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240 p. El control de los procesos reproductivos es indispensable para el sector ganadero, en el caso de especies de producción, pero también es crucial para el éxito de programas de recuperación de especies silvestres y para la optimización de cría en cautividad. En la reproducción de rumiantes, uno de los factores limitantes más relevantes es la estacionalidad reproductiva ligada al fotoperiodo. La melatonina pineal es mediadora de los efectos producidos por el fotoperiodo en estas especies, influyendo sobre la actividad sexual y gonadal. El primer objetivo de esta tesis fue caracterizar la distribución de los receptores sobre la membrana plasmática de ciervo y toro mediante inmunofluorescencia. En segundo lugar, se estudió la posible afectación de la capacitación espermática en la distribución de estos receptores en la membrana celular. Además, el estudio pretende determinar el papel de la melatonina en los principales parámetros fisiológicos de espermatozoides de ciervo y toro, incluyendo el efecto sobre la capacitación.

313 p. Desde la aparición de la Directiva Marco del Agua (2000/60/CE) y a lo largo de estos casi 20 años de desarrollo de la misma, se ha venido tratando de establecer un marco de trabajo que permita conocer cuál es el estado de las masas de agua a nivel europeo, cómo se deben controlar y cuáles serán los objetivos de calidad a alcanzar. Para ello, se han establecido unos protocolos oficiales y una serie de elementos de calidad biológica, físico-química e hidromorfológica que permitirán conocer los estados o potenciales ecológicos de las mismas. (Anexos I y II RDL 817/2015). Los embalses, en el contexto de la DMA, son masas de agua muy modificadas asimilables a lagos. El estado o potencial ecológico de una masa de agua se define como el grado de alteración que presenta respecto a sus condiciones naturales y viene determinado por el peor valor de su estado o potencial ecológico y de su estado químico. El potencial ecológico es una expresión de la calidad de la estructura y el funcionamiento de los ecosistemas acuáticos asociados a una masa de agua artificial o muy modificada. Conforme a la normativa, el potencial ecológico en embalses se evalúa mediante el Índice de Potencial Ecológico (IPE), que se basa en el fitoplancton como elemento indicador a través de los indicadores siguientes: Clorofila a, biovolumen, Índice de Grupos Algales (IGA) y % de cianobacterias. El presente trabajo tiene como objetivos generales describir las características ambientales y el potencial ecológico en embalses del norte de España, analizar la variabilidad temporal (estacional e interanual) de la comunidad fitoplanctónica y analizar críticamente el rendimiento del IPE para plantear, en su caso, propuestas de mejora. Para ello se han obtenido muestras de un total de 12 embalses ubicados en Asturias, de forma estacional y a lo largo de varios años. Los resultados obtenidos muestran un IPE muy homogéneo entre embalses y fechas de muestreo, que denotan mayoritariamente un potencial muy bueno, lo que no coincide con los resultados obtenidos mediante el estudio de otros indicadores tradicionales como el estado trófico. Si el potencial ecológico se centra en exclusiva en el elemento fitoplancton y en su composición a lo largo del tiempo, entonces el estudio de la comunidad desde un punto de vista temporal resulta de especial interés. Por ello, se ha estudiado la variabilidad de la composición taxonómica (estacional e interanual) recurriendo al índice de Sørensen como medida de heterogeneidad, desglosándolo además en sus dos componentes, reemplazo y anidamiento. La conclusión del mismo es que la variabilidad, tanto estacional como interanual, de la comunidad son elevadas y se explican fundamentalmente por el reemplazo de especies. Con estos antecedentes, en los que el IPE no parece reflejar de forma adecuada el estado de los embalses y dado que las métricas empleadas para su cálculo se basan exclusivamente en el fitoplancton, que presenta un comportamiento estocástico, se plantea la necesidad de revisar la metodología de cálculo del IPE. Los resultados del estudio apuntan a que la forma de calcular el IPE enmascara las condiciones reales de los embalses y no es lo suficientemente sensible a los procesos de eutrofia. A raíz de ello, se plantea una nueva propuesta para el cálculo del IPE, denominada IPE-PV, que mejora la correlación con el estado trófico sin alterar la relación entre el resto de métricas. Finalmente, se presenta otra propuesta de corrección final del IPE-PV con elementos de calidad físico-químicos, que suponen una mejora significativa entre los niveles de correlación existentes entre el IPE-PV y el estado trófico y que además, se adecúan mejor al marco normativo.

295 p. Nowadays, plastic pollution has become one of the major concerns of the society. As a result of that, bisphenol A, a chemical plasticizer used for the manufacture of polycarbonate plastics and epoxy resins, has caught the attention of great many scientific studies. Besides the capacity of this toxicant to interfere with the endocrine system, it has also been reported to exert both genotoxic and epigenotoxic effects. Bearing in mind that the spermatogenesis is a coordinated process that relies on several steroid hormones and that entails deep changes in the chromatin, such as DNA breaks and epigenetic remodelling, it might well be affected by bisphenol A exposure. Hence, there is a great deal of evidence to show that bisphenol A has detrimental effects on male reproductive health. Most of these works are focused on the alterations caused in sperm quality, sexual function and the development of gonads; however, the consequences of paternal bisphenol A exposure for future generations remain still unknown. In this regard, spermatozoa have long been considered as mere vectors to deliver the paternal haploid genome on the oocyte. Only recently have they been stated to harbour more information than just the nuclear DNA and, what is more, this information has been claimed to play a remarkable role in offspring health. Any alteration triggered by bisphenol A during male germline formation may affect the information contained in the spermatozoa, thus being transmitted to the progeny. For this reason, the First Chapter of this Ph.D. Thesis tackles the impact of paternal bisphenol A exposure on embryo development, using zebrafish (Danio rerio) as model species. Adult males were exposed to high doses of bisphenol A during the mitotic phase of spermatogenesis: two weeks of exposure and one week under standard conditions. After treatment, males were mated with non-treated females to obtain the F1 and also the F2 embryos. The evaluation of the embryo development was carried out by routine histology and by using the transgenic line Tg(fli1:EGFP;mlc2a: mCherry). Moreover, some spermatic information, such as global DNA methylation and sperm-borne transcripts, was analysed by UPLC-MS and qPCR, respectively. The results showed that, when treating males with 2000 µg/L BPA, the percentage of malformations, mainly consisting of cardiac edema, increased in both F1 and F2 larvae, a generation who was never in contact with the toxicant. Even though no differences in global DNA methylation were found either in testicles or sperm cells, bisphenol A exposure triggered a decrease in the sperm transcripts encoding insulin receptors in F0 and F1 males. Since the expression of the β subunit of insulin receptor was repressed in F1 and F2 embryos, we concluded that the alteration of spermatic transcripts induced by bisphenol A is transgenerationally inherited. The results derived from this chapter have been published in Environmental Pollution (IF: 4.839). The Second Chapter of this Ph.D. Thesis is focused on finding out the most vulnerable period of male germline formation to bisphenol A exposure. For this purpose, zebrafish were treated with this toxicant during different windows of exposure. The first one entailed the embryonic life, covering the process of primordial germ cell migration to the genital ridge (the first 24 hours of development in this species). The second one affected the same period that chapter I: the mitotic phase of spermatogenesis. And the third one also occurred during adult life, but it included also the meiotic phase and the spermiogenesis (three weeks of exposure). After embryonic exposure, the migration of primordial germ cells as well as their epigenetic status were analysed by whole mount immunostaining. Once embryos reached the adulthood, we assessed the development of the gonads and the breeding capacity of males. Concerning adult exposure, sperm DNA fragmentation and sperm epigenetic profile were evaluated by comet assay and cell immunostaining, respectively. In the F1 progeny, we assessed the percentage of mortality, the DNA repairing capacity and the epigenetic landscape (by whole mount immunostaining) as well as the apoptotic activity (by flow cytometry). The results showed that embryonic exposure to 2000 and 4000 µg/L bisphenol A during the first 24 hours of development alters the expression of two genes involved in primordial germ cell migration (sdf1a and cxcr4b), thus hindering the colonisation of the genital ridges in exposed embryos. However, the histological and morphometrical studies revealed that the impairment of primordial germ cell migration has no long-term effects in the development of the testicles. Regardless of the lower levels of histone acetylation displayed in the spermatozoa of males exposed to 4000 µg/L bisphenol A during embryonic life, they show a proper breeding capacity and generate a normal progeny. Regarding adult male exposure, the treatment with 2000 µg/L bisphenol A during mitotic phase and with 100 and 2000 µg/L bisphenol A during the whole spermatogenesis led to high levels of sperm DNA damage, which have fateful consequences for embryonic development. On the contrary, when males were exposed to 100 µg/L bisphenol A only during mitotic phase, the levels of DNA damage were not that high, so F1 embryos were able to activate DNA repair, showing basal levels of apoptosis. As far as the epigenetic profile of spermatozoa and F1 embryos is concerned, although no changes were observed in the pattern of sperm DNA methylation, males exposed to bisphenol A during the mitotic phase of spermatogenesis showed higher levels of H3K27ac, whereas males treated with the highest dose of the toxicant during the whole spermatogenesis had higher levels of H3K9ac. It is noteworthy that these alterations in the sperm epigenetic marks triggered by male bisphenol A exposure are inherited by F1 embryos, which displayed also an increase in H3K27ac and H3K9ac. In this chapter, it has been proved that the effects of bisphenol A on male germline depend on the window of exposure and that they are much more detrimental when meiosis and spermiogenesis periods are affected. The results obtained from embryonic exposure have been published in Biomolecules (IF: 4.694), whereas those concerning adult male exposure have been submitted to Scientific Reports. The Third Chapter of this Ph.D. Thesis aims to determine the mechanisms by which direct and paternal exposure to bisphenol A impairs heart development. For this purpose, three different experiments were performed: in vitro exposure was performed in rat embryonic cardiomyoblasts, whereas in vivo exposure to bisphenol A was carried out during early embryonic development and adult male life (early spermatogenesis). An immunostaining was performed to assess the levels of histone acetylation, whereas the acetylation of specific gene promoters was assessed by ChIP-qPCR. The expression of a set of genes, which involved heart transcription factors, estrogen receptors and a histone acetyltransferase was analysed by qPCR. The results showed that the treatment with bisphenol A in all these models alter some histone acetylation marks and the expression of the studied genes as well. Nevertheless, there were some differences between embryonic and paternal exposure. The levels of H3K9ac in the promoters of hand2 and esr2b in embryos exposed to bisphenol A were similar to those of control embryos, so in this case, estrogenic effects of bisphenol A, which affect the expression of specific genes, may be more likely related to heart defects than epigenetic changes. On the other hand, we did find out an increase in the enrichment of H3K9ac in the promoters of kat6a, hand2 and esr2b in embryos obtained from males exposed to 2000 µg/L bisphenol A, so the increase in histone acetylation promoted by paternal exposure underlies the overexpression of these three genes. Taking all this data into account, we decided to treat exposed embryos and embryos obtained from exposed males with epigallocatechin gallate. This compound is the major catechin of green tea and it has already been proved to act as an anti-estrogenic substance and as a histone acetyltransferase inhibitor. Our findings showed that the treatment with epigallocatechin gallate successfully counteracted the overexpression of estrogen receptors and histone acetylation, decreasing the levels of hand2 and, thus reducing the cardiac malformations induced by embryonic and paternal bisphenol A exposure. Therefore, in this chapter we have demonstrated not only the mechanisms by which changes in sperm promoted by paternal exposure to bisphenol A have long-term effects on cardiac health of the progeny, but also that epigallocatechin gallate is able to counteract these alterations, allowing a proper heart formation. The results derived from the embryonic exposure to bisphenol A and the neutralisation of direct effects with EGCG have been published in Environmental Pollution (IF: 5.714).

171 p. El impacto del uso de combustibles fósiles aumenta con la mayor demanda energética actual, con importantes consecuencias ambientales, políticas y económicas. Debemos concienciarnos de mantener nuestro entorno y fomentar un desarrollo sostenible, reduciendo el consumo de combustibles fósiles en la medida de lo posible. La alternativa actual al petróleo en muchos de sus aprovechamientos son los biocombustibles, aunque también tienen sus detractores por causas en algunos casos justificadas, cuando su cultivo obstaculiza el uso de esas extensiones para alimentos. Por ello, este estudio se centra en la obtención de biocombustible de biomasa residual, que se obtiene como subproducto de otros aprovechamientos y no interfiere en el consumo humano. Pocos estudios se han enfocado sobre el uso de los bioaceites generados en el proceso de pirólisis, que involucran menores tasas de polución que otras alternativas energéticas. En este trabajo se presenta un Proyecto de Tesis Doctoral registrado en el Programa de Doctorado de Ingeniería de Biosistemas de la Universidad de León que involucra, además de a ésta, a la Universidad de Extremadura y a la Academia Básica del Aire. El trabajo de investigación consta de varios apartados: - Comienza con la obtención de bioaceites a partir de biomasa residual, provenientes de planta de cardo y orujillo de aceituna a partir de un proceso de pirólisis y un proceso de gasificación industrial respectivamente. La fracción líquida obtenida supone entre un 30% y un 40% en masa del total de los productos de la pirólisis. - Seguidamente el bioaceite obtenido se trata mediante diversos procesos: para el aceite de cardo se lleva a cabo una extracción con solventes orgánicos para reducir su contenido en humedad mejorando su poder calorífico, y para el aceite de orujillo de aceituna se procede con una emulsificación con ultrasonidos y adición de surfactante para mejorar la miscibilidad con el combustible fósil y procesos de hidrodesoxigenación para reducir su contenido en oxígeno, lo que además mejora su miscibilidad y reduce su viscosidad. - Posteriormente se realizan pruebas en diversas máquinas térmicas que usan diferentes combustibles derivados del petróleo (queroseno, gasóleo y fuel óleo) para aumentar el alcance posible del uso del biocombustible pirolítico, estudiando el comportamiento del biocombustible obtenido mezclado con combustible fósil en diferentes proporciones. Las máquinas térmicas donde se realizaron las pruebas son: un motor a reacción a escala de fabricación propia (ciclo Brayton), simulando el desempeño del biocombustible en sustitución parcial del queroseno para motores de turbina de aviación y turbinas de gas para co-generación; un motor de gasóleo de automoción (ciclo Diesel) cuyos resultados positivos confirmaron la viabilidad del uso de biocombustible para diversos métodos de transporte marítimo y terrestre, así como para maquinaria industrial y generadores de corriente que utilicen igualmente motores de ciclo Diesel; se realizaron pruebas en una caldera de queroseno (parafina líquida) y finalmente se probo en sustitución total del combustible fósil para la fabricación de bioexplosivos tipo ANFO. Con ello se intenta comprobar la viabilidad del uso del biocombustible pirolítico para aumentar el alcance posible de fuentes de energía alternativas al petróleo para diferentes medios de transporte (aéreo, marítimo y terrestre) además de explotaciones industriales (máquinas térmicas industriales y calderas) y otros usos energéticos (turbinas de co-generación y generadores diésel), ampliando su uso incluso para la sustitución total de combustibles fósiles en la fabricación de explosivos ANFO con base biológica para minería y voladuras civiles. Los resultados a priori son satisfactorios, acercándose al desempeño ofrecido por el combustible fósil en la mayoría de los casos. Sin embargo, conviene mejorar ciertas características del bioaceite ya que el uso de este biocombustible pirolítico sin haber sido tratado puede afectar a la fiabilidad de las mecánicas, provocando posibles averías en las bombas y otras partes del sistema de alimentación de combustible. Para solucionar estos problemas, se somete el bioaceite a procesos de emulsificación que reducen su viscosidad y mejoran su miscibilidad con el combustible fósil, y tratamiento de desoxigenación que permiten reducir el poder corrosivo del bioaceite, mejorar su estabilidad y reducir los compuestos oxigenados. Ambos procesos suponen una optimización importante para poder utilizar el bioaceite en las máquinas térmicas citadas con mayores garantías.

215 p. Se han estudiado los mecanismos de oxidación reducción de una bacteria patógena denominada Rhodococcus equi, la cual es el agente causal de neumonía en potros y en seres humanos, principalmente inmunosuprimidos. El desarrollo de cepas atenuadas de esta bacteria, mediante la deleción de ciertos genes claves para la colonización intracelular ha sido el tema centra de la tesis. Concretamente, el estudio se ha centrado en la importancia de los sistemas basados en micorredoxinas y tiorredoxinas extracelulares, los cuales han demostrado ser esenciales para la virulencia de la bacteria descubriéndose así nuevos factores de virulencia que pueden ayudar en el desarrollo de nuevos y mejores tratamientos.

In recent years, the Mediterranean area has witnessed an increase of both the frequency and severity of large fires, which appears to be intimately associated with climate and land use changes. To measure the impact of wildfires on living organisms, diverse indicators have been proposed. These indicators of fire severity traditionally rely on quantifying the damage caused to the vegetal component of ecosystems. However, the use of bacterial communities as severity indicators has received less attention. Here, we studied the differences between bacterial communities of three different Mediterranean ecosystems, two shrubby and one arboreal, two months after a large wildfire. Two levels of severity were compared to a control unburnt soil. The results showed that greater fire severity triggers a reduction in the diversity of soil bacterial communities. In high-severity fires, this reduction reached 40.6 and 58.6% of the control values for richness and Shannon's diversity, respectively. We also found that the greatest differences between communities could be attributed first to the severity of the fire, and second to the ecosystem from which they originated. Importantly, species of just five families of bacteria: Oxalobacteraceae, Micrococcaceae, Paenibacillaceae, Bacillaceae and Planococcaceae, became dominant in all three ecosystems. The average frequency increase for particular species was 100 times. However, due to random uncontrolled factors, the species that became dominant in each community were not always the same.

The coupling of biological and thermal technologies allows for the complete conversion of wastes into energy and biochar eliminating the problem of sludge disposal. The valorisation of fatty residues as co-substrate in a mesophilic digester of a wastewater treatment plant was studied considering an integrated approach of co-digestion and pyrolysis. Four digested samples obtained from co-digestion of sewage sludge and butcher’s fat waste were studied by thermogravimetric analysis. The activation energy corresponding to the sludge pyrolysis was calculated by a non-isothermal kinetic. Arrhenius activation energy was lower for the pyrolysis of a digested grease sample (92 kJ mol obtained by OFW and 86 kJ mol obtained by Vyazovkin) than for the pyrolysis of sewage sludge and its blends (164–190 kJ mol obtained by OFW and 162–190 kJ mol obtained by Vyazovkin). The analysis of the integrated approach of anaerobic co-digestion and pyrolysis of digestates demonstrated that the addition of 3% (w/v) of fat to the feeding sludge results in a 25% increase in the electricity obtained from biogas (if a combined heat and power unit is considered for biogas valorisation) and increasing the fat content to 15% allows for covering all thermal needs for drying of digestate and more than doubles (2.4 times) the electricity production when the scenario of digestion and pyrolysis is contemplated., This study was funded by the Ministerio de Economía y Competitividad - FEDER (UNLE15-EE-3070).

P. 1-12 Severe fires associated to climate change and land cover changes are becoming more frequent in Mediterranean Europe. The influence of environmental drivers on fire severity, especially under different environmental conditions is still not fully understood. In this study we aim to determine the main environmental variables that control fire severity in large fires (>500 ha) occurring in fire-prone ecosystems under two different environmental conditions following a transition (Mediterranean-Oceanic)-Mediterranean climatic gradient within the Iberian Peninsula, and to provide management recommendations to mitigate fire damage. We estimated fire severity as the differenced Normalized Burn Ratio, through images obtained from Landsat 8 OLI. We also examined the relative influence of pre-fire vegetation structure (vegetation composition and configuration), pre-fire weather conditions, fire history and topography on fire severity using Random Forest machine learning algorithms. The results indicated that the severity of fires occurring along the transition (Mediterranean-Oceanic)-Mediterranean climatic gradient was primarily controlled by pre-fire vegetation composition. Nevertheless, the effect of vegetation composition was strongly dependent on interactions with fire recurrence and pre-fire vegetation structural configuration. The relationship between fire severity, weather and topographic predictors was not consistent among fires occurring in the Mediterranean-Oceanic transition and Mediterranean sites. In the Mediterranean-Oceanic transition site, fire severity was determined by weather conditions (i.e., summer cumulative rainfall), rather than being associated to topography, suggesting that the control exerted by topography may be overwhelmed by weather controls. Conversely, results showed that topography only had a major effect on fire severity in the Mediterranean site. The results of this study highlight the need to prioritise fuel treatments aiming at breaking fuel continuity and reducing fuel loads as an effective management strategy to mitigate fire damage in areas of high fire recurrence. SI

P. 217-228 In Mediterranean fire-prone ecosystems, shifts in fire regime as a consequence of global change could modify the resilience of vegetation communities. In this paper, we aim to compare the efficiency of high and moderate spatial resolution satellite imagery in the evaluation of resilience in a fire-prone landscape under different fire regime categories using two pixel unmixing techniques. A time series of Landsat (ETM+ and OLI; spatial resolution of 30 m) and WorldView-2 (spatial resolution of 2 m) imagery collected between 2011 (pre-fire conditions) and 2016 were used to estimate the temporal variation of fractional vegetation cover (FVC) as a quantitative measure of forest resilience. For this time series, FVC was computed under four fire-regime categories of recurrence and severity using two approaches: dimidiate pixel model and multiple endmember spectral mixture analysis (MESMA). The dimidiate pixel model was computed using NDVI as spectral response for the case of Landsat imagery and NDVI and red-edge NDVI (RENDVI) for WorldView-2. MESMA was applied to unmix WorldView-2 and Landsat imagery into four fraction images: photosynthetic vegetation (PV), non-photosynthetic vegetation (NPV), soil and shade. The PV shade normalized fraction corresponds to the FVC. In summer of 2016 we established 85 30 × 30 m field plots and 360 2 × 2 m field plots to measure the percentage of total vegetation cover in order to validate the FVC estimates made from remote sensing data. The FVC time series showed the same general pattern with both spatial scales and modeling approaches, high fire recurrence categories registering the highest resilience. The accuracy of the dimidiate pixel model was significantly higher for WorldView-2 based estimates (RMSE: 5–10%) than for Landsat (RMSE: 10–15%). The dimidiate pixel model computed from NDVI for both Landsat and WorldView-2 underestimated FVC at high field-sampled vegetation cover, while MESMA estimations were accurate for the entire range of vegetation cover for both satellites. The fraction of photosynthetic vegetation calculated using WorldView-2 had a higher performance (RMSE: 4–6%) than that quantified from Landsat (RMSE: 6–8%). The linear relationships assumed for validation purposes were statistically significant for both sensors and modeling approaches. Our study demonstrates the highest performance of very high spatial resolution satellite imagery and MESMA models in the quantitative estimation of FVC as a measure of post-fire resilience. SI

Changes in climate and land use are altering fire regimes in many regions across the globe. This work aims to study the influence of wildfire recurrence and burn severity on woody community structure and plant functional traits under different environmental conditions. We selected three study sites along a Mediterranean-Oceanic climatic gradient, where we studied the fire history and burn severity of the last wildfire. Four years after the last wildfire, we established 1776 1-m2 plots where the percentage cover of each woody species was sampled. We calculated (i) structural parameters of the community such as total cover, alpha species richness, evenness and diversity (Shannon diversity index), and (ii) vegetation cover of each functional group (differentiating life forms, eco-physiological traits and regenerative traits). Focusing on community structure, results showed increases in species richness and diversity as wildfire recurrence increased, but this effect was partially counterweighted in the areas affected by high severity. In relation to functional groups, we found that increases in recurrence and severity fostered transition from tree- to shrub-dominated ecosystems. Non-arboreal life form, high specific leaf area, N2-fixing capacity, resprouting ability and heat-stimulated germination were advantageous traits under high recurrences and severities, and low seed mass was advantageous under high recurrence situations. We suggest that the strength of the effects of wildfire recurrence and burn severity on vegetation structure and traits might vary with climate, increasing from Oceanic to Mediterranean conditions. In the Mediterranean site, recurrence and severity were strongly related to traits associated with germination (seed mass and heat-stimulated germination), whereas in the Oceanic site the strongest relationships were found with a resprouting-related trait (bud location). This study identifies changes in vegetation structure and composition in scenarios of high recurrence and severity, and provides useful information on plant traits that could be key in enhancing vegetation resilience. This study was financially supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness, the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities, and the European Regional Development Fund (ERDF), in the framework of the GESFIRE (AGL2013-48189-C2-1-R) and FIRESEVES (AGL2017-86075-C2-1-R) projects; and by the Regional Government of Castile and León in the framework of the FIRECYL (LE033U14) and SEFIRECYL (LE001P17) projects. Víctor Fernández-García was supported by a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Education, Culture and Sports (FPU14/00636). The statistical analysis was carried out by the senior author during a research stay at the School of Forestry, Northern Arizona University (EST17/00170).

[Background] The characterization of surface and canopy fuel loadings in fire-prone pine ecosystems is critical for understanding fire behavior and anticipating the most harmful ecological effects of fire. Nevertheless, the joint consideration of both overstory and understory strata in burn severity assessments is often dismissed. The aim of this work was to assess the role of total, overstory and understory pre-fire aboveground biomass (AGB), estimated by means of airborne Light Detection and Ranging (LiDAR) and Landsat data, as drivers of burn severity in a megafire occurred in a pine ecosystem dominated by Pinus pinaster Ait. in the western Mediterranean Basin. [Results] Total and overstory AGB were more accurately estimated (R equal to 0.72 and 0.68, respectively) from LiDAR and spectral data than understory AGB (R ​= ​0.26). Density and height percentile LiDAR metrics for several strata were found to be important predictors of AGB. Burn severity responded markedly and non-linearly to total (R ​= ​0.60) and overstory (R ​= ​0.53) AGB, whereas the relationship with understory AGB was weaker (R ​= ​0.21). Nevertheless, the overstory plus understory AGB contribution led to the highest ability to predict burn severity (RMSE ​= ​122.46 in dNBR scale), instead of the joint consideration as total AGB (RMSE ​= ​158.41). [Conclusions] This study novelty evaluated the potential of pre-fire AGB, as a vegetation biophysical property derived from LiDAR, spectral and field plot inventory data, for predicting burn severity, separating the contribution of the fuel loads in the understory and overstory strata in Pinus pinaster stands. The evidenced relationships between burn severity and pre-fire AGB distribution in Pinus pinaster stands would allow the implementation of threshold criteria to support decision making in fuel treatments designed to minimize crown fire hazard., This study was financially supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness, and the European Regional Development Fund (ERDF), in the framework of the GESFIRE (AGL2013-48189-C2-1-R) and FIRESEVES (AGL2017-86075-C2-1-R) projects; and by the Regional Government of Castilla and León in the framework of the FIRECYL (LE033U14), SEFIRECYL (LE001P17) and WUIFIRECYL (LE005P20) projects. P.M. Fernandes contributed to this article within the framework of the UIDB/04033/2020 project, funded by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT). J.M. Fernández-Guisuraga is supported by a predoctoral fellowship (FPU16/03070) and a research stay grant (EST19/00310) from the Spanish Ministry of Education.

P. 308-314 Oil fields are a source of heavy metal pollution, but few studies have evaluated its impact on the intake of these contaminants through milk, an important food especially for children. From February 2015 to 2016, 118 samples of raw cow's milk, 14 of fodder and 8 of water in Southwest Iran were collected from farms close to oil fields or related industries. Lead (Pb) and cadmium (Cd) levels were evaluated by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Mean ± SE in milk and fodder were 47.0 ± 3.9 and 54.0 ± 6.9 μg/kg for Pb, and 4.7 ± 1.0 and 3.5 ± 1.3 μg/kg for Cd. No Pb or Cd was detected in water. Most milk samples (82.2%) for Pb were above the permissible limits (20 μg/kg). Exposure to Pb and Cd from milk consumption was calculated in two scenarios: mean and maximum exposure for the age range of 2–90 years. The intake of an average Iranian adult (25 years, 60 kg b. w., 0.14 kg milk/day) would be 6.6 μg Pb and 0.66 μg Cd/day (WI of 46.2 and 4.6 μg, respectively), well below the risk values proposed by some international organizations, even in the maximum exposure scenario. However, Pb exposure for infants and toddlers may be closer to the risk values, since milk and milk products could be the main contributor to Cd and Pb, and small children consume 2–3 times more food than adults relative to their body weight. The risk of Pb and Cd exposure through milk close to oil fields should be considered and a monitoring plan for these contaminants is strongly recommended. SI

141 p. Cerebrovascular accident (stroke) represents one of the most devastating diseases in elderly since it is the main cause of death and permanent disability in adults and the second most common cause of dementia. A very active search for effective neuroprotective therapies exists in this field as a consequence of the lack of effective treatments, the high incidence of this pathology and its social and medical costs. In this study, the post-ischemic effect of celecoxib, a selective cyclooxygenase-2 inhibitor, was evaluated in a rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO), followed by two different times of reperfusion (12 h and 48 h). A standard time of ischemia of 1 h was used. In the first aim of this study, the neuroprotective effects of celecoxib were evaluated measuring both tissue damage and neurological deficits. Triple immunostaining, labelling neurons, microglia and astrocytes, was also carried out to analyze the effect of celecoxib on neuronal demise as well as on microglial and astroglia activation. Treatment with celecoxib reduced the infarct volume, neuronal demise, selective neuronal loss (SNL) areas and glial activation. Accordingly, celecoxib improved the neurological deficit. Data of celecoxib treatment suggest the idea that non-SNL areas progress toward SNL slower in the piriform cortex (Pir) than in the frontoparietal cortex, somatosensory area (FrPaSS), suggesting higher neuronal vulnerability to ischemia in the neocortex (FrPaSS) than in paleocortex (Pir). The second aim was to analyze the effect of celecoxib on ER stress. The study showed that treatment with celecoxib reduced GRP78 levels, increased XBP-1s mRNA levels, did not modify eIF2α phosphorylation or ATF4 transcript levels and reduced the Caspase 12, CHOP and polyubiquitinated protein levels. Moreover, celecoxib increased the transcription for catalytic proteasome subunits (β1, β2 and β5) and BAG1, decreased p62/SQSTM1 levels and BAG3 transcripts levels and did not modify the ratio of LC3BII/I. These results led to the conclusion that celecoxib treatment reduces ER-stress by igniting IRE1 pathway and UPS degradation pathway, and it does not seem to modify autophagy. In the third aim of this study, the effect of celecoxib on oxidative stress was analyzed. Treatment with celecoxib reduced lipid peroxidation and cPLA2 phosphorylation. Celecoxib increased superoxide dismutase (SOD) and total antioxidant capacity (TAC) activities, while it did not modify glutathione peroxidase (GPx) activity. Celecoxib also increased transcript levels of heme oxygenase 1 (HO-1) and glutamate-cysteine ligase modifier subunit (GCLM) but did not modify SOD transcript levels. These data allow the conclusion that celecoxib decreases the oxidative state of the cell by modifying the activity of some antioxidant enzymes and increasing the amount of some antioxidants such as glutathione.

260 p. Las denominadas “enfermedades de madera de vid” son uno de los principales problemas a los que se enfrenta el sector vitivinícola en todo el mundo y que implica importantes pérdidas económicas. Dichas enfermedades son causadas por diferentes hongos patógenos afectando tanto a viñedos establecidos como a viñedos jóvenes. El aumento de la incidencia de las enfermedades de madera a lo largo de la última década se atribuye a la pérdida de estrategias efectivas de control y a los cambios en los métodos de producción, donde la mecanización ha provocado que la densidad de los viñedos haya aumentado considerablemente. Durante muchos años, la estrategia empleada para limitar el crecimiento de hongos patógenos fue el empleo de pesticidas de síntesis. Sin embargo, la toxicidad unida al riesgo para la salud, han limitado su uso. Al mismo tiempo, han emergido y emergen otras estrategias como el empleo de compuestos naturales o la aplicación de microorganismos beneficiosos que habitan de forma natural en el en la planta y su entorno. En esta línea, se ha llevado a cabo el aislamiento y caracterización de actinobacterias, tanto de la rizosfera como del sistema radicular de plantas jóvenes de vid, para su posterior aplicación como alternativa novedosa, prometedora y respetuosa medioambientalmente para combatir las infecciones causadas por hongos patógenos. En general, todas las cepas seleccionadas para el estudio mostraron una clara disminución en la tasa de aislamiento de hongos patógenos en comparación con las plantas no tratadas. Las dos cepas más prometedoras, una endofñitica (Streptomyces sp. VV/E1) y otra rizosférica (Streptomyces sp. VV/R4) fueron seleccionadas para llevar a cabo un análisis más exhaustivo. En este trabajo también se estudió la colonización de las dos cepas más prometedoras mediante el desarrollo de marcadores moleculares de tipo SCAR diseñados a partir de regiones poco conservadas del genoma de ambas cepas. Se analizaron dos métodos de colonización diferentes: inmersión del sistema radicular en una suspensión de actinobacterias e inyección directa de una suspensión de actinobacterias en el portainjertos. La detección y cuantificación de las actinobacterias en el material vegetal se analizó mediante PCR a tiempo real (qPCR) empleando los marcadores moleculares desarrollados. Aunque los dos métodos fueron efectivos en la colonización de la actinobateria, la opción más adecuada es la inoculación por inmersión ya que asegura una correcta implantación sin añadir pasos adicionales en el proceso de aplicación industrial. Ésta técnica también permitió el estudio del movimiento de la actinobacteria endofítica a lo largo de la planta, detectándose a lo largo del portainjertos hasta el segundo peciolo sin llegar a detectarse en la segunda hoja. Los genomas de las dos cepas seleccionadas fueron secuenciados para su posterior análisis in silico que condujo a la identificación de varias agrupaciones génicas que podrían estar implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios con actividad antifúngica. La manipulación génica de dichas agrupaciones génicas mediante CRISPR, junto con el análisis de enzimas extracelulares y otros metabolitos secundarios detectados por HPLC-MS en la cepa endofítica fueron los métodos empleados para dilucidar si estos compuestos estaban involucrados o no en la actividad de biocontrol. De este modo, compuestos como la antimicina, la candicidina o la maculosina, descritos como antifúngicos, no pudieron ser relacionados con el efecto de biocontrol mostrado por esta cepa en campo. De un modo similar, la producción de enzimas extracelulares del tipo de las quitinasas tampoco podría ser considerada como responsable de la actividad de biocontrol. A modo de resumen, las actinobacterias que colonizan la rizosfera y el aparato radicular de las plantas de vid son una importante fuente de agentes de biocontrol para reducir la incidencia de hogos patógenos de vid, y por tanto mejorar la calidad de las plantas en vivero y viñedo en todo el mundo. Sin embargo, la identificación de los principales compuestos bioactivos implicados en el proceso de biocontrol es una tarea ardua aún sin resolver.

Con el fin de estudiar la ruta de biosíntesis de flavoglaucina y desarrollar un método para el control biológico de los ácaros en el jamón y la cecina, sin que ello afecte a las características organolépticas del producto final, el primer objetivo que se planteó en este trabajo de investigación fue la obtención de cepas afectadas en la producción de flavoglaucina.. El segundo de los objetivos de este trabajo de investigación, que tenía por objeto la caracterización de los genes implicados en la ruta de biosíntesis de flavoglaucina tiene interés desde el punto de vista biotecnológico porque dicha identificación podría permitir la obtención de cepas superproductoras de sustancia acaricida mediante técnicas de mutagénesis dirigida. Esta técnica nos permitiría obtener mutantes que sólo presenten afectada la producción de flavoglaucina, porque mediante las técnicas de mutación al azar se pueden producir varias mutaciones a la vez. El tercero y último de los objetivos de este trabajo de investigación fue el desarrollo de un sistema de control biológico de la infestación de jamones por ácaros, mediante la implantación de la cepa productora de flavoglaucina, E. rubrum C47 en condiciones controladas y naturales, 204 p.

141 p. Esta tesis aborda el estudio de la riqueza biológica de la comunidad de macroinvertebrados en lagunas de montaña. Trata de desvelar aspectos básicos de su conocimiento, como la obtención del mejor método para medir y estimar su valor, explorar los factores de los que depende, o mostrar la importancia que tienen estos sistemas y su contribución a la riqueza de una región. Es el primer estudio global llevado a cabo en Castilla y León sobre macroinvertebrados de sistemas lacustres de montaña y es clave en el marco de la gestión y conservación

280 p. Se ha elaborado un estudio en Lens mediante la utilización de marcadores moleculares basados en ADN y varios morfológicos para la construcción de mapas genéticos usando poblaciones (F2 y RIL) de un cruzamiento intersubespecífico entre la especie cultivada Lens culinaris ssp. culinaris del cultivar Lupa y la especie silvestre Lens culinaris ssp. orientalis BG 16880, utilizando tanto metodologías matemáticas para los diversos análisis de ligamiento como la novedosa técnica del mapeo por color. Para su consecución se estudiaron 835 marcadores moleculares desarrollados mediante las técnicas de detección de polimorfismos tipo SNP (polimorfismos de un único nucleótido) analizados mediante la utilización de la endonucleasa CEL I, CAPS (secuencias de restricción amplificadas y polimórficas) analizados mediante el uso de 17 enzimas de restricción distintas, RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar), SSR (repeticiones de secuencias cortas), SRAP (polimorfismos amplificados relacionados con secuencias), ISSR (polimorfismos entre microsatélites), SCAR (regiones amplificadas de secuencias caracterizadas) y variaciones observadas directamente en los productos de amplificación por PCR tanto de longitud como de presencia/ausencia. De esta forma se han conseguido un total de 7 mapas genéticos distintos , tanto de nueva construcción como por integración con otros mapas previos, permitiendo hacer estudios comparativos con otros trabajos mejorando el conocimiento del genoma de la lenteja. Esto unido a la diversidad de tipos de marcadores empleados, implica uno de los trabajos de ligamiento más exhaustivos en Lens. En estos mapas se incluyeron genes de interés como el gen para una quinasa de nucleósidos difosfato, gen de un componente del complejo de la piruvato deshidrogenasa y un gen inhibidor de la floración, correspondientes a los marcadores PNDKN1, LG093tq, y SSR- TFL1 respectivamente. Se analizaron varios productos de amplificación para observar similitudes con las bases de datos e identificar nuevas secuencias pertenecientes al genoma de la lenteja analizadas mediante distintas técnicas de detección de polimorfismos ya que correpondían a secuencias pertenecientes a EST (secuencias etiquetadas y expresadas), un gen análogo de resistencia (Pto-Kin) y el gen homólogo de floración TFL1 de Arabidopsis en lenteja. Se obtuvo la secuencia en lenteja del gen homólogo a TFL1 de Arabidopsis coincidiendo con la secuencia PsTFL1a de estudios realizados en guisante que corresponde a la función del gen DET (Determinate), que controla el inicio de la fase floral inhibiendo la transición desde la iniciación floral en el meristemo al estado de flor. Los análisis de alineamiento y filogenéticos realizados permiten clasificar a este gen en el grupo funcional TFL1-like dentro de la familia protéica PEBP o de proteínas de unión a fosfatidiletanolamina. El marcador SSR-TFL1 se ha desarrollado gracias al descubrimiento en esta tesis de una repetición del dinucleótido AT observada en la secuencia del intrón 2 del gen homólogo a TFL1 de Arabidopsis que ha permitido la inclusión de dicho gen en el mapa genético al ser polimórfico entre los parentales del cruzamiento analizado

200 p. La hepatitis C es una enfermedad infecciosa que supone uno de los problemas de salud más graves, debido a la propagación del virus de la hepatitis C (VHC) en todo el mundo, a la existencia de varias vías de transmisión y a la falta de una terapia realmente eficiente. El VHC posee la habilidad de activar varias respuestas celulares que pueden participar en el desarrollo de enfermedades hepáticas asociadas a la patogénesis del VHC, por ejemplo alterando el metabolismo lipídico o activando la vía de señalización oncogénica. Aproximadamente el 50% de los pacientes infectados con VHC tienen esteatosis, pudiendo evolucionar a esteatohepatitis y fibrosis e incluso progresar a cirrosis y carcinoma hepatocelular. La infección con el VHC es única en su dependencia y modificación del metabolismo lipídico del hospedador. De hecho, el acúmulo intrahepatocitario de lípidos inducido por el virus contribuye a una peor respuesta al tratamiento. Por ello, incluir terapias moduladoras del metabolismo lipídico junto con los agentes antivirales puede incrementar la efectividad del tratamiento. Se ha descrito la existencia de numerosos compuestos naturales que afectan al metabolismo lipídico y presentan actividad antiviral. Entre éstos se encuentra la quercetina, un componente perteneciente a la familia de los flavonoides, con actividad frente al VHC y capaz de reducir la acumulación de grasa en el hígado, disminuyendo tanto el estrés oxidativo como la expresión de genes relacionados con el desarrollo de esteatosis

174 p. Los objetivos planteados para este trabajo han sido: 1- Identificar retrotransposones del tipo LTR, en el genoma de Lens culinaris. 2- Identificar y secuenciar diferentes regiones de retrotransposones, incluyendo LTR, para la obtención de marcadores genéticos útiles en la construcción de mapas genéticos. 3- Obtener otros marcadores moleculares desarrollados a partir de elementos móviles de lenteja. 4- Analizar la segregación de dichos marcadores en una población RIL del cruzamiento entre la especie cultivada Lens culinaris ssp. culinaris cv. Lupa y la silvestre Lens culinaris ssp. orientalis BG16880. 5- Obtener un mapa genético basado en marcadores derivados de retrotransposones e integrarlo en mapas previos generados a partir de estudios en la misma población RIL. 6- Comparar el mapa genético obtenido con otros mapas de lenteja y establecer las relaciones de sintenia con la especie de referencia Medicago truncatula

312 p. Para la realización de esta tesis se estudiaron 39 sistemas lacustres situados en el cuadrante noroccidental de la Península Ibérica. En ellos, se estudió la comunidad de macrófitos, tanto desde un punto de vista estructural, como funcional y estableciendo relaciones entre otros componentes del sistema acuático, tanto abióticos como bióticos. Los objetivos fundamentales de la tesis fueron los siguientes: caracterizar la vegetación macrófita, a nivel específico y de grupos funcionales; estudiar la influencia de la temporalidad y variables asociadas a esta sobre la composición y estructura de las comunidades de macrófitos, en términos de riqueza, diversidad y cobertura; identificar las características ambientales más determinantes de la comunidad de macrófitos en los sistemas temporales y en los permanentes; evaluar la importancia relativa de las variables medioambientales a tres escalas diferentes (local, cuenca y regional); evaluar la variabilidad natural de las comunidades de macrófitos en una serie de lagos y lagunas de montaña en condición de referencia, con objeto de desarrollar una tipología que sea biológicamente relevante; evaluar si las tipologías previas elaboradas en España son apropiadas para estratificar la variación en la distribución natural de los macrófitos; examinar la validez de los grupos funcionales de macrófitos en el establecimiento de tipologías como alternativa al enfoque taxonómico; comparar el papel de las diferentes formas de crecimiento de los macrófitos y del agua libre de vegetación en la creación de hábitats diferenciados en cuanto a sus características ambientales, incluyendo hidroquímica y variables asociadas al desarrollo del perifiton; y valorar la influencia de las diferentes formas de crecimiento de los macrófitos sobre la composición y estructura de la comunidad de zooplancton.

El conocimiento, prevención y tratamiento de las patologías existentes es posiblemente el factor más limitante en la actualidad para el engorde del lenguado (Solea senegalensis, Kaup 1858). Sin embargo, no hay evidencia de que ésta sea una especie más susceptible que otras a las infecciones bacterianas. Los actuales sistemas de producción intensiva suponen un estrés para los ejemplares en cultivo, ocasionando una menor eficiencia digestiva, una mayor susceptibilidad frente a patógenos potenciales y pérdidas económicas para la industria. Puesto que la producción en acuicultura depende, en buena medida, del estatus fisiológico de los peces, se hace preciso el empleo de piensos comerciales específicos y adecuados protocolos de cultivo que favorezcan el bienestar animal. La utilización de probióticos a nivel comercial en dieta (células microbianas con un efecto positivo para la salud del hospedador) es ya una herramienta eficaz para la mejora del metabolismo, reducción de deformidades y prevención de patologías en acuicultura de salmónidos, 206 p.

148 p. Los objetivos generales de este trabajo han sido: 1. Obtener una información detallada del potencial del excremento de T. molitor como biofertilizante para diversos cultivos, incluyendo una descripción de las capacidades de promoción del crecimiento vegetal de su microbiota y análisis de sus cualidades como biofitofortificante y biopesticida. 2. Obtener información sobre cómo afecta la dieta de T. molitor a las cualidades de su excremento como potencial producto biofertilizante, atendiendo tanto a su composición, como a la ausencia de metales pesados y patógenos, la variación en las comunidades de microorganismos que contiene y como varía su potencial promotor del crecimiento vegetal.

250 p. Durante las últimas décadas se ha avanzado enormemente en el conocimiento de la composición, arquitectura y metabolismo de la pared celular de las plantas. A pesar de ser una estructura con una alta complejidad a nivel de composición, la pared celular conserva la capacidad de modificar su composición y arquitectura en respuesta a diferentes estreses bióticos y abióticos en un proceso denominado plasticidad estructural. Es estudio de la plasticidad estructural de la pared celular ha ayudado a profundizar en el conocimiento del metabolismo de esta estructura y su relación con la adquisición de tolerancia de las plantas a diferentes estreses. Una de las herramientas más utilizadas en el estudio de la plasticidad estructural de la pared celular es la habituación de cultivos celulares de plantas a concentraciones letales de compuestos relacionados con la inhibición de la biosíntesis de celulosa (CBIs). La habituación de cultivos celulares se consigue mediante la adición en el medio de cultivo de concentraciones crecientes del inhibidor y de manera continuada hasta obtener células que son capaces de crecer en concentraciones letales del CBI. En términos generales, los cultivos de células habituados a CBIs presentan una pared celular con un contenido reducido en celulosa el cual es compensado por incrementos en polisacáridos no celulósicos y otros componentes de pared con el objetivo de reforzar esta estructura. La habituación de suspensiones celulares de maíz habituadas al CBI 2,6-diclorobenzonitrilo (DCB), provocó una reducción de hasta un 70 % en el contenido en celulosa que fue compensado por un incremento en la red de arabinoxilanos. Las células de maíz habituadas a DCB también presentaron un incremento en el contenido en compuestos fenólicos (ácido cumárico, ácido ferúlico y dehidroferulatos) que se presentaron esterificados a estos arabinoxilanos incrementando su entrecruzamiento con el objetivo de reforzar esta pared celular deficiente en celulosa. De la misma forma, la habituación de cultivos celulares de maíz a DCB provocó la deposición de un material tipo lignina en respuesta a esa deficiencia en celulosa. El estudio de la composición de este material tipo lignina reveló que células bajo un tratamiento a tiempos cortos depositaron una lignina compuesta principalmente por unidades S y las células habituadas a altos niveles de DCB presentaron un material tipo lignina con un ratio S/G de 1,45 similar al presente en paredes celulares secundarias de la planta de maíz. La habituación de células a DCB provocó un incremento general en los niveles de expresión de los genes que codifican para las enzimas encargadas de la síntesis de los monolignoles: ferulato 5-hidroxilasa, cinamoil coA reductasa y la cinamil alcohol deshidrogenasa. La deposición de lignina ectópica como respuesta a la pérdida de integridad de la pared celular, participaron las rutas de señalización de estrés mediadas por ácido jasmónico y por especies reactivas de oxígeno (ROS). El tratamiento de suspensiones celulares de maíz con concentraciones de DCB en torno a su I50 - concentración que provoca un 50% de reducción del crecimiento- se caracterizó por un incremento en el contenido en ROS que, en consecuencia, provocaba un mayor daño oxidativo en las lineas celulares tratadas. Sin embargo, los cultivos celulares de maíz con habituación incipiente a DCB se caraterizaron por poseer un mayor control del daño oxidativo debido a un incremento de su capacidad antioxidante. La habituación incipiente a DCB presentó incrementos en las actividades antioxidantes peroxidasas de la clase III, glutatión S-transferasa, y una mayor concentración de glutatión total. En base a estos resultados, podemos concluir que el desarrollo de una estrategia antioxidante/ detoxificadora juega un papel clave en el proceso de habituación de suspensiones celulares de maíz a DCB. Por otro lado, el estudio de la habituación de cultivos en forma de callo de alubia al inhibidor ácido 3,7-dicloroquinolinocarboxílico (quinclorac) reveló que no inhibía directamente la síntesis de celulosa. Sin embargo, las células poseían una tolerancia adquirida a este herbicida. Teniendo en cuenta que fenotipos resistentes o plantas tolerantes de plantas a quinclorac tenían una mayor actividad constitutiva de enzimas antioxidantes, se procedió a realizar un estudio de estado oxidativo y del desarrollo de un estrategia antioxidante en los cultivos habituados de alubia. Los resultados indicaron que la habituación de cultivos celulares de alubia a quinclorac reside, al menos parcialmente, en el desarrollo de una estrategia antioxidante que permite a las células controlar el estrés oxidativo asociado al tratamiento con quinclorac. El incremento de la actividad peroxidasas de la clase III y la superóxido dismutasa indicaron que estas dos enzimas están asociadas al control del daño oxidativo que se produjo durante el proceso de habituación de cultivos celulares de alubia a quinclorac.

255 p. El análisis de una genoteca de Streptomyces clavuligerus, previamente construida, empleando una sonda homóloga al gen hlmA (acetiltransferasa) permitió localizar la agrupación génica de holomicina y, posteriormente, aislar la agrupación de biosíntesis de holomicina completa que consta de 13 marcos de lectura (genes). Los experimentos de transcriptómica realizados en este trabajo demostraron que los genes hlm fueron claramente sobre expresados en las cepas productoras de holmicina en comparación con la cepa silvestre S. clavuligerus ATCC 27064.

278 p. Las leishmaniosis son un complejo de enfermedades causadas por parásitos del género Leishmania spp. que presentan una elevada prevalencia a nivel mundial. Afectan sobretodo a países en vías de desarrollo, aunque recientemente, debido a diversos factores, se ha producido una propagación hacia regiones aparentemente exentas de riesgo. Por todo ello, la OMS considera la leishmaniosis una enfermedad priorizada dentro de su ¿Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases¿. Dado que no existen vacunas eficaces contra estas enfermedades y que los tratamientos médicos actuales están basados en fármacos obsoletos con una elevada toxicidad, es vital abrir nuevas vías de lucha frente a este parásito mediante la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el consiguiente diseño de inhibidores específicos. Recientemente, se han identificado las ADN topoisomerasas como prometedoras dianas de intervención terapéutica en tripanosomátidos. Estas enzimas están involucradas en resolver los problemas topológicos generados durante la replicación, trascripción y recombinación del ADN. La ADN topoisomerasa IB de Leishmania spp. es un complejo heterodimérico con escasa homología con respecto a la proteína del hospedador mamífero, por lo que las regiones no conservadas de la enzima de Leishmania constituyen una diana terapéutica altamente selectiva. En el presente trabajo se ha realizado un estudio exhaustivo de las regiones no conservadas de la ADN topoisomerasa IB de Leishmania, identificando las secuencias específicas responsables de las interacciones entre las dos subunidades del heterodímero así como de la conformación del dominio linker de la proteína, probando además la importancia de este dominio tanto en la capacidad de relajación de la enzima como en la sensibilidad a diferentes tipos de inhibidores. En segundo lugar se han identificado y caracterizado las tres secuencias responsables de la translocación de la proteína al interior del núcleo; una en el extremo C-terminal de la subunidad grande y dos en la subunidad pequeña. La primera de ellas correspondió con una secuencia de 10 aminoácidos localizados en el extremo N-terminal, mientras la que la segunda fue delimitada en las inmediaciones del residuo Tyr catalítico del extremo C-terminal. En este estudio no se encontró ninguna señal específica de translocación al kinetoplasto. Finalmente se evaluó la enzima de Leishmania como diana molecular de intervención terapéutica con tres familias de compuestos: derivados de la camptotecina, indenoisoquinolinas y ácidos grasos tanto acetilénicos como alquinoicos. Con ello se demostró que varios derivados camptotecínicos e indenoisoquinolínicos, especialmente el gimatecan y el LMP400, son inhibidores preferenciales de la enzima de Leishmania frente a la humana, encontrándose una buena correlación entre los ensayos in vitro e in vivo realizados. De igual manera se demostró el uso potencial de los ácidos grasos insaturados de cadena larga como inhibidores de la ADN topoisomerasa, por un mecanismo de acción diferente al de la camptotecina, en el que dichos ácidos grasos impiden el corte del ADN mediado por la enzima pero no la unión entre ambos.

498 p. Streptomyces clavuligerus es un actinomiceto conocido por ser el productor industrial de ácido clavulánico, un potente inhibidor de β-lactamasas que se administra en combinación con antibióticos β-lactámicos para el tratamiento de diversas infecciones, y productor de cefamicina C, un antibiótico β-lactámico empleado como molécula base en la elaboración de cefamicinas semisintéticas. Estos dos compuestos comparten mecanismos comunes de regulación de su biosíntesis. Tras la secuenciación del genoma de S. clavuligerus se ha descubierto que esta bacteria posee un megaplásmido de 1,8 Mb, hecho poco frecuente entre los Streptomyces, prescindible para su viabilidad. La información contenida en la secuencia del megaplásmido, pSCL4, y del cromosoma revela que ambos constituyen un reservorio de genes para la biosíntesis de compuestos bioactivos aún desconocidos. Por ello, en este trabajo se profundiza en la regulación del metabolismo secundario con el fin de poner en valor el potencial de S. clavuligerus en la producción de metabolitos secundarios aún no caracterizados. Para ello se abordaron los siguientes objetivos: la expresión heteróloga de la agrupación génica de la cefamicina C de S. clavuligerus en otras especies de Streptomyces, el análisis transcriptómico diferencial mediante micromatrices entre la cepa silvestre de S. clavuligerus y un mutante delecionado en el gen claR, el análisis transcriptómico diferencial mediante micromatrices entre la cepa silvestre de S. clavuligerus y un mutante carente del megaplásmido pSCL4, y, por último, la activación de compuestos bioactivos en S. clavuligerus mediante la expresión heteróloga del regulador PimM de Streptomyces natalensis.

173 p. Durante las últimas décadas, las consecuencias de las catástrofes naturales unidas a los efectos negativos de la actividad humana se han visto reflejadas en el deterioro de los hábitats naturales así como en la reducción de la variabilidad de las especies que habitan en ellos. Los cursos fluviales son uno de los hábitats más susceptibles, debido principalmente a que desde los comienzos de la civilización, los ríos han sido el foco de asentamiento de las poblaciones humanas. En la provincia de León, la degradación del medio fluvial, la pesca exhaustiva y los brotes epidémicos han diezmado algunas poblaciones de peces, siendo la especie más emblemática y más amenazada la trucha común (Salmo trutta L.). Por ello, se han desarrollado durante años programas de cría en cautividad y repoblación, que han permitido contrarrestar en gran medida estos efectos. Sin embargo, la cría intensiva de trucha común presenta más dificultades que el cultivo de otras especies, debido en parte a que es muy susceptible de padecer enfermedades. La creación de stocks híbridos a partir de machos autóctonos y hembras de procedencia centroeuropea mejoró la productividad en cautividad. Sin embargo, este tipo de cruzamientos provoca introgresión génica de las poblaciones foráneas en el genoma de las poblaciones nativas, provocando la desaparición de caracteres seleccionados, favorables en un determinado hábitat y reduciendo la variabilidad génica de las poblaciones salvajes. La repoblación con stocks obtenidos a partir de las poblaciones nativas, requeriría crear un stock para cada población genéticamente diferenciada, lo que conlleva un gran coste y un riesgo de deriva génica a lo largo de las generaciones

209 p. El objetivo principal de este estudio doctoral es obtener nuevos marcadores polimórficos que permitan ampliar el mapa genético de la lenteja (Lens culinaris Medik.), los análisis genéticos en general y puedan ser empleados como futuras herramientas en los programas de mejoramiento genético. El trabajo desarrolló dos procesos de purificación y cuantificación del ADN a dos muestras de lentejas, uno perteneciente al fondo del Área de Genética de la Universidad de León y otro externo. Se demuestra que la estrecha base genética de la lenteja cultivada hace necesaria una mejor comprensión de las relaciones genéticas entre ésta y el germoplasma silvestre y, con ello, facilitar el uso de la variabilidad presente en especies silvestres dentro de los programas de mejora genética

260 p. El espermatozoide ha pasado de ser considerado un mero portador de la información genética, que empezaría a expresarse en etapas relativamente avanzadas del desarrollo embrionario (transición materna-zigótica), a demostrarse como un protagonista esencial en el desarrollo futuro del embrión, al contener una serie de elementos epigenéticos cruciales para el éxito de la fecundación y el desarrollo temprano. En concreto, el conjunto de proteínas nucleares básicas espermáticas y sus modificaciones postraduccionales, la metilación del ADN, la presencia de ARNs codificantes y no codificantes y la presencia de proteínas de la matriz nuclear constituyen parte de la información epigenética contenida en el espermatozoide, que es transmitida al zigoto durante la fecundación. Tanto la información genética como la epigenética del espermatozoide son sensibles a la agresión de diferentes agentes externos. En particular, no solo es vulnerable el espermatozoide tras la eyaculación, sino que el propio proceso de espermatogénesis constituye una ventana de susceptibilidad genética y epigenética a tener en cuenta. Cualquier alteración que se produzca durante el proceso de formación del espermatozoide maduro puede afectar de diversas formas a las células de la línea germinal, lo que puede alterar la información recibida por el embrión en el momento de la fecundación e incluso transmitirse entre generaciones por vía paterna. Teniendo en cuenta la organización de la cromatina espermática, podrían existir áreas específicas del núcleo del espermatozoide menos protegidas frente al daño genético. Por ello, en el Primer Capítulo de esta Tesis Doctoral se abordó el estudio de la relación entre la susceptibilidad al daño genético y la asociación de la cromatina espermática con diferentes proteínas nucleares. Para ello, se emplearon dos especies de vertebrados como modelo de estudio: trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y pez cebra (Danio rerio), cuya cromatina espermática presenta un único tipo de proteína nuclear básica: protaminas en trucha e histonas en pez cebra Las muestras seminales fueron sometidas a diferentes tratamientos genotóxicos (irradiación UV, estrés oxidativo generado por H2O2 y criopreservación) y se valoró el daño genético a nivel global – mediante ensayo TUNEL – y a nivel específico en genes concretos localizados en regiones con diferente accesibilidad a la maquinaria de transcripción – mediante una evaluación por qPCR. Además, se determinó la localización en el núcleo espermático de la lesión oxidativa 8-OHdG tras los tratamientos, así como, su posible colocalización con proteínas nucleares mediante inmunocitoquímica. En los dos modelos empleados, la irradiación UV ocasionó el mayor nivel de daño en el ADN y en genes específicos y la lesión oxidativa se distribuyó de manera uniforme por el núcleo espermático. El peróxido de hidrógeno provocó una regionalización de la lesión oxidativa, restringiéndose a la periferia nuclear. Además, no se observó una colocalización total de la lesión oxidativa con las proteínas nucleares estudiadas. Estos resultados nos permitieron concluir que las diferencias de sensibilidad genética observadas no dependen de la presencia de proteínas nucleares básicas. En concreto, la accesibilidad de cada agente genotóxico al núcleo podría ser el mayor responsable en la distribución del daño del ADN espermático. A pesar de que los genes analizados no han podido establecerse como biomarcadores de daño genético global, estos estudios representan un punto de partida para el abordaje de nuevos posibles candidatos y permiten desarrollar técnicas más precisas en la detección del daño. Los resultados de este capítulo constituyen los dos primeros artículos derivados de esta Tesis Doctoral, uno de ellos publicado en la revista PLOS ONE y el otro bajo revisión en la revista Theriogenology. Así mismo, forman parte de un artículo de revisión publicado en la revista Aquaculture (ver ANEXO). El Segundo Capítulo de esta Tesis Doctoral se centra en el papel que puede tener la arquitectura nuclear en la distribución del daño genético en el gameto masculino de mamíferos. Para ello, se evaluó el efecto de los agentes genotóxicos analizados en el primer capítulo sobre muestras seminales humanas. El espermatozoide humano no presenta un solo tipo de proteína nuclear básica, sino que su cromatina se configura en tres dominios principales: ADN unido a histonas (HDNA), ADN unido a protaminas (PDNA) y ADN asociado a proteínas de la matriz nuclear. Las regiones HDNA (nucleosomales) y asociadas a proteínas de la matriz son consideradas las más sensibles a sufrir daño en mamíferos. De nuevo, usando una estrategia similar a la descrita unas líneas más arriba, observamos que la irradiación UV generó el mayor nivel de daño, tanto a nivel global como en genes específicos. El H2O2, además de promover un nivel de daño diferencial entre los genes analizados, provocó la localización de la lesión oxidativa en una región ecuatorial y subacrosómica del espermatozoide. Así mismo, la localización del daño oxidativo no coincidió ni con la de la histona H3 ni con la de una proteína de matriz nuclear, descartando, por tanto, la mayor sensibilidad al daño oxidativo asociada a la presencia de proteínas nucleares básicas o de la matriz nuclear del espermatozoide. La lesión oxidativa se distribuyó siguiendo el mismo patrón que una enzima antioxidante, concluyendo que las características propias de la cabeza del espermatozoide facilitan el acceso de los agentes genotóxicos a los territorios nucleares, promoviendo un nivel de daño diferencial entre ellos. Este estudio cuestiona una de las afirmaciones aceptadas en mamíferos en relación a la mayor sensibilidad a sufrir daño y descarta el uso de genes localizados en las regiones HDNA como biomarcadores de daño oxidativo del ADN. En la actualidad, los resultados de este capítulo se encuentran enviados para su publicación a la revista Asian Journal of Andrology. Dadas las repercusiones que puede tener la alteración de la línea germinal durante la espermatogénesis, en el Tercer Capítulo de esta Tesis Doctoral se exploró el efecto de un disruptor endocrino, ampliamente extendido en el medio ambiente, sobre machos de pez cebra. En particular, se evaluó el efecto genético y epigenético del bisfenol A, usado de manera extensa en la producción de policarbonatos y resinas epoxi, sobre la espermatogénesis, centrando el foco de estudio en las posibles alteraciones de la información epigenética que será aportada al embrión en el momento de la fecundación. Para ello, se expusieron machos adultos de pez cebra durante todo el proceso de espermatogénesis a dosis de bisfenol A ambientalmente relevantes. Los resultados revelaron un descenso del número de espermatocitos, así como, un incremento de la apoptosis en testículo tras la exposición al tóxico. Así mismo, el bisfenol A incrementó la expresión del receptor de estrógenos gper1 y disminuyó la expresión de ccnb1 y sycp3 en testículo, lo que puede representar una alteración de la espermatogénesis y del proceso meiótico. El bisfenol A provocó un incremento de la actividad de las enzimas acetiltransferasas de histonas, así como, una hiperacetilación de histonas e hipermetilación de ADN. Estos resultados nos han permitido hipotetizar que el receptor GPER puede estar mediando los efectos promovidos por el BPA. Además, la exposición a bisfenol A causó un incremento de la fragmentación de la cromatina, una alteración del patrón epigenético y una modificación de los transcritos en los espermatozoides de los machos expuestos, lo que podría desequilibrar la información epigenética recibida por el embrión. Este es el primer estudio que revela un incremento de la acetilación de histonas en células testiculares tras la exposición a bisfenol A y su mantenimiento en las células espermáticas. Así mismo, ha puesto de manifiesto que dosis de bisfenol A, consideradas seguras en el agua de consumo hasta hace relativamente poco, son capaces de modificar el patrón epigenético espermático, lo que puede comprometer el desarrollo de la progenie futura. En la actualidad, estos resultados se encuentran enviados a la revista Environmental International para su revisión.

223 p. Entre los objetivos fundamentales propuestos para esta tesis doctoral destaca el de evaluar la capacidad antimicrobiana de los caldos libres de células de cepas bacterianas ácido-lácticas con potencial probiótico frente a diversos microorganismos patógenos.

155 p. Al ser las comunidades de matorral las más afectadas por los incendios en la provincia de León, el objetivo general de la tesis es comprobar la efectividad de la siembra en estas zonas, con el propósito de aumentar la cobertura vegetal a fin de reducir la erosión del suelo. Para ello se tomaron cuatro acciones que centran el estudio: analizar cuál de las diferentes combinaciones de especies herbáceas y leñosas es la más indicada en la revegetación de un brezal quemado experimentalmente, para reducir la erosión a corto plazo, y poder favorecer la sucesión hacia el bosque, a largo plazo; establecer si la siembra de especies herbáceas autóctonas de la zona produce un incremento en la cobertura durante las primeras etapas de la regeneración en un brezal, quemado en un incendio natural; investigar la dinámica de la recuperación de la comunidad vegetal en los dos brezales, para determinar si la siembra afecta a la regeneración natural; determinar, mediante un estudio a corto plazo en laboratorio, si las especies herbáceas sembradas en ambos brezales (dos gramíneas y una leguminosa) afectan a la germinación de las semillas presentes en el banco edáfico de la zona, así como las posibles interacciones entre la leguminosa y las gramíneas; y, por último, determinar la dinámica de recuperación de la biomasa aérea después del fuego, en brezales, comparando parcelas quemadas en años diferentes y parcelas similares no quemadas

188 La presente tesis doctoral estudia las diferencias en la microbiota duodenal humana implicada en el metabolismo del gluten en función de la enfermedad celíaca. La investigación se realizó sobre las biopsias duodenales proporcionadas desde el Servicio de Gastroenterología Adulta y Pediátrica del Hospital de León de adultos de los siguientes grupos: pacientes con enfermedad celiaca activa antes de haber comenzado una dieta sin gluten (CA), pacientes celiacos tratados con dieta sin gluten durante más de 1 año, en los que se realizaba la biopsia para comprobar la evolución de la atrofia vellositaria (CT), familiares con un HLA-DQ susceptible a la EC (F) y familiares de celiacos sin susceptibilidad genética, que fueron considerados como sanos (S). Entre los resultados destacan: el duodeno humano está habitado por bacterias implicadas en el metabolismo del gluten; la microbiota duodenal implicada en el metabolismo del gluten está dominada por los géneros Streptococcus y Lactobacillus; la presencia de bacterias duodenales que participan en el metabolismo del gluten es dependiente del individuo y no del diagnóstico; o que la serrapeptasa muestra características de actividad y estabilidad que hacen que esta enzima sea una buena candidata para eliminar trazas de gluten

170 p., XXIII Los objetivos de esta tesis fueron: 1. Desarrollar un modelo de diferenciación endotelial en las células troncales embrionarias murinas E14Tg2¿, realizando un análisis comparativo de varios métodos de diferenciación 2. Determinar la función del gen TP73 en diferenciación endotelial, vasculogénesis y angiogénesis in vitro. 2.1. Analizar el efecto de la inhibición funcional de p73 en la diferenciación endotelial y morfogénesis vascular de las células troncales embrionarias murinas E14Tg2¿. 2.2. Analizar el efecto de la falta de p73 en la biología de las células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) 3. Identificar la función de p73 en la vasculogénesis y angiogénesis in vivo. 3.1. Evaluación del efecto de la falta de p73 en el desarrollo de la vasculatura de los embriones knockout Trp73. 3.2. Análisis de la vasculatura de la retina en los ratones knockout Trp73

303 p. La presente tesis doctoral estudia la reducción del arsénico, elemento altamente tóxico para los seres vivos que se encuentra de forma natural y ampliamente distribuido en la naturaleza. El estudio se centra en la característica de la actinobacteria Corynebacterium glutamicum de exibir una elevada resitencia al arsénico en comparación con el resto de microorganismos analizados al utilizar un sistema de desintoxicación a través de las arsenito permeasas y arsenito reductasas . La autora concluye que como aplicación práctica de los resultados obtenidos se han utilizado diferentes mutantes afectados en los genes de resistencia a arsénico de C. glutamicum como bioacumuladores de arsenito y arseniato, con objeto de usar los mutantes indicados en procesos de eliminación de arsénico.

261 p. El estrecho de Gibraltar constituye uno de los lugares de concentración de aves migratorias más importantes del mundo. El seguimiento a medio y largo plazo de planeadoras en el Estrecho (1970s – 1990s - 2010s) refleja cambios significativos en el paso, especialmente en la última década, que reflejan recuperaciones poblacionales de muchas especies de cigüeñas y rapaces, descensos en unas pocas, pero también cambios en los patrones migratorios que incluyen acortamientos en las distancias de migración, aparición de nuevas rutas migratorias y la colonización de elementos de filiación africana. Los censos a medio y largo plazo de aves planeadoras en el estrecho reflejan cambios significativos en los calendarios de paso, especialmente entre 1976 y 1999, con adelantos en el paso de algunas especies y retrasos en otras. Estos rápidos cambios en la fenología de paso aconsejan revisar periódicamente los protocolos y fechas de censo para ajustarlos a las tendencias detectadas. Las condiciones meteorológicas locales y a escala regional afectan sensiblemente a los números de aves planeadoras en tránsito por el estrecho de Gibraltar. Estas circunstancias deberían tenerse en cuenta cuando se hacen análisis de la fenología migratoria en base a los datos de observatorios de migración. Los conteos en puntos de concentración de migrantes, como el Estrecho de Gibraltar, constituyen una excelente alternativa a los censos mediante otros métodos, consiguiendo una gran cobertura con un esfuerzo relativamente reducido

143 p. Conocer cómo influye la presencia/ausencia de vegetación en los humedales construidos, así como la especie vegetal, en la eliminación de bacterias.

188 p. La microbiota digestiva tiene un gran impacto en la salud de los animales participando en diversas funciones fisiológicas. En los últimos años, en el ganado porcino han cobrado especial relevancia los problemas digestivos no específicos asociados a las alteraciones de esta microbiota denominadas disbiosis. Por otra parte, el control de las infecciones digestivas en el cerdo se basa, fundamentalmente, en el empleo de antimicrobianos aunque la legislación es cada vez más restrictiva respecto a su uso con fines profilácticos o metafilácticos. Por este motivo es necesario desarrollar nuevas opciones terapéuticas como los cambios en la dieta, ácidos orgánicos, el empleo de extractos vegetales o de pro y prebióticos que modifiquen, restauren o corrijan los desequilibrios de la microbiota intestinal. Sin embargo, antes de aplicar estas nuevas estrategias de control es necesario ampliar el conocimiento sobre la microbiota intestinal y desarrollar herramientas que permitan valorar su composición en condiciones de campo de forma sistemática y eficaz. El objetivo del presente trabajo ha sido el estudio de la microbiota digestiva del cerdo durante las primeras semanas de vida en animales sanos y con problemas digestivos asociados a disbiosis para avanzar en el desarrollo y evaluación de nuevas intervenciones para el control de estos procesos o en la reducción del empleo de antimicrobianos. La técnica elegida para el estudio de la composición y evolución de la microbiota intestinal fue la PCR cuantitativa o PCRc, un método más rápido y económico que la secuenciación masiva del ADN de la microbiota. Se cuantificaron las poblaciones de bacterias totales, bacteroides, lactobacilos, enterobacterias, bifidobacterias y clostridios de los clúster I, IV y XIV en un total de doce estudios experimentales que abarcaron las etapas de lactación, destete, transición y primera mitad de cebo. Además, se desarrolló y optimizó una técnica ELISA para la cuantificación de lactoferrina, un biomarcador de inflamación intestinal, en las heces de los lechones. La comparación de los resultados proporcionados por las PCRc desarrolladas en esta Tesis con los de la secuenciación masiva basada en la amplificación del ARNr 16S, técnica de referencia para el estudio de la microbiota digestiva, demostró una alta correlación entre las estimaciones obtenidas por ambas técnicas. El seguimiento longitudinal de la microbiota de los lechones, desde el nacimiento hasta el periodo de cebo, evidenció un incremento progresivo de bacteroides, una disminución de lactobacilos y enterobacterias, aunque éstas se elevaron ligeramente en el destete, y concentraciones relativamente estables de bifidobacterias y de los tres clúster de clostridios, aunque los clúster IV y XIV presentaron una concentración inferior durante los primeros días de vida. La comparación entre lechones sanos y lechones con signos clínicos compatibles con disbiosis permitió demostrar diferencias significativas. La microbiota de los lechones sanos presentó un número inferior de enterobacterias y mayores concentraciones de lactobacilos y clostridios del clúster IV y XIV. Sin embargo, la concentración de lactoferrina en las heces fue similar en ambos grupos de animales, por lo que no se pudo demostrar la existencia de inflamación intestinal asociada a esta disbiosis. Se observaron escasas diferencias en la composición de la microbiota en lechones con la misma genética y alimentación pero estabulados en granjas con diferente estatus sanitario. Los lechones de las granjas con un estatus alto presentaron una mejor microbiota al nacimiento mientras que los animales de las granjas de estatus sanitario bajo presentaron, a lo largo de todo el seguimiento, una menor diversidad en su microbiota, hecho que ha sido asociado a una mayor receptividad a las infecciones. Finalmente, se evaluaron diferentes intervenciones en la dieta. El empleo de óxido de zinc en lechones destetados redujo las enterobacterias presentes en las heces, disminuyendo, por tanto, el riesgo de diarreas posdestete. La reducción del uso de antibióticos en la dieta tuvo un efecto limitado en la composición bacteriana de la microbiota, destacando tan solo la reducción de la concentración de bacteroides. La adición de ácidos grasos de cadena media se relacionó con un aumento significativo de bacteroides y clostridios del clúster IV y XIV, microorganismos, a su vez, productores de ácidos grasos de cadena corta, mientras que el incremento de la fibra en la dieta mediante la administración de avena no incrementó la riqueza de la microbiota, contrariamente a lo propuesto en otros estudios, y se asoció a una reducción de los clostridios del clúster IV en uno de los estudios.

236 p. Durante la realización de esta Tesis Doctoral, se ha pretendido caracterizar bioquímica y genéticamente la ruta o rutas catabólicas responsables de la degradación bacteriana aeróbica de compuestos de naturaleza esteroidea en la cepa Pseudomonas putida DOC21. Dicha cepa es capaz de asimilar ácidos biliares (ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido litocólico y ácido ursodesoxicólico) y testosterona, entre otras moléculas de naturaleza esteroídica, como únicas fuentes de carbono y energía. Los trabajos desarrollados en las tesis doctorales de los doctores Joaquín Rodríguez Fernández y Estefanía Merino García, desarrolladas en nuestro grupo de investigación, habían expuesto la presencia en esta cepa de estudio de una serie de rutas periféricas conducentes a la obtención de un intermediario común, la AD, a partir del cual se unificaba la ruta degradativa para los compuestos esteroídicos. Durante el transcurso de este estudio se pretendieron caracterizar las etapas conducentes a la eliminación de la cadena lateral unida en posición 17 característica de los ácidos biliares. Empleando herramientas de ingeniería genética, se obtuvieron una serie de mutantes de deleción para determinados genes, estudiando la capacidad metabólica resultante de los mismos. Asimismo, se identificaron algunos de los intermediarios metabólicos que esta cepa genera durante el transcurso de la degradación de diferentes moléculas de carácter esteroideo. De este modo, pudo concluirse que la eliminación de la cadena lateral procede a través de una ruptura aldolítica, lo que exige la participación de dos enzimas con actividad CoA ligásica durante este proceso. La identificación de un compuesto de naturaleza aldehídica DHOPDCA, aislado también durante la degradación de ácido cólico en el caldo de cultivo de la cepa Pseudomonas sp. Chol1, así como la alta similitud de las regiones que codifican las actividades del catabolismo esteroideo en ambas especies soportaban la hipótesis. También fueron identificados varios de los genes y enzimas necesarios para llevar a cabo la oxidación del anillo A, proceso imprescindible para completar el catabolismo de esteroides en P. putida DOC21 Las conclusiones obtenidas en esta Tesis Doctoral, han permitido describir el mecanismo que emplea la cepa Pseudomonas putida DOC21 para llevar a cabo la eliminación de la cadena lateral unida en C17 de los ácidos biliares así como alguna de las reacciones posteriores necesarias para completar el catabolismo de estos y de otros compuestos esteroideos.

178 p. En este estudio se han inactivado cinco genes LAL de Streptomyces coelicolor: SCO0877, SCO6334, SCO7093, SCO7143 y SCO7173 observándose, en algunos casos, la alteración de la producción de antibióticos. Se han usado micromatrices de ADN y PCR cuantitativa para examinar el transcriptoma de los mutantes D0877 y D7173 en comparación con el obtenido en la cepa parental S. coelicolor M145. Nuestros resultados indican que los reguladores estudiados LAL 0877 y LAL 7173 actúan de una forma global, afectando a varios procesos celulares, entre los que se encuentran la respuesta a la escasez de fosfato y la biosíntesis del antibiótico pigmentado actinorrodina. Esta es la primera vez que se lleva a cabo un análisis funcional de este tipo de reguladores transcripcionales

357 p. La presente Tesis Doctoral es el resultado de aplicar diferentes técnicas y herramientas al estudio y conservación de táxones incluidos en el Catálogo de Flora Amenazada de la comunidad autónoma de Castilla y León. Este estudio se enmarca bajo la disciplina de la Biología de la Conservación que, en este caso, ha sido orientada principalmente a promover una gestión regional y nacional, entendiendo que la responsabilidad primera de conservar el patrimonio, tanto natural, como de otra índole, es de las administraciones locales

271 p. En las últimas tres décadas, el desarrollo de la industria, de las prácticas agrícolas y la urbanización han conducido al progresivo deterioro de los humedales. Las lagunas mediterráneas son someras, éstas son más sensibles a los cambios hidrológicos que las lagunas profundas ya que, incluso, pequeños cambios pueden influir en las concentraciones de los principales iones.

639 p. El trabajo presentado tiene como objectivo exponer la distribución altitudinal y horizontal en Colombia (Suramérica) de los coleópteros buceadores de la familia Dytiscidae (Coleoptera: Adephaga), en el contexto de la fuerte capacidad depredadora de estos adéfagos contra los estadios preimaginales de vectores merolimnéticos, sobre todo los dípteros de la famila Culicidae. Es el primer ensayo - en un país tropical seriamente afectado por enfermedades transmitidas por vectores - de delimitar los rangos altitudinales de todas las especies de un grupo taxonómico de macroinvertebrados acuáticos que tienen un papel importante como depredadores de vectores de enfermedades humanas. Los principales resultados del trabajo incluyen: 1. Colombia se convierte el tercer país del Neotropical y el primer país suramericano que cuenta con un tratamiento sistematizado y monográfico a nivel de especies de la familia Dytiscidae. 2. El número de especies conocidas para Colombia pasa de 53 a 159, de las cuales 132 han sido encontrados en el curso del presente estudio. Se re-encontraron 26 (49%) de las 53 especies anteriormente conocidas del país, encontraron 65 especies descritas como nuevas citas para Colombia, detectaron 24 especies nuevas para la ciencia y 17 taxones de incierta identidad. 3. Los brotes recientes más serias de Malaria y Dengue en Colombia se observan en el comienzo de una época La Niña después de una época El Niño fuerte - una situación cuando se forman cuerpos de agua libre de depredadores de culícidos en números extraordinarios. Con base en este resultado quizás se facilita disponer más delante de una nueva herramienta para alertas tempranas en materias de salud pública.

El estudio pretende conocer la variación de la biodiversidad de los pastos naturales sometidos al pastoreo racional. La investigación se llevó a cabo en el Altiplano de Rio Grande do Sur, Brasil, en dos localidades, Carazinho y Barros Cassal, entre 1999 y 2005. Los objetivos específicos se centraron en determinar la diversidad biológica de las plantas del paisaje natural sometido al pastoreo racional, caracterizar la comunidad vegetal ocurrente en este tipo de pastos, determinar la composición bromatológica y la variación de los factores pedológicos, establecer las series de la vegetación capaces de establecerse en las condiciones y definir una asociación resultante del manejo en las áreas sometidas al pastoreo racional, 183 p.

167 p. La obtención de esteroides de forma eficiente y rentable por parte de la industria farmacéutica es de elevada importancia habida cuenta de sus múltiples aplicaciones comerciales, entre las que destacan como antiinflamatorios, inmunosupresores y anticonceptivos. En este trabajo se han estudiado distintas formas de biotransformación de esteroides, como método de síntesis que aprovecha la capacidad de ciertos microorganismos para realizar modificaciones químicas sobre estos compuestos de forma mucho más sencilla y rápida que la tradicional síntesis química, que adolece de ser un procedimiento más laborioso y menos seguro laboral y medioambientalmente puesto que requiere el uso de metales pesados. No obstante, las biotransformaciones, como método de síntesis, todavía tienen mucho potencial que ofrecer ya que habitualmente se llevan a cabo con microorganismos silvestres que no son capaces de obtener los productos finales en un único paso. Por ello, en este estudio planteamos la posibilidad de crear microorganismos recombinantes que posean todos los genes necesarios para la obtención de esteroides interesantes desde el punto de vista farmacético a partir de precursores de bajo coste tales como los fitoesteroles. Concretamente, esta tesis se centra en el estudio del hongo Aspergillus nidulans como organismo receptor y donador de genes involucrados en el metabolismo de esteroides en el que destaca su actividad esteroide 11-alfa-hidroxilasa, relacionada con la obtención de moléculas con propiedades antiinflamatorias. Asimismo, se han empleado otros organismos fúngicos como donadores de genes que incluyen Aspergillus ochraceus, Rhizopus oryzae y Cochliobolus lunatus.

163 p. La Polaridad Cellular Planar (PCP) describe la orientación coordinada de las células en el plano del tejido y es una característica fundamental de los tejidos epiteliales. En las células multiciliadas, la orientación individual y coordinada de los cilios es esencial para el correcto funcionamiento de las mismas. En el cerebro del ratón, donde los ventrículos están tapizados por células multiciliadas denominadas células ependimarias, los fallos en la formación de los cilios y/o en el establecimiento de la PCP da lugar a una pérdida de función de los cilios e hidrocefalia. Las células ependimarias presentan dos tipos de polaridad, la polaridad translacional (tPCP) y la polaridad rotacional (rPCP), que son fundamentales para el movimiento coordinado de los cilios. Ambas se establecen durante el periodo perinatal, cuando las células de la glía radial (RGCs) monociliadas se transforman en células ependimarias multiciliadas (ECs). La regulación de la tPCP en células ependimarias es llevado a cabo, al menos en parte, por la activación de la miosina no muscular II (NMII), una proteína de unión a actina que es esencial para el control de la adhesión celular y la arquitectura tisular. La activación de NMII mediante la kinasa MLCK (myosin light chain kinase) es esencial para el establecimiento de la polaridad translacional en las células ependimarias. La regulación de la rPCP se lleva a cabo mediante la localización asimétrica de las proteínas pertenecientes a la vía de señalización PCP, que se mueven de manera diferencial dentro de la célula para establecer asimetrías moleculares. Esta asimetría se traducirá en cambios en el citoesqueleteto celular que orientará los cilios para su movimiento coordinado. El factor de transcripción p73, que pertenece a la familia de factores de transcripción p53, es un importante regulador del desarrollo del Sistema Nervioso Central y es necesario para el establecimiento de la arquitectura del nicho neurogénico que se localiza en la pared lateral de los ventrículos. En esta tesis doctoral se ha llevado a cabo el estudio del papel de p73 en el desarrollo de las células ependimarias, la formación de los cilios y su organización en la membrana apical.

359 p. La enfermedad celiaca (EC) es una enteropatía inflamatoria crónica del intestino delgado mediada inmunológicamente que está causada por la ingesta de gluten en individuos genéticamente predispuestos. Esta predisposición genética consiste en la presencia de los alelos HLA DQ2/DQ8, sin embargo, se sabe que la presencia de estos alelos es necesaria pero no suficiente para el desarrollo de la celiaquía, ya que el 30% de la población general posee estos alelos y solamente un pequeño porcentaje (aproximadamente el 1%) desarrolla la enfermedad tras la ingesta de gluten. Esto indica que deben existir otros factores asociados al desarrollo de la EC, uno de los factores más habitualmente asociados a esta enfermedad es la existencia de una disbiosis en la microbiota intestinal de los enfermos celiacos. Lo que resulta desconocido es si esta disbiosis es causa o consecuencia de la EC, en este trabajo proponemos que el desarrollo de la EC podría estar asociado no tanto a la presencia o ausencia de unos u otros microorganismos en el intestino, sino a la diferente funcionalidad que esos microorganismos puedan ejercer en el duodeno. Por ello, en esta Tesis Doctoral se ha hecho un estudio del efecto sobre el epitelio intestinal de la microbiota duodenal implicada en el metabolismo del gluten. Como resultado se ha observado la existencia de una cepa perjudicial para los enfermos celiacos, y también se ha concluido que la presencia de ciertas bacterias en el duodeno resulta beneficiosa para la salud del hospedador en general, y de los enfermos celiacos en particular. Por otro lado, se sabe que el gluten es resistente a la digestión completa por parte de las enzimas humanas en el tracto gastrointestinal, lo cual da lugar a diferentes péptidos responsables de la activación de la EC. En estudios previos se han descrito varios aspectos sobre el metabolismo del gluten en adultos, pero hasta ahora no ha sido descrito este metabolismo en recién nacidos. En esta Tesis Doctoral se describen varios aspectos sobre el metabolismo de gluten en recién nacidos y en niños de hasta 8 meses de edad, así como la posible influencia de la lactancia materna en este metabolismo. Por último, en este trabajo se ha aislado, identificado y caracterizado la microbiota implicada en metabolismo de gluten presente en la leche materna y en las heces de niños de 0 a 8 meses de edad. Actualmente, el único tratamiento aceptado para los enfermos celiacos es el mantenimiento de una dieta libre de gluten de por vida, lo cual resulta complicado debido entre otras causas a las transgresiones involuntarias de esta dieta provocadas por las contaminaciones traza. Por esta razón, el objetivo de este proceso de aislamiento, identificación y caracterización de microorganismos implicados en metabolismo de gluten era obtener uno o varios microorganismos con potencial probiótico para los enfermos celiacos que sirva de complemento a la dieta libre de gluten y haga más fácil la vida de estos enfermos. Como resultado, se aislaron e identificaron un total de 381 microorganismos capaces de digerir el gluten, los cuales fueron ampliamente caracterizados, dando lugar a una selección de 6 cepas con un alto potencial probiótico para el tratamiento complementario y/o prevención de la EC.

275 p. La proteína ABCG2/BCRP es un transportador de todo tipo de sustancias que se expresa en multitud de tejidos y órganos como el hígado, el intestino, la barrera hematoencefálica y la glándula mamaria). La presente memoria tiene como objetivo principal la caracterización del efecto del polimorfismo bovino Y581S in vivo así como la determinación de los efectos de dietas específicas sobre la secreción en leche de fármacos mediada por ABCG2 de rumiantes.Los estudios concluyeron que el polimorfismo bovino Y581S de ABCG2 tiene efectos específicos sobre propiedades fisicoquímicas de la leche como la conductividad y la cantidad de lactosa. También se observaron efectos generales sobre la metabolómica de las vacas portadoras del polimorfismo, aumentando la concentración de ciertos metabolitos en leche y orina y reduciéndose en plasma. Los resultados obtenidos en la presente memoria aportan información relevante acerca del papel de ABCG2 en la concentración de fármacos y compuestos naturales en la leche, así como la posibilidad de modular su actividad para obtener productos de mayor calidad para la industria y los consumidores.

216 p. Efectos de las deposiciones atmosféricas de nitrógeno en el funcionamiento de los brezales de Calluna vulgaris (L.) Hull de la cordillera cantábrica.= Calluna-vulgaris-heathlands located at the southern-most distribution area (Cantabrian Mountains, NW Spain) are currently threatened by global change drivers such as atmospheric nitrogen (N) depositions that affect their functioning, structure and plant species composition. The main aim of the present Doctoral Thesis was to evaluate the effects of different atmospheric N loads in Cantabrian Mountains heathlands at two different life-cycle stages (young- and mature-phase). Field measured bulk inorganic N deposition rates in the Cantabrian Mountains ranged between 2.8 kg N ha-1 yr-1 and 4.6 kg N ha-1 yr-1, with higher N deposition rates during the wet period. The prevailing N chemical form in atmospheric depositions is from oxidized compounds (NOY). The distribution and fate of these airborne N inputs in the Calluna-heathland were traced with 15N isotope. These heathlands were able to retain ∼72% of total N inputs in the short-term (< 1 year). The soil organic horizon immobilized ∼47% of the N inputs. During the second year, ∼95% of N inputs was likely lost by denitrification fluxes during the winter-spring period. Leaching losses were negligible over two years, suggesting that these heathlands were not N saturated. Furthermore, we aimed to evaluate the effects of different levels of experimentally simulated N deposition on the functioning, structure and composition of Cantabrian Calluna-heathlands. The increase in atmospheric N loads resulted in a subsequent increase in soil ammonium (NH4+) with long-term N inputs (10 years); although soil nitrate (NO3-), total N, organic carbon (C), and available phosphorus (P) pools remained unchanged. Besides, Calluna shoot N and P contents and litter N content also increased, which was accordingly reflected in higher N:P ratios. The greatest P demand by Calluna biomass from P-poor soils was supplied by the increase in acid phosphatase enzymatic activity to mineralize organic P, and by the extent of Calluna roots colonized by mycorrhizal fungi to support the higher P uptake. There were no changes in soil microbial biomass C and N contents in response to higher N availability, as well as in urease (N cycle) and β-glucosidase (C cycle) enzymatic activities associated to microbial nutrient demand. The lack of response of several soil properties and microbial nutrient contents could be due to extreme climatic conditions and short period of physiological activity in these montane areas, indicating that montane heathlands are highly resistant to increased N loads. Furthermore, plant community composition and plant species richness remained unchanged in response to enhanced N inputs, likely due to the resistant and resilient mechanisms of heathland dominant vegetation. However, at life-form level, percentage of cover of N-tolerant graminoids and forbs species increased with higher N availability, while the cover of bryophytes and lichens declined. There was a stimulation of Calluna vulgaris vital rates (shoot growth and flowering) in response to short-term N inputs, but the first symptoms of N saturation were observed under long-term N inputs (10 years) through a declined trend in these vital rates. The heathland life-cycle stage conditioned the response to enhanced N loads through stronger N-related effects in young stands compared to mature ones. In Cantabrian heathlands, the N critical load was set in the range of 10-20 kg N ha-1 yr-1 for both young and mature stands, based mainly on changes in Calluna flowering and shoot N content at 14.6 kg N ha-1 yr-1.

242 p. La presente tesis se centra en establecer la secuencia de la agrupación génica de biosítesis de tracolimus o FK506, el fármaco mayoritariamente elegido como inmunosupresor en transplantes de órganos. Este trabajo tiene como fin último encontrar un método que permita aumentar la producción de este policético macrólido, que se obtiene únicamente a partir de bacterias del género Streptomyces, pero cuyas cepas presentan una baja productividad. En este trabajo se establecen las agrupaciones génicas de tacrolimus de S. tsukubaensis NRRL 18488 y S. tacrolimicus y se presenta el mecanismo regulador ejercido por FkbN y OrfD sobre la agrupación de tacrolimus en S. tacrolimicus. El estudio consigue su objetivo pues, según la autora, se demuestra el potencial de manipular genes reguladores para incrementar el título de producción de tacrolimus, ya que tanto la sobreexpresión del gen fkbN como la deleción de orfD conducen a un incremento de la producción del inmunosupresor tacrolimus

128 Esta tesis tiene por objetivo principal estudiar las consecuencias de una potencial fuga de CO2 desde un almacén geológico sobre las comunidades microbianas del suelo. Para ello, se analizó la microbiota de una planta experimental que simula una fuga controlada de CO2 (experimento PISCO2). Paralelamente se estudiaron las comunidades microbianas de una zona de emisiones naturales de CO2 (La Sima, Campo de Calatrava) con el fin de comparar el sistema experimental con una emisión natural Tras el estudio se concluyó que la biomonitorización de la CAC mediante biota edáfica estaría indicada para controlar fugas leves que no han sido detectadas durante largos periodos o bien escapes de CO2 de gran flujo. Por lo tanto, los futuros estudios deberían centrarse en identificar el tiempo de exposición necesario para detectar cambios en la biota edáfica debidos a pequeñas fugas, y la concentración umbral de CO2 a partir de la cual puedan detectarse grandes fugas producidas en poco tiempo.