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Die Anwendbarkeit der Hydrothermalen Carbonisierung (HTC) ist u.a. wegen eines unzureichenden Prozessverständnisses noch beschränkt. Aus diesem Grund wurde die HTC von Landschaftspflegematerial (LPM) hinsichtlich Prozessablauf, Stöchiometrie, Kinetik und Thermodynamik untersucht. Es können prozessbedingte Änderungen in den Produkten aufgezeigt und auf ein Reaktionsmodell übertragen werden. Auf Basis einer stöchiometrischen Bilanzierung kann die Dehydratisierung von LPM für Temperaturen von 180, 200, 220 und 240°C mit einer Monod-Funktion beschrieben werden. Die Reaktionsgeschwindigkeit der Dehydratisierung kann mit den noch eliminierbaren Wasserstoff- und Sauerstoffkonzentration in der Kohle korreliert werden. Die Aktivierungsenergie beträgt 71,1 kJ mol^-1. Zur Kalorimetrie wird eine Messprozedur an einem Wärmestrom-DSC entwickelt. Entsprechende Messungen bestätigen den exothermen Charakter der HTC, wonach 1 g LPM (daf = trocken und aschefrei) -660 +- 3 J freisetzt. Eine theoretische Abschätzung der Reaktionswärme durch Massen- und Energiebilanzen überschätzt die gemessene Reaktionswärme um mehr als das Sechsfache. Erst die Berücksichtigung von volatilen Komponenten nähert die berechnete Reaktionswärme von -922 J g_daf^-1 dem Messwert an. Untersuchungen von Referenzbiomassen zeigen deutliche Unterschiede in den Wärmeprofilen und den resultierenden Reaktionswärmen (-841 bis -281 J g_daf^-1). Dabei wird die Reaktionswärme u. a. vom Sauerstoffgehalt im Edukt beeinflusst. Durch Mischen von Modellkomponenten kann ein dem LPM ähnliches Stoffgemisch erzeugt werden, dessen Reaktionswärme sich < 10 % von LPM unterscheidet. Insgesamt können der Prozessablauf und die Bildung von Reaktionswärme in dem entwickelten Reaktionsmodell aufeinander abgebildet werden., The applicability of the hydrothermal carbonization (HTC) is so far limited due to an insufficient process understanding. For this reason, biomass from landscape management (LPM) was investigated with respect to process flow, stoichiometry, kinetics and thermodynamics. Process dependent changes in the products can be transferred to a reaction model. Based on a stoichiometric balance, the dehydration of LPM can be described by a Monod-function for temperatures of 180, 200, 220 and 240°C. The rate of dehydration can be correlated to the still eliminable hydrogen and oxygen concentrations in the coal. The activation energy is 71,1 kJ mol^-1. For calorimetry, a new experimental setup at a heat flow DSC is developed. Measurements confirm the exothermic nature of HTC. For carbonization of LPM (daf = dry and ash free) the heat of reaction is about (-660 +-3 J g_daf^-1. A theoretical estimation of this value by mass and energy balances overestimated the heat of reaction more than sixfold. Considering volatile products of HTC, the calculated heat of reaction (-922 J g_daf^-1) is in the range of the measured value. Investigations of reference biomasses show significant differences in the thermal profiles and the resulting heat of reactions (-841 up to -281 J g_daf^-1) being influenced by the oxygen content of the reactant. A mixture of biomass model compounds shows a similar heat of reaction than real LPM (within 10 %). In summary, the process flow and the heat of reaction can be merged in the reaction modell.

In a 0.102 m ID bubble column, various techniques for flow regime identification based on pressure fluctuation measurements were applied. Most experiments were carried out for the system tap water/nitrogen at ambient pressure. Additionally, the pressure was increased up to 2 MPa, the viscosity was varied up to 16 mPa s using ethylene glycol and carboxymethyl cellulose solutions, respectively, and some experiments were performed with toluene. Four flow regimes could be identified: intermittent, homogeneous, transition and heterogeneous flow. Intermittent flow occurs at too low gas flow for continuous bubble formation at all sparger holes (uG < 0.02 m s-1 at ambient pressure, We < 2). The main flow transition (homogenous to transition) was observed at about 0.045 m s-1. Finally, heterogeneous flow was fully developed at uG > 0.10 m s-1. Since coalescence starts at the top, the critical transition velocities depend slightly and systematically on the axial position of the pressure sensor and on the clear liquid height. The critical velocities decrease with the viscosity and they strongly increase with the pressure. There are systematic differences between the various methods and not all transitions can be detected with all methods applied: standard deviation, fractal analysis, Kolmogorov entropy KE and power spectral density (PSD). KE most accurate way of its determination shows a sharp minimum at the main flow transition. The fractal analysis shows a minimum but at a clearly lower gas velocity. Therefore, it must indicate a different reorganisation of the system. Both methods require a variation of the gas velocity in order to locate the minimum. Standard deviation and PSD, less accurate than KE are more convenient since the value obtained in a single measurement could be compared to a threshold. The use of the PSD for flow regime identification is a new approach developed in this study. The homogeneous regime is characterized by a clear zone with no peak. The peaks observed in other flow are related to specific pressure sources: The bubbles formation at the sparger was associated with peaks at 39 s-1 while bubbles oscillations during the rise was related to about 35 s-1. Large bubbles eruption at the surface produces peaks at about 13 s-1 and liquid bed fluctuations cause strong signals at about 4 s-1. The peaks detection threshold and the identification of the pressure sources open a door to the direct detection of the prevailing flow regime., In einer Blasensäule (Durchmesser 0,102 m) wurden verschiedene Methoden für die Identifizierung der Strömungsart auf der Basis von Druckschwankungen untersucht. Die meisten Experimente wurden mit dem System Leitungswasser/Stickstoff bei Umgebungsdruck durchgeführt. Zusätzlich wurde der Betriebsdruck bis zu 2 MPa erhöht, die Viskosität wurde mit Ethylenglykol- und Carboxymethylcellulose-Lösungen auf bis zu 16 mPa s erhöht; einige Experimente wurden auch mit Toluol durgeführt. Vier Strömungsbereiche konnten identifiziert werden: intermittierende, homogene, Übergangs- und heterogene Strömung. Die intermittierende Strömung tritt auf, wenn der Gasdurchsatz zu niedrig für die kontinuierliche Blasenbildung an jedem Loch des Gasverteilers ist (bei Umgebungsdruck uG < 0.02 m s-1 ,Weo < 2). Der Haupt-Übergang (homogene zum Übergangsbereich) wurde bei ca. 0.045 m s-1 beobachtet. Die heterogene Strömung war völlig entwickelt bei uG > 0.10 m s-1. Da die Blasenkoaleszenz oben beginnt, ist die kritische Übergangsgeschwindigkeit (uG,crit) leicht und systematisch von der axialen Position der Sensoren und der Flüssigkeits-Füllhöhe abhängig. Die uG,crit sinken mit der Viskosität und steigen mit dem Betriebsdruck. Es gibt systematische Unterschiede zwischen den Methoden und bestimmte Übergangspunkte können nicht mit allen Methoden identifiziert werden: Die Kolmogorov-Entropie (KE), präziseste Methode zeigt ein scharfes Minimum am Hauptübergangspunkt. Die fraktale Analyse zeigt ein Minimum, aber bei kleinerer Gasgeschwindigkeit; es sollte sich daher um eine andere Reorganisation des Systems handeln. Beide Methoden benötigen eine Variation von uG. Standardabweichung und SLD sind weniger präzise als KE, aber praktischer, da der in einer Messung erhaltene Wert mit einem Schwellenwert verglichen werden kann. Die Benutzung der SLD für die Strömungs-Identifizierung ist ein neuer Ansatz dieser Arbeit. Der homogene Bereich ist durch einen peakfreien Bereich gekennzeichnet. Die beobachteten Spitzen können bestimmten Ursachen zugeordnet werden: Die Bildung Blasen am Gasverteiler kann Frequenzen um 39 s-1 zugeordnet werden, während die Oszillation Blasen beim Aufstieg Frequenzen um 35 s-1 zugeordnet ist. Das Platzen großer Blasen an der Oberfläche erzeugt Signale bei 13 s-1 und Flüssigkeitsschwankungen verursachen starke Signale bei 4 s-1. Die Schwellenwerte und die Erkennung der Ursachen der Druckschwankungen eröffnen die Möglichkeit der direkten Erkennung des Strömungsbereichs.

Diese Dissertation befasst sich mit den Herausforderungen des Kaltstarts in einem Brennstoffzellenantriebsstrang. Ziel der Dissertation ist der Gewinn grundlegender wissenschaftlicher Erkenntnisse bezüglich der Weiterentwicklung des Thermo- und Energiemanagements in dem Brennstoffzellenantriebsstrang. Die Untersuchung wird anhand der Gesamtfahrzeugsimulation eines Antriebstrangmodells durchgeführt, wobei dieses ein speziell entwickeltes Mehrphasen-Brennstoffzellenstapelmodell beinhaltet. Das für diese Arbeit erstellte Brennstoffzellenstapelmodell verfügt über die Möglichkeit einer 2D Ortsauflösung und kann Zweiphaseneffekte simulieren, die während der Kaltstartbetriebsbedingungen auftreten können. Diese Effekte beinhalten: die Sorption in der Dreiphasenzone zwischen der Membran und der Katalyseschicht; die Kondensation, Vereisung und Verdampfung in den porösen Schichten; die Zweiphasenströmung in den Gaskanälen. Der Brennstoffzellenstapel wird mit der akausalen Modellierungsprache Modelica modelliert und mit Froststartexperimenten validiert. Das Brennstoffzellenstapelmodell wird anschließend in ein Brennstoffzellenfahrzeugmodell integriert, welches den Zusatzenergieverbrauch einschließlich der Fahrgastraumheizung mitberücksichtigt. Eine Rapid-Warmup-Operation-Methode wird als eine wirksame Froststartmethode eingeführt, um die Stapeltemperatur innerhalb von 30s von -20°C auf +5°C zu erhöhen. Das Gesamtfahrzeugmodell simuliert den Froststart und einen anschließenden Artemis-Fahrzyklus bei -20°C Umgebungstemperatur. Die Energieverbrauchsstatistik und Exergieanalyse zeigen, dass der ineffiziente Energieverbrauch hauptsächlich in der Stadtphase nach dem Froststart stattfindet. Der Brennstoffzellenstapel erreicht über den gesamten Fahrzyklus bereits eine Exergieeffizienz nahe 73%, auch wenn er für den größten irreversiblen Verlust verantwortlich ist. Die Statistik zeigt, dass die Ineffizienz wegen der thermischen Massen der Subsystem-Komponenten entsteht, insbesondere aufgrund der Anzahl von vielen Wärmeübertragern in den Kühlkreisläufen. Die Verbesserung der Energieeffizienz sollte sich daher auf die Niedriglastfälle konzentrieren, um die thermische Trägheit der Subsystem-Komponenten zu reduzieren. Die in dieser Arbeit entwickelten Modelle stellen eine Methodik für solche weiteren Thermomanagement- und Energiemanagement-Untersuchungen dar., This dissertation deals with the cold start challenge in a PEM fuel cell powertrain. The aim of the dissertation is to draw basic scientific suggestions for the development of thermal and energy management. The investigation is done by drive cycle simulations of a fuel cell power train model which incorporates a multiphase fuel cell stack model specifically developed for such purpose. The specially established fuel cell stack model features the capability of 2D discretization and can simulate two phase effects that are prone to occur during cold start. These effects include: the sorption process in the triple-phase zone between the membrane and the catalyst layer; the condensation, freezing and evaporation in the porous layers; the two phase flow in the gas channels. The fuel cell stack is modeled with the acausal modeling language Modelica and validated with freeze start experiment data. The stack model is then incorporated into a full hybrid fuel cell vehicle model, in which the auxiliary energy consumption including cabin heating is taken into consideration. A Rapid-Warmup-Operation method is introduced as an effective freeze start method to quickly elevate stack temperature from -20°C to +5°C within 30s. The vehicle model simulates the cold start and Artemis drive cycle at -20°C ambient condition. The energy consumption statistics and exergy analysis show that the inefficient energy consumption occurs mainly in the city stage shortly after the successful freeze start. Despite contributing the largest irreversible loss, the fuel cell stack reaches a good exergy efficiency of nearly 73% throughout the entire drive cycle. The statistics show that the inefficiency is mainly due to the amount of thermal mass of the other subsystem components, especially the heat exchangers in the cooling circuits. The energy efficiency improvement should be thus focused in the low power demand stages, with the specific aim to minimize the thermal inertia. The established models offer a methodology for such thermo- and energy-management investigations.

Im Gegensatz für die biotechnologische Produktion von L-Lactat, gibt es noch kein industrielles Verfahren zur Herstellung von D-Lactat mit agrarischen Reststoffen. Der Fokus dieser Arbeit lag daher auf der Entwicklung eines biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung von D-Lactat auf der Basis von erneuerbaren Ressourcen. Für die Umsetzung dieses Ziels sollte zuerst nach entsprechenden Biokatalysatoren gescreent werden, die die Fertigkeiten haben, D-Lactat in hoher Konzentration, Ausbeute und hoher optischer Reinheit zu produzieren. Anhand dieser Kriterien wurden zwei Sporolactobacillus Spezies für eine biotechnologische Anwendung charakterisiert. Dazu wurden die allgemeinen Kultivierungsbedingungen untersucht sowie die optimale Temperatur für die D-Lactatproduktion bestimmt. Im Folgenden sind die im Hauptkulturmedium enthaltenden Stickstoffquellen sowie Spurenelemente und Salze qualitativ und quantitativ auf ihre Relevanz für die Kultivierung getestet worden. Darüber hinaus wurde der Substrattoleranzbereich mit Hilfe verschiedener Glucosestartkonzentrationen für die Bakterien ermittelt und verschiedene Zucker wurden auf die Nutzbarkeit zur D-Lactatproduktion untersucht. Anhand dieser Erkenntnisse wurden darauffolgend kostengünstige, in Deutschland verfügbare Ersatzstoffe auf ihre Eignung zur D-Lactatherstellung getestet. Weiterhin wurden zur Prozessoptimierung die optimalen pH-Werte der Bakterien zur Steigerung der Produktionsgeschwindigkeit durch Experimente im Bioreaktor definiert und Fermentationsstrategien im Batch- bzw. Fed-Batch-Verfahren, mit Calciumcarbonat sowie Ammoniakwasser als Neutralisationsmittel, entwickelt. Die Verwendung von Ammoniakwasser führte zudem zu einer Produktinhibition der Bakterien infolge der steigenden Konzentration an nicht-dissoziierter Säure während der Kultivierung bei konstanten pH-Wert. Dieses Problem konnte durch einen produktkonzentrationsabhängigen pH-Shift gelöst werden, wodurch die Gesamtproduktivität gesteigert werden konnte. Zusätzlich konnte die Prozessstabilität und die Gesamtproduktivität durch Zellimmobilisierung, unter Zuhilfenahme von Lentikats(R), deutlich erhöht werden. Letztendlich konnte aus der Kombination der gewonnenen Erkenntnisse ein kostengünstiger Fermentationsprozess auf der Grundlage von agrarischen Restoffen zur Produktion von D-Lactat realisiert werden., In contrast to the biotechnological production of L-lactic acid, there is no existing industrial procedure for the manufacture of D-lactic acid based on renewable resources. For this reason, the aim of this study was to develop a procedure for biotechnological production of D-lactic acid on the basis of agricultural residual materials. In the very first step appropriate biocatalysts were screened, which are capable to produce optically pure D-lactic acid in a high amount. Furthermore, two Sporolactobacillus species were selected and characterized for a potential biotechnological application. For this purpose, general cultivation conditions were evaluated and the optimal growth temperature of the bacteria was determined. Moreover, the ingredients of the culture medium were analyzed for their importance of D-lactic acid biosynthesis. Therefore, regarding to the compounds of the culture medium, the nitrogen sources, trace elements and salt ingredients were tested in a qualitative and quantitative manner. Additionally, the optimal initial Glucose concentration was specified and different sugar species were investigated for their usability by the bacteria. Based on these results, cost-effective sugar substitutes were selected and examined for their suitability for D-lactic acid production. Furthermore, the productivity of the bacteria could be increased by determining their optimal pH-value and by the development of batch and fed batch fermentation strategies with calcium carbonate and ammonia as neutralizing agents. Unfortunately, using ammonia as neutralizer, led to an inhibition due to the increase of undissociated acid during the fermentation at constant pH. Finally, this issue could be circumvented by a D-lactic acid concentration dependent pH-shift. In Addition, the bacterial lag-phase could be eliminated and the productivity was increased by cell immobilization, when using a polyvinyl alcohol matrix (Lentikats (R)) for bacteria entrapment. Eventually, combining all results, a high yielding procedure for the production of D-lactic acid on the basis of renewable resources could be realized using ammonia as neutralizing agent.

Mit einer Jahresproduktion von mehr als 3,6 Millionen Tonnen zählt n-Butanol (Butanol) zu einer der wichtigsten Commodities weltweit. Es wird großtechnisch aus Propylen mittels der Oxo-Synthese gewonnen. Demgegenüber steht Ethanol mit einer Produktionsmenge von 85 Mio. t/a, im größten Fermentationsprozess der Welt hergestellt, kostengünstig und in großen Mengen zur Verfügung. Aufgrund schwindender fossiler Ressourcen und der zusätzlichen Verknappung von Propylen durch Schiefergas-Fracking werden alternative Herstellungsmethoden für Butanol immer wichtiger. Einer dieser Methoden stellt die Guerbet-Reaktion dar, bei der Ethanol an heterogenen Katalysatoren zu Butanol kondensiert. In dieser Arbeit wurden heterogene Katalysatoren für eine diskontinuierliche sowie kontinuierliche Reaktionsführung der Guerbet-Reaktion von Ethanol zu Butanol entwickelt. Dafür wurden zunächst infolge der Ergebnisse von Screeningversuchen, unter vorher etablierten Standardbedingungen, Hydroxyapatite (HAP), Hydrotalcite (HT), Magnesiumoxide (MgO) und Aluminiumoxide (Al2O3) intensiver studiert. Vor allem HT (SBuOH=55-68%) und selbst-hergestellte MgO (SBuOH = 72%) erzielten vielversprechende Ergebnisse. Anschließend wurden die Trägermaterialien HAP, HT-Mg70, MgO-425°C und Al2O3 zur Herstellung von Metallträgerkatalysatoren verwendet, die dann umfassend getestet wurden. Die Ergebnisse der Versuche verdeutlichten, dass mit geringen Mengen eines Metalls im Vergleich zu den reinen Trägermaterialien höhere Umsätze und Butanol-Selektivitäten erreicht werden können. Des Weiteren wurde exemplarisch die Langzeitstabilität für 1% Co/Al2O3 und 10% Ni/Al2O3 in Repeated-Batches sowie im Konti-Reaktor untersucht, die sich mit konstanten Umsätzen und Selektivitäten im Konti-Reaktor für beide Katalysatoren als sehr gut herausstellte. Infolgedessen erfolgte mit den Katalysatorsystemen eine Optimierung, die besonders die große Auswirkung der Katalysatorreduktion auf die Ergebnisse der Reaktion zeigte. Anschließend wurde der Einfluss verschiedener Reaktionsparameter im Batch- und Konti-Reaktor auf die Reaktion studiert, um den Umsatz sowie die Butanol-Selektivität zu steigern. Zusätzlich wurden auch Versuche zum Mechanismus und des Reaktionsnetzwerkes der Guerbet-Reaktion durchgeführt, wofür verschiedene Intermediate, Nebenprodukte und Butanol als Edukte im Batch-Reaktor eingesetzt wurden. Die Ergebnisse der Experimente deuteten auf einen mehrstufigen Mechanismus der Reaktion von Ethanol zu Butanol hin., n-Butanol (Butanol) is one of the most important commodities worldwide and is used mainly as a solvent. The majority of the annual 3.6 million tons is produced via the oxo process from propylene. On the other hand ethanol is manufactured in the world largest fermentation process from carbohydrates (85 mio. t/a) and as a consequence available in large quantities at low costs. Dwindling fossil resources and the shortage of propylene because of excessive shale gas fracking have attracted great interest in alternative processes for the production of butanol. On of such processes is the Guerbet-reaction by which ethanol is condensed over heterogeneous catalysts to butanol. In this work different active heterogeneous catalysts were developed for the discontinuous and continuous Guerbet-reaction of ethanol to butanol. Due to the results of screening experiments performed under previously established standard reaction conditions in a batch reactor hydroxyapatite (HAP), hydrotalcite (HT), magnesium oxides (MgO) and aluminum oxides were studied more intensively. In particular HT (SBuOH = 55-68%) and synthesized MgO (SBuOH = 72%) showed high selectivities to butanol. Subsequently HAP (Sigma-Aldrich), HT-Mg70 (Sasol), MgO-425°C (synthesized) and Al2O3 (Sasol) were used as catalysts supports to prepare metal supported catalysts which were then tested in a batch and a continuous reactor. The results indicated that in comparison to the plain catalyst supports already small amounts of supported metal (1 wt%) enhance the conversion and the selectivity to butanol. Furthermore the long-term stability was tested for 1% Co/Al2O3 and 10% Ni/Al2O3 in repeated-batches and a continuous reactor. In particular a good stability was achieved in the continuous reactor because of constant conversions and selectivities. Therefore both catalysts were used for a catalyst optimization by varying the preparation method. These experiments demonstrated the great effects of the catalyst reduction on the results of the Guerbet-reaction. Following the development of active catalysts the influence of various reaction parameters on the Guerbet-reaction were studied to further increase the conversion and selectivity to butanol. In addition experiments for the elucidation of the mechanism and the reaction network were performed by using reaction intermediates, by-products and butanol as starting materials. The results indicated a multi-step mechanism in the Guerbet-reaction of ethanol to butanol.

Filamentöse Pilze besitzen die Eigenschaft, Proteinmengen im g/L-Maßstab zu sekretieren. Aufgrund ihrer einfachen Handhabung stellen sie daher interessante Organismen für die biotechnologische Produktion von Proteinen dar. In dieser Arbeit wurde der rote Brotschimmel Neurospora crassa als Produktionswirt für heterologe Proteine verwendet. Hierbei handelt es sich um einen etablierten Modellorganismus, weswegen viele molekulare Werkzeuge für seine gentechnische Manipulation zur Verfügung stehen und somit die Produktion auf einfache Art und Weise erreicht werden kann. Als Modellproteine wurden zwei Antikörperfragmente verwendet. Ziel dieser Arbeit war die Sekretion des Produktes in Form eines Fusionsproteins mit einem pilzeigenen Protein, hier der Glucoamylase, welches als Carrier fungiert. In der ersten Phase dieser Arbeit wurden Produktionsstämme generiert und anhand von Kultivierungen im Schüttelkolbenmaßstab bewertet. Als Carrier-Protein wurde sowohl die vollständige Glucoamylase als auch eine gekürzte Form verwendet. Es wurden verschiedene Promotoren, genetische Hintergründe und eine unterschiedliche Codon usage des Antikörperfragment-Gens miteinander verglichen. Der kritische Schritt bei der Stammerzeugung war die Beseitigung extrazellulärer Proteaseaktivität. Dazu wurden zwei Strategien verglichen: die Deletion eines Transkriptionsfaktorgens und die Deletion von mehreren Proteasegenen, welche zuvor identifiziert wurden. In der zweiten Phase wurde schrittweise ein Scale-Up auf ein Arbeitsvolumen von 9 L durchgeführt, das Wachstum charakterisiert, der Prozess optimiert und verschiedene Verfahrensweisen verglichen. Hierfür wurde zunächst ein paralleles Bioreaktorsystem (1 L) verwendet. Es wurde festgestellt, dass das verwendete Minimalmedium eine zu geringe Konzentration der Stickstoffquelle enthält. Nach der Medienoptimierung wurde gezeigt, dass der pH-Wert die verbliebene Proteaseaktivität im Kulturüberstand beeinflusst und pH 6,5 als optimaler pH-Wert für die geringste Aktivität identifiziert. Durch die Verwendung von Komplexmedium anstatt von Minimalmedium konnten sowohl die Ausbeute (15 mg/L) als auch die Wachstumsgeschwindigkeit erhöht werden. Die Ausschaltung mehrerer Proteasegene führte zu höheren Produktmengen als die Deletion des Transkriptionsfaktorgens und in beiden Medien zur vollständigen Unterdrückung der Proteaseaktivität. Das Produkt wurde abschließend mittels Affinitätschromatographie isoliert, zeigte aber nur eine geringe Aktivität auf., Filamentous fungi have the capacity to secrete large amounts of proteins (order of g/L). Due to their simple handling they are attractive organisms for the biotechnological production of proteins. In this thesis, the red bread mold Neurospora crassa was engineered for the production of heterologous proteins. This organism has been used as a model organism for decades which is why many tools are available for its genetic manipulation. It therefore provides a suitable system for protein production. Two antibody fragments were used as model proteins. The aim of the project was to achieve secretion of the protein of interest fused to an endogenous fungal carrier protein, which in this case was the glucoamylase. In the first phase of this project, production strains were generated and the production evaluated in shaking flask scale. Both the full enzyme and a truncated version of the glucoamylase were used as carrier proteins. Different promoters, genetic backgrounds and two types of codon usage were compared. The crucial step in the generation of the production strains was the elimination of the extracellular protease activity in the culture supernatant. For this purpose, two strategies were compared: the deletion of a transcription factor gene and the deletion of several protease genes, which were identified beforehand. In the second phase, an incremental scale-up was performed up to a working volume of 9 L, the growth of the fungus was characterized, the process was optimized, and different modes of operation were compared. For the optimization, a parallel bioreactor system (1 L) was used initially. Thereby, an insufficient concentration of the nitrogen source was determined in the used minimal medium. After optimization of the medium it was shown that the remaining protease activity in the culture supernatant is influenced by the pH value of the medium, with the lowest activity at pH 6.5. By cultivating in complex medium instead of minimal medium, both the yield (15 mg/L) and the growth rate were increased. Compared to the deletion of a transcription factor gene, the deletion of multiple protease genes led to higher product yields and the complete elimination of protease activity in both media. Finally, the product was isolated via affinity chromatography although only a small amount showed activity.

Pseudomonas aeruginosa is a multi-drug resistant opportunistic human pathogen that produces virulence factors. Among those, the blue phenazine compound pyocyanin plays a crucial role in lung infection by P. aeruginosa. As pyocyanin induces the formation of reactive oxygen species, the bacterium must have developed some intracellular protection machinery against this compound. In previous studies, the proteins PA0803, PA1353 and PA4641 were identified as pyocyanin resistance proteins. These proteins bind pyocyanin and shield it inside the bacterial cell. They belong to the family of beta-alpha-beta-beta-beta-module containing proteins which are generally involved in detoxification of small toxic molecules. In this study, 22 beta-alpha-beta-beta-beta-module proteins were identified in P. aeruginosa and classified according to highly conserved residues in their binding pockets. A selection of these proteins was characterized by X-ray crystallography, biochemical, biophysical and microbiological methods. Ergothioneine is a sulfur derivative of histidine betaine mainly produced by Actinobacteria and Basidiomycota. It has versatile functions as an antioxidant, metal chelator and it is involved in the biosynthetic reaction of lincomycin A. Humans are not able to biosynthesize ergothioneine, but resorb it from their diet and store it using a specific ergothioneine transporter ETT. Ergothioneine and its transporter are important players in human physiology. Disorders in ergothioneine homeostasis are for instance involved in Crohn’s disease and induce oxidative stress. In order to investigate mycobacterial ergothioneine biosynthesis, the SAM-dependent methyltransferase EgtD, the sulfoxide synthase EgtB and the Ntn hydrolase EgtC were examined in this study using X-ray crystallography, biophysical and biochemical approaches., Pseudomonas aeruginosa ist ein multi-resistentes, opportunistisches Humanpathogen, welches Virulenzfaktoren produziert. Unter diesen befindet sich auch das blaue Phenazin Pyocyanin, das eine wichtige Rolle in durch P. aeruginosa verursachten Lungeninfektionen spielt. Da Pyocyanin die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und Radikalen induziert, muss das Bakterium intrazelluläre Schutzmechanismen gegen diese Substanz entwickelt haben. In dieser Arbeit vorausgegangenen Studien wurden die Proteine PA0803, PA1353 und PA4641 als Pyocyanin-Resistenzproteine identifiziert. Diese Proteine binden Pyocyanin und schirmen es vom Innern der bakteriellen Zelle ab. Sie gehören zur Familie der beta-alpha-beta-beta-beta Modul-Resistenzproteine, die allgemein in Detoxifizierungsmechanismen verschiedener kleiner toxischer Moleküle involviert sind. In dieser Arbeit konnten 22 beta-alpha-beta-beta-beta-Modul-Resistenzproteine in P. aeruginosa identifiziert und anhand von hochkonservierten Aminosäuren in ihren Bindungstaschen klassifiziert werden. Eine Auswahl aus diesen Proteinen wurde im Rahmen dieser Arbeit mit röntgenkristallographischen, biochemischen, biophysikalischen und mikrobiologischen Methoden charakterisiert. Ergothionein ist ein Schwefelderivat von Histidinbetain und wird hauptsächlich von Actinobakterien und Ständerpilzen (Basidiomycota)produziert. Die Substanz erfüllt vielfältige Funktionen als Antioxidans, Metallchelator und als Aktivator in der Lincomycin A-Biosynthese. Menschen sind nicht in der Lage, Ergothionein selbst herzustellen, sondern nehmen es mit der Nahrung auf und lagern mit Hilfe des Ergothionein-Transporters ETT in bestimmten Geweben. Ergothionein und sein Transporter spielen eine wichtige Rolle in der Physiologie des Menschen. Störungen der Ergothioneinhomöostase induzieren oxidativen Stress und finden sich unter anderem bei Patienten, die an Morbus Chron leiden. Um die mycobakterielle Ergothioneinbiosynthese zu verstehen, wurden die S-Adenosylmethionin-abhängige Methyltransferase EgtD, die Sulfoxidsynthase EgtB und die Ntn Hydrolase EgtC in dieser Studie mittels Röntgenkristallographie, biophysikalischen und biochemischen Methoden untersucht.

Der Einsatz dieser kurzkettigen Glycoside erstreckt sich breitgefächert von medizinischen Therapeutika und Pharmaprodukten bis hin zu Kosmetik- und Lebensmittelprodukten. Im Fokus dieser Arbeit stand die Synthese von Fructooligosacchariden (FOS) durch eine Fructosyltransferase (FTF) aus Bacillus subtilis NCIMB 11871 und eine ß-Fructofuranosidase (ßFF) aus Aspergillus niger AB1.13. Die Aufarbeitung der nativ sekretierten FTF wurde durch geringe FTF-Konzentrationen in großen Kulturvolumina und die Anreicherung von Levan erschwert. Eine 50 kDa große FTF konnte isoliert werden. Die Gensequenz wurde als sacB identifiziert und in E. coli kloniert. Das Zellextrakt beinhaltete bis zu 370 U/ml der rekombinanten FTF. Hohe Konzentrationen an inclusion bodies konnten isoliert und als einheitliche und hochreine FTF-Charge renaturiert werden. Das während der Dialyse ausgefallene Protein konnte gut gelagert und auch mehrfach zur Renaturierung eingesetzt werden. Die spezifische Aktivität wurde gegenüber den Zelllysatüberständen mit bis zu 264,9 U/mg um das 100-fache gesteigert. Für die nativ sowie die rekombinant produzierten FTFs wurden die kinetischen Parameter ermittelt. In Gegenwart guter Akzeptoren, wie Xylose oder Galactose, wurde die Polymer-bildung und die Hydrolyse zugunsten einer höheren Transfructosylierungsaktivität reprimiert. Die Immobilisierung mittels Adsorption an Bentonit, Na-Bentonit und Hydroxylapatit sowie der Geleinschluss in Alginat hatten einen stark aktivierenden Einfluss auf die Transferge-schwindigkeit, so dass der Transfructosylierungsanteil von 35 % für die freie recFTF auf 50 % mit Bentonit und 72 % mit Hydroxylapatit bzw. Alginat anstieg. Die Annahme, dass die Ionen der Trägerstruktur eine aktivierende Wirkung auf die Transferaseaktivität haben, wurde durch Versuche mit den freien Ionen Ca2+, Mg2+, Al3+, Fe2+ und Fe3+ bestätigt. Eine trägervermittelte Rückfaltung mit Hydroxylapatit zeigte deutlich höhere Ausbeuten an aktivem Enzym als ohne die Zugabe des Adsorbens. Die rekombinant produzierte ß-Fructofuranosidase Suc1 wurde enzymkinetisch charakterisiert und zur Bildung neuartiger FOS verwendet. Beim Einsatz der Saccharosederivate Mannosyl-, Galactosyl- und Xylosylfructosid entstanden Inulintyp-FOS mit unterschiedlichen Pyranosylköpfen. Diese zielgerichtete Synthese macht hohe Ausbeuten von neuartigen 1 Kestose- und 1-Nystosederivaten möglich. Das Einsatz-spektrum wird jedoch durch die hohe Substrat- und Akzeptorspezifität einschränkt., The use of these short chain glycosides ranges considerably from medical drugs and pharmaceutical products to cosmetics and food products. This research was focused on the synthesis of fructooligosaccharides (FOS) by a fructosyltransferase (FTF) from Bacillus subtilis NCIMB 11871 and a ß-fructofuranosidase (ßFF) from Aspergillus niger AB1.13. The recovery of the secreted native FTF was hindered by low enzyme concentrations in large volumes of supernatant and the accumulation of viscous levan. The isolated fructosyltransferase was determined with a molecular weight of 50 kDa. The gene sequence was identified as sacB and cloned into E. coli. The cell extract contained up to 370 U/ml of recombinant FTF. High concentrations of inclusion bodies were isolated and refolded as a uniform and highly purified FTF. During dialysis precipitated protein can be stored and recycled for the refolding. The specific activity increased up to 264.9 U/mg by a factor of 100 compared to the cell extract supernatant. The kinetic parameters were determined for the native and the recombinant produced FTFs. The deceleration of polymer formation and hydrolysis by addition of good acceptors such as xylose or galactose, causes an increasing transfructosylation activity.The immobilization by adsorption on bentonite, Na-bentonite and hydroxyapatite as well as the gel inclusion in alginate increase the transfructosylation velocity. Hence the transfructosylation ratio of 35 % for the free recFTF raised up to 50 % with bentonite and to 72 % with hydroxyapatite/alginate. Experiments with the free ions of Ca2+, Mg2+, Al3+, Fe2+ and Fe3+ confirmed an activating effect on the transferase velocity of immobilized FTF. A carrier-mediated refolding with hydroxyapatite showed higher yields of active enzyme than without the adsorbens addition. The recombinant ß-fructofuranosidase Suc1 was characterized and has been used to synthesize novel FOS. By using the sucrose derivatives mannosyl-, galactosyl- and xylosylfructoside inulin-type FOS with various pyranosyl-heads were obtained. A tailor-made synthesis of novel 1-kestose and 1 nystose derivates enables very high yields, but the high specificity of substrates and of acceptors limits the range of products.

Um die für eine Verarbeitung aufgeschmolzener Schokoladenmassen nötigen Fließeigenschaften zu erhalten, wird der Emulgator Sojalecithin eingesetzt. Dessen Phospholipide lagern sich an die Oberflächen der Feststoffe an und reduzieren die freie Grenzflächenenergie. Immobilisierte Kakaobutter wird freigesetzt, steht nun für das Fließen zur Verfügung und bewirkt eine niedrigere Viskosität bei gleichem Gesamtfettgehalt. Zudem werden die interpartikulären Wechselwirkungen reduziert, die dadurch entstehende Fließgrenze verringert sowie die Partikel homogen verteilt. Bisher erfolgen Auswahl, Menge und Zugabezeitpunkt der Emulgatoren jedoch nur aufgrund von Erfahrungen. Die Zusammenhänge zwischen den Eigenschaften der Feststoffoberflächen und dessen Veränderungen bei der Schokoladenherstellung, insbesondere während der Zerkleinerung, sind bislang nicht bekannt. In dieser Arbeit wurden daher Oberflächentopographien und -adhäsivitäten mittels Rasterkraftmikroskopie untersucht, um Erkenntnisse über die Emulgatoranlagerung und Affinität zu verschiedenen Oberflächenbereichen zu erlangen. Dazu wurde zunächst der Einfluss unterschiedlicher Zerkleinerungsarten auf die Oberflächen und resultieren Eigenschaften von Modellsuspensionen bestimmt. Die Adhäsivitätsverteilung korrelierte mit den lokalen Topographien und der Art der Zerkleinerung. Weiterhin stimmten die Fließeigenschaften und Fettimmobilisierung sehr gut mit diesen Ergebnissen überein. Die mit der Walze zerkleinerten Partikel zeigten die höchste Fettfreisetzung und die Suspension eine entsprechend geringste Viskosität. Zudem wurde eine einheitliche Adhäsivitätsverteilung ermittelt, die weniger stark von der Topographie abhängt als bei den anderen Zerkleinerungsarten. Die Walzenzerkleinerung liefert daher sehr gute Partikeleigenschaften in Bezug auf die Herstellung von Schokoladenmassen. Die Wirkungsweise ausgewählter Emulgatoren wurde ebenfalls anhand der Eigenschaften von Modellsuspensionen und der Topographie und Adhäsivität der Feststoffoberflächen untersucht. So konnte die unterschiedliche Wirkung von Soja- und Sonnenblumenlecithin erklärt sowie der Wirkungsmechanismus des Emulgators PGPR näher bestimmt werden. Die Ergebnisse der Grenzflächenbelegung, der Fließeigenschaften, der Fettimmobilisierung sowie der AFM lieferten außerdem über eine Testreihe das Emulgatorgemisch, mit dem das aus GMO gewonnene Sojalecithin ohne Verschlechterung der Eigenschaften der Modellsuspension adäquat ersetzt werden kann., In order to obtain the flow properties necessary for processing of molten chocolate masses, the emulsifier soy lecithin is used. Its phospholipids adsorb at the surfaces of solid particles and reduce the free interfacial energy. Immobilized cocoa butter is released from the surfaces, is then available for flow and causes a lower viscosity for the same total fat content. In addition, the interparticle interactions are reduced, lowering the yield value and the particles are more homogeneously distributed in the continuous phase. So far, selection, quantity and time of emulsifier addition are only based on experimental data. The relationship between the properties of solid surfaces and the changes during chocolate production, especially during grinding processes, are not yet known. In this work, surface topographies and adhesion forces were examined using atomic force microscopy (AFM). So, knowledge about emulsifier adsorption and affinity to different surface areas was obtained. Therefore, at first, the influence of different types of grinding on the surfaces and resulting properties of model suspensions had to be determined. The deviation of adhesion forces correlated with the local surface topography and the type of grinding process. Furthermore, the flow properties and amounts of immobilized fat correlated with these results. The particles ground with the roller mill exhibited the highest fat release and, accordingly, the corresponding suspension showed a lower viscosity. In addition, a homogeneous deviation of adhesion forces was determined. It depended less on the topography than the ones from other types of grinding. Therefore, grinding with roller mill produces very good surface properties with respect to the manufacturing of chocolate masses. Based on the properties of model suspensions and topography as well as adhesiveness of the solid surfaces, the mode of function of selected emulsifiers was also investigated. Thus, the different effects of soy and sunflower lecithin could be explained and the mechanism of function of the emulsifier polyglycerol polyricinoleate (PGPR) could be determined in more detail. Via a series of tests, the results of surface coverage, flow properties, immobilized fat content and AFM supplied the emulsifier blend, with which soy lecithin derived from genetically modified organisms may be adequately replaced without deteriorating the properties of the model suspension.

In Zeiten der aufstrebenden personalisierten Medizin ist die schnelle und zuverlässige Generierung von spezifischen Antikörpern von besonderer Bedeutung - sei es zum Zwecke der Forschung, der Diagnostik oder der Therapie. Auch für die Erforschung der Proteomics, der Gesamtheit aller Proteine eines Organismus, sind spezifische Antikörper unabdingbar. Deren Generierung in-vitro wird seit den 1990er Jahren durch das Screenen von Antikörper-Phagenbibliotheken im sogenannten Panning erfolgreich durchgeführt. Verschiedene Faktoren wie die Antigenproduktion, die Antigenaufreinigung, der Verbrauch großer Mengen Antikörper-Phagenbibliotheken und der große manuelle Aufwand führen allerdings zu einer Limitierung dieser Methode im Hochdurchsatz. Aus diesem Grund müssen neue Antikörperselektionsstrategien für Hochdurchsatzverfahren entwickelt und deren Realisierung systematisch getestet werden. In dieser Arbeit wurde die etablierte Panningmethode mit scFv-Phagenbibliotheken auf immobilisiertem Antigen auf ihr Potential bezüglich der Miniaturisierung analysiert. Zusätzlich wurde die Protein-Microarraytechnologie in der Arbeitsgruppe etabliert und ihre Limitierung für die Anwendung im Panning aufgezeigt. Als unabhängige Technologie wurde eine Kombination aus Antikörper-Phagenbibliotheken und Antigen-Zelloberflächenbibliotheken entwickelt und das Potential für Antigen-Antikörper-Interaktionsstudien diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten so wichtige Vorarbeiten geleistet und Trends erfasst werden, die die Vision eines proteomweiten Antikörperrepertoires in Zukunft ermöglichen können., In the era of the upcoming personalized medicine the fast and reliable generation of specific antibodies is of strong interest for research, diagnostics and therapy. Furthermore, for additional investigations on proteomics, the entire set of proteins produced by an organism, antibodies are indispensable, too. The generation of which has successfully been established by in-vitro panning of antibody phage libraries since the early 1990s. However, various factors such as the production of target antigenes, their purification, the need of large amounts of antibody phage libraries, and the laborious process set limits to the method. Thus, new antibody selection strategies for high throughput generation of antibodies need to be developed and evaluated concerning their feasibility. In this study the established panning method with scFv-phage libraries on immobilized antigene was systematically analyzed with regard to its miniaturization scaling potential. In addition, epoxysilane based protein microarrays were established in the research group and their limits for the use in pannings were identified. As an independent technology, combinations of antibody phage display with antigenes displayed on Escherichia coli surfaces were tested and their potency as high throughput tool in antigen-antibody interaction studies was evaluated. In summary, this study entails important preliminary work and covers trends which allow the realization of a proteome-wide set of antibodies in the future.

Untersuchungen zur Kinetik der Hydrothermalen Karbonisierung wurden an Modellsubstanzen (Cellulose, Xylose, Lignin; einzeln und im Gemisch) und an verschiedenen Biomassen (Landschaftspflegematerial LPM, Laub, Schilf, Rübenblatt) durchgeführt. Eine Mischung der Modellsubstanzen wird nicht wie gleich zusammengesetztes LPM karbonisiert. Bei der Karbonisierung von LPM hat Zitronensäure (0,2 g/L) keinen Einfluss auf die Kinetik; Zusatz von Eisensalzen beschleunigt die Hydrolyse etwas. Rückführung des Prozesswassers führt zur Anreicherung von Kohlenstoff-Verbindungen in der Flüssigkeit und erhöht die Kohleausbeute aus LPM. Bei der Karbonisierung von Cellulose durchläuft die Feststoffausbeute ein ausgeprägtes Minimum; höhere Cellulose-Konzentrationen steigern die finale Kohleausbeute. Dies wird modelliert als Hydrolyse des Eduktes (A) zu gelösten Zwischenprodukten (B), die dann entweder zu Hydrokohle (C) polymerisieren oder zu gelöst bleibenden Folgeprodukten (D) reagieren. Der Konzentrationseinfluss wird durch eine höhere Reaktionsordnung n der Kohlebildung beschrieben. Die Karbonisierung von LPM, Laub und Schilf kann mit einem gleich strukturierten Modell beschrieben werden, z.B n=1,53 für LPM. Für die Biomassen erhält man unterschiedliche finale Kohlenstoffgehalte, was an der Zusammensetzung (u.a. Aschegehalt) liegt. Die Kinetik der Hydrolyse ist substratspezifisch; die Kinetik der Folgereaktionen ist ähnlich., The kinetics of hydrothermal carbonization (HTC) was studied for model compounds (cellulose, lignin, xylose and a mixture) and different types of biomass (soft rush hay SRH, copper beach leaves, reed, sugar beet leaves). A mixture of the model compounds does not react not like SRH of the same composition. Citric acid (0.2 g/L) shows no catalytic effect on the HTC of SRH; iron salts have a weak catalytic effect on the hydrolysis of SRH. Recycling of process water leads to enrichment of dissolved organic carbon and results in higher hydrochar yield from SRH. During the HTC of cellulose, the solids yield runs through a distinct minimum; higher cellulose concentration leads to a higher char yield. This is modelled as the hydrolysis of the solid substrate (A) to dissolved intermediates (B) which then either react to stable dissolved substances (D) or polymerize to hydrochar (C). The product (C) is defined by the maximum carbon content reached. The effect of the substrate concentration is accounted for by a higher reaction order (n=2.25) of hydrochar formation. The same model was used for the HTC of biomass, e.g., n=1.53 for SRH. The maximum carbon content depends on the type of biomass due to different compositions (e.g., ash contents). The kinetics of the hydrolysis reaction is substrate specific; the kinetics of the subsequent reactions is similar.

Botulismus ist eine akute, lebensbedrohliche Erkrankung, ausgelöst durch eine Intoxikation mit Botulinum Neurotoxine (BoNTs), welche von Clostridium botulinum und weiteren Clostridium spp. sekretiert werden. Bisher sind 8 Serotypen (A-H) von BoNT bekannt, von denen Serotyp A, B, E und in seltenen Fällen Serotyp F für den humanen Botulismus verantwortlich sind. Aufgrund ihrer Toxizität wurden BoNTs vom Centers of Disease Control and Prevention (CDC) als potenzielle Biowaffen der Kategorie A klassifiziert. BoNT/A gilt als die giftigste Substanz mit einem LD50 Wert (Letale Dosis) von 1 ng/kg intravenöser und subkutaner Applikation bzw. 3 ng/kg pulmonaler Applikation. Bisherige Therapieansätze beruhen auf einer passiven Immunisierung mit Pferdeantiserum bzw. im Fall von Säuglingsbotulismus mit dem humanen Antikörperpräparat BabyBig. Allerdings sind die Vorräte des Humanpräparates limitiert und die Verwendung von Pferdeantiserum birgt das Risiko einer Hypersensitivitätsreaktion. In dieser Arbeit wird die Generierung neutralisierender Antikörper gegen BoNT/A1 beschrieben. Ausgangspunkt war die Immunisierung eines Makaken mit der leichten Kette von BoNT/A1 und die Generierung einer Antikörpergenbibliothek zur Selektion von BoNT/A1 spezifischer Antikörper mittels der Phagen Display Technologie. Der Antikörper mit der besten Toxin-Neutralisation wurde mittels Germlinization humanisiert. Insgesamt wurden 22 Antikörper selektiert, von denen 7 die Toxizität von BoNT/A1 in ex vivo neutralisierten. Die beste Neutralisation wurde für SEM120‑IIIC1 beschrieben. Durch die Humanisierung von SEM120-IIIC1 wurde der Germinality Index (GI) von insgesamt 87,2 % auf 94,5 % gesteigert. Die Antigenbindung von SEM120-IIIC1 zu BoNT/A1 wurde durch die Humanisierung nicht beeinträchtigt. Die Affinität von SEM120-IIIC1 betrug als scFv-Fc 0,82 nM. Die humanisierte Variante hu8SEM120-IIIC1 besaß eine Affinität von 1,41 nM. Des Weiteren war hu8SEM120-IIIC1 als IgG (1 µg/Dosis) im in vivo Paralyse Assay mit BoNT/A1 (0,4LD50) protektiv. Zusammen mit hu8A1Hc38 stellte sich ein Synergieeffekt ein, bei dem beide Antikörper bei einer Konzentration von 0,25 µg/Dosis die Toxizität von BoNT/A1 vollständig neutralisierten. Dieser Synergieeffekt wurde im in vivo Maus Letalitäts Assay bestätigt, bei dem sämtliche Versuchstiere eine Intoxikation von BoNT/A1 (5MLD50) bei einer Antikörperkonzentration von 2,5 µg/Maus überlebten., Botulism is a life-threatening disease caused by an intoxication of several Botulinum neurotoxins (BoNTs) that are secreted by Clostridium botulinum and certain other Clostridium spp.. To date, there are 8 serologically distinct serotypes (designated A to H) of BoNT known. Four BoNT serotypes (A, B, E and rarely F) are mainly responsible for human botulism. Due to the high toxicity BoNTs are classified as category A agents by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and are among of the six agents with the highest risk of potential use as bioweapons. BoNT/A is the most toxic substance on earth with LD50 values (lethal dose) of 1 ng/kg by the intravenous and subcutaneous routes and 3 ng/kg by the pulmonary route. The current approach for the treatment of botulism is based on passive immunization with equine anti-toxin serum or in case of infant botulism with human anti-botulism immunoglobulines, such as BabyBig. Nevertheless, the use of equine anti-toxin serum may cause hypersensitivity and serumsickness and the human serum stock of BabyBig is limited. In this study, the development of neutralizing antibodies against BoNT/A1 is described. Therefor, a male macaque was immunized with BoNT/A1 (light chain). Afterwords, an immune phage display library was constructed and used for selection of BoNT/A1 specific antibodies. After multi-step panning 22 scFv were selected. Seven antibodies were neutralizing in ex vivo. SEM120-IIIC1 was the most promising candidate for further development and was used for humanization. The human-like nature of this antibody, given by the germinality index (GI), was increased by germlinization from 87.2 % up to 94.5 %. It was shown that the affinity of SEM120-IIIC1 was not significant changed by humanization. The affinity of the macaque antibody as scFv-Fc was 0.82 nM and correlates with the affinity of the humanized antibody hu8SEM120-IIIC1 (1.41 nM). Furthermore, hu8SEM120-IIIC1 was partial protective in vivo (0.4LD50 BoNT/A1) as IgG at 1 µg/dose and a synergistic effect was observed in combination with hu8A1Hc38. Both antibodies are completely protective in vivo against BoNT/A1 at 0.25 µg/dose per antibody. The synergistic effect was clarified using the in vivo mouse lethality assay. Here, all animals treated with BoNT/A1 (5MLD50) survived after medication with 2,5 µg/mouse of hu8SEM120-IIIC1 and hu8A1Hc38.

n-Butanol sowie seine Ester und Ether werden vorwiegend in der chemischen Industrie in Farben, Lacken und Klebern eingesetzt. Außerdem wird es als Zusatz in Kraftstoffen diskutiert. Für eine kostengünstige biotechnische Produktion ist es jedoch notwendig die schon seit langem bestehenden Probleme im strikt anaeroben Prozess zu lösen oder zu umgehen. Dazu gehören die geringe Butanolkonzentration in Kultur (15-21 g/L) sowie die schlechte Abtrennbarkeit des toxischen Produktes aus der Fermentationsbrühe. Außerdem ist ein solcher Prozess nur rentabel, wenn alternative Substrate eingesetzt werden, die nicht mit Nahrungsmitteln konkurrieren. In dieser Arbeit wurden Agrarsubstrate wie Zuckerrübe und lignocellulosehaltiges, hydrolysiertes Weizenkaff erfolgreich zu Butanol und Aceton umgesetzt. Es wurde außerdem mit 2-Butyoctan-1-ol ein geeignetes Extraktionsmittel mit einem Verteilungskoeffizienten von 5 für die in situ-Abtrennung von Butanol aus der Fermentationsbrühe gefunden und erfolgreich eingesetzt., n-butanol as well as his esters and ethers were predominantly used in the chemical industry for colors, lacquers and adhesives. It will also be discussed as a compound in fuels. For an economic biotechnological production it is necessary to overcome long standing existing problems of the strict anaerobic process. These are the low butanol concentration in culture (15-21 g/L) and the difficult separation of the toxic product from the fermentation broth. Additionally such processes are only profitable by using alternative substrates without competition to foods. In this thesis agricultural substrates like sugar beet and lignocellulose containing hydrolyzed wheat chaff was successfully converted to butanol and acetone. With 2-butyloctan-1-ol a suitable extractant with a partition coefficient of 5 was found and successfully used for the in situ recovery of butanol from the fermentation broth.

The objective of the present PhD thesis was the development of an efficient fermentative process for 2,3-butanediol (2,3-BD) production from wood hydrolysates using non-pathogenic microorganisms. In a first step, suitable non-pathogenic strains from different sources were screened for their potential to produce 2,3-BD and a strain improvement by random mutagenesis (UV light) was attempted. The best results were obtained with Paenibacillus polymyxa ATCC 12321 and Bacillus licheniformis DSM 8785. In the shake flask scale batch cultivations were carried out and optimized conditions were found with regard to the following parameters: C-/N-source and concentration, temperature, shaking rate, use of free/immobilized cells. Using the fed-batch cultivation mode and a stepwise addition of nutrients, 2,3-BD production could be increased up to 63.3 g/L (P. polymyxa) and 144.7 g/L (B. licheniformis). Cultivation results were similar on glucose medium, natural and artificial wood hydrolysates. Low amounts of the potential inhibitory compounds present in natural wood hydrolysates showed no negative effect on 2,3-BD production, while higher concentrations led to inhibiting effects. A scale-up to the 3.5 L bioreactor scale was carried out and optimal conditions for temperature, stirring speed and aeration rate were found. For P. polymyxa, an increase in productivity could be obtained using forced pH fluctuations. For B. licheniformis, 2,3-BD synthesis could be increased up to 78.9 g/L (batch) and 127.4 g/L (fed-batch) using 180 g/L initial glucose and 37°C. A successful scale-up to the 45 L bioreactor scale was obtained using the impeller tip speed as scale-up criterion, yielding up to 65.1 g/L 2,3-BD from 154 g/L glucose. The obtained results are the highest 2,3-BD concentrations reported so far using GRAS microorganisms and lie in the same range with data described for risk group 2 strains. B. licheniformis DSM 8785 is a suitable candidate for large scale 2,3-BD production processes., Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines effizienten fermentativen Prozesses für die 2,3-Butandiol (2,3-BD) Bildung aus Holzhydrolysaten unter Einsatz nicht-pathogener Mikroorganismen. Die erste Aufgabe war das Screening nach geeigneten nicht-pathogenen Mikroorganismen aus unterschiedlichen Quellen und deren Untersuchung hinsichtlich 2,3-BD Bildung. Die besten Ergebnisse wurden mit Paenibacillus polymyxa ATCC 12321 und Bacillus licheniformis DSM 8785 erzielt. Während Batch-Kultivierungen im Schüttelkolbenmaßstab wurden Optimierungen hinsichtlich folgender Parameter vorgenommen: C-/N-Quelle und Konzentration, Schüttelgeschwindigkeit, Temperatur, Einsatz von freien/immobilisierten Zellen. Die 2,3-BD Produktion konnte durch Fed-Batch-Kultivierungen mit schrittweise Zugabe von Nährstoffen auf 63.3 g/L (P. polymyxa) bzw. 144.7 g/L (B. licheniformis) erhöht werden. Kultivierungen auf Glucose bzw. natürlichem/künstlichem Holzhydrolysat wiesen ähnliche Ergebnisse auf. Niedrige Mengen der Hemmstoffe zeigten keinen negativen Einfluss auf die 2,3-BD Produktion, während höhere Konzentrationen zu inhibierenden Effekten führten. Bei dem Scale-up der 2,3-BD Produktion zum 3,5 L Bioreaktormaßstab wurden optimale Bedingungen für Temperatur, Rührergeschwindigkeit und Belüftungsrate gesucht. Durch den Einsatz erzwungener pH-Shifts konnte ein Anstieg der Produktivität für P. polymyxa erreicht werden. Mit B. licheniformis wurden bis zu 78,9 g/L 2,3-BD (Batch) und 127,4 g/L (Fed-Batch) von 180 g/L Glucose bei 37°C erzielt. Unter Verwendung der Rührerspitzengeschwindigkeit als Scale-up Kriterium konnte ein gelungenes Scale-up zum 45 L Bioreaktormaßstab durchgeführt werden und die 2,3-BD Produktion konnte auf 65,1 g/L erhöht werden. Die Ergebnisse weisen die höchsten 2,3-BD Konzentrationen auf, die bisher mit GRAS Mikroorganismen erzielt wurden und in der Größenordnung der Risikoklasse 2 Stämme liegen. B. licheniformis DSM 8785 ist für die 2,3-BD Produktion im großen Maßstab geeignet.

In this work the use of ZrO2 and BaTiO3 nanoparticles for the fabrication of thin films and nanocomposites is reported. The nanoparticles were synthesized through the non-aqueous benzyl alcohol route. It is shown that for ZrO2 nanoparticles the material of the reaction vessel and the reaction temperature have a strong influence on their crystal phase composition. Also, the effect of the use of co-solvents during the synthesis of BaTiO3 nanoparticles is shown. Here, the selected co-solvents have a strong influence on their crystallite size. Subsequently to the synthesis, the preparation of stable dispersions through surface modification of the nanoparticles is investigated. It is shown that by using minor amounts of ligand highly stable dispersions of ZrO2 and BaTiO3 can be achieved. Additionally, it is shown that the surface modified nanoparticles could be simply redispersed after induced precipitation. The dispersions were then successfully employed for the fabrication of nanocomposites and thin films. For the nanocomposites, the influence of the change in the surface chemistry on the particle-polymer interface and the properties of the nanocomposites are examined. It is shown that the surface chemistry as well as the embedding procedure of the modified nanoparticles has a strong impact on the mechanical properties of the composite, inducing an increase of up to 12 % for the maximum tensile strength and 11 % for the Young’s modulus, at a particle loading of only 2 wt% ZrO2. As for the thin films, the effect of the choice of ligand, its concentration and the drying procedure on the structure of the thin films is briefly investigated. Furthermore, the implementation of these thin films as a dielectric for capacitors, which are integratable into printed circuit boards, is shown. These capacitors exhibited outstanding dielectric properties, much better than the state of the art integratable capacitor solutions., In dieser Arbeit wird die Verwendung von ZrO2- und BaTiO3-Nanopartikeln zur Herstellung von Nanokompositen und Dünnschichten behandelt. Die Nanopartikel wurden durch die nichtwässrige Benzylalkoholroute synthetisiert. Es wird gezeigt, dass bei der Synthese von ZrO2 die Reaktionstemperatur einen großen Einfluss auf den resultierenden Kristall-Phasenanteil hat. Wobei bei der BaTiO3-Synthese die Verwendung eines Zusatzlösungsmittels die Kristallitgröße der Nanopartikel stark beeinflusst. Als anschließenden Schritt an die Nanopartikelsynthese wird die Herstellung stabiler Dispersionen durch eine Oberflächenmodifizierung der Nanopartikel beschrieben. Es wird gezeigt, dass durch die Zugabe von geringen Konzentrationen der Liganden sehr stabile Dispersionen von ZrO2 und BaTiO3 realisiert werden können. Zusätzlich wird gezeigt, dass die modifizierten Nanopartikel einfach nach einer induzierten Ausfällung redispergiert werden können. Des Weiteren wird die Herstellung von Nanokompositen und Dünnschichten aus diesen Dispersionen gezeigt. Bei den Nanokompositen, wird der Einfluss der Oberflächenchemie der Partikel auf die Polymer-Partikel-Grenzflächenwechselwirkung, und somit auf die Eigenschaften der Nanokomposite, untersucht. Es wird gezeigt, dass die Oberflächenchemie sowie das Einbettungsverfahren der modifizierten Nanopartikel einen starken Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften des Verbundes haben. So wird ein Anstieg der maximalen Zugfestigkeit von bis zu 12 % und des E-Moduls von 11 %, bei einer Partikelbeladung von nur 2 Gew.-% ZrO2, beobachtet. Bei der Herstellung der Dünnschichten wir kurz auf den Einfluss der Wahl der Liganden und deren Konzentration sowie der Schichttrocknung auf die Struktur der Schichten eingegangen. Darüber hinaus wird die Umsetzung dieser dünnen Schichten als Dielektrikum für in Leiterplatten integrierbare Kondensatoren beschrieben. Die Kondensatoren zeigten außerordentliche dielektrische Eigenschaften.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und Charakterisierung von verschiedenen polypeptidhaltigen Strukturen, die auf dem synthetischen Polypeptid Poly(gamma-benzyl-L-glutamat) (PBLG) basieren. Komplexe polypeptidhaltige Strukturen dienen als Modellsysteme zur Nachahmung von Proteinen und deren Selbstorganisation. Zur Herstellung von drei verschiedenen Strukturen wie PBLG-haltige Sternpolymere, Stäbchen Knäuel Blockcopolymere und PBLG-Bürsten wird endfunktionalisiertes PBLG als stäbchenförmiges Modellpolymer benötigt. Die Synthese von PBLG erfolgt über die Nickel-initiierte NCA Polymerisation sowie die amin-initiierte NCA Polymerisation. Es wird PBLG mit definierten Molekulargewichten und engen Molekulargewichtsverteilungen in einer kontrollierten Polymerisation erhalten. Für die Darstellung von Stäbchen-Knäuel Blockcopolymer wird PBLG mithilfe eines bifunktionellen Initiators hergestellt und als Makroinitiator für eine kontrolliert radikalische Polymerisation (NMP) eingesetzt. Mithilfe von GPC und LACCC können wichtige Hinweise auf eine erfolgreiche Synthese von Blockcopolymer gegeben werden. Für die Darstellung von PBLG-haltigen Sternpolymeren und PBLG-Bürsten wird die „Click-Chemie“ als Kupplungsreaktion eingesetzt. Mit zunehmendem Molekulargewicht des PBLG-arms wird die Kupplungseffektivität beeinflusst. Das spezifische Aggregationsverhalten von polypeptidhaltigen Pfropfcopolymeren in Lösung wird mithilfe der CD-Spektroskopie untersucht. Für die Untersuchung des pH-abhängigen Helix-Knäuel Übergangs im wässrigen Medium wird PBLG unter hydrolytischen Bedingungen entschützt und so in die Poly(L-glutaminsäure) (PLGA) überführt. Es wird mit steigendem Polymerisationsgrad der PLGA-Seitenkette sowie mit der Anzahl an kovalent gebundenen Seitenketten eine zunehmende Helizität im Pfropfcopolymer (pH < 4,5) beobachtet. Insgesamt wird gezeigt, dass mit den hier eingesetzten Synthesestrategien polypeptidhaltige komplexe Strukturen realisiert werden können., This thesis deals with the synthesis and characterization of different peptide based structures consisting of the synthetic polypeptide poly(gamma-benzyl-L-glutamate) (PBLG). Polypeptide materials with high-complex structures serve as model systems to mimic complex proteins and their self-assembly phenomena. The synthesis of three different macromolecular architectures like PBLG based star-shaped polymers; rod-coil block copolymers and PBLG based graft copolymers well-defined endfunctionalized PBLG as rigid segment is required. Endfunctionalized PBLG with defined molecular weights and narrow molecular weight distributions is obtained on the one hand by nickel mediated NCA polymerization and on the other hand by amine-initiated NCA polymerization. For the synthesis of rod-coil block copolymers PBLG can be used as a macroinitiator, which is obtained by means of a bifunctional initiator, for a controlled radical polymerization (NMP). From GPC and LACCC measurements important information is derived regarding a successful synthesis of rod-coil block copolymers. The synthesis of PBLG based star-shaped polypeptides and graft copolymers are obtained by “click-chemistry” as coupling reaction. With increasing molecular weight of PBLG-arm the coupling efficiency is influenced. The specific aggregation behavior in solution of polypeptide based graft copolymers is investigated by CD spectroscopy. For investigation of the pH-induced helix-coil transition of polypeptides in aqueous media PBLG is deprotected by hydrolysis to get poly(L-glutamic acid) (PLGA) as hydrophilic segment. With an increasing degree of polymerization of PLGA and also with increasing number of covalent bounded side-chains an increasing helical fraction of graft copolymers (pH < 4,5) is observed. In summary, the chosen synthetic strategies in the present work provide an opportunity to prepare polypeptide based materials with the presented different macromolecular architectures.

In the present work, absorption of pure oxygen (O2) and pure carbon dioxide (CO2) into aqueous emulsions of three different n-alkanes (n-heptane, n-dodecane and n-hexadecane) has been studied in a stirred tank at the stirring speed of 1000 min-1. The interfacial tensions have been measured with a tensiometer using the ring method. Positive spreading coefficients are calculated for all oils but the value for n-heptane is noticeably higher than the values for n-dodecane and n-hexadecane. The full range of oil volume fraction (0-100%) has been covered. Phase inversion (O/W to W/O) occurs at 60-65 % n-dodecane and n-hexadecane as identified with an electrical conductivity sensor, whereas observation of de-emulsification suggests the inversion region to be 50%-60% n-heptane. The volumetric mass transfer coefficient, kLa, has been evaluated from the pressure decrease under isochoric and isothermal (298.2 K) conditions with a pseudo-homogeneous mass transfer model. As expected, the solubility of both gases increases linearly with oil volume fraction; only for CO2-water-n-heptane system the values are low as compared to linear interpolation of the measured pure phase solubilities. In addition, a fluorescence technique with an oxygen-sensitive fluorophore, soluble only in the water phase, has been applied to measure the oxygen-water volumetric mass transfer coefficient, (kLa)GW, in emulsions of n-dodecane and n-hexadecane in order to gain more insight into the mass transfer mechanism. For O/W emulsions, both O2 and CO2 have similar trends in the variation of kLa with increasing dispersed oil volume fraction. A kLa maximum at low oil volume fractions (1-2%) is found for both n-dodecane and n-hexadecane; the “shuttle” mechanism might be responsible for this maximum. Differently, O/W emulsions of n-heptane always show higher kLa than pure water; this can be explained by a bubble covering mechanism enabled by its high positive spreading coefficient. The oxygen mass transfer rate is strongly enhanced by up to the factor of 38 at 50% n-heptane. Such strong effects have never reported before. For O2 absorption into O/W emulsions of n-dodecane and n-hexadecane, both (kLa)GW and kLa have the same trend with increasing oil volume fraction. The low values of spreading coefficient for n-dodecane and n-hexadecane and the strong decrease of both (kLa)GW and kLa towards the phase inversion region suggest the serial transport mechanism: gas → water → oil. For W/O emulsions, both O2 and CO2 have similar trends in the variation of kLa with increasing dispersed water volume fraction. In W/O emulsions of n-hexadecane, kLa decreases monotonously as expected due to increasing viscosity. For W/O emulsions of both n-dodecane and n-heptane, the kLa values do not decrease but increase substantially. The reason for this surprising trend is not clear., In dieser Arbeit wurde die Absorption von reinem Sauerstoff (O2) und von reinem Kohlendioxid (CO2) in wässrigen Emulsionen dreier n-Alkane (n-Heptan, n-Dodecan und n-Hexadecan) in einem Rührkessel bei der Rührerdrehzahl von 1000 min-1 untersucht. Die Grenz¬flächen-spannungen wurden mit einem Tensiometer nach der Ringmethode bestimmt. Aus den Messwerten errechnen sich für alle Öle positive Spreitungskoeffizienten, allerdings ist der Wert für n-Heptan deutlich größer als die Werte für die beiden anderen Öle. Es wurde der gesamte Bereich des Öl-Volumenanteils (0-100%) betrachtet. Die Phasenumkehr (O/W zu W/O) wurde durch Messen der elektrischen Leitfähigkeit untersucht; für n-Dodecan und n-Hexadecan erfolgt der Umschlag bei Ölanteilen von 60-65%. Beobachten des Entmischungsvorgangs deutet für n-Heptan den Umschlag im Bereich von 50-60% Ölanteil an. Die volumenbezogene Stoffübergangszahl kLa wurde aus dem Druckabfall unter isochoren und isothermen (298,2 K) Bedingungen mit einem pseudo-homogenen Modell ermittelt. Erwartungsgemäß variieren die Löslichkeiten beider Gase linear mit dem Ölanteil; einzig für CO2 in n-Heptan-Emulsionen sind die Messwerte kleiner als durch lineare Interpolation berechnet. Zusätzlich wurde eine optische Methode mit einem einzig in der wässrigen Phase löslichen Fluorophor verwendet, um über die daraus ermittelte Stoffübergangszahl (kLa)GW Hinweise zum Mechanismus des Stofftransports zu gewinnen. In O/W-Emulsionen zeigen die kLa-Werte beider Gase ähnliche Einflüsse des Ölanteils. Bei kleinen Anteilen (1-2%) von n-Dodecan und n-Hexadecan gibt es ein kLa-Maximum, das mit dem “Shuttle“-Mechanismus erklärt werden könnte. In O/W-Emulsionen von n-Heptan sind die kLa-Werte beider Gase durchweg höher als in reinem Wasser, was zusammen mit dem hohen Wert des Spreitungskoeffizienten den Transport über einen auf den Blasen spreitenden Ölfilm nahelegt. Bei 50% n-Heptan ist der Sauerstofftransport um den Faktor 38 erhöht; so hohe Werte wurden niemals zuvor berichtet. Für die Sauerstoffabsorption in n-Dodecan und n-Hexadecan ähneln sich die Verläufe von kLa und (kLa)GW. Die niedrigen Spreitungskoeffizienten und die starke Abnahme zum Inversionspunkt hin, legen den Transportweg Gas → Wasser → Öl nahe. In W/O-Emulsionen ist mit steigendem Volumenanteil der dispersen Wasserphase für beide Gase der Verlauf der kLa-Werte ähnlich. In W/O-Emulsionen von n-Hexadecan nimmt der kLa-Wert ab, wie es für steigende Emulsionsviskosität zu erwarten ist. In W/O-Emulsionen von n-Dodecan und n-Heptan dagegen steigen die kLa-Werte sogar deutlich an. Die Ursache für den unerwarteten Verlauf konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von Candida bombicola bzw. Pseudozyma aphidis gezielt Glycolipide nachproduziert und zur enzymatischen Modifikation mit Glycosidasen und Lipasen eingesetzt. Ein wesentliches Ziel war es u.a., bei Lipasen-Katalyse im organischen Lösungsmittel zwei ungewöhnliche Hydroxy-Fettsäuren mikrobiellen Ursprungs, (R)-3-OH-Decansäure bzw. (S)-17-OH-Stearinsäure, auf native Glycolipide zu übertragen. Das 2-Dodecyl-Sophorosid SL-E2-12 wurde erfolgreich in den primären C-6‘- und C-6‘‘-Positionen der Sophorose acyliert. Im Falle der beiden Mannoyslerythritol-Lipide MEL-A und MEL-B gelang dies in der freien primären OH-Gruppe des Erythritolteils. Insgesamt gingen aus den genannten Lipase-katalysierten Reaktionen und den nachfolgenden NMR/MS-Untersuchungen fünf neuartige Glycokonjugate hervor. Dazu kamen noch vier weitere neuartige Glycolipide, die aus den enzymatischen Acylierungen mit Hilfe von Decan-, Stearin- und Sebacinsäure resultieren; Acyl-Akzeptoren waren 2-Dodecyl-Sophorosid SL-E2-12 bzw. 2-Dodecyl-Glucosid GL-A2-12. Neben der Biokatalyse wurde auch die mikrobielle Konversion eines speziellen Co-Substrats, 2-Tridecanon, als effiziente Methode zur Bildung neuartiger Glycolipide durch C. bombicola eingesetzt. Nach der NMR/MS-Analyse konnten fünf verschiedene 2-Tridecyl-Sophoroside erfolgreich identifiziert werden. Die neuartige Glycolipide und ihre Edukte wurden physicochemisch bzw. in Bioaktivitätstests untersucht. Hinsichtlich des Einflusses auf die Senkung der Oberflächenspannung von Wasser waren insbesondere die Kombinationsprodukte aus 2-Dodecyl-Sophorosid bzw. MEL-A/-B und 3-OH-Decansäure effektiv. Fast alle neuen Substanzen stabilisieren w/o-Emulsionen recht gut. Bei den biologischen Tests war auffällig, dass die Glycolipide besonders gram-positive Bakterien inhibieren. Einige Produkte zeigten gute Effekte im in vivo-Experiment zur Anti-Tumor-Aktivität., In the framework of the present thesis initially unique glycolipids were produced by Candida bombicola and Pseudozyma aphidis using well-known protocols. Afterwards, after downstream processing, the corresponding pure compounds were functionalized by aid of glycosidases and lipases. An essential aim was the transfer of two uncommon hydroxyl fatty acids of microbial origin, (R)-3-OH decanoic acid and (S)-17-OH stearic acid, to native glycolipids by lipase catalysis in organic solvent. The 2-dodecyl-sophorosid SL-E2-12 was successfully acylated in the primary positions C-6’ and C-6’’ of the sophorose. In the case of the the mannosylerythriol lipids MEL-A and MEL-B this was performed in the free primary OH group of the erythritol moiety. Altogether five new glycoconjugates were produced by the mentioned lipase-catalyzed reactions. Additionally, four further new glycolipids were gained out of the enzymatic acylations using decanoic acid, stearic acid and sebacic acid. Thereby the acyl acceptors were the 2-dodecyl-sophorosid SL-E2-12 and the 2-dodecyl-glucosid GL-A2-12, respectively. Besides biocatalysis the microbial conversion of a special co-substrate, 2-tridecanone, was used to get new glycolipids with C. bombicola. After NMR/MS analysis five different 2-tridecyl-sophorosides were successfully identified. The novel glycolipids and their educts were analyzed by physico-chemical and bioactivity tests. Concerning the influence of the new substances to the reduction of the water’s surface tension particularly the combined products of 3-OH decanoic acid with 2-dodecyl-sophorosid and MEL-A/B were efficient. Nearly all new substances are able to stabilize w/o emulsions. The biological tests showed that the glycolipids especially inhibited gram positive bacteria. Several products appeared to have good effects in in vivo experiment for anti-tumor activity.

Im Fokus dieser Arbeit stand die erstmalige systematische Untersuchung des für die HMF-Herstellung wenig eingesetzten Lösungsmittels Sulfolan. Dadurch sollte die Eignung von Sulfolan als Lösungsmittel für die HMF-Herstellung aus Fructose und Saccharose und dessen Vor- bzw. Nachteile gegenüber dem bisher am meisten geeigneten Lösungsmittel DMSO gefunden werden. In verschiedenen Reaktionen unter Variation der Versuchsparameter konnte die Eignung von Sulfolan als Lösungsmittel für die HMF-Herstellung aus Fructose festgestellt werden. Weiterhin zeigte sich Sulfolan als vorteilhafter gegenüber DMSO in Bezug auf die Reaktionsgeschwindigkeit und der Abtrennung von HMF aus dem Lösungsmittel durch Adsorption an Aktivkohle. Für die HMF-Darstellung aus Saccharose zeigte es sich jedoch als weniger geeignet als DMSO. Weiterhin stand im Fokus dieser Arbeit die In-situ-Abtrennung von HMF aus wässrig-sauren Reaktionsbrühen mittels Adsorption. Hierbei wurden erstmalig verschiedene Adsorptionsmittel auf die Eignung zur HMF-Adsorption aus wässrig-sauren Lösungen untersucht. Dabei zeigte sich die Aktivkohle Norit® ROX 0.8 als besonders geeignet unter den Versuchsbedingungen. Die HMF-Beladung bei Raumtemperatur lag erstaunlich hoch bei 0,5 gHMF g-1Aktivkohle. Mit dieser Aktivkohle wurden systematisch verschiedene Adsorptions- und Desorptionsexperimente durchgeführt. Hierbei zeigte Aceton eine vollständige Desorption des zuvor adsorbierten HMFs, was einen Fortschritt gegenüber dem bisher beschriebenen Extraktionsmittel Ethanol aufweist. Die verwendete Aktivkohle weist zudem eine Langzeitstabilität in mehrmals durchgeführten Adsorptions- und Desorptionsschritten auf. Für eine bislang noch nicht untersuchte technisch relevante Saccharose-Konzentration von ca. 18 Gew.-% konnte die HMF-Selektivität in Wasser durch die In-situ-Adsorption von 27 % auf über 50 % erhöht werden. Die grundlegenden Untersuchungen geben Anhaltspunkte für weitere Forschungsarbeiten auf diesem Gebiet., This work focused on the first-time systematic investigation of the organic solvent sulfolane for the production of HMF from fructose and sucrose. Sulfolane should be proved for its suitability for the production of HMF from fructose and sucrose. Its advantages and disadvantages compared to the so far most suitable organic solvent DMSO should be evaluated. By different reactions under variation of the reaction parameters the suitability of sulfolane for the production of HMF from fructose could be ascertained. Furthermore, sulfolane showed advantages compared to DMSO in reaction rate and in separation of HMF by adsorption. Nevertheless, sulfolane had disadvantages in HMF production from sucrose compared to DMSO. Moreover, this work focused on the in-situ separation of HMF from water by adsorption. Different adsorption agents were tested for HMF adsorption under acidic conditions for the first-time. The activated carbon Norit® ROX 0.8 was found as the most suitable adsorption agent under the test conditions. The HMF loading was surprisingly high, which was 0.5 ghmf g-1activated carbon at ambient temperature. Following, different adsorption and desorption experiments were carried out systematically. In desorption experiments acetone showed complete desorption of the adsorbed HMF. Therewith it shows a progress compared with the extraction media ethanol which is described in literature. Besides, the activated carbon showed a long-time stability in several subsequent adsorption and desorption steps. For a technically relevant sucrose concentration of approx. 18 wt. % HMF selectivity could be increased in water as solvent by in-situ adsorption from 27 % to more than 50 %. The basic investigations give indications for further research projects in this area.

Oil-based plastic production processes have given rise to several environmental problems and energy availability. Over the past 30 years, polyhydroxyalkanoates (PHA) have become one of the main sustainable alternatives to replace petroleum-base commodities. These biopolymers have superior features than synthetic plastics since they are produced from biobased sources and their intrinsic chemical composition make them biodegradable, biocompatible, and part of the carbon cycle of the earth. Although there is a vast knowledge base for synthesizing eco-friendly biopolymers, the industrial production of PHAs is still 5-10 more expensive to obtain than conventional plastics. Therefore, the present research addresses this critical issue by using Pseudomonas putida as a cell factory along with a systems biotechnology approach with the aim of enhancing the production of PHAs. First, it was shown that P. putida and related species are suitable as whole-cell biocatalyzers for the production of several value-added industrial compounds. To highlight differences among various nutrient limitations and their influence on PHA synthesis in P. putida KT2442, chemostat cultures were employed to perform well-controlled nutrient limitations. Strict nitrogen-limiting condition reached the highest PHA productivity in standard continuous cultivation ever reported. To gain insight into the PHA machinery, transcriptome, proteome, and metabolome analyses were employed to investigate the metabolic responses under such limiting conditions. Dual limitation showed different expression patterns in comparison to those observed under strict carbon- or nitrogen-limiting conditions. Energy metabolism, fatty acids metabolism, stress response, and proteins belonging to the transport system were the components of the cell which were highly affected by the imposed nutrient limitation. Driven by the systems biology approach, it was possible to increase the PHA accumulation under dual limitation, which shows to use the carbon source in the most efficient and economic manner among all tested conditions. In order to reduce the production costs for PHA synthesis, P. putida KT2440 and in silico-driven metabolically engineered strains were subjected to PHA-producing conditions using the inexpensive carbon source glucose. Indeed, the created Δgcd mutant strain exhibited 60% increase in PHA accumulation as compared to the parental wild-type strain. The mutant maintained a high specific growth rate and exhibited an almost unaffected gene expression profile. To further develop an industrial-scale PHA production process, the P. putida strains were subjected to the industrial process of choice  the fed-batch cultivation. After the application of an exponential-feeding strategy for biomass synthesis, the PHA accumulation stage should be promoted by applying a pulse-feeding instead of a linear-feeding approach, which appears to be more appropriated for PHA synthesis in P. putida within high cell cultivations. In conclusion, the results described in this thesis have shown the strength of in silico modeling and integration of omics measurements to lead metabolic engineering works towards optimal performance of the cell and reengineering processes for the synthesis of polyhydroxyalkanoates., Die Produktion von Kunststoffen aus Erdöl ist mit erheblichen Umweltproblemen verbunden. Darüber hinaus stellt sich die Frage nach der zukünftigen Verfügbarkeit des nicht erneuerbaren Rohstoffs. Während der letzten 30 Jahre haben sich Polyhydroxyalkanoate (PHA) als nachhaltige Alternative zu Erdöl-basierten Produkten durchgesetzt. Im Gegensatz zu synthetischen Kunststoffen haben diese Biopolymere den Vorzug, dass ihre chemische Zusammensetzung sie biokompatibel und zugänglich für Biodegradation macht. Als Teil des natürlichen Kohlenstoffzyklus ist ihre Verwendung CO2-neutral. Trotz einer enormen Wissensbasis über die Synthese umweltfreundlicher Biopolymere ist die industrielle Produktion von PHA immer noch fünf bis zehnmal teurer als die herkömmlicher Kunststoffe. Die vorliegende Arbeit widmet sich diesem wichtigen Thema mit dem Ziel die Produktionsrate von PHAs durch einen systembiotechnologischen Ansatz in Pseudomonas putida als Zellfabrik zu steigern. Zunächst wurde gezeigt, dass lebende Zellen von P. putida und verwandter Spezies als Biokatalysatoren für die Herstellung verschiedener industriell relevanter Grundstoffe geeignet sind. Während kontinuierlicher Kultivierungen in der kontrollierten Umgebung eines Chemostats wurde der Einfluss verschiedener Nährstoff-Limitierungen auf den Stamm P. putida KT2442 sowie dessen Produktion von PHA untersucht. Unter strikter Stickstoff-Limitierung wurden die höchsten PHA-Konzentrationen erreicht, die bisher in kontinuierlichen Kulturen gemessen wurden. Um einen Einblick in die Biosynthese von PHA unter verschiedenen limitierenden Bedingungen zu erhalten, wurden Transkriptom-, Proteom- und Metabolom-Studien durchgeführt. Gleichzeitige Stickstoff- und Kohlenstoff-Limitierung zeigte dabei im Vergleich zu den einzelnen Limitierungen ein stark unterschiedliches Expressionsprofil. Unter den zellulären Komponenten, die am stärksten durch die Nährstoff-Limitierungen beeinflusst waren fanden sich der Energie-Metabolismus, der Fettsäure-Metabolismus, die Stressantwort sowie Bestandteile des Transportsystems. Mit Hilfe des Systembiologischen Ansatzes war es möglich, die PHA Biosynthese unter beiden Limitierungen zu erhöhen. Unter dieser Bedingung wurde die Kohlenstoffquelle am effizientesten und ökonomischsten genutzt. Um die Produktionskosten für PHA weiter zu minimieren, wurden P. putida KT2440 und in silco abgeleitete Stämme unter Bedingungen kultiviert, die eine PHA-Produktion mit der kostengünstigen Kohlenstoffquelle Glukose begünstigen. Der Stamm mit einer Δgcd-Mutation zeigte eine um 60% erhöhte PHA-Akkumulation im Vergleich zum Wildtyp-Stamm. Dabei zeigte dieser Stamm eine hohe spezifische Wachstumsrate und ein Genexpressionsprofil, das durch die Mutation kaum beeinflusst wurde. Um die PHA-Produktion im Industrie-Maßstab weiterzuentwickeln wurde die P. putida-Stämme mit der Methode der Wahl aus der Industrie kultiviert – dem "Fed-batch Process". Nach der Anwendung eines exponentiellen Fütterungsansatzes, um die Bildung von Biomasse zu optimieren sollte die Bildung von PHA über eine gepulste statt lineare Fütterungsstrategie angeregt werden. Diese stellte sich während der Hochdichte-Zellkultivierung als wesentlich geeigneter für die maximale PHA-Biosynthese heraus. Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit vorgestellten Resultate die Stärke von in silco basierten Methoden der Integration von "Omics"-Daten und Modellierung für die Optimierung von Stämmen für die Biosynthese von polyhydroxyalkanoaten.

A prerequisite for structural and biochemical analyses of proteins is the availability of large amounts of high-quality material. However, the recombinant production of complex proteins typically requires a profound screening process to identify expressible constructs. Furthermore, the evaluation of an optimal expression host has an important impact on protein quality, yield and cost efficiency. As a result, the production of target proteins in eukaryotic systems is a major bottleneck in structural biology. In this work, the novel expression/donor vector pFlpBtM has been constructed to be utilised for both, the rapid screening for expressible protein variants and the evaluation of an optimal expression host. The range of applications comprises a variety of highly efficient eukaryotic hosts used at the Helmholtz Protein Sample Production Facility (PSPF). It was realised by the unique combination of different expression methods including transient, viral and stable expression strategies. The efficiency of the vector is demonstrated in a comparative expression study of model proteins from different protein classes which have been produced by transient expression in HEK293-6E cells as well as in the baculovirus expression vector system and by stable expression using a recombinase mediated cassette exchange system in CHO Lec3.2.8.1 cells. Additionally, engineered BEVS host cell lines were generated, which enable the stable genomic expression of auxiliary proteins to facilitate the production of particularly challenging target proteins. The flexible RMCE system was implemented in insect cell lines for the first time to provide optimised coexpression for each target protein and deploy compatibility to the RMCE CHO Lec3.2.8.1 cell lines. With the combination of a versatile donor/expression plasmid and optimised mammalian and lepidopteran producer cell lines, the PSPF offers an integrated platform for protein production in eukaryotic systems., Eine Grundvoraussetzung für strukturbiologische und biochemische Analysen ist die Verfügbarkeit von Proteinen in großen Mengen und hoher Qualität. Die Identifizierung von exprimierbaren Varianten eines Zielproteins und die Evaluierung des am besten geeigneten Expressionswirtes ist jedoch ein zeit- und arbeitsaufwendiger sowie kostenintensiver Prozess. Die rekombinante Proteinproduktion in eukaryotischen Expressionssystemen ist daher ein entscheidender Flaschenhals in der strukturbiologischen Forschung. In dieser Arbeit wurde der neuartige Expressions- und Donorvektor pFlpBtM für die Produktion von Zielproteinen in den eukaryotischen Expressionssystemen der Helmholtz Protein Sample Production Facility (PSPF) konstruiert. Dies wurde durch die bislang nicht verfügbare Kombination mehrerer leistungsfähiger Expressionsmethoden in einem einzigen Plasmid ermöglicht. Der Vektor eignet sich dadurch sowohl für ein schnelles Screening von exprimierbaren Proteinkonstrukten mittels transienter Expression als auch für die parallele Evaluierung von verschiedenen Wirtssystemen. Die Funktionalität des Vektors konnte über die erfolgreiche Expression unterschiedlicher Modellproteinklassen in der humanen Zelllinie HEK293-6E, dem Baculovirus Expressionsvektorsystem sowie in stabiler genomischer Expression nach Rekombinase-vermitteltem Kassettenaustausch (RMCE) in CHO Lec3.2.8.1 gezeigt werden. Die PSPF wurde zudem um speziell entwickelte Insektenzelllinien erweitert, die eine stabile genomische Expression von auxiliären Proteinen ermöglichen und sich daher als optimierte Wirtszelllinien für die baculovirale Expression von besonders anspruchsvollen Zielproteinen eignen. Die erstmals erfolgte Implementierung des flexiblen RMCE in Insektenzellen ist kompatibel zu dem bereits vorhandenen System in CHO Lec3.2.8.1 Zellen. Mit der Kombination des vielseitigen Vektors und optimierten Wirtszellen bietet die PSPF nun eine integrierte Infrastruktur zur Proteinproduktion in eukaryotischen Systemen.

Das C-reaktive Protein (CRP) ist einer der wichtigsten Blutserummarker für Entzündungsreaktionen und bakterielle Infektionen. Bisher wird seine Konzentration unter großem Zeit- und Kostenaufwand in medizinischen Laboren mit Hilfe von Immunoassays bestimmt. Vor allem in Entwicklungsländern mit häufig mangelnder Infrastruktur ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Point-of-care-Diagnostik von CRP wünschenswert. In der vorliegenden Arbeit wurde das im Rahmen des SFB 578 etablierte, auf einer Quarzkristallmikrowaage (QCM) basierende Lab-on-a-chip-System zur vollautomatisierten, mikrofluidischen CRP-Detektion weiterentwickelt. Zur Steigerung der Sensitivität und Stabilität wurden bereits vorhandene CRP-spezifische scFv-Fragmente sowohl in verschiedene Antikörperformate überführt als auch in Genbibliotheken mutagenisiert, um deren biochemischen Eigenschaften gezielt zu verändern. So konnten hoch affine und extrem stabile Antikörperfragmente generiert werden, die sich besonders für den Einsatz in der Detektionszelle eines Sensor-Chips eignen. Mit der Phagen-Display-Methode konnten zusätzlich weitere CRP-spezifische Antikörperfragmente isoliert werden, die ausschließlich konformationelle Epitope des nativen CRP-Moleküls erkennen. Diese sind zur Anreicherung des CRPs aus Blutseren in der Anreicherungszelle anwendbar. Die gezielte Immobilisierung der CRP-spezifischen Antikörperfragmente auf Goldoberflächen mittels SNAP-Tag-Fusionsproteinen führt zur Erhöhung der Sensitivität des QCM-Chips. Ferner wurde der QCM-Sensor hinsichtlich Spezifität und Regenerierbarkeit in mehrfachen Messungen mit verschiedenen Antikörperfragmenten weiter charakterisiert. So konnten bereits über 100 repetitive CRP-Messzyklen durchgeführt werden. Auch konnte die Anwendbarkeit des Systems für die Detektion weiterer Antigene wie Lysozym und BSA mittels verschiedener Antikörper-Formate demonstriert werden. Somit wurden alle Voraussetzungen für ein CRP-spezifisches Lab-on-a-chip-System erfüllt., The acute phase protein C-reactive protein (CRP) is the most important blood marker for inflammation and bacterial infections. Its concentration is currently determined with time consuming and cost intensive immunoassays. Thus, there is a great demand for a simple, quick, reliable and cost-efficient Point-of-care testing (POCT). In this work the further development and evaluation of a micro-fluidic, quartz crystal microbalance (QCM) based lab-on-a-chip system for the measurements of whole blood samples are presented. For improvement of the sensitivity and stability of this special system several strategies were conducted. First off already existing scFv fragments were successfully converted into different antibody formats and mutagenized to derive binders with different biochemical properties. Several stable and high affinity binders were generated. These binders can be used for the detection of CRP molecules under denaturating conditions. Secondly, several new CRP specific antibody fragments which are able to bind to conformational epitopes of native CRP molecules were obtained via phage display. These binders can be used for the enrichment of CRP out of the blood serum in an enrichment matrix upstream the QCM-chip. Furthermore, directed immobilization of SNAP-tag labeled CRP specific antibody fragments onto gold surfaces could be shown for the first time. By this, the system’s sensitivity and specificity could be increased. In addition several different antibody fragments and formats were used for further characterization regarding robustness and regeneration of the QCM-sensor. In repeating measurements a concentration dependant detection of different antigens (CRP, Lysozyme and BSA) was demonstrated. For a CRP specific antibody fragment more than 100 measurement cycles could be shown. Thus, all necessary requirements for a fully-automated, micro-fluidic, QCM based lab-on-a-chip system for the point-of-care diagnostic of CRP were fulfilled

The study focuses on waste management in the Mekong Delta of Vietnam (MD) through the application of biogas plants to livestock and agricultural waste treatment. The MD accounts for more than 50% of the national aqua-agricultural production in which livestock sector contributes more than 20% of agricultural growth. The livestock sector, however, has been attributed to the environmental problems in the rural MD where the water from the canal network is used as main water supply sources for more than 60% of the local communities. To solve this problem, biogas technology has been applied as an environmentally-friendly treatment for animal and human wastes in the MD since the 1980s. Nevertheless, the number of the existing biogas plants is below the actual local demand on livestock waste treatment due to some impediments such as high investment cost, shortage of input to biogas plants, and limited application of by-products from biogas plants. In an attempt to seek for possible solutions to promote the widespread application of biogas plants in the MD to help improve the sanitary condition of the local communities, our research found water hyacinth and spent mushroom compost, the two local materials, highly potential for using as additional inputs for co-digesters in case of shortage of main biogas plant inputs. In addition, our finding shows that the bio-slurry of the co-digesters could be applied positively to vegetable planting and fish growing, thereby helping farmers generate more income and be engaged in sustainable farming. A new model of biogas plants was also successfully developed and tested in the real local conditions with acceptable investment cost but high treatment efficiency. The findings of our study give more scientific evidence on the benefits of biogas plants to local communities and contribute to the promotion of large-scale application of biogas plants in particularly the rural MD., Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Nutzung von Biogasanlagen zur Verwertung von tierischen und landwirtschaftlichen Abfällen im Mekong-Delta (MD) in Vietnam. Im MD werden mehr als 50% der agrarwirtschaftlichen Erzeugnisse Vietnams produziert, davon sind 20% der Viehwirtschaft zuzuordnen. Die stetig zunehmende Viehhaltung im MD führt jedoch zu großen ökologischen Problemen in den ländlichen Gebieten, insbesondere in Gemeinden, in denen Oberflächenwasser aus dem MD direkt zur Wasserversorgung genutzt wird. Um dieses Problem zu lösen, wurde die Biogas-Technologie bereits in den 1980er Jahren zur umweltfreundlichen Behandlung von Agrarabfällen im MD eingeführt. Dennoch ist die Zahl der errichteten Biogasanlagen im Vergleich zum tatsächlichen Bedarf aufgrund von Investitionskosten, Mangel an geeignetem Substrat und der begrenzten Nutzungs-möglichkeit von Gärresten gering. Deshalb wurde angestrebt, eine geeignete Lösung für die Verbreitung von Biogasanlagen im MD zu finden, die zudem die sanitäre Situation im MD verbessert. Bei dem Bestreben lokal verfügbare Materialien als Substrate für die Biogasanlagen zu verwenden, wurden aufgrund ihrer hohen Biogaspotenziale und ihrer regionalen Verfügbarkeit Wasserhyazinthen (WH) und Pilzkompost (SMC) ausgewählt. Diese Zuschlagstoffe (WH und SMC) haben zudem nach der Co-Vergärung einen positiven Effekt auf den landwirtschaftlichen Anbau und die Aquakultur, sie verhelfen Landwirten zu höheren Einkommen und sensibilisieren sie für eine nachhaltige Landwirtschaft. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Biogasanlage konnte unter den Randbedingungen des MD erfolgreich getestet und eine hohe Behandlungseffektivität bei gleichzeitig akzeptablen Kosten festgestellt werden. Der ökonomische und ökologische Nutzen des Einsatzes von Biogasanlagen in den Gemeinden konnte durch die wissenschaftlichen Untersuchungen untermauert werden und eine großflächige Verbreitung in den ländlichen Gebieten des MD wird angestrebt.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Darstellung des synthetischen Polypeptids Poly(gamma-benzyl-L-glutamat) (PBLG), der Synthese von PBLG-haltigen Blockcopolymeren und ihren Selbstorganisationsphänomen. Synthetische Polypeptide sowie auf solchen basierende Blockcopolymere dienen als Modellpolymere zur Nachahmung von komplexen Proteinen und deren Selbstorganisation. Die Synthese des PBLGs basiert auf einem bifunktionellen Übergangsmetall-Initiator. Es wird ein endfunktionalisiertes PBLG erhalten, das für eine makroinitiierte kontrolliert-radikalische Polymerisation (ATRP, Atom Transfer Radical Polymerization) zur Ausbildung eines Blockcopolymers eingesetzt wird. Durch verschiedene Optimierungen des Syntheseprotokolls wird PBLG mit definierten Molekulargewichten und engen Molekulargewichtsverteilungen in einer kontrollierten Polymerisation erhalten. Mit den endfunktionalisierten PBLGs werden dann PBLG-Poly(methylmethacrylat) und PBLG-Poly(tertbutylacrylat) Blockcopolymere hergestellt. Mit Hilfe von GPC können wichtige Hinweise für eine erfolgreiche Synthese erhalten werden. Sowohl von PBLG als auch von den Blockcopolymeren wurde die Fähigkeit zur Selbstorganisation in Toluol untersucht. Ab einer bestimmten Konzentration werden selbsttragende Organogele, bestehend aus einem Nanofasernetzwerk, gebildet. Die Nanostrukturen werden mit Hilfe von TEM (Transmission Electron Microscopy) und AFM (Atomic Force Microscopy) untersucht. Mit Hilfe von Röntgenstreumessungen wird gezeigt, dass die PBLG-Gele kristalline Domänen von ca. 200 nm Länge bestehend aus aggregierten PBLG-Helices aufweisen. Die PBLG-Helices liegen dicht gepackt auf einem verzerrt hexagonalen Gitter. Insgesamt wird gezeigt, dass anhand von kontrolliert darstellbaren synthetischen Polypeptiden und Blockcopolymeren Selbstorganisationsphänomene sehr gut untersucht werden können und diese Spezies so ein Hilfsmittel zum Verständnis solcher natürlicher Phänomene bieten., This thesis deals with the synthesis of the synthetic polypeptide Poly(gamma-benzyl-L-glutamate) (PBLG), the synthesis of PBLG-based block copolymers and their self-assembly. Synthetic Polypeptides as well as block copolymers based on these serve as model compounds to mimick complex proteins and their self-assembly phenomena. The synthesis of the PBLG is based on a bifunctional transition metall containing initiator. As a result an endfunctionalized PBLG is obtained which can be used for a macroinitiated controlled radical polymerization (ATRP, Atom Transfer Radical Polymerization) to obtain a block copolymer. By different optimizations of the synthetic protocol PBLG can be obtained with defined molecular weights and narrow molecular weight distributions. The end-functionalized PBLGs are used to synthesize PBLG- Poly(methylmethacrylate) and PBLG-Poly(tertbutylacrylate) block copolymers. From GPC (Gel Permeation Chromatography) measurements important information is derived regarding a successful synthesis. The ability to self-assemble in toluene is investigted for PBLG and the block copolymers. Above a certain concentration self-supporting organo gels are formed based on a three dimensional network of nanofibers. The nanostructures of the aggregates and gels are investigated by TEM (Transmission Electron Microscopy) and AFM (Atomic Force Microscopy). With the help of X-ray scattering measurements it is derived that the PBLG gels have crystalline domains in the range of 200 nm length consisting of aggregated PBLG-helices. Additionally it is found that the PBLG-helices are packed densely on a distorted hexagonal lattice. In summary, it is possible to study self-assembly phenomena with the help of synthetic polypeptides and polypeptide based block copolymers, obtained by controlled polymerization techniques. Thus, these systems represent a simplified tool to examine natural self-assembly phenomena.

Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Entwicklung eines hochaktiven und-selektiven goldbasierten Trägerkatalysators für die aerobe Flüssigphasenoxidation von Alkylethoxylaten zu ihren entsprechenden Ethercarbonsäuren. Aufgrund der großen Vielfalt der Alkylethoxylate wurden grundlegende Untersuchungen zur Katalysatorentwicklung zunächst an den Modellsystemen PEG M 1000 (Methylethoxylat) und Genapol LA 070 (Lauryethoxylat) durchgeführt. Mit der Entwicklung eines 0,1 %ig beladenen Au-Pt-Nassimpägnierungskatalysators auf Ceroxid und der Aufklärung des Hauptdesaktivierungsmechanismus als Überoxidation des Katalysators konnten gegenüber der Ausgangsituation in dieser Arbeit bedeutende Fortschritte erzielt werden. Werden durch eine angepasste Reaktionsführung ungünstige Reaktionsbedingungen, die eine Überoxidation des Katalysators hervorrufen, vermieden, so weist dieser Katalysator in Repeated Batches eine ausreichende Langzeitstabilität auf. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass der entwickelte Katalysator prinzipiell für die Oxidation einer Vielzahl an Polyethylenglykolen, Aryl- und gesättigten Alkylethoxylaten geeignet ist., This work focuses on developing a highly selective and active gold-based supported catalyst for the aerobic liquid-phase oxidation of alkyl ethoxylates to their corresponding ethercarboxylic acids. Because of the great variety of alkyl ethoxylates fundamental studies were conducted on the model systems PEG M 1000 (methyl ethoxylate) and Genapol LA 070 (lauryl ethoxylate). Significant progress was made by developing a 0,1 wt.-% Au-Pt-wet impregnation catalyst supported on ceria and by identifying over-oxidation of the catalyst as the main deactivation mechanism. A sufficient long-term stability of the catalyst could be achieved in repeated batches through an adjusted reaction procedure by avoiding adverse reaction conditions that favor over-oxidation of the catalyst. Furthermore, it was shown that the developed catalyst was in principle well-suited for the oxidation of a multitude of polyethylene glycols, aryl and saturated alkyl ethoxylates.

Auf Grund der steigenden Lebenserwartung ist in den nächsten Jahren mit einem Anstieg der Zahl der Erstimplantationen von Hüftendoprothesen zu rechnen. Deren Lebensdauer ist jedoch begrenzt, da in vielen Fällen eine aseptische Prothesenlockerung zum Versagen führt und die Prothese ausgetauscht werden muss. Verantwortlich für die Lockerung ist der aus dem Gelenk stammende Abrieb, der in den Spalt zwischen Implantat und Knochen gelangt und dort eine entzündliche Reaktion hervorruft. Die Anwendung von Bone Morphogenetic Proteins, insbesondere BMP2, kann dabei helfen, das Knochenwachstum zur Implantatoberfläche zu verbessern und somit den Verlust des Implantates zu verhindern. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine Beschichtung entwickelt, mit der BMP2 auf der Implantatoberfläche immobilisiert werden kann. Die eingesetzten Copolymere bestehen aus einem Monomer, das eine oberflächenaktive Phosphonatgruppe trägt, um an das Implantat zu binden, während das andere Monomer eine funktionelle Gruppe enthält, welche in der Lage ist, den Wachstumsfaktor BMP2 kovalent zu binden. Die entsprechenden Copolymere wurden im Rahmen dieser Arbeit synthetisiert und die daraus auf Titansubstraten mittels spin-coating hergestellten Filme mit verschiedenen analytischen Methoden, beispielsweise Ellipsometrie und Photoelektronenspektroskopie, charakterisiert. In Kooperation mit dem Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung wurden anschließend an einigen Filmen in-vitro-Untersuchungen durchgeführt, um die Menge des angebundenen BMP2 zu quantifizieren. Mit einem weiteren Test werden jedoch nur etwa 10 % davon als biologisch aktiv nachgewiesen und bestätigen somit die lediglich geringe Verbesserung des Knochen-Implantat-Kontaktes bei den in Zusammenarbeit mit der Orthopädischen Klinik der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführten in-vivo-Versuchen., In the last decades, the number of hip joint replacements has considerably increased and will grow further due to the increased life expectancy. However, problems arise from the non- perfect integration of these implants into the bone. Small gaps are remaining between the implant and the bone offering a working surface for bacteria and wear particles which can cause a chronic inflammatory response and finally lead to the failure of the implant. Being the reason for implant loosening, it would be advantageous to prevent this gap and to improve the osseointegration. The application of Bone Morphogenetic Proteins, especially BMP2, is one way to encourage bone growth to the implant surface. Hence a polymeric interlayer is developed to immobilize the BMP2 directly on the implant surface. Copolymers are used as interlayer as they can be synthesized of a monomer which contains a surface active phosphonate group to bind to the implant surface and a comonomer which is able to covalently bind the growth factor BMP2. The resulting copolymers were synthesized during this thesis. Thin layers of these copolymers were prepared on titanium via a spin-coating technique and characterized whith different analytical methods, for example X-ray photoelectron spectroscopy. Some of these films were incubated with BMP2 at the Helmholtz Centre for Infection Research and the amount quantified with an ELISA. However, only 10 % of it are biologically active which confirms the outcome of the in vivo experiment done in cooperation with the orthopaedic surgeons from Hannover Medical School in which only a slight improvement of bone-implant contact could be achieved.

This work deals with mimicking structural features found in nacre to fabricate composite materials as a tough ceramic material and to explore the mechanical properties. It is part of the work package D9 ôBiomimetic Ceramicsö of the Collaborative Research Centre 599 ôSustainable bioresorbable and permanent implants of metallic and ceramic materialsö of the DFG. Structural pattern found in nacre at micro level, so called ôbrick and mortarö assembly is formed in the presence of a mixture of proteins rich in acidic amino acids with aragonite. To mimic this hierarchical pattern, an appropriate inorganic material and an adhesive polymeric partner are the prerequisite. Specific polymers are required that can be used as crystallization controlling agents in order to synthesize inorganic platelets. For this purpose different phosphonic acid functional polymers and copolymers were synthesized. Properties of the basic polymer chains were altered by copolymerization with different monomers to get desired properties. The reactivity parameters of the copolymerizing units were also established. Furthermore a mussel adhesive protein mimic was also synthesized with dopamine functionality. These polymers were tested at Leibniz University Hannover for the controlled crystallization of hydroxyapatite, with a close resemblance to natural bone material and zirconium hydrogenphosphate hydrate, a biocompatible material which layered morphology. Nanoparticles or platelets, respectively, of these inorganic materials were obtained. Layered composites of zirconium hydrogenphosphate hydrate (ZrP) platelets and chitosan were prepared by layer-by-layer assembly. The growth and structural features of the composite films were studied along with their mechanical properties with reference to the number of dipping cycles, concentration and pH. Another composite was fabricated mimicking mussel proteins as organic component. A composite was prepared by LbL assembly using alumina platelets and hydroxyethyl starch modified with dopamine. Resulting composites have shown morphological similarities as found in nacre micro structure. For composites structure-property-relationships were identified. The thickness of the composites was measured with profilometer while structural details were elucidated with SEM. The mechanical properties of the fabricated composites were investigated with nanoindentation in cooperation with Max-Planck Institute for Metals Research Stuttgart., Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Nachbildung der strukturellen Charakteristika von Perlmutt, um auf diese Art harte Keramiken herzustellen und deren mechanische Eigenschaften zu untersuchen. Sie wurde im Rahmen des Projektes D9 „Biomimetische Keramiken“ des Sonderforschungsbereiches 599 „Zukunftsfähige bioresorbierbare und permanente Implantate aus metallischen und keramischen Werkstoffen“ der DFG durchgeführt. In der Natur entsteht die Struktur von Perlmutt, die mit einem Gefüge aus Ziegeln und Mörtel verglichen werden kann, aus Aragonit in Gegenwart eines Proteingemisches. Die Voraussetzung zur Nachahmung dieser hierarchischen Strukturen sind somit ein anorganisches Material mit entsprechender Geometrie und ein als Matrix dienendes haftfähiges Polymer. Zur Synthese der anorganischen Plättchen werden spezielle Polymere benötigt, die die Kristallisation kontrollieren. Daher wurden zunächst verschiedene Polymere mit dazu geeigneten Phosphonsäuregruppen synthetisiert. Die Eigenschaften der Polymerkette können hierbei durch die Copolymerisation mit unterschiedlichen Comonomeren verändert werden. Weiterhin wurde ein Copolymer mit der adhärierenden Dopamin-Einheit aus Muschel-Proteinen synthetisiert. Die hergestellten Polymere wurden an der Leibniz Universität Hannover zur kontrollierten Kristallisation von Hydroxylapatit, das dem natürlichen Knochen ähnelt, und Zirkonium (hydrogenphosphat)hydrat, einem biokompatiblem Material mit schichtartiger Morphologie, eingesetzt. In Abhängigkeit des eingesetzten kristallisationskontrollierenden Polymers wurden aus den anorganischen Materialien Nanopartikel oder Plättchen erhalten. Anschließend wurden aus den Zirkonium (hydrogenphosphat)hydrat-Plättchen und Chitosan schichtweise aufgebaute Komposite mit Hilfe des Layer-by-Layer Verfahrens hergestellt. Das Wachstum und die Struktur sowie die mechanischen Eigenschaften wurden in Abhängigkeit von der Anzahl der Dip-Zyklen, Konzentration und pH-Wert untersucht. Des Weiteren wurde ein Komposit mit dem nachgeahmten Muschel-Protein als organische Komponente erzeugt, indem mit Dopamin modifzierte Hydroxyethylstärke und Aluminiumoxid-Plättchen im Layer-by-Layer-Verfahren zusammengefügt wurden. Dieses zeigt morphologische Ähnlichkeiten zu der Mikrostruktur von Perlmutt. Die Schichtdicken der Komposite wurden mit einem Profilometer bestimmt und die strukturellen Details konnten an Hand von REM-Aufnahmen aufgeklärt werden. In Kooperation mit dem Max Planck Institut für Metallforschung in Stuttgart wurden die mechanischen Eigenschaften der Komposite mit Hilfe von Nanoindentation charakterisiert. Für die Komposite wurden Abhängigkeiten zwischen der Struktur und den Eigenschaften festgestellt.

An ever-increasing number of broadly neutralizing antibodies (bNAb) against the HIV-1 envelope (Env) have been discovered so far. Unfortunately, most antibody responses against HIV-1 in an acute infection are only strain-specific and quickly bypassed by escape mutations. Vaccination trials designed to re-elicit bNAbs that mediate protective immunity have remained futile (reverse vaccinology). The neutralization activity of the discovered bNAbs has been attributed to their affinity to functional Env trimers, although each cross-reacts with non- trimeric, immature or otherwise non-functional Env molecules. Therefore, a discovery platform was developed in order to select bNAb-bound, native, trimeric envelope variants that are displayed on the surface of mammalian cells. Conclusively, an HIV-1 derived lentiviral vector was developed to infect HEK293T cells by a low multiplicity of infection (MOI), in order to link phenotype and genotype. Hence, infected cells expressed and displayed membrane-associated Env proteins on their surface (lenti-cellular display). Subsequently to staining with an appropriate monoclonal antibody, Env-displaying cells were selected for high affinity binding via FACS sorting (Panning). A small model-library of Env variants with distinct binding capacities against the bNAb 447-52D was generated for evaluation. In a proof-of-concept study, it was demonstrated that the Env variant with the highest affinity to the applied bNAb was enriched in two rounds of selection (up to 10-fold). Hence, the demonstrated technique provides the possibility to screen membrane-bound Env variants for high binding capacities against the bNAb applied. Nevertheless, the presented lenti-cellular display and FACS-mediated panning platform still needs further optimizations. Prospectively, it needs to be challenged by libraries of larger diversity and selected candidates should be evaluated in vaccination trials., Die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffs gegen das humane Immundefizienz-Virus (HIV-1) gilt bis heute als ein ungelöstes Problem. Bei fast allen zugelassenen Impfstoffen beruht die Wirksamkeit auf der Bildung von Pathogen-neutralisierenden Antikörpern. Als zwingende Eigenschaft für ein erfolgreiches HIV-1-Vakzin gilt daher, dass es eine Antikörper-Immunantwort gegen essentielle Bestandteile des HI-Virus auslöst und ein breites Wirkspektrum aufweist. Einige sogenannte breit neutralisierende Antikörper (bNAb) sind bereits länger bekannt und wurden ausgiebig charakterisiert. In jüngster Zeit wurden in steigendem Maße weitere vielversprechende bNAbs isoliert und Ihre Eigenschaften sind derzeitig Bestandteil vieler Forschungsbemühungen. Eine Vielzahl von Versuchen, Antikörper mit ähnlichen Eigenschaften durch Impfungen zu induzieren, blieb jedoch bisher erfolglos (Reverse Vakzinologie). In der vorliegenden Arbeit wurde eine Selektionsmethode entwickelt, bei der Varianten trimerer Env-Proteine auf der Oberfläche von Säugetierzellen präsentiert werden. Die unterschiedlichen Bindungsstärken der verwendeten Env-Varianten zu einem gegebenen bNAb sollten es hierbei ermöglichen, auf Env-Varianten mit der höchsten Affinität zu selektionieren. Dies mündete in einer sogenannten lenti-zellulären Expressions- und FACS-basierten Anreicherungsmethode (Panning). Die entwickelte Methode wurde mit einer Modell-Bibliothek aus Env-Varianten mit bekannten Affinitäten zu bNAb 447-52D evaluiert. In dieser Studie konnte die Anreicherung der Env-Variante mit der höchsten Affinität zum verwendeten 447-52D Antikörper gezeigt werden (bis zu 10-fache Anreicherung). Nach weiterer Optimierung sollen zukünftig Env-Bibliotheken mit höherer Variabilität eingesetzt werden, um Env-Varianten zu selektionieren, die in präklinischen und klinischen Studien auf ihr Potential zur bNAb-Induktion untersucht werden sollen.

Cytotoxic T lymphocytes (CTL) directed against the HI-viral proteins Gag and Pol have been shown to control HIV replication efficiently. In a clinical phase-I trial the immunogenicity of the vaccine NYVAC-C was analyzed. NYVAC-C, consisting of the poxviral NYVAC vector coding for an artificial polyprotein Gag/Pol/Nef (GPN) and the envelope protein, induced modest Gag- and Pol-specific CTL responses in the participants. Thus, a new generation of immunogens based on GPN was developed. Immunogen expression and therefore immunogenicity should be enhanced by introducing several modifications. Again, NYVAC was chosen as antigen delivery system. To analyze the direct presentation of intracellular antigens, dendritic cells (DC) were infected with the vaccine candidates. The immunogen derived GL9 peptide was efficiently presented on DC despite incomplete maturation. Surprisingly, the weakly expressed antigen GPN induced most extensive direct presentation, whereas high expression of the new generation immunogens did not boost direct presentation.Vaccine candidate infected cells were analyzed to induce GL9 cross presentation on DC. Although poorly expressed, GPN induced the most extensive CTL restimulation by GL9-cross presentation on DC. Antigen presentation of the new generation immunogens was induced remotely and demanded high NYVAC multiplicities. Cross presentation was mainly driven by vaccine infected HeLa cells whereas Gag-derived virus-like particles did not induce GL9 presentation. Presentation of the alternative SP9 peptide was not detectable, indicating that not every immunogen-encoded peptide can be presented on APC. Thus, for induction of Gag specific CTL responses, GPN appears to be appropriate. The immunogenicity in humans could be enhanced by more effective expression without affecting the immunogenic properties of GPN., HIV-1 Gag und Pol spezifische zytotoxische T Lymphozyten (ZTL) haben die Fähigkeit, die HIV-Replikation effizient unterdrücken. In einer klinischen Phase-I Studie wurde die Immunogenität des pockenvirus-basierten Impfstoffes NYVAC-C, kodierend für das künstliche Polyprotein Gag/Pol/Nef (GPN) sowie das HIV-Hüllprotein gp120, untersucht. Der Impfstoff induzierte geringe Gag- und Pol-spezifische T-Zell Antworten in den Studienteilnehmern. Deswegen wurde eine neue Generation von Immunogenen basierend auf GPN entwickelt, die verstärkte Gag-Expression und somit verbesserte Immunogenität induzieren sollten. Zur Verabreichung der Immunogene wurde das NYVAC-Vektorsystem verwendet. Zur Analyse der Vakzine-induzierten direct presentation intrazellulären Antigens wurden Dendritische Zellen (DC) mit den verschiedenen Varianten infiziert. Trotz unvollständiger DC-Maturation wurde die Präsentation des Gag-spezifischen GL9-Peptides festgestellt. Überraschenderweise induzierte das schwach exprimierte Ausgangsantigen GPN stärkere Peptidpräsentation als die besser exprimierten Immunogene der neuen Generation. Außerdem induzierte GPN die umfangreichste cross presentation extrazellulären Antigens. Die Immunogene der neuen Generation induzierten cross presentation in geringerem Umfang und nur unter Einsatz hoher Viruskonzentrationen. Cross presentation wurde hauptsächlich durch die Aufnahme infizierter Zellen ausgelöst. Da die Präsentation eines alternativen Gag-Peptids nicht festgestellt werden konnte wird angenommen, dass nicht jedes im Immunogen enthaltene Peptid auf APCs präsentiert werden kann. Obwohl das künstliche Polyprotein GPN die stärkste Antigenpräsentation auf APC hervorruft, erfordet eine effektive GPN-Vewendung in Impfstoffen eine Verstärkung der Expression ohne die Immunogenität des Proteins zu verringern.

Die biotechnologische Produktion von OS und insbesondere FOS gewinnt zunehmend an Bedeutung. Aufgrund ihrer präbiotischen Eigenschaften stellen sie interessante Produkte für die Pharma-, Kosmetik- und Ernährungsindustrie dar. Aus einer Ftf-Bibliothek konnte die SacB aus B. meg. als geeignetes Enzym für die Transfructosylierung der Akzeptoren Isomaltulose, Xylose und Galacturonsäure (GalA) ermittelt werden. Dabei erwies sich GalA als interessantester Akzeptor (Umsatz zu GalA-Fru 86%). Zur Etablierung einer kontinuierlichen Prozessführung konnte gezeigt werden, dass die Adsorption der SacB an den Träger Bentonit und dem anschließendem Einschluss in Alginat zu Immobilisat führt, das für den Einsatz im kontinuierlich betriebenem System zur Produktion von FOS geeignet ist. Zur kinetischen Beschreibung der SacB wurde ein kinetisches Modell entwickelt, das die Bestimmung der kinetischen Parameter der Akzeptorreaktion mit GalA zur Produktion des GalA-Fru ermöglicht. Die kinetischen Konstanten wurden dabei durch Integration nach Runge-Kutta in Kombination mit dem Simplexalgorithmus zur Parameteroptimierung ermittelt. Die Konzentrationsverläufe der Akzeptorreaktionen konnten sowohl für die native, die adsorbierte als auch die in Alginat eingeschlossene SacB gut durch das Modell beschrieben werden. Die ermittelten kinetischen Parameter verdeutlichten, dass die Immobilisierung der Ftf einen Shift von Hydrolyse zur Produktbildung bewirkt. Für die nachgeschaltete säulenchromatographische Aufreinigung des FOS wurde der Kationentauscher Purolite PCR642 gefunden. Dieser erlaubt eine präparative Gewinnung des GalA-Fru (Ausbeute 44%, Reinheit 75%). Für die kontinuierliche Produktion des GalA-Fru wurde eine Optimierung der Randbedingungen des Prozesses durch mathematische Simulation durchgeführt. Darüberhinaus konnte ein Reaktionssystem bestehend aus einer Wirbelschicht aus Bentonit-Alginat-Immobilisat der SacB aufgebaut werden, das eine kontinuierliche Produktion des GalA-Fru ermöglicht., The biotechnological production of oligosaccharides, in particular FOS, is gaining increasing importance. Due to their prebiotic properties they represent interesting products for the pharmaceutical-, cosmetic- and nutrition industry. The fructosyltransferase SacB from B. meg. was obtained from a fructosyltransferase library which is able to transfructolyse the acceptors isomaltulose, xylose and galacturonic acid (GalA). As a result GalA proved to be the most interesting acceptor (conversion to GalA-Fru 86%). To establish a continuous process, it has been shown that adsorption of SacB on the carrier bentonite followed by encapsulation in alginate leads to immobilisates, which are suitable for the use in a continuously operating system for the production of FOS. For the kinetic description of SacB a kinetic model has been developed which allows the determination of the kinetic parameters of the acceptor reaction with GalA for the production of the GalA-Fru. The kinetic constants were determined through integration by Runge-Kutta in combination with the simplex algorithm of parameter optimization. With the proposed reaction model, the concentration gradient of the acceptor reactions were very well described both for native and adsorbed as well as embedded SacB. The kinetic parameters determined from the model show that the immobilization of the fructosyltransferase led to a shift from hydrolysis to product formation rate. A subsequent column chromatographic method for the purification of FOS was found by using the cation-exchange resin Purolite PCR642. This allows a preparative extraction of GalA-Fru (yield 44%, purity 75%). For the continuous production of GalA-Fru, an optimization of process boundary conditions was performed by mathematical simulation. Moreover a reaction system consisting of a fluidized bed of bentonite alginate immobilisate of SacB has been composed which enabled a continuous production of GalA-Fru.

The studies in this doctoral thesis concentrate on enhancing of WPC performance characteristics with a special bifunctional polydimethylsiloxane (PDMS) coupling agent containing groups of triethoxy and vinyl. Composites manufactured from 70% wood flour and 30% polypropylene (WF/PP 70/30) were investigated to see the influence of this special coupling agent on the WPC performance characteristics. In the first step, wood flour was treated with PDMS using impregnation procedure. Composites were prepared by compounding treated or untreated WF and PP in a lab scale twin screw compounder. Flexural strength test, impact test, moisture and water absorption analysis, morphology and microstructure investigation, Fourier transform infrared analysis and dynamic mechanical analysis were done to determine the properties of WPCs produced with and without PDMS. Also, dicumylperoxide (DCP) was used as the radical initiator for the bonding reaction of the vinyl groups with PP. As a result of these investigations it was found that the optimum amount of coupling agent for 70/30 WF/PP is about 1.75 % PDMS and 0.1% DCP. PDMS with very high molecular weight gave composites with better mechanical properties compared to composites treated with PDMS with lower molecular weights. Also, a better interphase bonding between wood and PP was detected when both vinyl and triethoxy groups were available compared to single functionality PDMS. Covalent bonding was proposed between coupling agent-wood interface through triethoxy reaction with OH-groups of wood during treatment as well as coupling with PP interface through the reaction of the vinyl group initiated by DCP during compounding. These additional bridges between the interfaces of wood and PP could be indirectly indicated by improvements of mechanical properties of WPC but were below the detection limit of the available analytical procedures. The performance of this special PDMS treated WPC was also proven to be comparable with the performance of commercially available MAPP treated composite., Die Arbeiten dieser Doktorarbeit konzentrieren sich auf die Verbesserung der Eigenschaften von WPC durch Einsatz von Polydimethylsiloxan (PDMS) mit den funktionellen Triethoxy- und Vinyl-Gruppen als Haftvermittler. Die Untersuchungen erfolgten mit einem Komposit bestehend aus 70% Holzmehl und 30% Polypropylen (WF/PP 70/30). Es wurde der Einfluss dieses Kopplungsmittels auf die Eigenschaften des WPC ermittelt. Das Holzmehl wurde im Imprägnierungsverfahren zunächst mit PDMS vorbehandelt. Die Komposite wurden dann in einem Labor-Doppelschneckenextruder sowohl aus unbehandeltem als auch aus behandeltem Holzmehl und Polypropylen durch Kompoundierung erzeugt und danach zu WPC-Platten gepresst. An diesem Material wurden Biege- und Schlagfestigkeitstest, Feuchtigkeits- und Wasserabsorptions-Analyse sowie Untersuchung der Mikrostruktur, FTIR und DMA durchgeführt. Auch wurde der Einfluss von Dicumylperoxid (DCP) als Radikalstarter für die Bindungsreaktion der Vinylgruppe mit PP untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass für 70/30 WF/PP die optimalen Mengen des Kopplungsmittels 1,75 % und des DCP 0,1 % betragen. Mit bifunktionalem und hochmolekularem PDMS erzeugte Kompositen zeigten deutlich bessere mechanische Eigenschaften als die Komposite erzeugt mit niedermolekularem PDMS bzw. mit monofunktionalem PDMS. Dieser Befund lässt sich durch eine bessere Interphasenbindung zwischen Holz und PP erklären, insbesondere dann wenn an der PDMS-Polymerkette die chemischen Funktionen der Vinyl- und Triethoxygruppen zur Verfügung standen. Kovalente Bindungen mit den Holzoberflächen sind möglich durch Reaktion der Triethoxygruppe mit den OH-Gruppen des Holzes. Das Kopplungsmittel kann auch mit der Oberfläche des PP reagieren, wenn die Vinylgruppen vom DCP während der Kompoundierung aktiviert werden. Dieser Reaktionsablauf wurde postuliert, lag aber unterhalb der Erfassungsgrenze gängiger Analyseverfahren und zeigte sich nur indirekt in der deutlich Verbesserung der mechanischen Eigenschaften. Es wurde zudem nachgewiesen, dass die Eigenschaften der mit dem PDMS behandelten WPC vergleichbar sind wie die von WPC, die mit dem kommerziellen Haftvermittler Maleinsäureanhydrid MAPP hergestellt werden.

Background Reproducibly high transfection rates with low methodology-induced cytotoxic side effects are essential to attain the required effect on targeted cells when exogenous DNA is transfected. Different approaches and modifications such as the use of nanoparticles (NPs) are being evaluated to increase transfection efficiencies. Several studies have focused on the attained transfection efficiency after NP-mediated approaches. However, data comparing toxicity of these novel approaches with conventional methods is still rare. Transfection efficiency and methodology-induced cytotoxicity were analysed after transfection with different NP-mediated and conventional approaches. Two eukaryotic DNA-expression-plasmids were used to transfect the mammalian cell line MTH53A applying six different transfection protocols: conventional transfection reagent (FuGENE HD, FHD), FHD in combination with two different sizes of stabilizer-free laser-generated AuNPs (PLAL-AuNPs_S1,_S2), FHD and commercially available AuNPs (Plano-AuNP), and two magnetic transfection protocols. 24 h post transfection efficiency of each protocol was analysed using fluorescence microscopy and GFP-based flow cytometry. Toxicity was assessed measuring cell proliferation and percentage of propidium iodide (PI%) positive cells. Expression of the respective recombinant proteins was evaluated by immunofluorescence. Results The addition of AuNPs to the transfection protocols significantly increased transfection efficiency in the pIRES-hrGFPII-eIL-12 transfections (FHD: 16%; AuNPs mean: 28%), whereas the magnet-assisted protocols did not increase efficiency. Ligand-free PLAL-AuNPs had no significant cytotoxic effect, while the ligand-stabilized Plano-AuNPs induced a significant increase in the PI% and lower cell proliferation. For pIRES-hrGFPII-rHMGB1 transfections significantly higher transfection efficiency was observed with PLAL-AuNPs (FHD: 31%; PLAL-AuNPs_S1: 46%; PLAL-AuNPs_S2: 50%), while the magnet-assisted transfection led to significantly lower efficiencies than the FHD protocol. With PLAL-AuNPs_S1 and _S2 the PI% was significantly higher, yet no consistent effect of these NPs on cell proliferation was observed. The magnet-assisted protocols were least effective, but did result in the lowest cytotoxic effect. Conclusions This study demonstrated that transfection efficiency of DNA-expression-plasmids was significantly improved by the addition of AuNPs. In some combinations the respective cytotoxicity was increased depending on the type of the applied AuNPs and the transfected DNA construct. Consequently, our results indicate that for routine use of these AuNPs the specific nanoparticle formulation and DNA construct combination has to be considered.

Ansätze für die Entwicklung selektiv wirkender bakterizider Beschichtungen, die eine Biofilmbildung auf Implantatoberflächen mit Hautdurchtrittsregion verhindern und sich durch eine für die klinische Praxis zufrieden stellende Biokompatibilität auszeichnen, wurden untersucht. Dabei wurde die Fähigkeit von amphiphilen Polymeren zur Schädigung bakterieller Zellmembran sowie die antiseptische Wirksamkeit von Silberionen bei gleichzeitig geringer Toxizität genutzt. Ein möglicher Lösungsansatz beinhaltete die Verwendung von 4-Vinyl-N-hexyl-pyridiniumbromid als antimikrobiell aktive und das Phosphonat Dimethyl(2-methacryloyloxyethyl)phosphonat als oberflächenaktive Komponente. Durch freie radikalische Copolymerisation gelang zunächst die Synthese von Vinylpyridin-haltigen Präpolymeren mit definierten Abstufungen in der Zusammensetzung. Durch polymeranaloge Umsetzung im Rahmen einer N-Alkylierungsreaktion erfolgte die Einführung antimikrobiell aktiver quartärer Ammoniumgruppen. In Abhängigkeit des Beschichtungsmaterials wurden Ausmaß der N-Alkylierung und eingesetztes N-Alkylierungsreagenz variiert. In als Matrices für Kompositmaterialien dienende Copolymere konnte in einem weiteren Schritt durch in-situ Fällungsreaktion die Einlagerung von Silberbromid-Nanopartikeln erreicht werden. Die Anbindung der phosphonathaltigen Polymere und Komposite an Titan(oxid) in Form von ultradünnen Filmen konnte aufgrund ihrer Oberflächenaktivität in einem einfachen Spin Coating-Prozess mit anschließendem Tempern erzielt werden. Die Evaluierung der antimikrobiellen Wirksamkeit der modifizierten Oberflächen und die Evaluierung der Kompatibilität gegenüber humanen Gingivafibroblasten identifizierten die Polymerbeschichtung mit einer Zusammensetzung von (hexyl VP)0.24-co-(DMMEP)0.76 als am besten für die zahnmedizinische Anwendung geeignet. Es wurde ein signifikant antimikrobieller Effekt bei gleichzeitig akzeptabler Biokompatibilität erzielt., Approaches for the development of selective antimicrobial coatings that suppress biofilm formation on implant surfaces passing through human skin and showing sufficient biocompatibility for clinical application were investigated. Therefore the ability of amphiphillic polymers to damage bacterial cell membrane as well as the antiseptic action of silver ions exhibiting low toxicity at the same time was utilized. A possible route comprised the use of 4-vinyl-N-hexylpyridinium bromide exhibiting antimicrobial action and the use of the phosphonate dimethyl 2-methacryloyloxyethyl phosphonate being surface active. Initially synthesis of vinylpyridine based prepolymers by free radical copolymerization showing distinct variation in copolymer composition was achived. Introduction of quarternary ammonium groups showing antimicrobial action was carried out by polymer-analogous reaction in terms of N-alkylation. Depending on the coating material the extend of N-alkylation as well as the N-alkylating reagent applied were varried. In a next step incorporation of silver bromide nanoparticles into polymers serving as matrices for composite materials was achieved via in-situ precipitation reaction. Binding of phophonate containing polymers and composites onto titanium oxide surfaces by formation of ultrathin films could be achieved in a simple spin coating process followed by annealing taking advantage of the surface activity of phophonates. Evaluation of antimicrobial activity of modified surfaces and evaluation of compatibility with human gingival fibroblasts revealed a polymer coating consisting of hexyl VP0.24-co-DMMEP 0.76 as being most suitable for dental application. Significant antimicrobial effect and sufficient biocompatibility could be realized at the same time.

Over the past few decades, advances in hydrogel technologies have spurred development in many biomedical applications e.g. controlled drug delivery for proteins. Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) is one of the most frequently synthetic polymers which are used in biomedical applications. Biocompatibility and biodegradability of that polymer have been proven by many published reports. In this work, dextran and hydroxyethyl starch have been used as important starting polymer materials for developing new hydrogels by modification with HEMA as drug delivery system hydrogels. The degree of substitution (DS) of synthesized polymers was controlled during the coupling reaction in the polymer synthesis stage. Equilibrium swelling behavior of the gels was studied as one of the widely used methods to determine the average molecular weight between two adjacent crosslinks (Mc), the crosslinking density (Px), and the mesh size (?) of the hydrogel network. HES-HEMA, Dex-HEMA and HES-PEGMA hydrogels were successfully synthesized by in-situ hydrogelation via photocrosslinking based on visible light-irradiation, to avoid the risks which are arising from photocrosslinking by the use of UV-irradiation. The visible-light crosslinking method which is used in this study so far is mainly used in dentistry. However, the absorption wavelength of the photosensitizer and its efficiency has to be taken into account in the crosslinking process. Therefore, camphorquinone (CQ) was used in this study as a common photosensitizer in visible-light initiating system. In order to improve the insufficient mechanical properties of virgin hydrogels; nano-filler clays were introduced into the hydrogels particularly montmorillonite and Laponite-RD as model of natural and synthetic clays respectively. Additionally, hydroxyapatite nanoparticles have been investigated as biodegradable nanoparticles. The interactions between nanocomposite materials and polymer networks were evaluated by FTIR and XRD analysis. To overcome the poor solubility of CQ in water, carboxylated-camphorquinone (CQCOOH) was prepared. CQCOOH-amine-DPIC was evaluated to establish an innovative photoinitiating system, in terms of the crosslinking efficiency and the mechanical properties of the prepared hydrogels. HES-HEMA hydrogel which was crosslinked with CQCOOH-amine-DPIC system showed a very fast gelation time (~5 Sec.), more efficient crosslinking and more mechanically stable hydrogel than that was crosslinked with CQ-amine-DPIC. The biocompatibility of polymers and the components of photoinitiating system have been evaluated by MTT-assay using HGF cells. Photoinitiating system components e.g. CQCOOH, NPG, and L-arginine showed no toxic effect on HGF cell viability even in high concentrations., In den letzten Dekaden haben Fortschritte in der Hydrogel-Technologie die Entwicklung in vielen biomedizinischen Anwendungen z.B. der kontrollierten Wirkstofffreisetzung von Proteinen angeregt. Poly(2-hyroxyethylmethacrylat) (PHEMA) ist eines der am Häufigsten verwendeten synthetischen Polymere für biomedizinische Anwendungen. Die Biokompatibilität und die Bioabbaubarkeit dieses Polymers wurden vielfach untersucht und belegt. In dieser Arbeit wurden Dextran und Hydroxyethylstärke als Ausgangsmaterialien für die Modifikation von HEMA verwendet, um neue Hydrogele für die Wirkstofffreisetzung zu entwickeln. Der Substitutionsgrad (DS) der synthetisierten Polymere wurde kontrolliert. Das Gleichgewichtsquellungsverhalten der Gele wurde untersucht, um das durchschnittliche Molekulargewicht zwischen zwei benachbarten Verknüpfungspunkten (Mc), die Verknüpfungsdichte (Px) und die Maschengröße (ξ) des Hydrogelnetzwerkes zu bestimmen. HES-HEMA-, Dex-HEMA- und HES-PEGMA-Hydrogele wurden durch in-situ Hydrogelierung über Photovernetzung mit sichtbarem Licht erfolgreich hergestellt. Das sichtbare Licht wurde verwendet, um die Risiken, die durch eine Photovernetzung mit UV-Strahlung entstehen, zu vermeiden. Die Vernetzung mit Hilfe von sichtbarem Licht wird derzeit hauptsächlich in der Zahnmedizin angewendet. Die Wellenlänge der Absorptionsbande des verwendeten Photosensibilisators und seine Effizienz müssen beim Vernetzungsprozess beachtet werden. Deshalb wurde in dieser Arbeit Campherchinon (CQ), ein gebräuchlicher Photosensibilisator in Initiierungssystemen mit sichtbarem Licht verwendet. Untersuchungen zur Struktur der Oberfläche und des inneren der Hydrogele wurden mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) durchgeführt. Für die Probenpräparation wurde eine spezielle kryofixation/kryobruch-Technik verwendet. Um die ungenügenden mechanischen Eigenschaften der reinen Hydrogele zu verbessern wurden Füllstoffe verwendet. Es wurden Tonmineralien in die Hydrogele eingemischt: Montmorillonit als Modellsubstanz für natürlichen Ton und Laponit-RD für synthetischen Ton. Die Nanostruktur der HES-HEMA/MMT Nanokomposithydrogele wurde mit Weitwinkel-Röntgenstreuung (WAXS) untersucht und so der Schichtabstand zwischen den Silikaschichten des Tonminerals abgeschätzt. Um Campherchinon wasserlöslich zu machen, wurde carboxyliertes Campherchinon (CQCOOH) hergestellt. Das System CQCOOH-Amin-DPIC wurde als innovatives Photoinitiierungssystem, in Hinblick auf die Vernetzungseffiziens und die mechanischen Eigenschaften der entstehenden Hydrogele, entwickelt: HES-HEMA Hydrogele, die mit dem System CQCOOH-Amin-DPIC vernetzt wurden zeigen eine schnelle Gelierung (~ 5 Sek.), eine höhere Vernetzungseffiziens und bessere mechanische Stabilität als Hydrogele, die mit dem System CQ-Amin-DPIC vernetzt wurden. Die Biokompatibilität der Polymere und der Komponenten des Photoinitiierungssystems wurden mit einem MTT-Assay unter Verwendung von HGF-Zellen durchgeführt. Die Komponenten CQCOOH, NPG und L-Arginin zeigten keine Toxizität auf Zellen und dies auch bei hohen Konzentrationen.

Seit den 1990´er Jahren ist das Wort Nano, das griechische Wort für Zwerg, in der Welt der Wissenschaft immer verbreiteter geworden. Nanotechnologie wird als eines der viel versprechendsden Felder in der heutigen Forschung und Entwicklung angesehen. In den vergangenen Jahren sind Partikel in der Größenordnung von 10 bis 50 Nanometern zu einem nützlichen Instrument geworden, um die Eigenschaften einer breiten Varianz von Materialien festzulegen und einzustellen. In der Vergangenheit führte dies zu einigen verschiedenartigen Anwendungen im täglichen Leben, wie zum Beispiel Lacken oder Sonnenschutzcremes oder sogar zur Verbesserung der Kratzfestigkeit von Compact Disks. Daher ist es aussichtsreich zu untersuchen, wie Nanopartikel zur Steigerung der elektrischen Eigenschaften von Isoliermaterialien dienen können, und welchen Einfluss sie auf die Prozessierbarkeit, sowie die chemischen und physikalischen Eigenschaften haben. Indes ist der entscheidende Faktor die Vorauswahl des Füllmaterials in der Kombination mit der Trägermatrix und genau so die Technik des Einbringens. Daher ist es nützlich, eine Testanordnung zu entwickeln, die es erlaubt eine signifikante Anzahl von verschiedenen Materialien zu testen und ein Hochspannungslabor dazu befähigt, die Festigkeit unter elektrischen Feldbedingungen zu untersuchen, die die Entstehung von elektrischen Teilentladungen provozieren. Hierfür wurde eine Testanordnung auf Basis der DIN 60343 entwickelt, mit der leicht herstellbare plattenförmige Prüfkörper getestet werden können. Mit Hilfe unterschiedlicher Elektrodengeometrien können so unterschiedliche elektrische Feldgeometrien erzeugt und der Einfluss auf die verschiedenartigen Materialien geprüft werden. Die Nutzung solcher plattenförmiger Prüflinge erlaubt auch die vorab zerstörungsfreie Untersuchung weiterer in elektrischen Anwendungen interessanter Eigenschaften, wie beispielsweise der Wärmeleitfähigket. Das kann in der Zukunft zu Neuentwicklungen von Isoliersystemen mit verbesserter Ausnutzung, beispielsweise rotierender Maschinen, führen., Since the 1990ies the word änanoö, which is the greek word for ôdwarfö has became more and more common within the world of sciences. Nanotechnology is thought to be one of the most promising fields in research and development of our time. In the future it is expected to become a key technology. Recent years saw particles with the scale of some ten to fifty nanometers becoming a useful instrument to define and adjust properties of a broad variety of materials. In the past this led to some different applications in workaday life, like varnishes or sun protection for instance or even to improve scratch resistance of optical storage media like compact discs. Hence it is beneficial to investigate how nanoparticles can serve to improve the electrical properties of insulation materials and how this affects their behavior during processing and other physical or chemical characteristics. However; a crucial factor is the choice of the filling material in combination with the carrying matrix as well as the filling technology. Hence it is useful to develop a testing arrangement that allows one to perform a significant number of tests on different materials and enables a high voltage laboratory to investigate the strength under electrical stress levels that generate partial discharges. Therefore; a testing device has been developed that uses a very common and easy-to-produce plate shape for specimens. This paper reports an easy way how to modify the testing configuration according to IEC 60343 to create different field geometries as well as different materials to provide some interesting and outstanding results. Using a plate shaped specimen allows the application of further non destructive measurements that provide other material characteristics which are of great interest for some electrical applications like thermal conductivity for instance. This can actually lead to the development of new insulation systems to be used for a more effective design of high voltage devices like rotating machines.

Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden immunologische und molekularbiologische Biochip-Nachweise für Viren, welche als potentielle biologische Waffen angesehen werden, aufgebaut, getestet und optimiert. Die Besonderheit des benutzten Microarray-Systems besteht in der Tatsache, dass die gesamte Nachweis-Reaktion in einer Kartusche mit integriertem Biochip unterbrechungsfrei abläuft und dass die Kartusche – je nach immobilisiertem Fängerset – sowohl für die immunologische als auch molekularbiologische Identifikation von Viren genutzt werden kann. Der immunologische Nachweis auf Basis eines klassischen Sandwich-ELISAs von Alpha- und Orthopockenviren gelang innerhalb von 30 Minuten mit Nachweisgrenzen pro Kartusche von 500 bzw. 200000 infektiösen Einheiten für VacV bzw. VEEV. Der Zeitbedarf für diese molekularbiologische Identifikation der Alpha-, Flavi- und Orthopockenviren betrug anderthalb bis zwei Stunden. Die Titrationen der einzelnen Viren ergaben abhängig vom nachzuweisenden Genabschnitt Nachweisgrenzen im Bereich zwischen 10 und 100 Genomkopien pro Ansatz. Anders als in anderen Biochip-Systemen erfolgt der molekularbiologische Nachweis in dem hier vorgestellten System als direkte Kombination von Nukleinsäureamplifikation und Hybridisierung an die spezifischen Fängersonden. Für diesen unterbrechungsfreien Reaktionsablauf wurde einerseits die Enzym-, Magnesiumchlorid- und Primerkonzentration im Reaktionsmix und andererseits die Temperatur- und Zeitparameter der Prozessierungsbedingungen optimiert. Zusätzlich erfolgte die Weiterentwicklung und Verbesserung der Oligonukleotidsonden für eine sensitive und spezifische Identifizierung verschiedener Virusstämme einer Virusgattung. Für alle untersuchten Alpha-, Flavi- und Orthopockenviren konnten spezifische, signalintensive Nachweise für das Biochip-Format etabliert werden. Ein Parallelnachweis von bis zu drei verschiedenen Viren ist zeitgleich auf dem Biochip mit ausreichenden Sensitivitäten möglich., Within the scope of the present PhD thesis we established, tested and optimized immunological and molecular biochip assays for viruses, which were regarded as prospective biological warfare agents. The specific characteristic of the used microarray system consists in the fact that the whole detection reaction proceeds without interruption inside a cartridge with an integrated biochip. The cartridge can be deployed – depending on the immobilized capture set – either for the immunological or molecular identification of viruses. The immunological analysis of alpha- and orthopoxviruses on the basis of a classical sandwich ELISA succeeded within 30 minutes and resulted in detection limits of 500 and 200000 infectious virus particles per cartridge for VacV and VEEV respectively. The molecular assay for the viral identification of alpha-, flavi- and orthopoxviruses required one and a half to two hours. The titrations of the individual viruses resulted in detection limits between 10 to 100 genome copies per cartridge dependent on the analyzed gene sequence. In comparison to other biochip-systems the molecular identification proceeds inside the introduced AP-system as a direct combination of nucleic acid amplification and hybridization to specific capture probes. For this non-interruptable reaction process the enzyme-, magnesium chloride- and the primer- concentration of the reaction mix as well as the temperature and time parameters of the processing conditions were optimized. Additionally, the oligonucleotide probes were refined and improved for a sensitive and specific identification of several viral strains of one virus genus. Specific and signal-intensive assays for the biochip format could be established for the examined alpha-, flavi and orthopoxviruses. The parallel detection of up to three viruses on the biochip is simultaneously feasible with adequate sensitivities.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Herstellung von Sophoroselipiden mit der Hefe Candida bombicola. Die Arbeit gliedert sich in zwei Teilbereiche: Die Herstellung von Sophoroselipiden aus ungewöhnlichen hydrophoben Co-Substraten im Schüttelkolbenmaßstab. Unter den so entstandenen Produkten sollten Neuartige identifiziert und ihre Struktur aufgeklärt werden. Die Integration eines Verfahrens zur Zellabtrennung in den Produktionsprozess. Es sollte untersucht werden, ob dadurch die Aufarbeitung des Produktes vereinfacht oder die Produktivität des Prozesses erhöht werden kann. Da die Zusammensetzung der Sophoroselipidgemische, die mit C. bombicola hergestellt werden, stark von den verwendeten hydrophoben Co-Substraten abhängt, wurden dafür verschiedene Pflanzenöle, Fettsäuren oder langkettige Alkohole verwendet. Die Analyse der Produktgemische erfolgte mit Dünnschichtchromatographie, Gaschromatographie mit nachfolgender Massenspektrometrie nach saurer Methanolyse oder Kernspinresonanzspektroskopie und Massenspektrometrie. Damit konnte gezeigt werden, dass Kultivierungen mit dem Co-Substrat 2-Hexyl-1-Decanol neuartige Produkte ergeben können. Ein Produkt der Kultivierung mit 2-Hexyl-1-Decanol konnte als neuartiges Alkyl-Glucosid mit verzweigtem hydrophoben Anteil identifiziert werden. Als Verfahren zur Zellabtrennung, das in den Produktionsprozess integriert werden sollte, wurde zunächst die das so genannte Ultrasonically Enhanced Settling gewählt. Dieses relativ neue Verfahren wurde zunächst hinsichtlich seiner Anwendbarkeit mit C. bombicola geprüft, bezüglich verschiedener Einflussgrößen charakterisiert und schließlich in einen laufenden Produktionsprozess integriert. Dabei zeigte sich, dass gute Trennleistungen von über 99 % mit hohen Überlebensraten der Zellen erzielbar waren. Allerdings wurde auch deutlich, dass dieses Trennverfahren empfindlich gegenüber hohen Konzentrationen an hydrophobem Co-Substrat von über 25 g/l war. Bei einer Bioreaktorkultivierung von C. bombicola mit integrierter Ultraschallzelltrennung konnten ca. 23 % des gebildeten Produktes aus dem Prozess abgeschieden und dadurch die Produktaufarbeitung deutlich vereinfacht werden. Des Weiteren wurde die grundsätzliche Durchführbarkeit von aufeinander folgenden Querstrom-Membranfiltrationsschritten im Mikro- und Ultrafiltrationsmaßstab zur Trennung von Zellen und Produkt gezeigt., This work presents the production of sophorose lipids with the yeast Candida bombicola. It is separated into two parts: The production of sophorose lipids using unusual hydrophobic carbon co-substrates on shaking flask scale. Among the products obtained this way, novel ones should be identified and their strucure elucidated. The integration of a cell separation procedure into the production process. It should be examinated if the down stream processing could be facilitated or the process productivity could be increased. Because the composition of the sophorose lipid mixtures produced by C. bombicola strongly depends on the used hydrophobic co-substrates, different plant oils, fatty acids or long-chained fatty alcohols were used for this purpose. The analysis of the product mixtures was performed via thin layer chromatography, gas chromatography and following mass spectrometry after acidic methanolysis or nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry. Thus it could be shown that cultivations using the co-substrate 2-hexyl-1-decanol can result in novel products. One of the cultivation products with 2-hexyl-1-decanol could be identified to be a novel alkyl-glucoside containing a branched hydrophobic part. The procedure chosen at first to be integrated into the production process was the so-called ultrasonically enhanced settling. This rather new procedure was first examined with respect to its applicability with C. bombicola, then several influencing parameters were characterized and finally it was integrated into a running production process. It could be shown that good separation efficiencies of more than 99 % could be achieved at high survival rates of the yeast cells. Nevertheless, the procedure was shown to be sensitive to high concentrations of hydrophobic co-substrate of more than 25 g/L. During a bioreactor cultivation of C. bombicola, about 23 % of the product could be separated during the process using ultrasonically enhanced settling and thus downstream processing could be enormously facilitated. Furthermore, the basic applicability of consecutive cross-flow membrane filtration steps at micro and ultra filtration scale could be shown to be effective in the separation of cells and product.

Die gerichtete Evolution ermöglicht die Modifikation von Proteinen und Nukleinsäuren nach den drei Prinzipien von Darwin - Mutation, Selektion und Replikation. Bisherige Methoden sind durch ihre diskontinuierliche Form und ihre Variantenanzahl limitiert. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Verfahrens zur kontinuierlichen, gerichteten Evolution hochaffiner Protein-Liganden in vitro. Dabei wurde erstmals die Kombination einer fehlerbehafteten DNA-Amplifikation (NASBA) mit einem in vitro Proteinsynthesesystem gezeigt. Verschiedene Parameter der NASBA wurden hinsichtlich einer effizienteren Amplifikation von DNA-Templates optimiert. Mutationen, basierend auf der fehlerbehafteten Aktivität von T7 RNA Polymerase und MMuLV RT, wurden analysiert und die Mutationsraten mit Hilfe des seriellen Transfer-Prinzips gesteigert. Für den Selektionsschritt, basierend auf der Affinität zweier Interaktionspartner, wurde die Expression und Aufreinigung von T7 RNA Polymerase-Fusionsproteinen optimiert. Die Fusion der zu evolvierenden Bindepartner an die MMuLV RT zeigte einen vernachlässigbaren Effekt auf die Reverse Transkriptase-Aktivität. Für die Kombination von NASBA und in vitro Proteinexpression wurde das PURE System, das im Gegensatz zu E.coli Lysaten die DNA-Amplifikation nicht inhibierte, verwendet. Nach Optimierung der Nukleotid- und Magnesiumionenkonzentration konnte erstmals eine funktionelle Kombination von NASBA und in vitro Proteinsynthese in einem Reaktionsansatz stattfinden. Weiterhin wurde gezeigt, dass das NASBA-Produkt als Template für die Proteinexpression fungieren kann und eine endogen exprimierte MMuLV RT ausreichend Aktivität besitzt, um die NASBA anzutreiben. Versuche mit einem Test-Interaktionspaar ergaben, dass der Selektionsschritt innerhalb des Systems weiterer Optimierung bedarf. Damit wurden grundlegende Voraussetzungen für ein System zur kontinuierlichen, gerichteten Evolution hochaffiner Protein-Liganden geschaffen., Directed evolution based on the three principles of mutation, selection and replication has become a popular strategy to modify proteins and nucleic acids. But today’s methods for directed evolution are still limited in their variant diversity and discontinuous in their nature. Aim of this work was to establish an in vitro system for continuous directed evolution of high affinity protein ligands. Thereby, an erroneous DNA amplification method was combined with an in vitro protein synthesis system for the first time. NASBA, an isothermal method to amplify short RNA molecules, was optimised regarding incubation temperature, buffer conditions, enzymes and primers to achieve efficient amplification of DNA templates. Mutations due to the error-prone activities of T7 RNA polymerase and MMuLV RT were analysed and mutation rates could be increased by applying the serial transfer principle. Selection should rely on the affinity of two interacting partners. Expression and purification parameters of T7 RNA polymerase fusion proteins were optimized. The fusion of MMuLV RT to binding partners only hardly affected reverse transcriptase activity. To combine NASBA and in vitro protein expression the PURE System was chosen, which in contrary to E. coli lysates caused no inhibition of DNA amplification during NASBA. The concentrations of nucleotides and magnesium ions turned out to be highly critical and were readjusted to facilitate a functional combination of NASBA and in vitro protein synthesis within one reaction. It was shown that NASBA products can function as templates for protein expression and that endogenously expressed MMuLV RT exhibits enough activity to drive NASBA amplification. First trials with an interacting couple revealed that both - NASBA and in vitro protein synthesis - operate simultaneously, but the selection step needs to be further optimised. In summary, fundamental preconditions for a continuous directed evolution system were established within this work.

Hydrogele aus Hydroxyethlstärke sind aufgrund der guten Biokompatibilität von Hydroxyethylstärke viel versprechende Kandidaten für Drug Delivery Systeme von therapeutisch wirksamen Proteinen. Nach Aktivierung via Carbonyldiimidazol lassen sich Hydroxyethylmethacrylat oder unterschiedliche Polyethylenglykolmethacrylate mit Hydroxyethylstärke zu vernetzbaren Derivaten umsetzen, die in wässrigem Medium mittels Photoinitiator (Irgacure 2959) und UV-Licht vernetzen können. Durch diese Synthesen sind vernetzbare Hydroxyethylstärkederivate möglich, die sich neben dem Substitutionsgrad in der Länge des Spacers zwischen dem Polymerrückgrat und der vernetzbaren Methacrylatgruppe unterscheiden. Durch Umsetzung von Hydroxyethylstärke mittels Glycidylmethacrylat lassen sich zudem Hydroxyethylstärkederivate herstellen, die über eine Esterbindung mit Methacrylatfunktionen substituiert sind und somit keinen Spacer aufweisen. Die aus diesen Hydroxyethylstärkederivaten hergestellten Hydrogele lassen sich mit der Magnetrelaxometrie untersuchen, bei der magnetische Nanopartikel als Sonden in der Hydrogelmatrix eingesetzt werden. Die dabei erhaltenen Resultate für die immobilisierten Nanopartikel nach unterschiedlich langer Bestrahlungsdauer lassen sich sehr gut mit den Messergebnissen der klassischen Hydrogelcharakterisierungsmethoden wie Rheologie und Quellungsmessungen korellieren, so dass sich hier eine neue Art zur Hydrogelcharakterisierung abzeichnet. Diese Hydroxyethylstärkederivate können nicht nur zu Hydrogelzylindern im cm-Massstab umgesetzt werden, sondern lassen sich in einem wässrigem Zwei-Phasen-System mit Polyethylenglycol in Gegenwart von Proteinen zu Mikrosphären umsetzen, so dass ein Einsatz als Drug Delivery System für therapeutisch wirksame Proteine möglich ist., Hydrogels of hydroxyethylstarch are, due to their good biocompatibility promising candidates as drug delivery systems for therapeutic proteins. Crosslinkable derivatives of hydroxyethylstarch can be synthesized by substitution of hydroxyethylstarch with hydroxyethylmethacrylate or different polyethylenemethacrylates after activation with carbonyldiimidazole. By variation of the substituent and its amount, hydroxyethylstarchderivatives with different degree of substitution and different spacerlength between the crosslinkable methacrylate group and the polymer backbone are possible. Adding glycidylmethacrylate to hydroxethylstarch results also in a crosslinkable hydroxyethylstarchderivate, but with an esterbonding between the methacrylate group and the hydroxyethylstarch without any spacer. All these derivatives can be crosslinked in aqueous media with a photoinitiator (Irgacure 2959) and UV-light. The crosslinking can be monitored with magnetorelaxometry by using the relaxation signal of magnetic nanoparticles as probes inside of the hydrogelmatrix. These results correlate good with the results of classic hydrogelcharacterisation methods like rheology and swelling, which shows the potential of magnetorelaxometry as a characterisation method of crosslinkable systems. Next to the crosslinking into hydrogelcylinders in cm-range, it is also possible to use these hydroxyethylstarchderivatives in an aqueous two-phase system with polyethylenglycole in presence of proteins resulting in microspheres. After crosslinking of the microspheres the proteins are immobilzed. These hydrogel microspheres are promising candidates as drug delivery systems for therapeutic proteins.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung von Hydroxyethylstärke-Hydroxyethylmethacrylat-Hydrogele (HES-HEMA) als Freisetzungssystem für Proteine. Aufgrund der besonderen Eigenschaften von Proteinen, stellt deren Anwendung in der Medizin immer noch eine Herausforderung dar. So weisen die meisten Proteine eine geringe Stabilität, kurze Halbwertszeiten und große Molekülgrößen auf. Über ein wässriges Phasenseparationsverfahren wurden Hydrogelmikrosphären mit verschiedenen, eingeschlossenen Testsubstanzen hergestellt und auf ihre Morphologie, Quellungseigenschaften, Einschlusseffektivität und Freisetzung untersucht. Das Freisetzungsverhalten lässt sich über verschiedene Faktoren wie Netzwerkdichte, Molekülgröße der eingeschlossenen Substanz, sowie der Wahl des Akzeptormediums steuern. Wählt man bei der Herstellung der Hydrogele HES-HEMA-Polymere mit hohem Substitutionsgrad (DS) so erhält man Hydrogele mit hoher Netzwerkdichte und stark retardierter Freisetzung. Neben diesen Erkenntnissen wurde die Magnetrelaxometrie als Charakterisierungsmethode für Hydrogele weiterentwickelt. Über die veränderte Beweglichkeit von eingeschlossenen magnetischen Nanopartikeln lässt sich der Abbau des Hydrogels in Abhängigkeit von der Netzwerkdichte beobachten und beschreiben. Um die biologische Aktivität nach der Freisetzung aus dem Hydrogel nachweisen zu können, wurden fluoreszenzmarkierte Antikörper eingesetzt. Dadurch sollte im Vergleich von Fluoreszenzmessungen und Antikörperbindungsaktivität (ELISA) ein Rückschluss auf das Verhältnis von freigesetzten, strukturell veränderten zu funktionalen Antikörpern gezogen werden können. Nach Anpassung der Rezeptur konnte eine Wiederfindungsrate von funktionsfähigem Antikörper von ca. 80 % im Freisetzungsversuch erreicht werden. Demnach ist eine Anwendung der nach dieser Methode hergestellten Hydrogele als Freisetzungssystem für Proteine vielversprechend., The aim of this work was the development and characterisation of Hydroxyethylstarch-Hydroxyethylmethacrylate hydrogels (HES-HEMA) as Drug Delivery System (DDS) for proteins. The clinical application of those proteins is still challenging, because of their unique properties, such as low stability, short circulation half-life and large molecular size. Therefore a successful application of proteins as active ingredients requires an efficient delivery system, which allows gentle entrapment into the DDS and controlled release of physiological amounts of proteins. Hydrogel microspheres were produced by a radical polymerisation of HES-HEMA in an all aqueous two phase system (ATPS) using different encapsulated substances. The Hydrogels were characterised regarding their morphology, swelling properties, encapsulation efficiency and release characteristics. The release properties can be steered by the choice of the network density, the molecular size of the entrapped substance as well as the type of acceptor media. The polymerisation of HES-HEMA-polymers with a high degree of substitution (DS) leads to hydrogels with a high network density and a retarded release. Furthermore a magnetorelaxometry method for the characterisation of network properties was advanced. Due to a changing mobility of magnetic nano particles, the degradation of hydrogels with different network density can be monitored. To analyse the biological activity of proteins after release, fluorescence labelled antibodies where entrapped. After optimisation of the hydrogel formulation a release of 80 % functional antibody was reached. Hence the use of this technique to produce hydrogels as DDS is promising.

It is known that eukaryotic cells have an envelope of carbohydrates – the glycocalyx – which plays a crucial role in cell-cell and cell-ligand interaction processes. Additionally, bacterial glycosylation patterns are in the spotlight. Carbohydrate structures influence inflammation, tomor formation and progression, infections and many other biological processes. Glycobiology is a science on the crossroads of chemistry and biology. Synthesis and analysis of carbohydrate structures demand the application of methods from both fields of science and beyond. Carbohydrates are on the one hand chemically similar, on the other hand its structure determination demands basic chemical methods like nuclear magnetic resonance (NMR) and mass spectroscopy (MS) or even their combination. Glycosyl transferases are carbohydrate-active enzymes and are of outstanding relevance in glycobiology. They are involved in the synthesis as well as the degradation and carbohydrate recognition. In this thesis novel oligosaccharides were synthesized by the consecutive action of two fructosyltransferases. The fructosyltransferases SacB from Bacillus megaterium transfers a fructosyl moiety to different acceptors (galactose, mannose, fucose and xylose). The fructosyltransferase Suc1 from Aspergillus niger synthesizes defined tri- and tetrasaccharides. These oligofructosides were examined concerning their immuno-stimulatory properties by a co-cultivation with human colorectal epithelial carcinoma cells (Caco-2). A test regarding the secretion of 25 different cytokines yielded a significantly high level of interleukin 8 (IL-8) and monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1). The fructosyltransferase SacB from Bacillus megaterium was examined by a intensive mutagenesis study. By enzyme engineering, 27 variants were created on the basis of sequence alignments with fructosyltransferases from other organisms and the solved structure of the fructosyltransferase from Bacillus megaterium (in cooperation with Rebekka Biedendieck and Martin Gamer, Department of Microbiology, TU Braunschweig and Christian Strube, Helmholtz-Centre for Infection Research). The biochemical data of these variants proved their influence on the polysaccharide formation. The variants of the amino acids Y247, N252, K315 and K373 are not located in the active site, but have a clear impact on the poly- vs. oligosaccharide formation. In spite of their altered product spectrum, their kinetic data are similar to the wild-type SacB. On the basis of these examinations, the polymer vs. Oligosaccharide formation mechanism of glycosyltransferases became clearer. Furthermore, a sucrose isomerase from Protaminobacter rubrum was examined. Substrate engineering of this enzyme led to the synthesis of an isomaltulose analogue consisting of a galactose unit instead of glucose. The linkage was determined as alpha-(1,6) analogous to isomaltulose. Finally, chemically functionalized carbohydrates were synthesized and presented on the surface of eukaryotic cells by glycoengineering techniques. In this position they are specific targets on the surface of human larynx carcinoma cells (HEp-2) for further chemical modification. This was performed by the incorporation of azido-functionalized N-acetyl-glucosamine and alkyne-functionalized N-acetyl neuraminic acid. By “click chemistry” with alkynylated rhodamine or azido fluorescein, respectively, these modified carbohydrates were detected., Seit langem ist bekannt, dass eukaryotische Zellen eine Hülle aus Kohlenhydraten (Glycocalyx) besitzen, die eine entscheidende Rolle bei Zell-Zell und Zell-Ligand Interaktionsprozessen spielt. Mehr und mehr treten aber auch bakterielle Glycosylierungen in den Vordergrund. Zuckerstrukturen beeinflussen Entzündungen, Tumorentstehung und -entwicklung, Infektionen und viele andere biologische Prozesse. Die Glycobiologie ist eine Wissenschaft an der Kreuzung zwischen Biologie und Chemie. Aufbau und Analyse von Kohlenhydraten erfordern den Einsatz von Methoden aus beiden Wissenschaftsgebieten und darüber hinaus. Zuckerstrukturen sind einerseits chemisch sehr ähnlich, ihre Strukturaufklärung erfordert aber gängige chemische Methoden wie nuclear magnetic resonance (NMR), mass spectrometry (MS) oder deren Kombinationen. Glycosyltransferasen sind Enzyme, die auf Zucker Aktivität zeigen und sind in der Glycobiologie von besonderer Bedeutung. Sie sind sowohl am Aufbau als auch an Abbau von Zuckerstrukturen sowie der Zuckererkennung beteiligt. In dieser Arbeit wurden durch den prozessiven Einsatz zweier Fructosyltransferasen neuartige Oligosaccharide synthetisiert. Die Fructosyltransferase SacB aus Bacillus megaterium überträgt Fruktose auf verschiedene Akzeptoren (Galactose, Mannose, Fucose und Xylose). Die Fructosyltransferase Suc1 aus Aspergillus niger synthetisiert Tri- und Tetrafructoside von definierter Länge. Diese Oligofructoside wurden auf ihre immmunstimulierende Funktion hin mittels einer Co-Kultivierung mit humanen Darmepithelzellen (Caco-2) untersucht. Ein Test auf Sekretion von 25 unterschiedlichen Cytokinen ergab einen erhöhten Level von Interleukin 8 (IL-8) und monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1). Die Fructosytransferase SacB aus Bacillus megaterium wurde einer intensiven Mutagenesestudie unterzogen. Mittels Enzym-Engineering wurden 27 verschiedene Varianten aufgrund von Sequenzvergleichen mit anderen Fructosyltransferasen sowie der erzeugten Struktur der SacB aus Bacillus megaterium hergestellt (Kooperation mit Rebekka Biedendieck und Martin Gamer, Institut für Mikrobiologie, TU Braunschweig und Christian Strube, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung). Die biochemische Untersuchung der Varianten zeigte deutlich ihren Einfluss auf die Polysaccharidbildung. Die Varianten der Aminosäuren Y247, N252, K315 und K373 liegen nicht im aktiven Zentrum, beeinflussen aber deutlich die Polysaccharidbildung. Trotz der Variation ihres Polymer-Produktspektrums sind ihre kinetischen Daten dem Wildtyp sehr ähnlich. Der Polymer- gegenüber Oligosaccharid-Bildungsmechanismus von Glykosyltransferasen wurde durch diese Untersuchungen klarer. Weiterhin wurde eine Saccharose-Isomerase aus Protaminobacter rubrum untersucht. Substrat-Engineering dieses Enzyms führte zur Synthese eines Isomaltulose-Analogons, das Galaktose anstelle der Glucose-Einheit besitzt. Die Verknüpfungsart wurde durch Spektroskopie als alpha-(1,6), also analog der Isomaltulose, bestimmt. Als letzter Punkt dieser Arbeit wurden chemisch funktionalisierte Kohlenhydrate erzeugt, die mittels Glyko-Engineering auf Zelloberflächen von eukaryotischen Zellen präsentiert werden sollen. Dort sollen sie als spezifisch funktionalisierbare Angriffspunkte dienen, um die Zelloberflächen von humanen Kehlkopfepithelzellen (HEp-2) gezielt zu modifizieren. Dies gelang durch Einbau von Azid-funktionalisiertem N-acetyl-glucosamin sowie Alkin-funktionalisierter N-acetyl-neuraminsäure. Durch „Click Chemie“ mit Alkin-Rhodamin bzw. Azido-Fluoreszein wurden diese Gruppen auf den Zelloberflächen detektiert.

Bei der holographischen Bestrahlung von azobenzenhaltigen Polymerfilmen mit polarisierten Laserstrahlen kommt es zur Ausbildung von Oberflächenreliefgittern (OFG). Der Effekt basiert auf einem massiven Massetransport von Polymerketten weit unterhalb der Glastemperatur des Materials. Die OFG-Ausbildung ist bis zum heutigen Zeitpunkt noch nicht vollständig verstanden; es existieren zwar verschiedene Modelle, jedoch kann keiner der in der Literatur diskutierten Mechanismen alle Beobachtungen und experimentellen Befunde hinreichend erklären. Der Einfluss der Polymerstruktur auf die Effizienz der OFG-Ausbildung kann durch die systematische Variation der molekularen Parameter untersucht werden. Da bisher keine gezielten Studien vorliegen, die ausschließlich die Glastemperatur mit der Effizienz der OFG-Ausbildung korrelieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit azobenzenhaltige Polymere hergestellt, die sich nur in ihrer Glastemperatur unterscheiden und in den weiteren strukturellen Parametern Molekulargewicht bzw. Polymerisationsgrad, Chromophorstruktur und -gehalt sowie Polymerarchitektur übereinstimmen. Der Syntheseansatz beinhaltet in einem ersten Schritt die Darstellung von Präpolymeren mittels der Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) und anschließend deren Umwandlung in die entsprechenden azobenzenhaltigen Derivate in einer polymeranalogen Veresterung. Das Ausmaß, mit dem die verschiedenen Substituenten in den Polymersystemen die Glastemperatur, das freie Volumen und damit die Beweglichkeit der Chromophore und deren Isomerisierung beeinflussen, wurde mittels der Kinetik der thermischen Rückisomerisierung UV/VIS-spektroskopisch untersucht. Diese Resultate wurden mit Untersuchungen zur photoinduzierten Chromophororientierung und Effizienz der OFG-Ausbildung in Beziehung gesetzt., Irradiation of azobenzene-containing polymer films in a holographic setup produces an unexpected modification of the film surface, the so-called surface relief grating (SRG). The mechanism of this macroscopic effect which involves a massive transport of the polymer material well below the glass transition temperature is not yet clarified. Various models have been proposed to explain the formation of photo-induced SRGs, but none can explain all observations described in the literature. The influence of the polymer structure on the efficiency of SRG formation could be investigated by systematically varying the molecular parameters. Since up to now no studies exist correlating the glass transition temperature with the SRG efficiency, it was within the scope of this thesis to synthesize polymers with different glass transition temperature, while not varying the chromophore substitution, chromophore content, polymer architecture, and molecular weight or rather degree of polymerization. In a prepolymer approach, at first, well defined polymers were synthesized using Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) technique, and then subsequently the corresponding azobenzene-containing polymers were obtained via a polymer-analogous reaction. The kinetics of thermal isomerization were studied with UV/vis spectroscopy in order to get information about the influence of the different substituents at the polymer chains on the glass transition temperature, the free volume, and the mobility and isomerization behaviour of the chromophores. These results were correlated with investigations of photo-induced chromophore orientation and SRG efficiency.

Coupling of multiphase fluid dynamics and biological growth is a common area of application in process engineering. At the forefront, environmental conditions and rising energy cost force companies to optimize reactor systems and processes. In optimization problems virtual methods play a major role. Models form the basis of virtual methods. Differences in time scales for computational fluid dynamics and biological growth make direct co-simulation infeasible. A sequential method has to be applied. This work proposes the sequential co-simulation in application to baker's yeast production in a 200 L bubble column reactor. The method combines a module for fluid dynamics implemented in CFX by Ansys and a module for biological growth implemented in Matlab and Simulink by Mathworks. Data interfaces are defined for module changes between sequences. Switching from the fluid dynamics module to the growth module data is mapped to a reduced set of elements by the neural gas algorithm. Computational demand for sequences of growth is significantly reduced. Validation of this method follows two steps. First, computational fluid dynamics are validated with experimental data for axial liquid velocity. Second, growth model and the sequential method are validated with cultivation data. Experimental data has been determined in the same bubble column reactor. Target prediction for the sequential co-simulation deviates less than three percent from measured values., Die Kombination aus Mehrphasenströmung und biologischem Wachstum findet eine weit verbreitete Anwendung in der Prozesstechnik. In erster Linie zwingen anspruchsvolle Auflagen zum Umweltschutz und steigende Energiepreise Unternehmen dazu ihre Anlagen und Prozesse zu optimieren. Virtuelle Methoden sind ein wesentliches Hilfsmittel zur Lösung von Optimierungsproblemen. Modelle stellen die Grundlage für diese Methoden dar. Derzeit ist eine direkte Co-Simulation aufgrund unterschiedlicher Zeitskalen für die Berechnung von Strömungs- und Wachstumsvorgängen nicht machbar. Alternativ werden sequenzielle Methoden angewandt. In dieser Arbeit wird die sequenzielle Co-Simulation am Beispiel der Backhefeherstellung in einem 200 L Blasensäulenreaktor vorgestellt. Implementiert ist diese Methode in Form von zwei Modulen. Das Modul für die Strömungssimulation ist in CFX von Ansys umgesetzt. Das Wachstumsmodell ist als Modul in Matlab und Simulink von Mathworks realisiert. Schnittstellen beschreiben die Datenübergabe zwischen den Sequenzen. Bei der Übergabe von CFX an Matlab werden die Daten mithilfe des Neural Gas Algorithmus einem reduzierten Elementsatz zugeordnet. Damit sinkt der Rechenbedarf für Wachstumssequenzen deutlich. Die sequenzielle Co-Simulation wird in zwei Schritten validiert. Im ersten Schritt dienen Messungen der axialen Komponente der Flüssigkeitsgeschwindigkeit zur Validierung der numerischen Strömungssimulation. Im zweiten Schritt werden experimentell ermittelte Wachstumsdaten mit Ergebnissen des Wachstumsmodells und der sequenziellen Methode abgeglichen. Grundlage der Daten ist immer der gleiche Reaktor. Der mit der sequenziellen Co-Simulation berechnete Zielwert weicht weniger als drei Prozent vom Messwert ab., ibvt-Schriftenreihe: Schriftenreihe des Instituts für Bioverfahrenstechnik der Technischen Universität Braunschweig, vol. 42

Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitärer Schimmelpilz, der durch Inhalation seiner Sporen bei immunsupprimierten und immungeschwächten Patienten eine letale Invasive Aspergillose (IA) auslöst. Aus der mRNA eines klinischen Patientenisolats wurde die cDNA einer neuen, sequenzhomologen Variante der Glykosylhydrolase Crf1 isoliert, die als Crf2 bezeichnet wurde. Rekombinant hergestelltes Crf2 erwies sich in einer aktiven Immunisierung gegen die IA im Mausmodell als protektiv und die Mausseren wurden zur Kartierung der immunogenen Epitope von Crf2 und der sequenzhomologen Glykosylhydrolasen Crf1 und Asp f16 eingesetzt. In der Immunfluoreszenzmikroskopie wurden mit den Immunseren ausschließlich Bereiche aktiven Wachstums auf den Hyphen von A. fumigatus gefärbt und nicht seine ruhenden Sporen. Für die Generierung rekombinanter Crf2-spezifischer Antikörper wurde die Phagen-Display-Technologie eingesetzt. Die Antikörperselektion wurde mit der Antikörpergenbibliothek HAL4/7 und der neu generierten Makaken-Immunantikörpergenbibliothek MAYKI, mit jeweils zwei unterschiedlichen Selektionsstrategien, durchgeführt. Die Wahl der Selektionsmethode hatte für die isolierten Antikörper einen erheblichen Einfluss auf die Art der von ihnen erkannten Epitope. Es wurden gegen direkt immobilisiertes Crf2-Protein nur scFv-Fragmente gegen lineare Epitope und gegen das biotinylierte Antigen in Lösung nur Antikörperfragmente gegen konformationelle Epitope isoliert. Für Antikörperfragmente gegen lineare Epitope des Crf2-Proteins, wurde im capture-ELISA eine geringere Nachweisgrenze festgestellt und zudem eine intensivere Färbung der Hyphen in der Immunfluoreszenz. Die rekombinanten anti-Crf2 Antikörper zeigten ein ähnliches Färbemuster wie die anti-Crf2 Mausseren und wiesen keine Kreuzreaktionen mit anderen humanpathogenen Pilzen auf. Abschließend wurde die Affinität der isolierten Antikörper mittels Oberflächenplasmonresonanztechnologie bestimmt., Aspergillus fumigatus is an ubiquitous mould that causes a lethal invasive aspergillosis (IA) in immunosuppressed and immunocompromised persons via the inhalation of its spores. The cDNA of a new sequence homologue variant of the glycosylhydrolase crf1, called crf2, was isolated from the mRNA of a clinical isolate. The recombinant Crf2-protein was found to be protective in an active immunisation with mice against IA. The immunogenic epitopes of the Crf2-protein and its sequence homologues glycosylhydrolases Crf1 and Asp f16 were determined using these mice sera. Contrary to dormant spores, with these sera were in the immunofluorescence microscopy exclusevely areas of active growing, on hyphaes of A. fumigatus, stained. The phage-display-technology was used to generate recombinant anti-Crf2 antibodies. The antibody selection was performed with the antibody gene library HAL 4/7 and the new generated immune antibody gene library MAYKI, derived from a macaque, in two different selection stratagies. The choice of selection strategy had an enormous influence on the character of the bound epitopes. ScFvs against linear epitopes were only isolated on direct coated Crf2-protein and scFvs against conformational epitopes were isolated when the selection was performed with in vivo biotinylated protein in solution. The detection limit of soluble antigen in the Crf2-capture-ELISA was lower when using scFvs binding linear epitopes and additional showed these scFvs a more intensive staining of hyphae in the immunofluorescence. The recombinant anti-Crf2 antibodies had a similar staining pattern as the anti-Crf2 immune sera of Crf2-immunised mice and did not show any cross reaction with other humanpathogenic fungi. Finally, the affinity for some antibody fragments were determined via the surface plasmon resonance technology

Fucoidan is a natural occurring, heterogeneous sulphated marine polysaccharide from brown algae. Due to its special structure it is said to possess interesting biological activities. During the implementation of this project, methods were developed to extract fucoidan from Fucus vesiculosus (bladder wrack), analyse it, modify it and test it concerning the different biologic activities. The main focus point was to find hydrolytic enzymes as the special sulphatation pattern of the fucoidan may be destroyed by unspecific (e.g. chemical) hydrolysis. In the beginning, the algae were collected and the extraction procedure as well as the purification steps were optimised with regard to the yield of these polysaccharides. As the proportion of fucoidan in the algae is subject to seasonal variations, a yield of 1% could be obtained. Two big fractions of fucoidan were produced. Due to the special heterogeneous structure of the polysaccharides, it was very difficult to characterise them. During the project, several methods for detection were established and developed. The combination of these methods allowed a clearer picture of the produced fucoidans to be drawn. By means of a special carbohydrate gel electrophoresis, size exclusion chromatography, colorimetric tests, elemental analysis as well as a combination of gas chromatography and mass spectrometry, the high molecular fucoidan fraction (FVEhigh), could be elucidated to be 1,300 kDa. The sulphatation degree of this fraction was estimated to be 8.45%. The other fraction (FVElow) was 30-50 kDa in size and had a sulphatation grade of 2.62%. For comparison, commercial fucoidan (Fucoidan Sigma) was estimated to 300 kDa in size and a sulphatation grade of 7.9%. Determination of the monosaccharide composition revealed, that FVEhigh was composed of 78% of fucose and only minor parts of xylose, mannose and galactose. FVElow, however, consisted of only 59% fucose, 4% xylose, 9% mannose and 4% galactose.

Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine schutzgruppenfreie chemoenzymatische Synthese entwickelt, mit der diverse verzweigte Thiooligosaccharide in nur zwei Stufen erhalten werden. Zur Untersuchung von Kohlenhydrat-Protein Wechselwirkungen wurde eine Mikroarray-Plattform geschaffen, welche die Untersuchung minimalster Mengen von Kohlenhydraten im Hochdurchsatzverfahren ermöglicht. Hierbei wurden die Kohlenhydrate auf dem Chip nicht nur immobilisiert, wie es bei bisherigen Arrays üblich ist, sondern Glykosyltransferasen zur Modifikation der gebunden Kohlenhydrate eingesetzt und so die Diversität der Kohlenhydratbibliothek erhöht., Within the scope of this dissertation a protecting group free chemoenzymatic synthesis was developed, with which diverse branched thiooligosaccharides can be synthesized in only two steps. To investigate carbohydrate-protein interactions a microarray platform was developed, which enables the investigation of minimal amounts of carbohydrates in high-throughput manner. The carbohydrates were not only immobilized onto the chip as it is common in previous arrays but glycosyltransferases were used to modifiy the immobilized carbohydrates and thereby enhance the diversity of the carbohydrate library.

Das C-reaktive Protein (CRP) ist ein wichtiger Marker für bakterielle Entzündungen und wird in der Blutserumdiagnostik zeit- und kostenaufwändig in Zentrallaboratorien bestimmt. Gleichzeitig besteht aber auch der Bedarf nach einem point-of-care Mikroanalysesystem für die schnelle CRP-Diagnostik unmittelbar am Patienten, beispielsweise während einer Operation, am Krankenhausbett oder auch zu Hause bei ambulanter Behandlung. Bisher entwickelte CRP-Diagnostiksysteme basieren auf CRP-spezifischen Antikörpern aus Hybridomzellen oder Immunbibliotheken. Dabei fehlen Untersuchungen zur Antikörperstabilität, ein entscheidender Parameter für die spätere Lagerung und Regenerierung des fertigen klinischen Analysesystems. Die in dieser Arbeit aus den semisynthetischen Antikörpergen-Bibliotheken Tomlinson I und J isolierten CRP-spezifischen single chain Fv (scFv)-Antikörperfragmente sind für den Einsatz in mikrofluidische Analysesysteme geeignet. Sie wurden hinsichtlich Affinität und Stabilität sowie ihrer Antigenbindestelle (Epitop) charakterisiert und können aufgrund ihrer hohen Stabilität ohne signifikanten Funktionalitätsverlust für mehr als 2 Wochen bei 37 °C gelagert werden, besitzen eine hohe Affinität im nanomolaren Bereich (1,1 - 2,7 x 10-8 M) und eignen sich für den qualitativen Nachweis von CRP mittels eines Fließsystems. Die hier isolierten und charakterisierten Antikörperfragmente erkennen spezifisch natives CRP als auch partiell denaturiertes Neo-CRP. Die Implementierung der CRP-spezifischen Antikörper in den Quarz-Mikrosensor wurde hinsichtlich Antikörperformat, chemischer Kopplungsmethode und Absättigungsreagenz in goldbeschichteten Mikrotiterplatten optimiert, diese Parameter wurden bereits auf dem mikrofluidischen Quarzsensor umgesetzt. Dabei erfolgten Messungen von reinen CRP-Lösungen auf dem Quarzmikrosensor, nach sechs Regenerationsschritten kam es weiterhin zu einer gleichbleibend sensitiven und spezifischen Detektion von CRP. Mit diesen Messungen wurde erstmals der Einsatz CRP-spezifischer scFv-Antikörperfragmente aus einer semisynthetischen Antikörpergen-Bibliothek in einem Immunosensor, das wiederholte Messungen von CRP in einem konstanten Fluß ermöglicht, gezeigt. Damit gelang die erfolgreiche Isolation und zusätzliche Charakterisierung CRP-spezifischer Antikörperfragmente für die Entwicklung eines quarzbasierten Immunosensors, mit dem sich Blutserumanalysen direkt am Patienten mit einem geringem Zeitaufwand durchführen lassen können., C-reactive protein (CRP) is an important marker for bacterial infections. CRP determination is conducted in centralised laboratories, requiring much time at high costs. Hence, there is a great demand for a "point of care" micro total analysis system (µTAS) for fast and immediate CRP diagnosis, e. g. during surgeries or as bedside tests. Known CRP diagnostic systems are based on antibodies derived from hybridoma cell lines or antibody gene immunolibraries. Until now no examinations concerning antibody stability - a crucial issue for handling and storage of the prefabricated diagnostic system - have been performed. CRP-specific single chain Fv (scFv) were isolated from the semisynthetic antibody gene libraries Tomlinson I and J and can be applied in microfluidic analysis systems. They are characterised regarding affinity, stability and antigen binding site and can be stored for more than 2 weeks at 37 °C without loss of functionality due to their high stability. Additionally they are highly affine, with kD values within the nanomolar range (1,1 - 2,7 x 10-8 M) and are therefore suitable for qualitative determination of CRP via a flow system. The here isolated and characterised CRP-specific antibody fragments bind both native CRP and partial denatured Neo-CRP. Implementation of CRP-specific antibodies into a quartz microsensor system are optimised in a gold coated mitcrotitre plate model regarding to antibody format, bonding technology and blocking solution, furthermore the obtained parameters were transferred to the microfluidic quartz micro sensor. A minimum of 6 repetitive steps of CRP measurement followed by sensor regeneration were possible without loss of sensitivity or specificity. Here, the application of CRP-specific scFv antibody fragments derived from a semisynthetic antibody gene library in an immunosensor was shown for repeatable measurements of CRP in a constant flow. With these measurements the isolation and additional characterisation of CRP-specific antibody fragments for the development of a quartz crystal immunosensor suceeded for fast blood serum analysis as a "point of care" application.

Ligand Sneaking-Proteine sind Antikörperfusionsproteine, mit denen intrazelluläre Signaltransduktionswege moduliert werden sollen. Sie bestehen aus drei Komponenten: Der erste Teil besteht aus einem scFv-Antikörperfragment, mit dem das Protein an einen internalisierenden Zelloberflächenrezeptor bindet. Der zweite Teil besteht aus einer Translokationsdomäne, welche die Translokation des dritten Teils, der Effektordomäne, aus dem Endosom in das Zytoplasma vermittelt. Die Effektordomäne interagiert im Zytoplasma mit Komponenten des Signaltransduktionsweges, um diesen zu modulieren. In einer vorangegangenen Arbeit wurde ein Ligand Sneaking-Fusionsprotein aus einem gegen den Transferrinrezeptor CD71 gerichteten scFv-Antikörperfragment, der Translokationsdomäne ETA II aus dem Pseudomonas Exotoxin A und einer NEMO binding domain (NBD) aus dem humanen IkappaB Kinase 2 (IKK-2)-Protein als Effektordomäne entwickelt. NBD bindet intrazellulär an NEMO (NF-kappaB essential modulator), die regulatorische Untereinheit des IKK-Komplexes, wodurch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB durch proinflammatorische Stimuli unterbrochen wird. Die Ausbeute bei der Produktion des Ligand Sneaking-Antikörperfusionsproteins durch Sekretion in das Periplasma von E. coli war sehr gering. In dieser Arbeit wurden die Ursachen dafür untersucht und mehrere Produktionsmethoden auf ihre Eignung für die Produktion des Fusionsproteins überprüft. Es konnten grundlegende Voraussetzungen für die Produktion von Ligand Sneaking-Antikörperfusionsproteinen geklärt werden. Es stellte sich heraus, dass sowohl der gewählte scFv-Klon als auch die verwendete NBD-Variante die Sekretion massiv behinderten. Durch Austausch des scFv-Antikörperfragmentes und der NBD-Variante im LS-Fusionsprotein gegen andere Varianten ließen sich Fusionsproteine durch Sekretion ins Periplasma von E. coli erfolgreich produzieren und aufreinigen. Das Protein band spezifisch an Zielzellen. Eine Reduktion der NF-kappaB-Aktivität konnte über einen zellbasierten Reporterassay allerdings nicht nachgewiesen werden, wofür eine geringe Affinität des alternativen scFv-Klons und die mangelnde Sensitivität des Assaysystems verantwortlich waren., The Ligand Sneaking concept aims at the manipulation of intracellular signal transduction pathways using antibody fusion proteins that consist of three parts. The first part is an scFv antibody fragment directed against an internalizing receptor on the surface of a target cell. The second part of the fusion protein is a translocation domain that is capable of translocating the third part of the fusion protein, an effector domain, from the endosome into the cytoplasm of the target cell. In the cytoplasm the effector domain interacts with components of the signal transduction pathway, thereby leading to its disruption or down-regulation. In a previous work a Ligand Sneaking fusion protein was developed that consisted of an scFv antibody fragment directed against the transferrin receptor CD71, the translocation domain ETA II derived from the Pseudomonas Exotoxin A and the NEMO binding domain (NBD) derived from the human IkappaB kinase (IKK) 2 protein as the effector domain that binds to the intracellular protein NEMO (NF-kappaB essential modulator). NEMO represents the regulatory subunit of the IKK complex. By binding of NBD to NEMO the formation of the native IKK complex is inhibited. The yield of Ligand Sneaking fusion proteins produced by secretion into the periplasm of E. coli was very low. In this work the potential of several production methods to yield functional fusion protein was evaluated and basic requirements for the production of Ligand Sneaking fusion proteins were identified. It was shown that the scFv antibody fragment and the NBD variant used in the original fusion protein were detrimental to secretion. New anti-CD71 scFv antibody fragments were isolated from phage display libraries und characterised. After exchange of both the scFv antibody fragment and the NBD variant originally used in the Ligand Sneaking fusion protein modified fusion proteins were successfully produced in E. coli and purified. The material specifically bound to target cells. However, using a cell based NF-kappaB activity reporter assay it was not possible to show a reduction of NF-kappaB-activity because of the low affinity of the alternative scFv antibody fragment and the low sensitivity of the assay system.

Rekombinante Antikörper und Antikörperfragmente sind wichtige Hilfsmittel für die Forschung, Diagnostik und Therapie. Seit zwanzig Jahren wird E. coli für die Produktion rekombinanter Antikörperfragmente eingesetzt. Als gramnegatives Bakterium mit einer äußeren Membran weist es jedoch nur eine eingeschränkte Sekretionskapazität für heterologe Proteine auf. Alternative Produktionssysteme, wie grampositive Bakterien, versprechen aufgrund der fehlenden äußeren Membran Vorteile bei der sekretorischen Produktion von Antikörperfragmenten. In dieser Arbeit wurde das grampositive Bakterium B. megaterium für die Produktion und Sekretion von Antikörperfragmenten untersucht. Hierfür wurde der Einfluss von Parametern wie Temperatur, Medium und Produktionsdauer auf die Produktion des anti-Lysozym D1.3 scFv überprüft. Eine Produktionstemperatur von 37 °C – 43 °C, eine Produktionsdauer von 24 h und die Verwendung des reichhaltigen TB-Mediums waren optimal für die scFv-Produktion. Mit den optimierten Produktionsparametern konnten der D1.3 scFv und der anti-CRP LA13-IIE3 scFv in B. megaterium produziert und anschließend aufgereinigt werden. Die Ausbeuten aus den B. megaterium- und E. coli-Produktionen waren vergleichbar. Die in B. megaterium produzierten scFvs zeigten jedoch eine höhere spezifische Aktivität. Der Antikörper D1.3 konnte auch im neuartigen scFabDeltaC-Format in B. megaterium produziert werden. Die aus der B. megaterium-Produktion erzielte Ausbeute war nur wenig geringer als die Ausbeute aus der E. coli-Produktion. Die spezifische Aktivität der aufgereinigten scFabDeltaC-Fragmente war jedoch identisch. In B. megaterium konnte erstmals neben scFv-Fragmenten auch ein scFabDeltaC-Fragment erfolgreich sekretorisch produziert werden. Damit stellt B. megaterium ein alternatives, prokaryotisches Produktionssystem für Antikörperfragmente mit viel Entwicklungspotential dar., Recombinant antibodies and antibody fragments are important tools for research, diagnostic and therapy. Since twenty years E. coli have been used for the production of recombinant antibody fragments. As a Gram-negative bacterium with an outer membrane it possesses a limited secretory capacity for heterologous proteins. Alternative production systems like Gram-positive bacteria have advantages concerning the secretory production of antibody fragments, because they are lacking an outer membrane. In this work the Gram-positive bacterium B. megaterium was tested for the production and secretion of antibody fragments. For this purpose the influence of the parameters temperature, medium and production time on the production of the anti-lysozyme D1.3 scFv were investigated. A production temperature of 37 °C – 43 °C, a production time of 24 h and the usage of the rich TB medium were optimal for scFv production. Using these optimized production parameters the D1.3 scFv and the anti-CRP LA13-IIE3 scFv were produced in B. megaterium and purified afterwards. The yields of the B. megaterium and E. coli productions were comparable, but the scFvs produced in B. megaterium showed a higher specific activity. The antibody D1.3 was also produced in the novel scFabDeltaC format in B. megaterium. The yield of the B. megaterium production was little lower than the yield of the E. coli production. The specific activity of the purified scFabDeltaC fragments was identical. For the first time scFv fragments and a scFabDeltaC fragment were successfully produced and secreted in B. megaterium. For this reason B. megaterium is an alternative, prokaryotic production system for antibody fragments with a great potential for further improvement.

Biofilms – microbial communities on interfaces – are of central importance in nature, technosphere and also for human life. They can beneficially be applied for the treatment of wastewater. A bigger challenge however is provided by the prevention and control of unwanted biofilms. A better understanding of the relevant processes determining biofilm development is thus desirable. Due to the high degree of complexity of biological systems a pure experimental approach does not lead to the desired gain in knowledge. A pure theoretical proceeding on the other hand may lack relation to reality. The aim of this essay is thus to combine mathematical modeling and experimental methods in close interaction in order to shed light onto the coherences determining biofilm development in time and in space. Therefore, recent mathematical modeling tools are applied which allow prognoses about the behavior of biofilm systems on the reactor scale as well as concerning the structural development on the microscale. In terms of the experimental validation of the modeling approaches a recently developed reactor system is presented and tested. The numerical solution (simulation) of the models allows prognoses which are quantitatively compared with results of biofilm cultivations under comparable conditions. Thereby not only a better process understanding but also improvements on the experimental side as well as in terms of the model assumptions are reached. These results bring the focus of this work to the detailed investigation of biofilm detachment phenomena. Here, a mechanical approach is presented regarding the interaction of fluid dynamics and biofilm structure which allows a more detailed analysis., Biofilme – mikrobielle Lebensgemeinschaften auf Grenzflächen – besitzen eine zentrale Bedeutung in der Natur, der Technik und auch für den Menschen. So lassen sie sich häufig nutzbringend in der Abwasserbehandlung einsetzen. Eine größere Herausforderung jedoch stellt die Vermeidung und Kontrolle unerwünschter Biofilme dar. Ein besseres Verständnis der relevanten Prozesse, welche die Entwicklung von Biofilmen bestimmen, ist daher wünschenswert. Aufgrund des hohen Komplexitätsgrads biologischer Systeme erbringt eine rein experimentelle Herangehensweise nicht den gewünschten Erkenntnisgewinn. Einem rein theoretischen Vorgehen mangelt es andererseits am Bezug zur Realität. Das Ziel dieser Arbeit ist es daher, mathematische Modelle und experimentelle Methoden in engem Austausch zu kombinieren, um so die Zusammenhänge zu beleuchten, welche die zeitliche und räumliche Entwicklung von Biofilmen bestimmen. Hierzu kommen aktuelle Biofilmmodelle zum Einsatz, die die Entwicklung von Biofilmsystemen sowohl global, auf Ebene des Reaktors, als auch hinsichtlich der strukturellen Entwicklung auf der Mikroebene prognostizieren können. Seitens der experimentellen Validierung dieser Modellansätze wird ein eigens konzipiertes Reaktorsystem vorgestellt und getestet. Die numerische Lösung (Simulation) der entwickelten Modelle erlaubt Prognosen, die so mit den Resultaten von langfristigen Biofilmkultivierungen quantitativ verglichen werden. Auf diese Weise werden nicht nur ein tieferes Prozessverständnis sondern auch Verbesserungen ebenso auf experimenteller Seite wie auf Ebene der Modellierung erzielt. Die so gewonnenen Erkentnisse bringen den Fokus dieser Arbeit auf die Untersuchung von Abtragsphänomenen in Biofilmsystemen. Hierzu wird ein mechanischer Ansatz präsentiert, der die Interaktion von Fluidströmung und Biofilmstruktur betrachtet und eine detailliertere Analyse dieser noch nicht gut verstandenen Vorgänge zulässt., ibvt-Schriftenreihe: Schriftenreihe des Instituts für Bioverfahrenstechnik der Technischen Universität Braunschweig, vol. 35