Mitokondriot tunnetaan yleisesti eukaryoottisolujen voimalaitoksina niiden ainutlaatuisen energiatuotannon ansiosta. Tämän lisäksi mitokondriot osallistuvat solun aineenvaihdunnan, apoptoosin ja lämmöntuotannon säätelyyn. Mitokondrioilla on oma kaksijuosteiseen DNA:han koodattu genomi (mtDNA), johon sisältyvät 37 geeniä tuottavat tärkeitä osia energiantuotannosta vastaaviin entsyymikomplekseihin. MtDNA:n menetyksestä tai virheellisestä säätelystä seuraa useimmiten vakava sairaus kuten MELAS tai Alpersin syndrooma, joille ei ole parannuskeinoa. Näiden sairauksien molekylaaristen taustojen ymmärtämiseksi olisi ensimmäiseksi selvitettävä mtDNA:n ylläpitoon liittyvät mekanismit. Aiemmassa tutkimuksessa koko genomin kattava kartoitus mtDNA:n aineenvaihduntaan liittyvistä geeneistä identifioi useita uusia tai vähemmälle huomiolle jääneitä proteiineja, mukaan lukien ATP syntaasin alayksiköitä, mitokondrioiden biogeneesin säätelijöitä sekä kuljetusvesikkelien proteiineja. Hyödyntäen Drosophila melanogasteria, tunnettua malliorganismia, sekä yhdistelemällä solubiologisia, geneettisiä sekä biokemiallisia menetelmiä, esitetyt tutkimustulokset pyrkivät syventämään ymmärrystämme näiden proteiinien toiminnasta mitokondrioissa. MtDNA:n aineenvaihduntaan liittyvien geenien kartoituksessa tunnistettiin kaksi vesikkelien kuljetukseen osallistuvaa, syntaxin 5-SNARE kompleksin alayksikköinä toimivaa proteiinia, Bet1 ja Slh. Tutkimukset osoittivat että Bet1- ja Slh- geenien ilmentymisen aleneminen ei vaikuttanut mtDNA:n määrään tai laatuun. Näiden proteiinien puutos kuitenkin johti mitokondrioiden yleiseen vajaatoimintaan heikentämällä soluhengitystä, vähentämällä mitokondrioiden määrää ja kalvopotentiaalia sekä aktivoimalla mitokondriaalista proteotoksista stressivastetta. Proteiinien solunsisäistä lokalisaatiota tutkittiin immunosytokemian avulla sekä solufraktioiden Western blot -analyysilla. Analyysit osoittivat, että sekä Bet1 että Slh lokalisoituivat Golgiin ja myöhäisiin endosomeihin. Lisäksi osa Bet1-signaalista paikantui mitokondrioihin. Bet1 paikantui immunosytokemialla samoihin rakenteisiin Mitotracker- ja Lysotracker-värjäysten kanssa. Tämä yhteislokalisaatio kuitenkin rikkoutui, kun Slh:n ilmentymistä alennettiin. Näiden sekä aiempien tulosten perusteella, esitän että endoplasmisen retikulumin (ER) ja Golgin välinen vesikkelien lajittelu toimii osana mitokondrioiden laadunvalvontajärjestelmää. Ribonukleaasi H1 (RNase H1, jota koodaa Drosophilan rnh1 -geeni) on yksi genomin kartoituksessa identifioiduista geeneistä ja sen tehtävänä on hajottaa RNA/DNA hybridejä. Kun rnh1:n ilmentymistä tutkittiin Drosophilan S2 soluissa, geenin koodaamaa proteiinia löytyi sekä mitokondrioista että tumasta. Geenin lähetti-RNA:n kaksi vaihtoehtoista translaation aloituskohtaa tuottavat kaksi erilaista polypeptidiä, jotka näiden löydösten perusteella paikantuvat solun eri osiin. Rnh1:n puute S2 soluissa alensi mtDNA:n kopioiden määrää mutta ei vaikuttanut solujen elinkykyyn. Sen sijaan geenin matala ilmentyminen kärpäsissä aiheutti oireita, jotka vastasivat RNASEH1 mutaatiota kantavien potilaiden oireisiin. Näihin lukeutui alentunut elinikä, merkittävät motoriset häiriöt sekä puutteellinen soluhengitys, DNA replikaatio ja transkriptio. Geenin ilmentymisen modulaatioilla oli systemaattisia vaikutuksia mtDNA replikaation välimuotoihin erityisesti alueilla missä mtDNA:n transkriptio ja replikaatio etenevät vastakkaisiin suuntiin. Lisäksi pitkäaikainen rnh1:n ilmentymisen aleneminen S2 soluissa laukaisi topologisten epämuodostumien kerääntymisen. Tällaisia mtDNA:n rakenteita olivat mm. nelisuuntaiset liittymät sekä rakenteet, jotka liittyvät replikaatiohaarukan hidastumiseen replikaation aloituskohdassa. Yleisesti ottaen tulokset osoittivat, että mtDNA:n transkription ja replikaation välillä on tiukka yhteys, jossa RNaasi H1 toimii molempia prosesseja säätelevänä tekijänä. RNaasi H1 aktiivisuuden menetyksestä johtuvien mtDNA:n rakenteellisten epämuodostumien kerääntymistä havaittiin kärpäsissä mutta ei nisäkkäissä. Tämä viittaa mitokondriaalisen genomin järjestäytymisessä ja replikaatiossa oleviin eroavaisuuksiin näiden eliöiden välillä. Drosophila RNaasi H1 entsyymi karakterisoitiin biokemiallisia analytiikkatekniikoita hyödyntäen ja sen ominaisuuksia verrattiin ihmisen vastaavaan homologiin. Eukaryoottien RNaasi H1:n tyypillinen kanoninen rakenne on myös ennustettu toteutuvan kärpäsen entsyymissä. Hybridi sitoutumisalueena (HBD, hybrid binding domain) tunnettu nukleiinihappojen sitoutumiselementti sijaitsee N-terminuksessa kun katalyyttinen alue puolestaan sijaitsee C-terminuksessa. Nämä kaksi aluetta yhdistävällä alueella ei ole tunnettua rakennetta tai toimintaa mutta karakterisointi osoitti, että Drosophilalla kyseinen alue on koolta kaksinkertainen ihmisen vastaavaan alueeseen verrattuna. In silico rakennemallinnus alueesta ennusti HBD:n kaltaista rakennetta. Erilaisten Drosophila RNaasi H1 deleetiovarianttien biokemiallinen analyysi paljasti, että toinen HBD:n kaltainen alue lisää katalyysiä mutta heikentää entsyymin sitoutumista RNA/DNA- hybridiin. Näin ollen ehdotan, että tämän toisen HDB-rakenteen tarkoitus on tehostaa entsyymin etenemistä. Proteomiikka-analyysi RNaasi H1:n kanssa vuorovaikutuksessa toimivista proteiineista identifioi osia sekä mitokondriaalisen että tuman genomin ylläpitoon osallistuvista tekijöistä. Lisäksi analyysissä löytyi useita aineenvaihdunnallisia entsyymejä, translaatiotekijöitä sekä kuljetukseen ja prosessointiin osallistuvia proteiineja. Näihin lukeutui mitokondriaalinen yksijuosteista DNA:ta sitova proteiini (mtSSB, mitochondrial single-stranded DNA binding protein). In vivo ja in vitro menetelmiä hyödyntäen, päätin analysoida mtSSB:n vuorovaikutusta RNaasi H1:n kanssa. Tutkimukset eivät kuitenkaan paljastaneet suoraa fyysistä kontaktia näiden kahden proteiinin välillä. Myöskään niiden toiminnallisesta vuorovaikutuksesta ei löytynyt todisteita. Tutkimukseni toi uutta tietoa siitä, miten Bet1, Slh ja RNaasi H1 sekä suorasti että epäsuorasti toimivat osana mitokondrioita. Lisäksi tutkimus paljasti Drosophilan ribonukleaasin ainutlaatuisia, aiemmin tuntemattomia biokemiallisia ominaisuuksia. Huolimatta siitä, että eri tiedeyhteisöt ovat tutkineet mitokondrioita jo yli sata vuotta, nämä löydökset osoittavat, että niiden toiminnoissa ja säätelyssä on vielä paljon mitä emme ymmärrä. Lisätutkimuksia tarvitaan, jotta voisimme todella ymmärtää mekanismeja, jotka mitokondrioiden kautta säätelevät solujen aineenvaihduntaa ja energiatarpeita. The mitochondrion is commonly described as the powerplant of the eukaryotic cell, due to its unique role in energy transactions; although it is also a required organelle for metabolism, apoptosis, and thermostasis. The thirty-seven genes required to synthesise the bioeneregtic machinery are encoded in a small double-stranded mitochondrial genome (mtDNA). Loss or misregulation of mtDNA causes a set of devastating diseases such as MELAS or Alpers syndrome, with no currently available treatment. To elucidate the underlying molecular causes of these diseases it is essential to understand the mechanisms involved in mtDNA maintenance. Previously, a genome-wide screening for genes involved in mtDNA metabolism identified several novel or previously unsuspected proteins (Fukuoh et al., 2014), including subunits of the ATP synthase complex, mitochondrial biogenesis factors, and vesicle trafficking proteins. The research reported in this thesis aimed to broaden our understanding of the mitochondrial function(s) of a subset of these proteins, using Drosophila melanogaster as a model organism, applying a combination of cellular, genetic and biochemical techniques. Two components of the vesicle-trafficking syntaxin 5-SNARE complex, Bet1 and Slh, were identified in the original screen. A detailed analysis found that downregulation (KD) of Slh and Bet1 did not affect mtDNA quantity or quality, but led to mitochondrial dysfunction by impairing respiration, mitochondrial content, membrane potential, and upregulation of the mitochondrial proteotoxic stress response machinery. The subcellular distribution of both proteins was investigated by immunocytochemistry and by Western blot analysis of subcellular fractions, revealing colocalization of Bet1 and Slh with the Golgi apparatus and late endosomes, whilst part of the Bet1 signal was also present in the mitochondrial fraction. Taken together with other findings from the laboratory, I propose that endoplasmic reticulum- Golgi vesicle sorting is involved in the mitochondrial quality control machinery. Ribonuclease H1 (RNase H1, encoded in Drosophila by the rnh1 gene), an enzyme that degrades RNA/DNA hybrids, was also identified in the genome-wide screening. The expression of rnh1 was studied in in Drosophila S2 cells, revealing a heterogeneous distribution of the protein between mitochondria and nucleus. Based on these findings, the presence of two alternative translation initiation sites in a single messenger RNA is proposed to generate two alternative polypeptides distributing the enzyme between the two compartments. Rnh1 depletion in S2 cells was found to decrease mtDNA copy number without any impact on cell viability. On the contrary, low levels of rnh1 in flies led to features similar to those seen in some patients carrying mutations in RNASEH1, causing a decrease in lifespan and triggering severe locomotor dysfunction, accompanied by defects in mitochondrial respiration, DNA replication, and transcription. Modulation of rnh1 expression had systematic effects on mtDNA replication intermediates, especially in regions where transcription and DNA replication are inferred to progress in opposite directions. In addition, long-term rnh1 knockdown in S2 cells triggered the accumulation of four-way junctions and other topological abnormalities in mtDNA, as well as of structures associated with fork regression at the origin of replication. Overall, a tight connection between transcription and replication of the mtDNA is implied, with RNase H1 acting as a regulatory component, influencing both processes. The loss of RNase H1 activity in the fly resulted in particular defects at the molecular level that were not seen in mammals, such as the appearance of abnormal four-way junctions, the accumulation of DNA replication intermediates in specific regions of the mtDNA or large changes in the relative abundance of different mitochondrial mRNAs. In part, this may reflect the differences in mtDNA organization and replication between mammals and Drosophila. To understand whether these differences are also caused by the unique biochemical properties of Drosophila RNase H1, I used a set of biochemical techniques to characterize the Drosophila enzyme and compared it to its human homolog. The canonical structure described for eukaryotic RNase H1 is also predicted to be present in the fly enzyme. A nucleic acid-binding element, denoted as the hybrid binding domain (HBD), is located in the N-terminal region, whilst the C-terminal region contains the catalytic domain; the two are connected through a linker without defined function or structure. The Drosophila linker is double the size of the human one. Structure modeling in silico predicted that it should adopt an HBD-like structure. Biochemical analysis of a deletion series of Drosophila RNase H1 variants revealed that this second HBD-like domain accelerates catalysis but weakens binding of the enzyme to RNA/DNA hybrid. I propose that these features of the second HBD confer processivity on the enzyme. A shotgun proteomic screen to identify RNase H1- interacting proteins yielded components of the mitochondrial and nuclear genome maintenance machinery, as well as several metabolic enzymes, translation factors and elements of the import and processing machinery. These included the mitochondrial single-stranded DNA binding protein (mtSSB) prompted me to conduct a closer analysis of its interaction with RNase H1, using in vivo and in vitro approaches. These experiments were unable to document any direct physical interaction between the two proteins, and their functional interaction was also negligible. In conclusion, this project shed light on the direct or indirect mitochondrial roles of Bet1, Slh, and RNase H1, and investigated the unique biochemical properties of the Drosophila ribonuclease. Altogether, the findings underline that even though the scientific community has investigated mitochondria for more than a century, our understanding of mitochondrial functions and requirements are still far from complete. Further investigation is necessary to elucidate the pathways that converge in mitochondria to maintain the metabolic and energetic requirements of cells.