Search

Metabolizam galaktoze u stanicama kvasca Saccharomyces cerevisiae zahtjeva funkcionalne enzime Leloirovog biokemijskog puta te transportni protein za unos galaktoze u stanicu. Metabolizam tog šećera kompleksno je reguliran mehanizmima indukcije, kataboličke represije izvorom ugljika te kataboličke inaktivacije. Kad se stanice uzgojene na nešećernom supstratu prenesu u podlogu s galaktozom, dolazi do indukcije enzima Leloirovog puta, koja je pod kontrolom regulacijskih gena GAL4, GAL80 i GAL3. Protein Gal4 veže se na specifična mjesta GAL promotora. Ako nema galaktoze u okolišu, na protein Gal4 se veže negativni regulacijski protein Gal80 i time se sprečava transkripcija. Ako je galaktoza prisutna u okolišu,djelovanjem galaktoze i ATP-a na protein Gal80 veže se protein Gal3 stvarajući Gal4-Gal80-Gal3 proteinski kompleks koji aktivira transkripciju GAL gena. Glukoza snažno reprimira GAL gene, čak i uz galaktozu, a molekularni mehanizam te pojave još nije dovoljno objašnjen . Kad je u okolišu galaktoza , a nema glukoze, transkripcija gena GAL4 je potpuna, čime se održava visoka razina pozitivnog regulacijskog proteina Gal4. Ako se glukoza doda u podlogu s galaktozom, pokreće se složeni slijed djelovanja na molekularnoj razini. Nalaz glukoze u okolišu detektiraju membranski proteini Snf3 i Rgt2 iz porodice Hxt transportnih proteina i senzora glukoze. Oni proizvode signal glukoze, koji se prenosi preko Grr1 i Hxk2 proteina do regulacijskog kruga Reg1 i Glc7. Protein Glc7 defosforilira kompleks Snf1 i tako ga pretvara iz aktivnog u inaktivni oblik. Bez aktivnog Snf1 kompleksa dolazi do dominacije nefosforiliranog oblika proteina Mig1, koji se zatim prenosi iz citoplazme u jezgru gdje stvara kompleks s proteinima Cyc8 i Tup1, koji zajedno čine snažan represor gena GAL4 i GAL2 te skupine strukturnih gena GAL7-GAL10-GAL1. Time se reprimiraju GAL geni za više od tisuću puta u odnosu na de-reprimirane uvjete.

Oxytetracycline is a polyketide antibiotic made by Streptomyces rimosus. From DNA sequencing, the gene product of otcD1 is deduced to function as a bifunctional cyclase/aromatase involved in ring closure of the polyketide backbone. Although otcD1 is contiguous with the ketoreductase gene, they are located an unusually large distance from the genes encoding the 'minimal polyketide synthase' of the oxytetracycline gene cluster. A recombinant, disrupted in the genomic copy of otcD1, made four novel polyketides - all of shorter chain length (by up to 10 carbons) than OTC. All four novel structures contained the unusual carboxamido group, typical of oxytetracycline. This implies that the carboxamido group is present at the start of biosynthesis of oxytetracycline - a topic that has been debated in the literature. Loss of the cyclase protein has a profound influence on the length of polyketide chain assembled, implying that OtcD1 plays a greater role in the overall integrity of the quaternary structure of the polyketide complex than hitherto imagined.

Celotna skupina genov za biosinteze oksitetraciklina (OTC) iz S. rimosus je že klonirana. Eden od načinov, da sa določi vloga določenega gena is skupine genov za biosintezo OTC je, da se identificira metabolit ali metaboliti, katere producira rekombinantni sev, ki ima ta gen prekinjen (neaktiven). Procedura prekinitve otcD-ORF1 gena, domnevne ciklaze je bila izvedena v kromosomu bakterije S. rimosus. Predpostavljalo se je, da je domnevna ciklaza (otcD-ORF1) vpletena v zlaganje, ciklizacijo in aromatizacijo domnevne poliketidne verige v biosintezi OTC. Rekombinantni sev več ni produciral OTC. Sev s prekinjenim otcD-ORF1 genom je produciral večje število novih spojin, ki jih prej ni bilo mogoče zaznati. Izkazalo se je, da posedujejo izolirane spojine 9, 15 in 17 namesto 19 ugljikovih atomov. Poznano je, da je funkcionalna enota PKS razreda II sestavljena iz treh do čestih enodelnih ali dvodelnih encimov, ki v ponavljajočih se ciklih katalizirajo sintezo poliketidne verige. Tako imenovani "chain length factor (CLF)" določa dolžino verige poliketidne molekule. Naši rezultati kažejo, da to le ni popolnoma točno. Namreč, medsebojno delovanje encimov znotraj multi-encimskega kompleksa lahko bistveno vpliva na obliko konačnega produkta.

The entire gene cluster for oxytetracycline (OTC) biosynthesis has been cloned (1) from S. rimosus. A strategy to deduce the function of each gene is to identify the metabolite(s) made by a recombinant which has the gene disrupted, e.g. (2). Gene disruption of a putative cyclase gene, otcD1, was undertaken within the chromosome of S. rimosus. OtcD1 is thought to be involved in the folding, cyclization and aromatization of the hypothetical nonaketide intermediate in OTC biosynthesis. The same procedure was also completed for otcZ , which is thought to methylate either the C-4 or C-6 position of the OTC backbone. However, in this case, the otc cluster was present on low copy number plasmid pIJ941 in S. lividans TK64. The disrupted strains no longer produced OTC. Whereas the strain with the disrupted otcZ gene produced one new compound, the mutant with the disrupted otcD1 gene produced a number of compounds, not detectable in the wild-type strain. Preliminary results showed that those isolated are of polyketide structure. The construction of these mutants and further analysis of the metabolites that they make will be presented. 1. Binnie, C., M. Warren & M. Butler. J. Bacteriol. 171: 887-895, 1989. 2. Khosla, C., S. Ebert-Khosla & D.A. Hopwood. Mol. Microbiol. 21: 3237-3249, 1992.