H342 and PI) and acrosomal (FITC-PSA) and mitochondrial membrane potential (JC-1). The concentrations of 150 µUI/mL insulin and 100 ng/mL IGF-I showed the best results, being the INS150 preserved better sperm characteristics than the control or IGF groups. In study 2, was evaluated the impact of insulin and IGF-I supplementation on semen of bulls with high and low freezability on sperm quality and pregnancy rates. Two studies were accomplishes. In experiment 1, were used four ejaculates of 10 bulls of high freezability (n = 40) and 10 bulls of low (n = 40), which they were divided into three fractions, and added treatments: Control: only Triladyl® extender; IGF: Triladyl® extender added IGF-I (100 ng/mL) and INS: Triladyl® extender added Insulin (150 µUI/mL). Post-cryopreservation, semen was evaluated for motility (CASA), plasma membrane integrity (Live: Dead sperm Viability kit), acrosome integrity (FITC-PSA), lipid peroxidation (BODIPY) and membrane stability (Merocyanine 540). It was noted that insulin showed greater conservation of subjective, total, progressive motility, average path velocity, plasma and acrosomal membrane integrity, lower lipid peroxidation index and less membrane disorder, especially in semen of bulls with low freezability. In experiment 2, the effect of adding insulin to the cryopreservation extender was verified on the pregnancy rate. Two ejaculates from three bulls of high freezability (n = 6) and three bulls of low (n = 6) were used. Each ejaculate was divided into two fractions and added treatments: Control: only Triladyl® extender and INS: Triladyl® extender added Insulin (150 µUI/mL). Cows were subjected to fixed-time artificial insemination (FTAI), 509 received semen with high freezability, being 252 controls and 257 with insulin, and 513 received semen with low freezability, being 261control and 252 with insulin. The pregnancy rate was not influenced by the addition of insulin and was not different for cows receiving high or low semen freezability. Thus, it can be concluded that insulin at a concentration of 150 µUI/mL preserves sperm kinetics and membrane integrity, decreases lipid peroxidation and increases membrane stability; however, it does not influence the pregnancy rate by FTAI.

O objetivo do presente trabalho foi comparar os efeitos da Congelação Lenta (CL) e da Vitrificação em Superfície Sólida (VSS) na criopreservação da pele auricular apical de gatos domésticos utilizando ferramentas histológicas. Fragmentos de pele obtidos a partir de seis gatos (Felis silvestres catus) foram processados e destinadas à criopreservação por CL e VSS, utilizando uma solução composta por Meio Essencial Mínimo Modificado por Dulbecco (DMEM) acrescida de dimetilsulfóxido (DMSO) a 1,5 M ou 3,0 M, para CL e VSS, respectivamente, além de 0,25 M de sacarose e 10% de soro fetal bovino (SFB). Após o aquecimento, as amostras foram destinadas ao processamento histológico para posterior realização das colorações com hematoxilina-eosina, tricrômico de Gômori, e coloração de Weigert, bem como foi realizada a marcação de regiões organizadoras de nucléolo (NORs) utilizando nitrato de prata. Na técnica de VSS, características como espessura da epiderme, derme e espessura total da pele, apresentaram valores similares ao grupo controle (p > 0,05). Além disso, a VSS mostrou-se eficiente na manutenção do número de células epidermais e percentual de fibras de colágenas. Conclui-se que a aplicação da técnica de VSS mostrou-se superior na manutenção histológica da pele auricular apical de gatos domésticos, auxiliando na geração de um banco somático da espécie.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O quantitativo populacional cada vez mais reduzido de onças-pintadas, associado à sua importância ecológica, tem resultado no desenvolvimento de estratégias que promovam a sua conservação. Nesse sentido, células somáticas derivadas da pele destes animais podem ser empregadas para essa finalidade, seja na produção de embriões clones, na obtenção de células induzidas à pluripotência e nos estudos genéticos da espécie. Para tanto, o estabelecimento adequado destas amostras é etapa inicial para essas aplicações. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar os danos gerados pelas condições de cultivo in vitro e criopreservação sobre o estabelecimento de cinco linhagens fibroblásticas derivadas de onças-pintadas adultas. Assim, fragmentos da pele da região auricular apical de uma fêmea e quatro machos foram cultivados in vitro para a obtenção das células somáticas. Inicialmente, para a identificação do tipo celular, células foram confirmadas como fibroblastos após análise morfológica e de imunofluorescência, e as cinco linhagens (um animal/uma linhagem) foram submetidas a dois experimentos. No primeiro experimento, células foram avaliadas em diferentes passagens do cultivo (primeira, terceira décima) para viabilidade, metabolismo e atividade proliferativa. No segundo experimento, células criopreservadas foram avaliadas quanto a viabilidade, metabolismo, atividade proliferativa, níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e apoptose após descongelação em uma, três e dez passagens de cultivo. Células não criopreservadas foram utilizadas como controle. O cultivo in vitro após a primeira (26,1 h ± 4,9), terceira (22,9 h ± 1,6) e décima passagem (22,8 h ± 3,7) e criopreservação (30,0 h ± 1,4) não afetaram a atividade proliferativa. Além disso, nenhuma diferença foi observada para a viabilidade após a primeira (98,9% ± 0,8), terceira (92,5% ± 6,2), décima (95,7% ± 1,4) passagem e criopreservação (73,2% ± 9,8). Contudo, células cultivadas até a décima passagem (49,0% ± 3,3) e criopreservadas (32,7% ± 2,8) reduziram seu metabolismo. Adicionalmente, células criopreservadas mostraram em unidades de fluorescência arbitrárias altos níveis de EROs (1,4 ± 0,1) e ΔΨm alterado (0,9 ± 0,0), quando comparados às células não criopreservadas (1,0 ± 0,1 e 1,0 ± 0,2). Finalmente, células criopreservadas e cultivadas após dez passagens reduziram a atividade proliferativa reduzida (45,1% ± 12,0) e número de células viáveis (30,4% ± 5,7), quando comparadas as células criopreservadas e cultivadas após uma e três passagens. Em conclusão, fibroblastos viáveis podem ser estabelecidos a partir da orelha de onças-pintadas e que embora essas células não tenham mostrado alterações na viabilidade e atividade proliferativa, elas sofrem danos durante um longo cultivo e criopreservação nas condições estudadas The increasingly small population quantity of jaguars, associated with their ecological importance, has resulted in the development of strategies that promote their conservation. In this sense, somatic cells derived from the skin of these animals can be used for this purpose, either in the production of clone embryos, in obtaining cells induced to pluripotency and in genetic studies of the species. Thus, the proper establishment of these samples is an initial step for these applications. Therefore, the aim of the present study was to assess the damage caused by in vitro culture and cryopreservation conditions on the establishment of five fibroblast lines derived from adult jaguars. Thus, fragments of skin from the apical auricular region of one female and four males were cultured in vitro to obtain somatic cells. Initially, to identify the cell type, cells were confirmed as fibroblasts after morphological and immunofluorescence analysis, and the five strains (one animal/one line) were subjected to two experiments. In the first experiment, cells were evaluated in different culture passages (first, third, tenth) for viability, metabolism and proliferative activity. In the second experiment, cryopreserved cells were evaluated for viability, metabolism, proliferative activity, levels of reactive oxygen species (ROSs), mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and apoptosis after thawing and one, three and ten culture passages. Noncryopreserved cells were used as controls. The in vitro culture after the first (26.1 h ± 4.9), third (22.9 h ± 1.6) and tenth passage (22.8 h ± 3.7) and cryopreservation (30.0 h ± 1.4) did not affect proliferative activity. Moreover, no difference was observed for viability after the first (98.9% ± 0.8), third (92.5% ± 6.2), tenth (95.7% ± 1.4) passage and cryopreservation (73.2% ± 9.8). Nevertheless, cells cultured to the tenth passage (49.0% ± 3.3) and cryopreserved (32.7% ± 2.8) reduced their metabolism. Additionally, cryopreserved cells showed high levels of ROS (1.4 ± 0.1) and altered ΔΨm (0.9 ± 0.0) in arbitrary fluorescence units, when compared to non-cryopreserved cells (1.0 ± 0.1 and 1.0 ± 0.2). Finally, cryopreserved cells and cultured after ten passages reduced the reduced proliferative activity (45.1% ± 12.0) and number of viable cells (30.4% ± 5.7), when compared to cryopreserved and cultured cells after one and three passages. In conclusion, viable fibroblasts can be established from jaguars’ ears and that although these cells have not shown changes in viability and proliferative activity, they suffer damage during a long culture and cryopreservation under the studied conditions

Orientador: Prof. Dr. Romildo Romualdo Weiss Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias. Defesa : Curitiba, 22/05/2020 Inclui referências Área de concentração: Biologia Integrada Resumo: O processo de criopreservação do sêmen submete os espermatozoides a um grande estresse celular, expondo-os a condições desfavoráveis que dificultam a manutenção da sua viabilidade. Ainda, essas células também sofrem estresse oxidativo, caracterizado pela geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), que ocasiona a peroxidação lipídica, reduzindo a viabilidade espermática. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo testar dois antioxidantes importantes para o controle da geração de ROS, a superóxido dismutase e o ácido ascórbico. Esse trabalho foi dividido em dois capítulos, sendo o primeiro composto por uma revisão bibliográfica sobre estresse oxidativo no sêmen criopreservado bovino e o segundo abordando o experimento realizado para avaliação da ação dos antioxidantes ácido ascórbico e superóxido dismutase após a criopreservação do sêmen bovino. Para o experimento, foram utilizados cinco touros, previamente condicionados a coleta de sêmen. Foram realizadas cinco coletas, com intervalo de dois dias, e em cada uma, forma-se um pool de sêmen (5 pools). Após cada coleta, os pools foram divididos em cinco grupos de tratamento: GC (sem adição de antioxidantes), GAC I (adição 4,5 mg/mL de ácido ascórbico), GAC II (adição de 6,5 mg/mL de ácido ascórbico), GSOD I (adição de 250 U/mL de superóxido dismutase) e GSOD II (adição de 500 U/mL de superóxido dismutase), para depois serem criopreservados e mantidos em botijão criogênica a - 196°C. Realizou-se a avaliação dos parâmetros espermáticos (MT, MP, VAP, VCL, VSL, LIN, STR e ALH), da integridade de membrana (teste hiposmótico) e morfologia espermática (método formol-salina). Ainda, realizou-se avaliações bioquímicas do sêmen, como o potencial antioxidante (FRAP), o teste ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a medição das ROS. Após avaliação, constatou-se que a MT foi reduzida nos grupos AC I e SOD II. Do mesmo modo, o GSOD II proporcionou redução significativa da MP. Já os parâmetros de VCL e ALH, o GSODI foi o que demonstrou melhores resultados, e a adição de ácido ascórbico (GAC I e GAC II) reduziu esses valores, quando comparado ao GC. Com relação a LIN e STR, o GAC II demonstrou melhorar esses parâmetros e, em contrapartida, o GSOD I reduziu a LIN e STR, em relação ao GC. Porém, a adição de ácido ascórbico na dose de 6,5 mg/mL (GAC II) aumentou a peroxidação lipídica da membrana espermática, e a adição de SOD na dose de 250 U/mL (GSOD I) reduziu esse estresse oxidativo. Ainda, o ácido ascórbico em ambas doses demonstrou melhor potencial antioxidante, quando comparado aos outros grupos. Palavras-chave: criopreservação, parâmetros espermáticos, espécies reativas de oxigênio, antioxidante Abstract: The semen cryopreservation process submits sperm to great cellular stress, exposing them to unfavoreble conditions that make it difficult to maintain their viability. Still, the cells also suffer oxidative stress, characterized by the generation of reactive oxygen species (ROS), which causes lipid peroxidation, reducing sperm viability. Thus, the present study aimed to test two important antioxidants for controlling ROS generation, superoxide dismutase and ascorbic acid. This work was divided into two chapters, the first consisting of a bibliographic review on oxidative stress in cryopreserved bovine semen and the second addressing the experiment carried out to evaluate the action of the antioxidants ascorbic acid and superoxide dismutase after the cryopreservation of bovine semen. For the experiment, five bulls were used, previously conditioned to semen collection. Five collections were carried out, with an interval of two days, and in each one, a semen pool is formed (5 pools). After each collection, the pools were divided into five treatment groups: CG (without adding antioxidants), ACG I (adding 4.5 mg/mL of ascorbic acid), ACG II (adding 6.5 mg/mL of ascorbic acid), SODG I (adding 250 U/mL of superoxide dismutase) and SODG II (adding 500 U/mL of superoxide dismutase), to then be cryopreserved and kept in a cryogenic cylinder at -196°C. Sperm parameters (TM, PM, VAP, VCL, VSL, LIN, STR and ALH), membrane integrity (hyposmotic test) and sperm morphology (formalin-saline method) were evaluated. In addition, biochemical evaluations of the semen were performed, such as the antioxidant potential (FRAP), the thiobarbituric acid test (TBARS) and the measurement of ROS. After evaluation, it was found tha TM was reduced in the AC I and SOD II groups. Likewise, SODG II provided a significant reduction in PM. The parameters of VCL and ALH, SODG I showed the best results, and the addition of ascorbic acid (ACG I and ACG II) reduced these values, when compared to CG. With regard to LIN and STR, ACG II demonstrated to improve these parameters and, in contrast, SODG I reduced LIN and STR, in relation to CG. However, the addition of ascorbic acid at a dose of 6.5 mg/mL (ACG II) increased the lipid peroxidation of the sperm membrane, and the addition of SOD at a dose of 250 U/mL (SODG I) reduced this oxidative stress. Still, ascorbic acid in both doses showed better antioxidant potential, when compared to the other groups. Key words: cryopreservation, sperm parameters, reactive oxygen species, antioxidant

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES A criopreservação de tecido gonadal masculino pode ser usada na conservação de material genético, no intuito da formação de um banco de germoplasma permitindo a manutenção da variabilidade genética em animais pré-puberes e adultos. Diante disso, objetivou-se estabelecer um protocolo eficiente de criopreservação de tecido testicular de catetos. Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos, sendo utilizados 10 animais adultos, 5 em cada experimento, oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres da UFERSA. No experimento I, cinco pares de testículos foram fragmentados (9 mm3) e alocados em grupos não-vitrificados (controle) e vitrificados em superfície sólida (VSS), após a exposição a diferentes crioprotetores (dimetilsulfóxido - DMSO 3,0 M, etileno glicol - EG 3,0 M e a combinação 1,5 M DMSO/1,5 M EG). As amostras não-vitrificadas e vitrificadas foram avaliadas quanto à histomorfologia, ultraestrutura, viabilidade e potencial de capacidade proliferativa. A conservação adequada da organização ultraestrutural do túbulo seminífero em termos de presença de lúmen e junções celulares foi observada somente com o uso da combinação DMSO/EG. Independentemente do crioprotetor, a vitrificação conservou efetivamente a visualização e a condensação nuclear das células de maneira semelhante à observada no grupo não vitrificado. Além disso, a combinação DMSO/EG proporcionou uma melhor conservação das membranas basais dos túbulos seminíferos que o DMSO (P < 0,05). Somente a combinação DMSO/EG manteve o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia (3,69 Regiões Organizadoras de Nucléolos - NORs/célula) e célula de Sertoli (3,19 NORs/célula) semelhantes aos controles (3,46 e 3,31 NORS/célula, respectivamente). Portanto, DMSO/EG é melhor que o DMSO ou o EG sozinho para VSS de tecido testicular de cateto adulto. No experimento II, cinco pares de testículos foram fragmentados (3 mm3) e alocados a grupos não-criopreservados (controle) e criopreservados usando três métodos de criopreservação: congelação lenta (CL), vitrificação em criotubos (VC) e VSS, sendo então expostos a diferentes combinações de crioprotetores (1,5 M DMSO/1,5 M EG, 1,5 M DMSO/1,5 M glicerol – G, e 1,5 M G/1,5 M EG). As amostras, não-criopreservadas e criopreservadas foram avaliadas quanto à fragmentação de DNA, viabilidade, potencial de capacidade proliferativa e histomorfologia. Apenas no uso de DMSO/EG durante a CL e VC foi possível conservar a integridade do DNA de modo similar ao controle (P>0,05). Em adição, observou-se que, independentemente do método de criopreservação, as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram capazes de conservar a viabilidade (P>0,05). Todos os tratamentos mantiveram o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia de modo similar; entretanto, apenas o G/EG, nos métodos de CL e VSS, foram inferiores ao controle para célula de Sertoli (P>0,05). Finalmente, o protocolo de CL usando as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram melhores em evitar o aparecimento de edemas que G/EG – CL e DMSO/G – VSS (P 0.05). In addition, it was observed that, regardless the cryopreservation method, the DMSO/EG and DMSO/G combinations were able to preserve viability (P> 0.05). All treatments maintained the proliferative capacity potential for spermatogonia in a similar manner; however, G/EG in the SF and SSV methods impaired the proliferative potential of Sertoli cells (P> 0.05). Finally, the SF protocol using the DMSO/EG or DMSO/G combinations were better at preventing edema than G/EG for SF and DMSO/ G for SSV (P

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-06-14T13:12:29Z No. of bitstreams: 1 Thalles Cloves Maciel de Moura.pdf: 598623 bytes, checksum: 1334de126ab769ec1f7cbbe5e338795e (MD5) Made available in DSpace on 2018-06-14T13:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thalles Cloves Maciel de Moura.pdf: 598623 bytes, checksum: 1334de126ab769ec1f7cbbe5e338795e (MD5) Previous issue date: 2017-08-02 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES The objective of the study was to investigate the effects of different concentrations of sucrose on equine semen quality after thawing. Twenty-four ejaculates were obtained from 6 Mangalarga Marchador and Campolina stallions, in which each ejaculate was divided into 5 groups: control (freezing diluent without sucrose), positive control (Botucrio®®) and three groups consisting of the freezing diluent supplemented with Saccharose at concentrations of 25 mM, 50 mM and 100 mM. The semen samples were obtained with artificial vagina, evaluated and transported (5 ºC) to the laboratory. The semen samples were diluted (200x106 sperm / mL), packed in vales and subjected to freezing. Immediately after thawing (37 ° C, 30s), the semen samples were evaluated for kinetics, plasma and acrosomal membrane integrity, membrane stability and mitochondrial membrane potential. The addition of 50 and 100 mM sucrose to the freezing diluent increased (P

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2017 Submitted by Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa (repositorio@medicina.ulisboa.pt) on 2018-01-18T14:12:55Z No. of bitstreams: 1 AnaCChaves.pdf: 801825 bytes, checksum: fb87b4e37a52f7a6f2455bc73f063a3f (MD5) Made available in DSpace on 2018-01-19T13:41:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaCChaves.pdf: 801825 bytes, checksum: fb87b4e37a52f7a6f2455bc73f063a3f (MD5) Previous issue date: 2017

ResumoIntroduçãoas indicações iniciais para o uso da técnica de fertilização in vitro contemplavam boa parte dos diagnósticos de infertilidade feminina. Com o passar do tempo, tornou‐se necessário o desenvolvimento de outras tecnologias que tratassem também os casos de infertilidade masculina. Dentre elas, destaca‐se a criopreservação de gametas. Apesar das vantagens do uso da criopreservação, sabe‐se que alguns processos de congelamento podem afetar o potencial de fertilidade em muitos aspectos.Objetivopor meio de uma revisão, verificar o impacto da criopreservação na qualidade do sêmen por meio da observação da taxa de gestação, taxa de aborto e das características seminais (morfologia, motilidade, concentração, fragmentação do DNA) no sêmen congelado e o no fresco, colhidos diretamente do epidídimo.Métodofoi feita uma estratégia de busca nas bases de dados Literatura Latino‐Americana e do Caribe em Ciências da Saúde (Lilacs), Medical Literature Analysis and Retrieval System Online (Medline) e Biblioteca Cochrane por meio das seguintes palavras‐chaves: sêmen, criopreservation, frozen sêmen, thawed sêmen e sêmen quality. As pesquisas foram feitas tanto nos artigos e nas revisões disponíveis em full text como nos resumos.Resultadosde maneira geral, o que se observou foi que em alguns casos a criopreservação pode prejudicar a morfologia seminal. Porém, a quantidade de nascimentos e de abortos não varia significativamente quando comparado sêmen fresco com congelado obtidos diretamente do epidídimo.Conclusõespor prolongar a fertilidade de muitos pacientes e ajudá‐los na realização do sonho da paternidade, na maioria dos casos, a criopreservação é uma boa técnica que deve ser usada quando necessário.AbstractIntroductionthe initial indications to the use of in vitro fertilization technologie attented almost all the female infertility cases. Over the time, the development of others technologies that could treat the male infertility cases too became necessary. Among the technologies, it can be standed out the gametes cryopreservation. Despite the cryopreservation advantages, it is known that some freezing processes can affect fertility potential in many ways.Objectiveverify the impact of cryopreservation on semen quality by observing the pregnancy rate, abortion rate and seminal characteristics (morphology, motility, concentration and DNA) fragmentation between frozen semen and fresh semen harvested directly from the epididymis, through a review.Methodfor this, it was done a research in the databases Literatura Latino‐Americana e do Caribe em Ciências da Saúde (Lilacs), Medical Literature Analysis and Retrieval System Online (Medline) and Cochrane using the following keywords semen cryopreservation, frozen semen, thawed semen and semen quality. The surveys were made both in articles and reviews available in full text as in the summaries.Resultsin general, the seminal cryopreservation may damage the morphology of semen. However, the number of births and abortions does not vary significantly when compared frozen semen with fresh semen obtained directly from the epididymisConclusionsthus, by extending the fertility of many patients, helping them in achieving the dream of paternity in most cases, cryopreservation is a good technique that can be used when necessary.

Seeds of Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers) were desiccated at 25 °C on silica gel for 0 h (T0), 7 h (T1) and 24 h (T2), reaching moisture contents of 6.5%, 4.4% and 3.8%, respectively. Seeds were frozen rapidly in liquid nitrogen (+LN) at -263 °C.min.-1 and after 72 h, they were thawed slowly at room temperature (25 ± 2 °C) at a speed of 5 °C.min.-1. Seed germinability evaluation before (-LN) and after freezing (+LN) was conducted at 25 °C, on paper roll substrate, and germinated at 16 hrs light/8 hrs dark, normal seedling counts for 38 days. The germinative percentages were 88% (T0-LN), 98% (T0+LN), 61% (T1-LN), 95% (T1+LN), 78% (T2-LN) and 89% (T2+LN). Mean days for seedling formation were 23 (T0-LN), 22 (T1-LN and T2-LN) and 30 days for seeds exposed to LN. Fast freezing, slow thawing, and the three tested moisture contents, were suitable for cryopreservation of Pyrostegia venusta seeds. Resumo Sementes de Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers) foram dessecadas a 25 °C, sobre sílica gel por 0 h (T0), 7 h (T1) e 24 h (T2), atingindo teores de água de 6,5%, 4,4% e 3,8%, respectivamente. As sementes foram congeladas em nitrogênio líquido (+NL), a -263 ºC.min.-1 e após 72 h foi descongeladas à temperatura ambiente de 25 ± 2 ºC, a 5 °C.min.-1. A avaliação da germinabilidade das sementes antes (-NL) e após congelamento (+NL) foi conduzida a 25 °C, substrato rolo de papel, fotoperíodo 16 h luz/8 h escuro e contagens de plântulas normais por 38 dias. Os percentuais germinativos foram de 88% (T0-NL), 98% (T0+NL), 61% (T1-NL), 95% (T1+NL), 78% (T2- NL) e de 89% (T2+NL). Os tempos médios para a formação de plântulas foram de 23 (T0-NL), 22 (T1-NL e T2-NL) e de 30 dias para as sementes expostas ao NL. O congelamento rápido, o descongelamento lento e os três teores de água testados foram adequados para a criopreservação de sementes de Pyrostegia venusta.

The objective of this work was to evaluate different concentrations of Aloe vera (AV) in the production of an extender of vegetable origin for the preservation of goat sperm cells. The AV was processed and submitted to qualitative characterization, pH measurement and determination of reducing sugars. After characterization, a buffer solution was prepared based on TRIS with the following parameters: A1 (TRIS, AV1 concentration, 5% glycerol); A2 (TRIS, AV2 concentration, 5% glycerol); and A3 (TRIS, AV3 concentration, 5% glycerol), subjected to osmolarity and rheology tests. Ejaculates applied to three goats were homogenized and applied to the freezing protocol, divided into four experimental groups (GC - diluter based on TRIS-yolk; AV1, AV2 and AV3). After thawing, seminal samples were evaluated for kinetics (Computer- Assisted Sperm Analysis), integrity of plasmatic and acrossomal membranes, mitochondrial membrane potential and levels of reactive intracellular oxygen species (flow cytometry). AV showed terpenoids, esters and saponin, acid pH (5.5) and high amount of reducing sugars (1g / L). The osmolarity of the CG and the AV groups keep the next ones, however, the higher the percentage of AV, the lower the osmolarity. There is no clinical trial, viscosity reduction with increased temperature and AV groups that obtain lower viscosity when compared to the CG. In the analysis of goat semen subjected to freezing, the AV groups showed less (P 0.05) between groups for the other tests performed, as far as kinetics and integrity of membranes. A seminal extender requires osmolarity and pH, energy source and cryoprotectants, and these requirements are provided by the AV-based extender, which also exhibits antioxidant substances (terpenoids) and lipids (sterols), which provide cell protection at low temperatures. Motility is a necessary parameter for the cell to reach or hide and close it. The AV groups demonstrated water motility values of those observed in the GC, due to their composition, which presents complex polysaccharides that form a mesh and recover these sperm. The higher the percentage of AV, the greater the proportion of these polysaccharides. This is reflected in the greater potential of the mitochondrial membrane in group A3, since the sperm increases or wastes to try to move through the medium. The AV groups were able to maintain the integrity of the membranes applicable to the GC, as well as the levels of ROS produced. This condition is possible due to bioactive substances present in AV, which allows cell protection during cell freezing. Based on not exposed, conclude that an Aloe vera can be a substitute for the common extenders used in freezing goat sperm, however, more studies are needed to increase sperm mobility after thawing. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes concentrações de Aloe vera (AV) na produção de um diluidor de origem vegetal para criopreservação de células espermáticas de caprino. A AV foi processada e submetida à caracterização qualitativa, mensuração de pH e determinação de açúcares redutores. Após caraterização, foi elaborada solução tampão à base de TRIS com as seguintes concentrações: A1 (TRIS, concentração AV1, 5% de glicerol); A2 (TRIS, concentração AV2, 5% de glicerol); e A3 (TRIS, concentração AV3, 5% de glicerol), submetidos a testes de osmolaridade e reologia. Ejaculados aprovados de três caprinos foram homogeneizados e submetidos ao protocolo de congelação, divididos em quatro grupos experimentais (GC – diluidor à base de TRIS-gema; A1, A2 e A3). Após descongelação, as amostras seminais foram avaliadas quanto à cinética (Computer Assisted Sperm Analysis), integridade das membranas plasmática e acrossomal, potencial de membrana mitocondrial e níveis de espécies reativas de oxigênio intracelular (Citometria de fluxo). A AV apresentou terpenoides, esteróis e saponina, pH ácido (5,5) e alta quantidade de açúcares redutores (1g/L). A osmolaridade do GC e dos grupos AV se mantiveram próximas, entretanto, quanto maior a porcentagem de AV, menor a osmolaridade. No ensaio reológico, observou-se redução da viscosidade com o aumento da temperatura e os grupos AV obtiveram menor viscosidade quando comparados ao GC. Na análise do sêmen caprino submetido à congelação, os grupos AV apresentaram menor (P0,05) entre os grupos para os demais testes realizados, tanto de cinética quanto de integridade de membranas. Um diluidor seminal requer osmolaridade e pH adequados, fonte de energia e crioprotetores, e estes quesitos foram atendidos pelo diluidor à base de AV, que apresentou ainda substâncias antioxidantes (terpenoides) e lipídeos (esteróis), que conferem proteção da célula em baixas temperaturas. A motilidade é um parâmetro necessário para que a célula alcance o oócito e fecunde- o. Os grupos AV apresentaram valores de motilidade aquém dos observados no GC provavelmente devido à sua composição, que apresenta polissacarídeos complexos que formam uma malha e retém esses espermatozoides. Quanto maior a porcentagem de AV, maior a proporção desses polissacarídeos. Isso é refletido no maior potencial da membrana mitocondrial no grupo A3, uma vez que o espermatozoide aumenta o gasto para tentar se locomover através do meio. Os grupos AV conseguiram manter integridade das membranas compatíveis ao GC, bem como os níveis de ROS produzido. Esta condição é possível devido aos bioativos presentes na AV, que possibilitou proteção à célula durante a congelação celular. Baseado no exposto, conclui-se que a Aloe vera pode ser um substituto aos diluidores comumente utilizados na congelação de espermatozoide caprino, entretanto, são necessários mais estudos para aumento da motilidade espermática após a descongelação.

Butia yatay é uma palmeira nativa do Rio Grande do Sul que encontra-se em risco de extinção. Sua propagação é realizada por via sexuada, porém a germinação por sementes é baixa, lenta e desuniforme. Objetivou-se estabelecer um protocolo de criopreservação visando a conservação da espécie. Foram testadas concentrações de sacarose em pré-tratamento de embriões antes do congelamento. Embriões de Butia yatay podem ser criopreservados, com subseqüente retomada do crescimento, quando submetidos ao prévio tratamento com sacarose a 0,4 M. Neste estudo, os embriões foram congelados por 10 dias, indicando que o pré-tratamento possibilita a conservação de Butia yatay por longo tempo. Made available in DSpace on 2020-12-05T09:02:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Criopreservacao-de-uma-especie-de-butia.pdf: 764439 bytes, checksum: 5f76fdb13408f6f0c407e8a45654da48 (MD5) Previous issue date: 2020