This work is focused on the application of simple biochemical techniques to study protein-ligand interaction involved in some diseases of frequent incidence, such as Alzheimer’s disease (AD) and cancer. The current therapies for AD, still symptomatic and palliative, from one side act to inhibit AChE, in order to restore the natural level of ACh, and, from the other side act as inhibitors of β-secretase 1 (BACE-1), useful to prevent the A aggregation. Under this regard, efforts have been recently devoted to the development of dual inhibitors of AChE and BACE-1. In this frame, donepezil-like compounds were synthesised, in order to identify novel effective drugs for the treatment of AD. For all these new synthesized analogues, more rigid and diversely substituted compared to donepezil structure, the inhibitor activity on AChE, the selectivity vs BuChE, the side-activity on BACE-1 and the effect on SHSY-5Y neuroblastoma cell viability were tested. Two potential new lead compounds for a dual therapeutic strategy against Alzheimer disease were envisaged. Activation of p53 tumor suppressor by antagonizing its negative regulators MDM2/X has been considered an attractive strategy for cancer therapy. Great effort has been given in the development of drugs able to dissociate the p53•MDM2/X complex. Under this regard, a simple and rapid technique to study the p53–MDM2/X interaction has been developed. This method is based on the different mobility between the interacting domains of the oncosuppressor p53 and its protein ligands MDM2/X on polyacrylamide gels under native conditions. While the two proteins MDM2/X alone were able to enter the gel, the formation of a binary complex between p53 and MDM2/X prevented the gel entry. The novel technique is reliable for determining the different affinity elicited by MDM2 or MDMX toward p53, and for analyzing the dissociation power exerted by small molecules on the complex taking advantage of the appearance of migrating MDM2 or MDMX, when inhibitors are added to the complex mixture. Despite the fact that some other different methods have been employed to study this kind of interaction, including NMR technology, surface plasmon resonance or fluorescence polarization, the relevance of the method here described resides in the fact that it is much more simple and it does not require any tagging/derivatization procedure of the protein fragments employed. This simple and rapid technique can be useful to easily discriminate, among a library of compounds endowed with a potential pharmacological activity against cancer development, the molecules with the highest dissociative potency, preventing the use of expensive and more sophisticated technologies. Questo lavoro ha riguardato l’utilizzo di comuni tecniche biochimiche ottimizzate per lo studio delle interazioni proteina-ligando coinvolte in alcune patologie di frequente incidenza, quali il morbo di Alzheimer ed il cancro. Il morbo di Alzheimer è una patologia neurodegenerativa, progressiva ed irreversibile, caratterizzata principalmente da un’alterazione del sistema colinergico, con conseguente riduzione dei livelli del neurotrasmettitore acetilcolina (Ach), e dall’accumulo extracellulare di placche senili costituite soprattutto dal peptide β-amiloide (Aβ). Allo stato attuale delle conoscenze mediche non c’è ancora una cura definitiva per questa malattia; il trattamento si avvale di terapie farmacologiche di tipo sintomatico e palliativo, il cui scopo è quello di inibire sia le colinesterasi, onde ripristinare i livelli naturali dell’Ach, sia la β-secretasi 1 (BACE-1), per prevenire l'aggregazione del peptide Aβ. A tal fine, composti analoghi del Donepezil, farmaco attualmente utilizzato per le forme lieve e moderata del morbo di Alzheimer, sono stati identificati, mediante procedure di “docking” molecolare, e quindi sintetizzati, mediante procedure di sintesi “eco-friendly”. Per tutte le molecole sintetizzate, strutturalmente più rigide del Donepezil e caratterizzate da gruppi sostituenti differenti, è stato valutato i) l’effetto sull’attività dell’AChE, ii) la selettività nei confronti di BuChE, iii) l’effetto inibitorio sull’attività enzimatica di BACE-1 e iv) la tossicità su linee cellulari di neuroblastoma. Da questi esperimenti è risultato che tra tutti i composti sintetizzati solo due possono essere dei promettenti candidati per lo sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento dell’Alzheimer, essendo caratterizzati da una duplice attività inibitoria, sia nei confronti di AChE che di BACE-1. La proteina p53 regola il ciclo cellulare e svolge la funzione di soppressore tumorale. La sua attività è regolata dalle proteine Minute Double Mourine (MDM) 2 e 4, meglio conosciute come MDM2 e MDMX, le quali agiscono nei confronti di p53 attraverso un meccanismo di tipo feedback negativo, legandosi al dominio idrofobico N-terminale della proteina. In effetti, un’interessante strategia per la terapia del cancro sarebbe ripristinare la funzionalità di p53 antagonizzando l’attività regolatrice negativa di MDM2/X. A tal fine, è stata ottimizzata la comune tecnica dell’elettroforesi in condizioni native, per lo studio dei complessi che l’oncosoppressore p53 forma con MDM2/MDMX. Tale tecnica sfrutta la differente mobilità elettroforetica delle proteine su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti. Il vantaggio di utilizzare l’elettroforesi in condizioni native consiste nell’economicità e nella semplicità della metodica, a differenza dei metodi attualmente utilizzati per lo stesso tipo di analisi, quali ad esempio la tecnica NMR, la risonanza plasmonica di superficie o la fluorescenza polarizzata. Dagli esperimenti condotti, tale tecnica è risultata potenzialmente utile anche per uno screening delle molecole dotate di un potenziale potere farmacologico antitumorale. Dottorato di ricerca in Scienze e tecnologie biologiche ed ambientali (XXVIII ciclo)