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MitoBlue is a fluorescent bisamidine that can be used to easily monitor the changes in mitochondrial degradation processes in different cells and cellular conditions. MitoBlue staining pattern is exceptional among mitochondrial dyes and recombinant fluorescent probes, allowing the dynamic study of mitochondrial recycling in a variety of situations in living cells. MitoBlue is a unique tool for the study of these processes that will allow the detailed characterization of communication between mitochondria and lysosomes We are thankful for the support given by the Spanish grants BFU2013-43513-R, SAF2016-76689-R, CTQ2015-70698-R, RTI2018-099877-B-I00, CTQ2013-49317-EXP, CTQ2013-41339-P, CTQ2016-75870-P, CTQ2015-71896-REDT (Red de Fotoquímica Biológica) and Instituto de Salud Carlos III (ISCIII; RETIC ARADYALRD16/0006/0012), Junta de Andalucía (PI0250-2016 and UMA18-FEDERJA-007), Orfeo-cinqa network CTQ2016-81797-REDC; the Xunta de Galicia (2015-CP082, ED431C 2017/19, Centro Singular de investigación de Galicia accreditation 2019–2022, ED431G 2019/03), the European Union (European Regional Development Fund - ERDF), and the European Research Council (Advanced Grant No. 340055) are gratefully acknowledged. M.E.V. also acknowledges the support provided by the Fundación AECC (IDEAS197VAZQ grant) SI

[eng] G proteins transduce a myriad of signals from receptors at the plasma membrane. Recent reports point to a novel localization of G proteins at the mitochondria and other endomembranes where they regulate the physiology of these organelles. In particular, the Gαq subfamily is required to keep the proper balance between mitochondria fusion and fission acting at both outer and inner membrane, among other functions. In order to unveil the putative effectors of Gαq that mediate those effects at the mitochondria, our group has undertaken a mass-spectrometry analysis based on Gαq immunoprecipitates from cellular endomembranes. The “mito- interactome” study provided evidence of Gαq interaction with the armadillo domain-containing proteins Alex3 and Armc10. Subsequent immunoprecipitation and pull-down studies demonstrated a specific interaction of Gαq with the mitochondrial Rho GTPase 1 (Miro1) and both milton adaptor proteins TRAK1 and 2, that couple mitochondria to kinesin and dynein motor proteins and constitute the main regulators of mitochondrial transport in neurons. To analyze the physiological role of those interactions, we have performed tracking analysis of mitochondria along the axons of hippocampal neurons overexpressing Gαq or its constitutive-active mutant, GαqR183C, as well as activating a Gαq-specific GPCR (DREADD) with its specific agonist. The results of these studies reveal a significant increase in anterograde movement upon Gαq expression, whereas Gαq activation by either expressing the active-mutant or activating the Gαq-specific GPCR induces mitochondrial arrest. In contrast, depletion of Gαq using short-hairpin RNAs increases the number of motile mitochondria and their speed and promotes retrograde transport. Both activation of Gαq or its depletion alter mitochondrial dynamics including fusion/fission events, whereas expression of active-Gαq also alters neuronal physiology by reducing their complexity and dendritic branching. In summary, our group postulates a new non-canonical mitochondrial function of Gαq acting as a molecular switch through its association with Alex3, Miro1 and TRAK2. Gαq would associate to Alex3 and Miro1 to allow mitochondrial movement, whereas its GTP-bound conformation would associate to TRAK2 to halt motility. This process would be regulated by Alex3, which could play crucial roles as an adaptor for the protein complex and Gαq transactivation.

Mitochondria contribute to shape intraneuronal Ca2+ signals. Excessive Ca2+ taken up by mitochondria could lead to cell death. Amyloid beta (A beta) causes cytosolic Ca2+ overload, but the effects of A beta on mitochondrial Ca2+ levels in Alzheimer's disease (AD) remain unclear. Using a ratiometric Ca2+ indicator targeted to neuronal mitochondria and intravital multiphoton microscopy, we find increased mitochondrial Ca2+ levels associated with plaque deposition and neuronal death in a transgenic mouse model of cerebral beta -amyloidosis. Naturally secreted soluble A beta applied onto the healthy brain increases Ca2+ concentration in mitochondria, which is prevented by blockage of the mitochondrial calcium uniporter. RNA-sequencing from post-mortem AD human brains shows downregulation in the expression of mitochondrial influx Ca2+ transporter genes, but upregulation in the genes related to mitochondrial Ca2+ efflux pathways, suggesting a counteracting effect to avoid Ca2+ overload. We propose lowering neuronal mitochondrial Ca2+ by inhibiting the mitochondrial Ca2+ uniporter as a novel potential therapeutic target against AD. Calvo-Rodriguez et al. show elevated calcium levels in neuronal mitochondria in a mouse model of cerebral beta -amyloidosis after plaque deposition, which precede rare neuron death events in this model. The mechanism involves toxic extracellular A beta oligomers and the mitochondrial calcium uniporter.

This article was submitted to Cellular Endocrinology, a section of the journal Frontiers in Endocrinology Volumen 11 Atículo 319. Secretion is an energy consuming process that plays a relevant role in cell communication and adaptation to the environment. Among others, endocrine cells producing hormones, immune cells producing cytokines or antibodies, neurons releasing neurotransmitters at synapsis, and more recently acknowledged, senescent cells synthesizing and secreting multiple cytokines, growth factors and proteases, require energy to successfully accomplish the different stages of the secretion process. Calcium ions (Ca2+) act as second messengers regulating secretion in many of these cases. In this setting, mitochondria appear as key players providing ATP by oxidative phosphorylation, buffering Ca2+ concentrations and acting as structural platforms. These tasks also require the concerted actions of the mitochondrial dynamics machinery. These proteins mediate mitochondrial fusion and fission, and are also required for transport and tethering of mitochondria to cellular organelles where the different steps of the secretion process take place. Herein we present a brief overview of mitochondrial energy metabolism, mitochondrial dynamics, and the different steps of the secretion processes, along with evidence of the interaction between these pathways. We also analyze the role of mitochondria in secretion by different cell types in physiological and pathological settings. Agencia Nacional de Investigación e Innovación FCE_1_2017_1_136021

Os primeiros 1000 dias de vida são uma janela crítica de vulnerabilidade, onde a exposição a fatores ambientais pode influenciar positiva ou negativamente a saúde ao longo da vida. A ingestão exclusiva de leite materno, combinado com o cuidado materno, durante os primeiros seis meses de vida garante um melhor desenvolvimento ao recém-nascido. No entanto, o desmame precoce é uma prática que vem aumentando, a qual tem sido associada ao desenvolvimento de diversas alterações moleculares e comportamentais. Dessa forma, investigamos o efeito do desmame precoce aos 16 dias de vida sobre a homeostase redox e a função mitocondrial no encéfalo de filhotes fêmeas e machos de ratos Wistar, além disso investigamos parâmetros comportamentais aos 60 dias de vida. Os filhotes foram divididos em 4 grupos: (1) desmame controle (desmame aos 21 dias pós-natal), (2) desmame precoce por bromocriptina (desmame aos 16 dias pós-natal), (3) desmame precoce por separação materna combinado com adoção (desmame aos 16 dias pós-natal), (4) desmame precoce por separação materna sem cuidados (desmame aos 16 dias pós-natal). Acompanhamos o peso corporal dos animais desde os 16 até os 59 dias de idade. No 21° dia, parte dos filhotes foram eutanasiados e o hipocampo e o hipotálamo foram removidos para avaliações bioquímicas. Medimos por citometria de fluxo a massa e o potencial de membrana mitocondrial, os níveis de superóxido mitocondrial, espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, óxido nítrico e peroxidação lipídica. Avaliamos também as atividades de algumas enzimas antioxidantes. Os filhotes remanescentes foram submetidos aos testes comportamentais no 60° dia pós-natal. Realizamos os testes de campo aberto a fim de avaliar atividade motora, reconhecimento de objeto novo para avaliar a memória de longa duração de reconhecimento, teste de labirinto em Y para avaliar a memória de trabalho e a disposição dos roedores para explorar novos ambientes e labirinto em cruz elevado para avaliar o comportamento tipo ansioso na prole. Aos 16 dias de vida o desmame precoce por separação materna foi capaz de reduzir o peso corporal dos filhotes; em relação às alterações bioquímicas no hipocampo, o desmame alterou os níveis de óxido nítrico nas fêmeas do grupo desmame precoce por bromocriptina e por separação materna seguido por adoção, além disso a razão das atividades enzimáticas de SOD/GPx+CAT nas fêmeas em ambos os grupos de desmame precoce por separação materna apresentaram um aumento na razão enzimática; e no hipotálamo o desmame aumentou a peroxidação lipídica nos machos de ambos os grupos desmame precoce por separação materna. Aos 60 dias de vida, os filhotes machos apresentaram um peso corporal menor comparado com filhotes controles. Além disso, o peso corporal das fêmeas foi menor que os filhotes machos. Os filhotes machos do grupo desmame precoce por bromocriptina apresentaram um déficit de memória de longa duração, além de apresentarem um comportamento tipo ansioso, o grupo desmame precoce por separação materna seguido por adoção também apresentou um comportamento tipo ansioso. Dessa forma, concluímos que o desmame precoce pode ser prejudicial ao desenvolvimento do sistema nervoso central em relação à homeostase redox e pode promover alterações comportamentais e de aprendizado na vida adulta. The first 1000 days of life are a critical window of vulnerability, where exposure to environmental factors can positively or negatively influence health throughout life. Exclusive intake of breast milk, combined with maternal care, during the first 6 months of life guarantees a better development of the newborn. However, early weaning is an increasing practice, which has been associated with the development of several molecular and behavioral changes. Thus, we investigated the effect of early weaning at 16 days of life on redox homeostasis and mitochondrial function in the brain of female and male pups of Wistar rats, in addition to investigating behavioral parameters at 60 days of life. The pups were divided into 4 groups: (1) control weaning (weaning at 21 postnatal days), (2) early weaning by bromocriptine (weaning at 16 postnatal days), (3) early weaning by maternal separation combined with adoption (weaning at 16 postnatal days), and (4) early weaning by separation without maternal care (weaning at 16 postnatal days). We monitor the animals' body weight from 16 to 59 days of age. On the 21st day, part of the pups was euthanized and the hippocampus and hypothalamus were removed for biochemical evaluations. We measured mitochondrial membrane potential and mass, levels of mitochondrial superoxide, reactive oxygen and nitrogen species, nitric oxide and lipid peroxidation by flow cytometry. We also evaluated the enzymatic activities of some antioxidant enzymes. The remaining pups was subjected to behavioral tests on the 60th postnatal day, we performed the open field test, recognition of new object, Y-Maze test and elevated plus-maze test. At 16 days of age, early weaning by maternal separation was able to reduce the pups’ body weight; in relation to the biochemical changes in the hippocampus, weaning changed the levels of nitric oxide in females in the early weaning by bromocriptine and maternal separation followed by adoption groups. In addition, the SOD/GPx+CAT ratio in the females from both groups of the weaning early maternal separation showed an increase. In the hypothalamus, weaning increased lipid peroxidation in males in both groups of the early weaning by maternal separation. At 60 days of age, male pups had lower body weight compared to control pups, moreover the female body weight was lower than male. Male pups in the early bromocriptine weaning group had a long-term memory deficit evaluated by novel object recognition test, in addition to having an anxious type behavior. The early weaning by maternal separation followed by adoption group also showed an anxious type behavior. Thus, we conclude that early weaning can be detrimental to the development of the central nervous system in relation to redox homeostasis and can promote behavioral and learning changes in adulthood.

A Doença de Alzheimer (DA) tem grande impacto na qualidade de vida das pessoas com a doença e na vida dos familiares por ser uma das doenças neurodegenerativas mais prevalentes, de curso crônico e com prejuízo cognitivo progressivo. Ainda não há tratamento capaz de impedir ou reverter a progressão da DA e a severidade dos sintomas vai aumentando com o tempo, causando importante perda cognitiva, funcional e comportamental nas fases mais avançadas. Nesses estágios mais críticos da doença, há grande necessidade de auxílio de outras pessoas para as atividades da vida diária, maior risco de acidentes e maior frequência de internações hospitalares. Os oligômeros β-amiloide (AβOs) têm grande potencial tóxico e estão envolvidos no dano e morte neuronal em fase que precede a formação das placas amiloide, uma vez que os oligômeros se difundem facilmente pelo cérebro e são capazes de se ligar a receptores e a membranas lipídicas alterando suas funções. Além disso, estudos vem indicando que ocorre falha energética no cérebro de pessoas com DA e essa também pode ser uma das vias pelas quais a doença se inicia e progride. Nesse contexto, ocorre produção ineficiente de ATP e alterações mitocondriais que culminam em um ciclo de deterioração celular: aumento da fosforilação oxidativa para suprir a necessidade energética, com consequente formação de mais espécies reativas, e dano a moléculas e estruturas celulares que agravam intensamente a capacidade de produzir ATP. Por esse ciclo, ocorre disfunção sináptica, redução das espinhas dendríticas e morte neuronal. Neste trabalho, utilizamos um modelo de DA, induzido com AβOs, e avaliamos a memória de curto prazo. Como estratégia terapêutica, utilizamos a Guanosina, um nucleosídeo purinérgico que interage com o sistema glutamatérgico, evitando a excitotoxicidade presente em situações patológicas. A hipótese deste estudo é verificar: i) a contribuição da administração in vivo (via injeção ICV) de oligômeros beta-amiloide nas alterações energéticas, por meio de avaliação mitocondrial e ii) se a administração in vivo (via gavagem) da Guanosina tem efeito neuroprotetor nesse contexto. Os resultados mostram que os AβOs causam déficit de memória de curto prazo na tarefa de reconhecimento de objetos após 24 horas da administração e a GUO recupera o déficit causado pelos AβOs. Em 48h, os AβOs reduziram a captação e oxidação de glutamato em fatias de hipocampo, e reduziram as defesas antioxidantes, sem aumentar o dano oxidativo. Não houve alterações significativas de expressão de genes e de conteúdo de proteínas relacionadas a metabolismo bioenergético cerebral, dinâmica mitocondrial, e membrana sináptica. A GUO recuperou a captação de glutamato, sem alterar a oxidação e apresentou proteção antioxidante. Na avaliação das funções mitocondriais na pré-sinapse (utilizando sinaptossoma e/ou mitocôndria sinaptossomal isolada), os AβOs reduziram a capacidade respiratória reserva e os níveis de ATP, aumentaram a produção de peróxido de hidrogênio, desregularam o tamponamento de Ca2+ e modificaram a morfologia mitocondrial. Enquanto isso, a GUO recuperou a homeostase do Ca2+ e reduziu a proporção de mitocôndrias danificadas. Assim, compreendemos que a GUO apresenta efeito protetor no metabolismo do hipocampo e na atividade mitocondrial, impedindo a deterioração induzida pelos AβOs em funções essenciais para o funcionamento da pré-sinapse hipocampal, incluindo processos de aprendizado e memória. Alzheimer's disease (AD) has a significant impact on people’s quality of life of with the disease and on the lives of family members as it is one of the most prevalent neurodegenerative diseases, with a chronic course and with progressive cognitive impairment. There is still no treatment able to prevent or reverse the AD’s progression, and the severity of symptoms increases over time, causing a critical cognitive, functional, and behavioral loss in the most advanced stages. In these more critical phases of the disease, there is an increased demand for help from others for the daily living activities, increased risk of accidents, and higher frequency of hospital admissions. Amyloid-β oligomers (AβOs) have high toxic potential and are involved in neuronal damage and death in the phase that precedes the formation of amyloid plaques since oligomers easily diffuse through the brain and can bind to receptors and lipid membranes, changing their functions. Also, studies have indicated that energy failure occurs in the brain of people with AD and this can also be one of the mechanisms through which the disease starts and progresses. In this context, there is inefficient production of ATP and mitochondrial changes that culminate in a cycle of cellular deterioration: increased phosphorylative activity to supply the energy need, with the consequent formation of more reactive species, and damage to molecules and cellular structures that aggravate more intensely the ability to produce ATP. Through this cycle, synaptic dysfunction, reduction of dendritic spines and neuronal death occur. In this work, we used an AD model, induced with AβOs, and evaluated short-term memory. As a therapeutic strategy, we used Guanosine, a purinergic nucleoside that interacts with the glutamatergic system, avoiding the excitotoxicity present in pathological situations. The hypothesis in this study is to verify: i) the contribution of in vivo administration of β-amyloid oligomers (via ICV injection) in energy changes, through mitochondrial evaluation and ii) if the in vivo administration of Guanosine (via gavage) has a neuroprotective effect in this context. The results show that AβOs cause short-term memory deficits in the object recognition task in 24 h, and GUO recovers the deficit caused by AβOs. After 48 h AβOs reduced glutamate uptake and oxidation in hippocampus slices, and reduced antioxidant defenses, without increasing oxidative damage. There were no significant changes in gene expression, protein content to brain bioenergetic metabolism, mitochondrial dynamics, and synaptic membrane. GUO recovered glutamate uptake without changing oxidation and provided antioxidant protection. In the assessment of mitochondrial functions in the pre-synapse (using synaptosome preparation or isolated mitochondria from synaptosome), AβOs reduced the spare respiratory capacity and ATP levels, increased hydrogen peroxide production, deregulated Ca2+ buffering, and led to changes in mitochondrial morphology. Meanwhile, GUO recovered Ca2+ homeostasis and reduced the ratio of damaged mitochondria. Thus, we understand that GUO has a protective effect on the hippocampus metabolism and mitochondrial activity, preventing the deterioration of essential functions for the functioning of the hippocampal pre-synapse, including learning and memory processes.

Chromosomal Instability (CIN) and associated aneuploidy are salient features of the majority of human solid tumors. In the Drosophila epithelial model of CIN, the generation of highly aneuploid karyotypes drive cell delamination and c-Jun N-terminal Kinase (JNK) dependent cell death. Aneuploidy associated generation of Reactive Oxygen Species (ROS) plays a key role in the activation of JNK. When delaminating cells are maintained in the tissue by apoptosis inhibition, aberrant karyotypes promote a cell-autonomous malignant behavior. Here we have dissected the molecular mechanisms underlying aneuploidy-induced ROS production and cell delamination. On one hand, we have shown that aneuploidy associated proteotoxic stress is being sensed and activates the major protein quality control mechanisms in a cell. On the other hand, mitochondria act as signaling centers as well as major sensors of the unbalanced proteome in CIN tissues. Aneuploidy associated proteotoxic stress leads to mitochondrial dysfunction and ROS production, which further drives cell delamination as well as JNK activation in CIN tissues. La inestabilidad cromosómica y la aneuploidía son características destacadas de la mayoría de los tumores sólidos en humanos. En el modelo epitelial de Drosophila, la generación de cariotipos altamente aneuploides promueve la delaminación y la muerte celular dependiente de c-Jun N-terminal Kinase (JNK). La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) juega un papel clave en la activación de JNK bajo dichas condiciones. Cuando las células delaminadas se mantienen en el tejido gracias a la inhibición de la apoptosis, los cariotipos aberrantes promueven un comportamiento maligno tumoral. En esta tesis hemos analizado los mecanismos moleculares subyacentes a la producción de ROS como consecuencia de la aneuploidía. Hemos demostrado que bajo una situación de inestablidad cromosómica se genera un estrés proteotóxico, detectado por la célula que activa los principales mecanismos de control de calidad de las proteínas. Además, dicho estrés, promueve la disfuncionalidad de las mitocondrias, favoreciendo la generación de ROS, que a su vez contribuye a la activación de JNK y a la delaminación celular al afectar el citoesqueleto de actina-miosina en los tejidos CIN.

Introducción : El síndrome de Down (SD) es un trastorno multisistémico considerado la causa genética más frecuente de discapacidad intelectual. Es un síndrome relacionado con el neurodesarrollo, caracterizado por un retraso a nivel neurológico que se encuentra vinculado a la enfermedad del Alzheimer (EA). Una característica destacada de esta demencia son los niveles de estrés oxidativo (EO), que pueden tener un impacto en la patogenia del SD. Objetivos : Identificar el rol que desempeña el EO en la etiopatogenia del SD. Metodología: Estudio descriptivo, analítico y transversal basado en una revisión bibliográfica narrativa de los artículos recuperados mediante revisión bibliográfica de la base de datos Pubmed, con impacto Journal Citation Report (JCR). Para la búsqueda se emplearon palabras clave: Down’s syndrome , Oxidative stress , Plaque Amyloid , Alzheimer Disease , Superoxide Dismutase , Mitochondria . Resultados y discusión : A partir de los objetivos planteados, y tras aplicar las estrategias de búsqueda se seleccionaron finalmente 107 artículos, que fueron analizados y discutidos. Conclusiones : Como consecuencia del elevado EO que presentan los pacientes con SD, se produce una gran cantidad de problemas de salud relacionados a su vez etiopatogénicamente con alteraciones genéticas, alteraciones mitocondriales y aparición de placas amiloideas. Introduction : Down Syndrome (SD) is a multisystemic disorder considered the most common genetic cause of intellectual disability. Is a neurodevelopmental-related disease, characterized by a neurological delay that is linked to Alzheimer’s disease (EA), a prominent characteristic of this dementia is the levels of Oxidative Stress (EO), which can have an impact on SD pathogeny. Objectives : To identify the role that EO plays in SD etiopathogenesis. Methodology : Descriptive, analytical and cross-sectional study based on a narrative bibliographic review of the articles retrieved through a bibliographic review of the Pubmed database, with the impact of the Journal Citation Report (JCR). For the search, keywords were used: Down’s syndrome, Oxidative stress, Plaque Amyloid, Alzheimer Disease, Superoxide Dismutase, Mitochondria. Results and discussion : Based on the objectives set, and after applying the search strategies, 107 articles were finally selected, which were analyzed and discussed. Conclusions : As a consequence of the high EO presented by patients with DS, a large number of health problems occur that are etiopathogenically related to genetic alterations, mitochondrial alterations and the appearance of amyloid plaques. Medicina

[Resumen]: La osteoartritis (OA) es una de las enfermedades musculoesqueléticas más prevalentes a nivel mundial, sin embargo, su patogenia es compleja y a día de hoy no está clara. En los últimos años se ha puesto de manifiesto el papel de la mitocondria en la OA, así como el papel de los haplogrupos de ADNmt en su incidencia y progresión. La mitocondria es un orgánulo celular que desempeña una función esencial en el metabolismo de la glucosa y de los ácidos grasos. La concentración de glucosa tiene un efecto sobre el metabolismo celular y la OA ya que altas concentraciones se relacionan con una mayor producción de Especies Reactivas de Oxígeno (ERO). Se ha descrito que los condrocitos sanos son células altamente glucolíticas, aunque obtienen un 25% del ATP por la vía mitocondrial y tienen la flexibilidad metabólica necesaria para adaptarse a los cambios de metabolitos, lo que no ocurre en condrocitos OA. La utilización de un modelo celular in vitro se presenta como una herramienta útil para estudiar de forma simple el papel de la mitocondria en numerosas patologías complejas como la OA. Así, el objetivo de este proyecto es estudiar si la glucosa podría tener un papel modulador en la respuesta mitocondrial en un modelo celular in vitro basado en cíbridos transmitocondriales portadores de mitocondrias sanas y artrósicas. Para ello, se evaluará el estatus mitocondrial, por un lado, analizando el número de copias de ADNmt y la biogénesis mitocondrial y, por otro, analizando la red mitocondrial y los niveles de producción de ERO utilizando MitoTracker Red y MitoSOX respectivamente. Dada la importancia del metabolismo, también se analizarán las concentraciones de tres metabolitos esenciales: la glucosa, el ácido láctico y el piruvato y seguidamente se estudiará la capacidad glucolítica y la función mitocondrial utilizando un SeaHorse XFp Flux Analyzer. Todo ello, como respuesta a la incubación con diferentes concentraciones de glucosa. Traballo fin de mestrado (UDC.CIE). Bioloxía molecular, celular e xenética. Curso 2019/2020

Carotid body glomus cells are multimodal arterial chemoreceptors able to sense and integrate changes in several physical and chemical parameters in the blood. These cells are also essential for O2 homeostasis. Glomus cells are prototypical peripheral O2 sensors necessary to detect hypoxemia and to elicit rapid compensatory responses (hyperventilation and sympathetic activation). The mechanisms underlying acute O2 sensing by glomus cells have been elusive. Using a combination of mouse genetics and single-cell optical and electrophysiological techniques, it has recently been shown that activation of glomus cells by hypoxia relies on the generation of mitochondrial signals (NADH and reactive oxygen species), which modulate membrane ion channels to induce depolarization, Ca2+ influx, and transmitter release. The special sensitivity of glomus cell mitochondria to changes in O2 tension is due to Hif2α-dependent expression of several atypical mitochondrial subunits, which are responsible for an accelerated oxidative metabolism and the strict dependence of mitochondrial complex IV activity on O2 availability. A mitochondrial-to-membrane signaling model of acute O2 sensing has been proposed, which explains existing data and provides a solid foundation for future experimental tests. This model has also unraveled new molecular targets for pharmacological modulation of carotid body activity potentially relevant in the treatment of highly prevalent medical conditions. This research was supported by the Spanish Ministries of Science and Innovation and Health (SAF2012-39343 and SAF2016-74990-R) and the European Research Council (ERC-ADGPRJ201502629).

Type 2 diabetes (T2D) is a very prevalent, multisystemic, chronic metabolic disorder closely related to atherosclerosis and cardiovascular diseases. It is characterised by mitochondrial dysfunction and the presence of oxidative stress. Metformin is one of the safest and most effective anti-hyperglycaemic agents currently employed as first-line oral therapy for T2D. It has demonstrated additional beneficial effects, unrelated to its hypoglycaemic action, on weight loss and several diseases, such as cancer, cardiovascular disorders and metabolic diseases, including thyroid diseases. Despite the vast clinical experience gained over several decades of use, the mechanism of action of metformin is still not fully understood. This review provides an overview of the existing literature concerning the beneficial mitochondrial and vascular effects of metformin, which it exerts by diminishing oxidative stress and reducing leukocyte-endothelium interactions. Specifically, we describe the molecular mechanisms involved in metformin's effect on gluconeogenesis, its capacity to interfere with major metabolic pathways (AMPK and mTORC1), its action on mitochondria and its antioxidant effects. We also discuss potential targets for therapeutic intervention based on these molecular actions. This work was funded by grants PI16/00090, PI19/00838, PI19/0437,PI19/01266 and CIBERehd CB06/04/0071 by Carlos III Health Institute and by the European Regional Development Fund (ERDF ‘‘A way to build Europe’‘); by PROMETEO/2019/027 by Ministry of Education of the Valencian Regional Government; by RTI2018-096748-B-100 (Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities), by Andalusian Ministry of Economy, Innovation, Science and Employment (CTS-6264), Andalusian Ministry of Equality, Health and Social Policies (PI-0198-2016) and by an unrestricted grant from Menarini S.A. M.R and VM.V are recipients of contracts from the Ministry of Health of the Valencian Regional Government and Carlos III Health Institute (CPII16/00037 and CES10/030, respectively) while AG is supported by the Foundation “Juan Esplugues”.

A hipóxia-isquemia neonatal (HI) causa severas sequelas e faz parte da etiologia de diversas doenças neurológicas. Já é bem descrito que o mesmo protocolo de HI que causa danos cognitivos e teciduais significativos em animais no dia pós-natal 7 (P7), ou HIP7, não causa danos em animais mais jovens, HIP3. Os fatores que culminam na diferença de resposta à lesão hipóxico-isquêmica ainda não foram estudados. Diferenças no metabolismo encefálico como utilização de corpos cetônicos e glicose, além de mudanças na função mitocondrial observados durante estes estágios parecem estar entre os fatores que mais contribuem para a diferença de severidade na lesão. Essa tese tem como objetivo estudar a influência desses mecanismos no modelo de HI neonatal induzido em diferentes estágios do desenvolvimento em ratos Wistar. No primeiro capítulo comparamos o efeito da lesão em 3 idades: HIP3, HIP7 e HIP11, com seus respectivos sham. Observamos prejuízos no aprendizado e dano tecidual de maneira dependente da idade, em que o grupo HIP11 possuía déficits de aprendizado e grande lesão tecidual, o grupo HIP7 possuía menor prejuízo, enquanto o grupo HIP3 não apresentava nenhum dano detectável. Através do imageamento por [18F]FDG microPET realizados 24 e 72h após a lesão mostrou um crescimento linear da captação de glicose do encéfalo com a idade, além de um hipometabolismo significativo no hemisfério ipsilateral no grupo HIP11, enquanto o mesmo não foi encontrado no grupo HIP3. Observamos também uma acentuada redução da oxidação de β-hidroxibutirato com o desenvolvimento, sugerindo que a maior contribuição de β-hidroxibutirato e menor de glicose podem estar entre os fatores que conferem ao encéfalo imaturo maior resiliência à lesão. Além disso, foram encontradas correlações significativas entre a captação de glicose (determinada por imageamento por [18F]FDG microPET), principalmente 72h após a HI, e os déficits de aprendizado, bem como a lesão tecidual na idade adulta, mostrando que a técnica é eficaz em prever as consequências da lesão na idade adulta. No capítulo II investigamos diferentes respostas à HI na função mitocondrial, utilizando os grupos HIP3 e HIP11, com seus respectivos sham. Um aumento na apoptose e perda do potencial de membrana mitocondrial foram observados apenas no grupo HIP11. Além disso, observamos um aumento na atividade do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial com o desenvolvimento, na ausência de lesão. A HI induziu uma redução na atividade de enzimas do ciclo TCA, bem como dos complexos mitocondriais apenas no grupo HIP11, sugerindo que um aumento de demanda metabólica no encéfalo em fases avançadas do desenvolvimento pode explicar sua maior susceptibilidade à lesão HI. Ainda, uma maior produção de espécies reativas de oxigênio somadas a uma menor atividade de enzimas antioxidantes também parecem contribuir para o maior dano observado no grupo HIP11. Os resultados da presente tese demonstram que as diferenças no metabolismo encefálico durante o desenvolvimento estão entre os principais determinantes da severidade da HI. O maior uso de corpos cetônicos e a redução do metabolismo encefálico parecem ser alvos terapêuticos importantes que merecem ser mais estudados. Neonatal hypoxia-ischemia (HI) causes severe sequelae and is part of the etiology of several neurological pathologies. It is known that the same HI protocol that causes significant cognitive and tissue damage in animals on the postnatal day 7 (P7), or HIP7, does not cause damage to younger animals, HIP3. The factors that culminate in the different responses to the HI injury have not yet been studied. Differences in brain metabolism such as the use of ketone bodies and glucose, in addition to changes in mitochondrial function observed during these stages seem to be among the factors that contribute to the difference in injury severity. This thesis aims to study the influence of such mechanisms in a model of neonatal HI induced at different developmental stages in Wistar rats. In the first chapter we compare the effect of the injury in 3 ages: HIP3, HIP7 and HIP11, with their respective sham groups. We observed impairments in learning and tissue damage in an age-dependent manner, in which the HIP11 group had learning deficits and more tissue damage, the HIP7 group showed less impairment, while the HIP3 group presented no detectable damage. [18F] FDG microPET imaging performed 24 and 72h after the injury showed a linear increase in brain glucose uptake during development, in addition to a significant hypometabolism in the ipsilateral hemisphere in the HIP11 group, while it was not found in the HIP3 group. We also observed a marked reduction in the oxidation of β-hydroxybutyrate throughout development, suggesting that the greater β-hydroxybutyrate contribution and lower glucose usage may be among the factors that give the immature brain greater resilience to HI injury. In addition, significant correlations were found between glucose uptake (determined by [18F] FDG microPET imaging), especially 72 hours after the HI, and learning deficits, as well as tissue injury in adulthood, showing that the technique is effective in predicting the consequences of the injury in adulthood. In chapter II we investigated different HI-induced responses in mitochondrial function, using the HIP3 and HIP11groups, with their respective shams. An increase in apoptosis and loss of mitochondrial membrane potential was observed in the HIP11 group only. In addition, we observed an increase in the activity of the tricarboxylic acid (TCA) cycle and in the mitochondrial respiratory complexes with development, in the absence of injury. HI induced a reduction in the activity of TCA cycle enzymes as well as in the mitochondrial complexes in the HIP11 group only, suggesting that an increase in metabolic demand in the brain in advanced stages of development may explain its greater susceptibility to HI injury. Still, a higher production of reactive oxygen species associated with a lower activity of antioxidant enzymes also seem to contribute to the greater damage observed in the HIP11 group. The results of the present thesis demonstrate that the differences in brain metabolism during development are among the main determinants of HI severity. The greater use of ketone bodies and the reduction of brain metabolism seem to be important therapeutic targets that deserve further study.

Visceral obesity may be a driving factor in nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) development. Previous studies have shown that the omega-3 polyunsaturated fatty acid, eicosapentaenoic acid (EPA), ameliorates obesity in high-fat (HF) fed male, C57Bl/6 mice at thermoneutral conditions, independent of uncoupling protein 1 (UCP1). Our goals herein were to investigate sex-dependent mechanisms of EPA in the livers of wild type (WT) and UCP1 knockout (KO) male and female mice fed a HF diet (45% kcal fat; WT-HF, KO-HF) with or without supplementation of 36 g/kg EPA (WT-EPA, KO-EPA). KO significantly increased body weight in males, with no significant reductions with EPA in the WT or KO groups. In females, there were no significant differences in body weight among KO groups and no effects of EPA. In males, liver TGs were significantly higher in the KO-HF group and reduced with EPA, which was not observed in females. Accordingly, gene and protein markers of mitochondrial oxidation, peroxisomal biogenesis and oxidation, as well as metabolic futile cycles were sex-dependently impacted by KO and EPA supplementation. These findings suggest a genotypic difference in response to dietary EPA supplementation on the livers of male and female mice with diet-induced obesity and housed at thermoneutrality.

Fil: Brown, Gregory M. Univeridad de Toronto. Centro para la Adicción y la Salud Mental. Ciencias Moleculares del Cerebro; Canadá Fil: Pandi Perumal, Seithikurippu R. Universidad Saveetha. Instituto Saveetha de Medicina y Ciencias Médicas. Hospital Universitario Saveetha; India Fil: Pandi Perumal, Seithikurippu R. Somnogen Canada Inc.; Canadá Fil: Pupko, Harold. Investigador independiente; Canadá Fil: Kennedy, James L. Univeridad de Toronto. Centro para la Adicción y la Salud Mental. Ciencias Moleculares del Cerebro; Canadá Fil: Cardinali, Daniel Pedro. Pontificia Universidad Católica Argentina. Facultad de Ciencias Médicas; Argentina Abstract: This brief review was written to provide a perspective on the flurry of reports suggesting that melatonin can be an important add-on therapy for COVID-19. Despite the passage of more than 60 years since its discovery and much evidence representing the contrary, there has been great reluctance to conceive melatonin as anything other than a hormone. Many other body chemicals are known to have multiple roles. Melatonin was first shown to be a hormone derived from the pineal gland, to be actively synthesized there only at night, and to act on targets directly or via the G-proteincoupled receptors (GPCRs) superfamily. It is of note that over 40 years ago, it was also established that melatonin is present, synthesized locally, and acts within the gastrointestinal tract. A wider distribution was then found, including the retina and multiple body tissues. In addition, melatonin is now known to have non-hormonal actions, acting as a free radical scavenger, an antioxidant, and as modulating immunity, dampening down innate tissue responses to invaders while boosting the production of antibodies against them. These actions make it a potentially excellent weapon against infection by the SARS-CoV-2 virus. Early published results support that thesis. Recently, a randomized controlled study reported that low doses of melatonin significantly improved symptoms in hospitalized COVID-19 patients, leading to more rapid discharge with no side effects, while significantly decreasing levels of CRP, proinflammatory cytokines, and modulating dysregulated genes governing cellular and humoral immunity. It is now critical that these trials be repeated, with dose-response studies conducted and safety proven. Numerous randomized controlled trials are ongoing, which should complete those objectives while also allowing for a more thorough evaluation of the mechanisms of action and possible applications to other severe diseases.

Photobiomodulation therapy (PBMT) uses light to stimulate cells. The molecular basis of the effects of PBMT is being unveiled, but it is stated that the cytochrome-c oxidase enzyme in mitochondria, a photon acceptor of PBMT, contributes to an increase in ATP production and modulates the reduction and oxidation of electron carriers NADH and FAD. Since its effects are not fully understood, PBMT is not used on tumors. Thus, it is interesting to investigate if its effects correlate to mitochondrial metabolism and if so, how it could be linked to the optical redox ratio (ORR), defined as the ratio of FAD/(NADH + FAD) fluorescences. To that end, fibroblasts (HDFn cell line) and oral squamous cell carcinoma (SCC-25 cell line) were irradiated with a light source of 780 nm and a total dose of 5 J/cm2, and imaged by optical microscopy. PBMT down-regulated the SCC-25 ORR by 10%. Furthermore, PBMT led to an increase in ROS and ATP production in carcinoma cells after 4 h, while fibroblasts only had a modest ATP increase 6 h after irradiation. Cell lines did not show distinct cell cycle profiles, as both had an increase in G2/M cells. This study indicates that PBMT decreases the redox state of oral cancer by possibly increasing glycolysis and affects normal and tumor cells through distinct pathways. To our knowledge, this is the first study that investigated the effects of PBMT on mitochondrial metabolism from the initiation of the cascade to DNA replication. This is an essential step in the investigation of the mechanism of action of PBMT in an effort to avoid misinterpretations of a variety of combined protocols.

We developed a highly sensitive oxygen consumption scanning microscopy system using platinized platinum disc microelectrodes. The system is capable of reliably detecting single-cell respiration, responding to classical regulators of mitochondrial oxygen consumption activity as expected. Comparisons with commercial multi-cell oxygen detection systems show that the system has comparable errors (if not smaller), with the advantage of being able to monitor inter and intra-cell heterogeneity in oxygen consumption characteristics. Our results uncover heterogeneous oxygen consumption characteristics between cells and within the same cell´s microenvironments. Single Cell Oxygen Mapping (SCOM) is thus capable of reliably studying mitochondrial oxygen consumption characteristics and heterogeneity at a single-cell level.

HDLs appear to affect regulatory T cell (Treg) homeostasis, as suggested by the increased Treg counts in HDL-treated mice and by the positive correlation between Treg frequency and HDL-cholesterol levels in statin-treated healthy adults. However, the underlying mechanisms remain unclear. Herein, we show that HDLs, not LDLs, significantly decreased the apoptosis of human Tregs in vitro, whereas they did not alter naïve or memory CD4+T cell survival. Sim- ilarly, oleic acid bound to serum albumin increased Treg sur- vival. Tregs bound and internalized high amounts of HDL compared with other subsets, which might arise from the higher expression of the scavenger receptor class B type I by Tregs; accordingly, blocking this receptor hindered HDL- mediated Treg survival. Mechanistically, we showed that HDL increased Treg ATP concentration and mitochondrial activity, enhancing basal respiration, maximal respiration, and spare respiratory capacity. Blockade of FA oxidation by etoxomir abolished the HDL-mediated enhanced survival and mitochondrial activity. Our findings thus suggest that Tregs can specifically internalize HDLs from their microenvironment and use them as an energy source. Furthermore, a novel implication of our data is that enhanced Treg survival may contribute to HDLs’ anti-inflammatory properties. COL0012444

Ischemia/reperfusion injury (IRI) permeates a variety of diseases and is a ubiquitous concern in every transplantation proceeding, from whole organs to modest grafts. Given its significance, efforts to evade the damaging effects of both ischemia and reperfusion are abundant in the literature and they consist of several strategies, such as applying pre-ischemic conditioning protocols, improving protection from preservation solutions, thus providing extended cold ischemia time and so on. In this review, we describe many of the latest pharmacological approaches that have been proven effective against IRI, while also revisiting well-established concepts and presenting recent pathophysiological findings in this ever-expanding field. A plethora of promising protocols has emerged in the last few years. They have been showing exciting results regarding protection against IRI by employing drugs that engage several strategies, such as modulating cell-surviving pathways, evading oxidative damage, physically protecting cell membrane integrity, and enhancing cell energetics.

[eng] Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease, and the most common movement disorder in the world population. In most cases its aetiology is still unknown, however, mitochondrial alterations and autophagy deregulations are some of the molecular mechanisms that are altered in this disease. These molecular alterations of PD are not limited only to the destruction of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta, but they have also been described in the peripheral nervous system and the organs that it innervates. There is also evidence of the presence of other molecular alterations in diverse tissues, such as dysfunction of Complex I of the mitochondrial respiratory chain and accumulation of alpha synuclein in fibroblasts of patients with PD. One of the great difficulties the research and understanding of the mechanisms that lead to PD is the inaccessibility of the target tissue of the disease. In the best of cases, autopsy tissue from patients with advanced PD is available, leaving a question mark about the molecular processes of prodromal and early stages of the disease. Animal models have helped to unravel some questions, but the development of accessible and replicable cell models, preferably at low cost, is much needed. It is in this context that the cellular models obtained from PD patients and from asymptomatic carriers of genes associated with the disease are of great importance and require validation. The present thesis consists of the study of two cell models obtained from patients with PD associated with the LRRK2 mutation (G2019S), asymptomatic carriers of LRRK2 (G2019S) and homozygous and heterozygous carriers of GBA (N370S); which are the genes most frequently associated with familial PD and the most important genetic risk factor for PD, respectively. First, the mitochondrial and autophagic profile of fibroblasts derived from the skin of asymptomatic carriers of the LRRK2 (G2019S) mutation and with PD were analysed. The analysis was carried out under two conditions, keeping the fibroblasts in a standard culture medium (DMEM with 25mM glucose) and after subjecting them to a mitochondrial challenge for 24 hours (DMEM with 10mM galactose), in order to simulate the oxidative environment of neurons. dopaminergic. In this study, a genotype-phenotype correlation was confirmed in fibroblasts obtained from asymptomatic carriers of the LRRK2 (G2029S) mutation and patients with PD linked to this same mutation, and it was demonstrated that a mitochondrial and autophagic function profile allows to differentiate between groups. The second study explored the genotype-phenotype correlation in a cellular model characterized by neurospheres, a conglomerate of cells obtained from the dedifferentiation of human adipocytes into neuronal stem cells, and its relationship with the onset of macroautophagy in subjects carrying the mutation GBA (N370S). The main finding of this study is that mitochondrial dysfunction preceded alterations of macroautogphagic flux in subjects carrying the GBA (N370S) mutation. In conclusion, the study of asymptomatic subjects carrying mutations associated with PD represents a relevant study method that shows initial molecular alterations and the presence of compensatory mechanisms that can be studied for the development of preventive strategies and treatments in early stages of the disease., [spa] La enfermedad de Parkinson (EP) es el trastorno de movimiento más frecuente en la población mundial. Considerada mayoritariamente idiopática y multifactorial, alteraciones mitocondriales y en la regulación autofagica son algunos de los mecanismos moleculares que se han encontrado alterados en la etiopatología de la enfermedad. El descubrimiento de genes relacionados a formas familiares de EP, del cual LRRK2 es el más frecuente, y los genes que aumentan el riesgo de padecer la enfermedad, como GBA, han abierto un campo de estudio en el cual se pueden analizar los mecanismos moleculares que llevan a la neurodegeneración en formas genéticas de la EP. La presente tesis consiste en el estudio de dos modelos celulares obtenidos a partir de portadores asintomáticos de LRRK2(G2019S) (NMLRRK2(G2019S)), pacientes con EP asociada a la mutación LRRK2(G2019S) (PDLRRK2(G2019S)), así como de portadores homozigotos y heterozigotos de GBA(N370S). El primer estudio analizó el perfil mitocondrial y autofágico de fibroblastos NMLRRK2(G2019S) y PDLRRK2(G2019S). El análisis se realizó en dos condiciones, en un medio de cultivo estándar (DMEM, glucosa 25mM) y tras someterlos 24 horas a un reto mitocondrial (DMEM, galactosa 10mM), simulando el ambiente oxidativo de las neuronas dopaminérgicas. En este estudio se confirmó una correlación genotipo-fenotipo en fibroblastos obtenidos de ambos grupos y una función mitocondrial y autofágica que permite diferenciarlos entre ellos. El segundo estudio exploró la correlación genotipo-fenotipo en un modelo celular caracterizado por neuroesferas, un conglomerado de células obtenido a partir de la desdiferenciación de adipocitos humanos en células madres neuronales, y su relación con el inicio de la macroautofagia en sujetos portadores de la mutación GBA(N370S). El hallazgo principal de este segundo estudio es que la disfunción mitocondrial precede a las alteraciones del flujo macroautofágico en sujetos portadores de la mutación GBA(N370S). El estudio de sujetos asintomáticos portadores de mutaciones asociadas a PD representa un relevante método de estudio que evidencia alteraciones moleculares iniciales y la presencia de mecanismos compensatorios que pueden ser estudiados para el desarrollo de estrategias preventivas y tratamientos en lateabas tempranas de la enfermedad.

Memoria de Trabajo fin de Máster presentada por Irene Costa Laparra, para obtener el Máster en Neurociencia por la Universidad Complutense de Madrid (UCM), realizada bajo la dirección de la Dra. Rosario Moratalla Villalba y la Dra. Patricia Julia García Sanz.-- 31 páginas., Alzheimer’s disease is the most common neurodegenerative disease, characterized by memory loss and the presence of senile plaques and neurofibrillary tangles in the brain. Numerous studies relate this disease with several biochemical and cellular alterations like the loss of synapses, neuronal death, disruption of lipid homeostasis, mitochondrial fragmentation or elevated oxidative stress. However, most recent studies are focused in the alterations of the autophagic pathway, which has turned out to be a key factor in the development of the disease. The present research is aimed to determine the impact of the APOE allele ε4 and a mutation in PS1 on the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Through biochemical, immunofluorescence, flow citometry and confocal microscopy techniques, we have determined that fibroblasts derived from Alzheimer’s disease patients show different vulnerabilities to oxidative stress, being APOE 4/4 and APOE 3/3 genotypes less vulnerable and APOE 3/4 + PS1 more sensitive to reactive oxygen species. In addition, homozygosis for the APOE allele ε4 also induces more fragmentation of the mitochondrial network and a tendency to increased mitophagy. Furthermore, fibroblasts carrying the mutation in PS1 also show alterations in the mitochondrial network structure, as well as an increased lysosome accumulation and grouping. All these modifications could eventually be responsible for the neuronal degeneration that underlies the pathogenesis of Alzheimer’s disease., El Alzheimer es la enfermedad neurodegenerativa más común, caracterizada por la pérdida de memoria y la presencia de placas seniles y ovillos neurofibrilares en el cerebro. Numerosos estudios relacionan esta enfermedad con diversas alteraciones bioquímicas y celulares como la pérdida de sinapsis, la muerte neuronal, perturbaciones de la homeostasis lipídica, desestructuración mitocondrial y aumento del estrés oxidativo. Sin embargo, la mayoría de los estudios recientes se centran en alteraciones en la vía de la autofagia, que está resultando ser una pieza clave en el desarrollo de la enfermedad. Este trabajo se centra en el estudio del impacto del alelo ε4 del gen APOE y una mutación en PS1 sobre la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer. Empleando técnicas bioquímicas, de fluorescencia, de citometría de flujo y de microscopía confocal, hemos determinado que los fibroblastos de pacientes con Alzheimer presentan una diferente vulnerabilidad al estrés oxidativo, siendo los genotipos APOE 4/4 y APOE 3/3 menos vulnerables y el APOE 3/4 + PS1 más sensible. El alelo e4 del gen APOE en homocigosis induce también una mayor fragmentación de la red mitocondrial, así como una tendencia al incremento de la mitofagia. Además, la presencia de la mutación en PS1 también genera alteraciones en la estructura de la red mitocondrial, así como una acumulación de lisosomas y una mayor agrupación de los mismos. Todas estas modificaciones podrían ser responsables, en última instancia, de la degeneración neuronal que subyace a la enfermedad de Alzheimer.

Tesis Doctoral presentada por Rebeca Torres Merino para optar al grado de Doctora por la Universidad de Valladolid, Facultad de Medicina: Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología., La mitocondria es un orgánulo intracelular que está involucrado en diferentes vías metabólicas, pero su principal función es la producción de la mayor parte de la energía que requiere la célula para su funcionamiento mediante la fosforilación oxidativa (OXPHOS). Trece de las proteínas que forman parte de los complejos mitocondriales son codificadas por el DNA mitocondrial. La mitocondria posee maquinaria de transcripción y traducción propias. Una de las familias de proteínas mitocondriales descubiertas recientemente, ha sido la familia FAST (Fas-activated Serine/Threonine phosphoprotein), que incluye cinco miembros (FASTKD 1-5), además de FAST, el miembro fundador. Todos ellos poseen un dominio RAP, mediante el cual se unen al RNA. Muy recientemente se ha descrito la importancia de FAST, FASTKD2, FASTKD4 y FASTKD5 en la regulación del metabolismo del RNA mitocondrial y traducción mediante ensayos de silenciamiento y en modelos knockout, con importantes consecuencias en el funcionamiento de la cadena respiratoria mitocondrial. Nuestro grupo ha descrito previamente que el silenciamiento de FASTKD3 produce alteraciones en la respiración mitocondrial. En este trabajo de tesis, estudiamos los mecanismos moleculares que subyacen en esta alteración. Hemos generado como herramienta de trabajo una línea celular U2OS FASTKD3 knockout mediante el uso de un plásmido donante y nucleasas TALENs (Transcription Activator Like Effector Nucleases). Nuestros estudios, mediante Northern-blot y qRT-PCR, revelan que la ausencia de FASTKD3 produce un aumento de los niveles basales de 6 de los 13 mRNAs mitocondriales (ND2, ND3, ND4/4L, COX2, CYTB y ATP6/8), y también observamos que sus vidas medias están alargadas. Nuestros estudios de mapeo revelan que el dominio RAP, y en particular, cinco de sus aminoácidos altamente conservados, son claves en esta función de FASTKD3. Asimismo, nuestros estudios de traducción mitocondrial revelan una disminución específica en la traducción del transcrito COX1, subunidad clave en el funcionamiento del complejo IV mitocondrial. En conclusión, esta tesis introduce a FASTKD3 como un elemento clave en la estabilidad de los transcritos mitocondriales ND2, ND3, ND4/4L, COX2, ATP6/8 y CYTB y como regulador de la traducción de COX1. Esta importante investigación abre las puertas para encontrar relaciones entre nuestra molécula de estudio y enfermedades mitocondriales que puedan estar asociadas a ella, pudiendo dar una explicación precisa de los mecanismos moleculares responsables de las mismas., El trabajo realizado en esta tesis ha sido financiado por: Consejería de Educación. Junta de Castilla y León (VA244A11-2). Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigación Sanitaria, FIS (PI10/02511). Fundación Ramón Areces CIVP16A1843). Beca Fundación Ramón Areces de doctorado (29 meses).

A pesar de la importancia del Ca2+ como segundo mensajero intracelular, aun existen discrepancias en la literatura sobre los niveles de Ca2+ que se alcanzan en el interior de la mitocondria tras un estímulo fisiológico. En esta tesis se ha realizado una comparativa detallada de los diferentes métodos de medida del Ca2+mitocondrial y además se han desarrollado nuevos métodos de medida para dicho Ca2+. Gracias a estas nuevas técnicas hemos podido realizar un estudio exhaustivo de los flujos de entrada y salida del Ca2+, tanto en células HeLa intactas como permeabilizadas. Hemos esclarecido algunos puntos tales como la dependencia de Ca2+ de la apertura del poro de transición de permeabilidad, la relación intramitocondrial entre Ca2+-libre/Ca2+ ligado, el efecto del fosfato en los niveles de Ca2+ mitocondriales o la dependencia d la salida del Ca2+ mitocondrial con el Na+ citosólico., Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología, Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM)

La excesiva proliferación celular contribuye al desarrollo de enfermedades como la aterosclerosis y la restenosis. Los anti-inflamatorios no esteroideos (AINEs) inhiben esa excesiva proliferación independientemente de su actividad anti-inflamatoria. La entrada de Ca2+ operada por depósitos (SOCE) es importante en la proliferación de las células de músculo liso vascular (VSMCs), por lo que estudiamos los canales de Ca2+ de estas células y el efecto antiproliferativo de ciertos AINEs. Utilizando las técnicas de medida de Ca2+ citosólico y mitocondrial, registros electrofisiológicos, qRT-PCR y western-blotting realizamos nuestro estudio en células A10 y un cultivo primario de células de músculo liso de arteria coronaria humana. Los resultados obtenidos muestran que SOCE, y las mitocondrias, que modulan esta vía, son esenciales en la proliferación de las VSMCs. Además, los AINEs actúan directamente sobre las mitocondrias y consecuentemente sobre SOCE, explicando de esta forma su efecto antiproliferativo., Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología

[eng] The mitochondrial Seryl-tRNA Synthetase (SerRS2) is a member of the class II tRNA synthetase family. The mature enzyme catalyses the ligation of serine to tRNASer in mitochondria. During the process of constructing a model for human disorders caused by mitochondrial tRNA aminoacylation deficiencies in Drosophila melanogaster, a previously uncharacterized paralogue of SerRS2 named Seryl-tRNA synthetase-Like Insect Mitochondrial Protein (SLIMP) was identified. SLIMP is a new type of aminoacyl tRNA synthetase-like protein that has acquired an essential function in insects. This fast evolving paralogue is a mitochondrial RNA-binding protein which lacks tRNA aminoacylation activity. It has been previously demonstrated that mitochondrial SLIMP interacts with its homologue SerRS2 and also with LON protease. We confirmed these interactions and we described the function of SLIMP by depleting its protein levels in Drosophila melanogaster S2 cells, which led to severe defects in mitochondrial function and cell cycle arrest. We found that SLIMP simultaneously acts as a regulator of DNA replication and translation in the mitochondria and, as regulator of cell cycle progression. We show that SLIMP activates mitochondrial protein synthesis through its interaction with SerRS2 and regulates mitochondrial DNA levels by stimulating TFAM digestion by the protease LON. SLIMP was previously reported to be required for correct cell cycle progression. We showed that the depletion of a non-mitochondrial pool of SLIMP causes cell cycle arrest in G2 and the activation of E2F-related and G2/M check-point genes. Our results indicate that SLIMP activity provides an important protein for the communication between mitochondrial anabolism and cell cycle regulation., [cat] La Seril-ARNt Sintetasa mitocondrial (SerRS2) és membre de la família de ARNt sintetases de classe II. Aquest enzim es responsable de la lligació de l’aminoàcid serina al corresponent ARNtSer a la mitocòndria. En el procés de desenvolupament d’un model de malalties mitocondrials causades per deficiències en l’aminoacilació de ARNt en Drosophila melanogaster, es descobrí una proteïna paràleg de SerRS2 no caracteritzada fins el moment, anomenada Seril-ARNt sintetasa-Like Insect Mitochondrial Protein (SLIMP). SLIMP representa una nova classe de proteïna semblant a les ARNt sintetases que ha adquirit funcions essencials en insectes. Aquest paràleg ha evolucionat en poc temps i constitueix una proteïna amb unió a ARN però sense capacitat d’aminoacilació. Prèviament s’havia caracteritzat que SLIMP interacciona amb el seu homòleg SerRS2 i també amb la proteasa mitocondrial LON. Ara hem confirmat aquestes interaccions i hem descrit les funcions de SLIMP, caracteritzant l’efecte de la depleció dels seus nivells proteics en cèl·lules S2 de Drosophila melanogaster, que comportà severs defectes mitocondrials i un arrest del cicle cel·lular. Hem definit que SLIMP actua simultàniament com un regulador de la replicació del ADN i la traducció a la mitocòndria i, com a regulador de la progressió del cicle cel·lular. SLIMP activa la síntesis proteica mitocondrial gràcies a la interacció amb SerRS2, i a més regula els nivells de ADN mitocondrial, estimulant la degradació de TFAM per la proteasa LON. Anteriorment, es descrigué que SLIMP és necessari per la correcta progressió del cicle cel·lular. Hem trobat que la depleció d’una isoforma no mitocondrial de SLIMP arresta el cicle cel·lular en la fase G2 i activa la transcripció de gens relacionats amb E2F i amb el punt de control de G2/M. Aquests resultats indiquen la important tasca de SLIMP per la comunicació entre l’anabolisme mitocondrial i la regulació del cicle cel·lular.

Submitted by GABRIELA DA SILVA FERREIRA (gabrielasf2@hotmail.com) on 2019-01-31T16:47:44Z No. of bitstreams: 1 TESE GABRIELA REAPRESENTAÇÃO.pdf: 1059757 bytes, checksum: 317764f09d9c4d28d72de68078917c1a (MD5) Approved for entry into archive by Ederson Vasconcelos Pereira null (edersonpereira@fmva.unesp.br) on 2019-02-01T11:42:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferreira_gs_dr_araca_int.pdf: 1059757 bytes, checksum: 317764f09d9c4d28d72de68078917c1a (MD5) Made available in DSpace on 2019-02-01T11:42:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferreira_gs_dr_araca_int.pdf: 1059757 bytes, checksum: 317764f09d9c4d28d72de68078917c1a (MD5) Previous issue date: 2019-01-21 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Com aumento global da temperatura, compreender como o metabolismo de bovinos se adapta ao estresse térmico, permitirá selecionar animais melhor adaptados ao aumento da temperatura ambiente. Uma das possibilidades é compreender como cada raça responde a esse efeito ambiente. O trabalho objetivou expor ao sol duas raças distintas de bovinos com diferente resistência ao calor e estudar as alterações no metabolismo mitocondrial e comportamental após a exposição ao sol ou não por 60 dias. Foram analisados 23 animais da raça Angus – susceptível ao calor (12 ao sol e 11 sob sombra) e 25 Nelores – tolerantes ao calor (13 ao sol e 12 sob sombra). Após todos os animais passarem por período de adaptação de 60 dias, foram divididos entre os grupos e analisados os parâmetros ambientais (THI, HLI e AHLU), movimentação (por radiotelemetria), concentrações séricas de testosterona e LH por radioimunoensaio, espessura de tecido adiposo subcutâneo por ultrassonografia e atividade enzimática mitocondrial de músculo esquelético do complexo I (NADH oxidoredutase). A atividade mitocondrial foi avaliada em amostras da musculatura do tríceps braquial colhidas por biópsia periodicamente ao longo do experimento. Os parâmetros ambientais caracterizam o desconforto térmico que os animais foram submetidos, principalmente Angus sol com índice de AHLU muito acima de estresse extremo. Os Angus se movimentaram mais que os Nelore durante o período experimental (p

As doenças de oxidação mitocondrial de ácidos graxos são patologias genéticas reconhecidas como importantes causas de morbidade e mortalidade na população infanto-juvenil. Uma das mais comuns é a deficiência da desidrogenase de acilas- CoA de cadeia muito longa (VLCAD). Essa doença é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia longa e de seus conjugados de carnitina nos tecidos e líquidos biológicos dos pacientes afetados e, clinicamente, por disfunção cardíaca, hepática e muscular. Os ácidos cis-5-tetradecenoico (Cis-5) e mirístico (Myr) são os que mais se acumulam nessa doença, sendo que o primeiro é o marcador bioquímico. As disfunções cardíaca e hepática, que podem levar os pacientes à morte, bem como os recorrentes episódios de rabdomiólise ainda não possuem sua fisiopatologia esclarecida. A presente investigação objetivou estudar os efeitos desses metabólitos acumulados sobre parâmetros importantes da função mitocondrial (parâmetros respiratórios, potencial de membrana (ΔΨm), conteúdo de NAD(P)H, inchamento mitocondrial, capacidade de retenção de Ca2+, liberação de citocromo c, produção de ATP, atividades dos complexos da cadeia respiratória e enzimas do ciclo do ácido cítrico) em mitocôndrias isoladas de coração, fígado e músculo esquelético de ratos jovens, bem como em fibras permeabilizadas de coração e de músculo esquelético e células hepáticas e cardíacas cultivadas. Verificamos que o Cis-5 e o Myr, em concentrações patológicas, reduziram significativamente os estados 3 e desacoplado da respiração celular, a produção de ATP, o ΔΨm e a capacidade de retenção de Ca2+ nos três tecidos testados, bem como o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial no coração, e a atividade do complexo I no coração, do complexo I-III no fígado e músculo esquelético e da enzima α-cetoglutarato desidrogenase no fígado. Estes ácidos graxos também aumentaram o estado 4 da respiração celular (efeito desacoplador) em todos os tecidos testados, com o envolvimento do translocador de nucleotídeos de adenina em coração e fígado, pois o carboxiatractilosídeo atenuou significantemente o aumento do estado 4 provocado pelos Cis-5 e Myr. Além disso, o Cis-5 e o Myr induziram inchamento mitocondrial e a liberação de citocromo c no fígado. Observamos ainda que os inibidores clássicos da formação do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) ciclosporina A mais ADP, bem como o inibidor da captação de Ca2+ rutênio vermelho preveniram completamente a diminuição do ΔΨm mitocondrial em todos os tecidos testados, bem como a indução do inchamento mitocondrial em fígado, provocados pelo Myr e Cis-5 na presença de Ca2+, sugerindo, respectivamente, que a indução da abertura do poro de MTP e a contribuição do Ca2+ estão envolvidas nesses efeitos. Os efeitos observados na respiração celular obtidos em mitocôndrias isoladas se confirmaram em preparações in situ de células cultivadas (cardiomiócitos e hepatócitos) e em fibras musculares cardíacas e esqueléticas, reforçando os efeitos deletérios desses ácidos graxos. Não foram observadas alterações na homeostase redox avaliados através do conteúdo de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico e glutationa reduzida em coração. Os achados no presente trabalho indicam que, em concentrações patológicas, os ácidos graxos de cadeia longa que mais se acumulam na deficiência da VLCAD prejudicam a bioenergética mitocondrial e a homeostase do Ca2+, atuando como desacopladores e inibidores metabólicos da fosforilação oxidativa, além de serem indutores da abertura do poro de MPT em coração, fígado e músculo esquelético. Assim, presumimos que o comprometimento na bioenergética e na homeostase do Ca2+ possam contribuir para as manifestações cardíacas, hepáticas e musculares observadas na deficiência da VLCAD. The genetic fatty acid oxidation disorders are genetic pathologies recognized as important causes of morbidity and mortality in child-juvenile population. One of the most common is very-long-chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD) deficiency. This disease is biochemically characterized by accumulation of fatty acids and their correspondent carnitine derivatives in tissues and biological fluids from affected patients, and clinically by cardiac, hepatic and muscular dysfunction. Cis-5- tetradecenoic (Cis-5) and myristic (Myr) acids are those that most accumulate in this disorder, wherein the first one is the biochemical hallmark. The cardiac and hepatic dysfunction, which may lead the patients to death, as well as the recurrent rhabdomyolysis episodes have the pathogenesis still poorly unknown. The present investigation was aimed to study the effects of these accumulated metabolites on important mitochondrial function parameters (respiratory parameters, membrane potential (ΔΨm), NAD(P)H content, mitochondrial swelling, Ca2+ retention capacity, cytochrome c release, ATP production, respiratory chain complexes and citric acid cycle enzymes activities) in isolated mitochondria of heart, liver and skeletal muscle from young rats, as well as in permeabilized heart and skeletal muscle fibers and hepatic and cardiac cultivated cells. We verified that Cis-5 and Myr, at pathological concentrations, strongly reduced states 3 and uncoupled of respiration, ATP production, ΔΨm and Ca2+ retention capacity in all tested tissues, as well as matrix mitochondrial NAD(P)H content in heart, complex I activity in heart, complex I-III in liver and skeletal muscle and α-ketoglutarate dehydrogenase activity in liver. Also, these fatty acids increased state 4 respiration (uncoupling effect) in all tested tissues, with the involvement of the adenine nucleotide translocator in heart and liver since carboxyatractyloside significantly attenuated the increased state 4 respiration provoked by Cis-5 and Myr. In addition, Cis-5 and Myr caused mitochondrial swelling and cytochrome c release in liver. We also observed that the classical inhibitors of mitochondrial permeability transition (MPT) pore cyclosporin A plus ADP, as well as the Ca2+ uptake blocker ruthenium red, fully prevented the decrease of ΔΨm in all tested tissues as well as mitochondrial swelling induction in liver provoked by Myr and Cis-5 in Ca2+-loaded mitochondria, suggesting, respectively, induction of MPT pore opening and the contribution of Ca2+ in these effects. The effects observed in cellular respiration obtained in isolated mitochondria were confirmed in in situ cell preparations (cardiomyocytes and hepatocytes), as well as in cardiac and skeletal muscle fibers, reinforcing the deleterious effects of the fatty acids. In contrast, there were no alterations of redox homeostasis evaluated by the content of thiobarbituric acid reative species and reduced glutathione in heart. The present findings indicate that the major long-chain fatty acids that accumulate in VLCAD deficiency disrupt mitochondrial bioenergetics and Ca2+ homeostasis, acting as uncouplers and metabolic inhibitors of oxidative phosphorylation, as well as inducers of MPT pore opening in the heart, liver and skeletal muscle at pathological relevant concentrations. It is therefore presumed that disturbance of bioenergetics and Ca2+ homeostasis may contribute to the cardiac, hepatic and muscular manifestations observed in VLCAD deficiency.

As doenças neurodegenerativas constituem um grupo de doenças marcadas pela progressiva morte neuronal e consequente disfunção cognitiva. A prevalência dessas patologias tem aumentado rapidamente com o crescimento da expectativa de vida da população, fazendo do desenvolvimento de tratamentos efetivos e métodos de diagnóstico precoce uma questão de saúde pública a nível global. Entretanto, a evolução dessas pesquisas aparece como um grande desafio, visto a grande variedade de apresentações clínicas e distintos achados neuropatológicos presentes nessas doenças, tornando ainda mais difícil a compreensão dos mecanismos envolvidos na patogênese e evolução de seus processos neurodegenerativos. Alguns achados comuns à maior parte desses distúrbios e ainda pouco esclarecidos são a redução no metabolismo energético celular e disfunções na proteostase celular que levam ao acúmulo de diferentes proteínas patológicas. Na presente tese, avançamos na elucidação das alterações presentes nos circuitos de sinalização desses mecanismos e no entendimento da associação destes com outro achado frequente nas doenças neurodegenerativas: a redução da atividade da proteína fosfatase 2A (PP2A). Além disso, também ampliamos o entendimento sobre possíveis mecanismos neuroprotetores para esses distúrbios, demonstrando a necessidade de modular a interação astrócito-neurônio para a ação preventiva alcançada no tratamento com memantina em nosso modelo de inibição da atividade da PP2A. Dessa forma, buscamos progredir no contexto da busca por um diagnóstico precoce e por tratamentos eficazes para as doenças neurodegenerativas. Neurodegenerative diseases are a group of disorders marked by progressive neuronal death and consequent cognitive dysfunction. The prevalence of these pathologies has raised rapidly with the increase in the life expectancy of the population, making the development of effective treatments and methods of early diagnosis a public health issue at a global level. However, the evolution of these researches presents a challenge, considering the great variety of clinical presentations and different neuropathological findings present in these diseases, making it even more difficult to understand the mechanisms involved in the pathogenesis and evolution of their neurodegenerative processes. Some findings common to most of these disorders and still unclear are the reduction in cellular energy metabolism and dysfunctions in the cellular proteostase that lead to the accumulation of different pathological proteins. In the present thesis, we advanced the elucidation of the alterations present in the signaling circuits of these mechanisms and in the understanding of the association of these with another frequent finding in the neurodegenerative diseases: the reduced activity of protein phosphatase 2A (PP2A). In addition, we also broadened our understanding of possible neuroprotective mechanisms for these disorders, demonstrating the need to modulate the neuron-astrocyte interaction for the preventive action achieved in the treatment with memantine in our model of inhibition of PP2A activity. Thus, we seek to progress in the context of the search for an early diagnosis and effective treatments for neurodegenerative diseases.

Mitochondrial oxidative stress accumulates with aging and age-related diseases and induces alterations in mitochondrial DNA (mtDNA) content. Since mtDNA qualitative alterations are also associated with aging, repair of mtDNA damage is of great importance. The most relevant form of DNA repair in this context is base excision repair (BER), which removes oxidized bases such as 8-oxoguanine (8-oxoG) and thymine glycol through the action of the mitochondrial isoform of the specific 8-oxoG DNA glycosylase/apurinic or apyrimidinic (AP) lyase (OGG1) or the endonuclease III homolog (NTH1). Mouse strains lacking OGG1 (OGG1−/−) or NTH1 (NTH1−/−) were analyzed for mtDNA alterations. Interestingly, both knockout strains presented a significant increase in mtDNA content, suggestive of a compensatory mtDNA replication. The mtDNA “common deletion” was not detected in either knockout mouse strain, likely because of the young age of the mice. Formamidopyrimidine DNA glycosylase (Fpg)-sensitive sites accumulated in mtDNA from OGG1−/− but not from NTH1−/− mice. Interestingly, the D-loop region was most severely affected by the absence of OGG1, suggesting that this region may be a hotspot for oxidative damage. Thus, we speculate that mtDNA alterations may send a stress message to evoke cell changes through a retrograde mitochondrial−nucleus communication.

Orientador: Prof. Dr. Tiago Rodrigues Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2019. A leucemia mielóide crônica (LMC) é responsável por aproximadamente 20% das leucemias em adultos e tem incidência de um a dois casos a cada 100 mil habitantes entre 45 a 55 anos de idade. É um tumor ocasionado pelo acúmulo de células mielóides e em 95% dos casos por alterações genéticas em células mielóides, ocasionando a formação do gene anormal bcr-abl, conhecido como cromossomo Philadelphia. Uma das formas de tratamento dessa doença atualmente é a utilização de inibidores de tirosina-quinase (targeted therapy), porém um dos principais problemas a ser enfrentado é o surgimento de resistência aos fármacos. Atualmente, o aumento da eficácia da quimioterapia com a descoberta de novos agentes antitumorais, juntamente com as tentativas de diminuição da resistência à quimioterapia, têm sido os principais objetivos no desenvolvimento de novas terapias. A reutilização de medicamentos antigos usados para outras doenças aplicados em pacientes oncológicos (drug repurposing) compõe uma interessante estratégia terapêutica, pois é de menor custo e o tempo para sua aprovação, considerando todas as etapas necessárias, seria muito mais curto. Isso pode ajudar a fechar a lacuna crescente entre as expectativas do paciente e os orçamentos de saúde, à medida que o custo da terapia médica anticâncer aumenta. Dados da literatura têm mostrado que fármacos antipsicóticos da família das fenotiazinas são capazes de induzir a morte de células tumorais, porém os efeitos colaterais das fenotiazinas com ação antipsicótica envolvem efeitos extrapiramidais e arritmias cardíacas, o que leva à necessidade de encontrar um derivado fenotiazínico com menores efeitos colaterais e que mantenha o efeito citotóxico em células tumorais. Assim, neste trabalho estudamos o efeito da PTZ , um derivado fenotiazínico com ação predominantemente anti-histamínica, sobre o metabolismo de células leucêmicas como alternativa de drug repurposing para auxiliar no tratamento da leucemia mielóide crônica. Os resultados obtidos mostraram que a PTZ apresenta uma potente capacidade citotóxica de forma concentração dependente, não afetando significativamente células normais. Em termos mecanísticos, observa-se disfunções mitocondriais induzidas pela PTZ e a autofagia tem papel crucial na morte celular. Ainda é necessário ser feita uma investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares de PTZ sobre a citotoxicidade especificamente na dinâmica mitocondrial para uma melhor compreensão da mitofagia induzida por PTZ, bem como avaliar in vivo a ocorrência deste efeito antitumoral, mas ainda sim, a PTZ mostrou grande potencial para ser usado como alternativa no tratamento da leucemia mielóide crônica. Chronic myelogenous leukemia (CML) is responsible for approximately 20% of adult leukemias and has an incidence of one to two cases per 100,000 inhabitants between 45 and 55 years of age. It is a tumor caused by the accumulation of myeloid cells and in 95% of cases by genetic changes in myeloid cells, causing the formation of the abnormal gene bcr-abl, known as Philadelphia chromosome. One way of treating this disease today is the use of targeted therapy tyrosine kinase, but one of the main problems to be faced is the emergence of drug resistance. Increasing the efficacy of chemotherapy with the discovery of new antitumor agents, in conformity with attempts to decrease resistance to chemotherapy, have been the main goals in the development of new therapies. The reuse of old drugs used for other diseases in cancer patients (drug repurposing) makes an interesting therapeutic strategy, since it is cheaper and the time for its approval, considering all necessary steps, would be much shorter. This may help close the growing gap between patient expectations and health budgets as the cost of anticancer medical therapy increases. The current literature have shown that antipsychotic drugs in the phenothiazine family are capable of inducing death of tumor cells, but the side effects of antipsychotic phenothiazines involve extrapyramidal effects and cardiac arrhythmias, which leads to the need to find a phenothiazine derivative with minor side effects and maintains the cytotoxic effect on tumor cells. Thus, in this work we studied the effect of promethazine, a phenothiazine derivative with predominantly antihistaminic action, on the metabolism of leukemic cells as an alternative drug repurposing to assist in the treatment of chronic myeloid leukemia. The results showed that promethazine has a potent cytotoxic capacity in a concentration-dependent manner not significantly affecting normal cells. Mechanistically, promethazine-induced mitochondrial dysfunctions are observed and autophagy plays a crucial role in cell death. Further investigation of the molecular mechanisms of PTZ on cytotoxicity specifically in mitochondrial dynamics is required to better understand the PTZ-induced mitofagia, as well as to evaluate in vivo the occurrence of this antitumor effect, but rather promethazine as a great alternative in the treatment of chronic myeloid leukemia.

O envelhecimento é um processo biológico caracterizado pela deterioração progressiva das funções fisiológicas do organismo. A perda de função e o acúmulo de dano tecidual estão relacionados a uma série de marcadores celulares, dentre eles, o encurtamento acelerado de telômeros, acúmulo de células senescentes e o comprometimento da função mitocondrial. O estabelecimento do fenótipo senescente pode ser caracterizado pelo aumento na transcrição do gene CDKN1A (P21) e pela atividade da enzima β-galactosidase (β-gal), além de um conjunto de citocinas que constituem um secretoma capaz de contribuir para um estado de inflamação crônico, observado em doenças relacionadas à aceleração do envelhecimento. A obesidade é uma condição fisiológica caracterizada pela alteração na composição e a estrutura do tecido adiposo e uma desregulação metabólica. É uma doença associada a um estado de inflamação crônica, compartilhando aspectos relacionados ao envelhecimento e ao aparecimento de características de senescência de forma antecipada. Dessa maneira, o objetivo principal desta tese foi avaliar parâmetros relacionados à homeostasia do complexo telomérico e o impacto do ambiente oxidativo, característico da obesidade, na indução do fenótipo senescente. Para isso, relacionamos a homeostase do complexo telomérico de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) com a indução do fenótipo senescente relacionado à disfunção mitocondrial em células tronco adipo-derivadas (ADSC) expostas ao plasma de indivíduos portadores de obesidade após 10 dias de tratamento. Nossos resultados demonstraram que indivíduos portadores de obesidade possuem telômeros mais curtos e uma desregulação na expressão dos componentes do complexo shelterin em PBMC, independente da ocorrência de comorbidades associadas à doença. Além disso, observamos um aumento do dano oxidativo relacionado ao aumento da lipoperoxidação e o conteúdo de proteínas carboniladas no plasma de indivíduos portadores de obesidade. A Análise de Componentes Principais (PCA) ainda sugere que o comprometimento da homeostase telomérica pode ser parcialmente explicado pela desregulação de TRF1, o qual não pôde ser revertido pelo aumento na resposta antioxidante não enzimática, decorrente de uma possível resposta celular adaptativa. Os efeitos crônicos do plasma de indivíduos portadores de obesidade sugeriram o gatilho da indução do fenótipo senescente em ADSC pelo aumento da atividade da enzima β-gal e um aumento na expressão de CDKN1A. Observamos um acúmulo de mitocôndrias danificadas e indícios de inibição da autofagia celular, características que podem contribuir na indução do fenótipo senescente no contexto da obesidade. Complementando os achados obtidos no sistema periférico (PBMC), nossos resultados ainda demonstram um aumento na expressão de TRF1 nas ADSC no início do fenótipo senescente, sugerindo novamente que TRF1 tem um papel importante na progressão do envelhecimento, tanto a nível de tecido adiposo quando a nível sistêmico. Os dados obtidos nessa tese sugerem que a obesidade é uma doença que está associada à aceleração do fenótipo senescente em diferentes contextos celulares, induzindo a ativação de respostas moleculares antecipadas, similares aos mecanismos observados no envelhecimento. Aging is a biological process characterized by the progressive deterioration of the physiological functions of the organism. Loss of function and accumulation of tissue damage are related to several cell hallmarks, such as accelerated telomere shortening, senescent cell accumulation, and mitochondrial dysfunction. The establishment of the senescent phenotype can be characterized by the increase in CDKN1A (P21) gene transcription and the enzyme β-galactosidase (β-gal) activity, as well as a set of cytokines that constitute a secretome that contributes to a chronic inflammation state, observed in age-related diseases. Obesity is a multifactorial condition characterized by changes in the composition and structure of adipose tissue and excessive metabolic dysregulation. It is associated with a chronic low-grade inflammatory condition that accompanies metabolic dysfunction, sharing aspects related to anticipation of aging characteristics. Thus, the aim of this thesis was to evaluate parameters related to homeostasis of the telomeric complex and the impact of the obesity-related oxidative environment on the induction of senescent phenotype. To this end, we evaluated the telomere homeostasis of the peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and the senescence induction on adipose-derived stem cells (ADSC) by chronic exposure to an obesogenic environment. We demonstrated that obese individuals have shorter telomeres and dysregulated gene expression of shelterin components in PBMC, regardless of the occurrence of disease-associated comorbidities. In addition, we observed increased oxidative damage related to augmented lipoperoxidation and carbonyl protein content in plasma of obese individuals. Also, Principal Component Analysis (PCA) suggests that the impairment of telomeric homeostasis may be partially explained by the positive regulation of TRF1 and could not be reversed by the increase in non-enzymatic antioxidant response, observed as an adaptive cellular response. The chronic effects of obesogenic environment were observed after plasma incubation for 10 days. Our data sugested that the onset of senescent phenotype induction in ADSC was observed by increased β-gal enzyme activity and an increase in CDKN1A expression. After plasma incubation for 10 days. Furthermore, the accumulation of damaged mitochondria may be a response due to autophagy machinery impairment, so that it may contribute to the induction of senescent phenotype in the context of obesity. Our data further demonstrated an increase in TRF1 expression in ADSC at the onset of the senescent phenotype, suggesting that TRF1 plays an important role in the progression of aging, both at adipose and systemic levels. The data obtained in this thesis suggest that obesity is a disease that is associated with acceleration of the senescent phenotype in different cellular contexts, contributing to the activation of molecular responses that trigger characteristics observed in aging.

[ES] Los ácidos biliares desempeñan un papel determinante en la función digestiva y excretora del hígado, pero, además, son importantes moléculas de señalización implicadas en la regulación del metabolismo energético y de los procesos inflamatorios y regenerativos del hígado. Existe una gran variedad de patologías asociadas a fallos en el metabolismo de los ácidos biliares. Se trata, en la mayor parte de los casos, de afecciones muy graves y poco frecuentes, que no sólo afectan al tejido hepático, sino que pueden acompañarse también de trastornos neurológicos, renales y endocrinos debido a la acumulación de metabolitos intermediarios con potencial toxicidad. En esta Tesis Doctoral se describe y estudia el caso de un paciente adolescente con hipertransaminasemia idiopática persistente. Tras descartar las patologías asociadas a daño hepático más comunes, el análisis genético permitió identificar una mutación (c.673C>T) en la región codificante del gen ACOX2, cuyo producto es la variante R225W de la enzima implicada en la síntesis de novo de los ácidos biliares acil-CoA oxidasa 2 (ACOX2). Los estudios funcionales en modelos celulares in vitro revelaron que la mutación causa una reducción de la actividad de esta enzima peroxisomal que acarrea una deficiencia de ácidos biliares maduros y la acumulación de metabolitos intermediarios tóxicos, capaces de inducir estrés oxidativo y de retículo endoplásmico. Los resultados del estudio sugieren que la deficiencia parcial de ACOX2 (APD) podría ser un trastorno más frecuente que las patologías asociadas al metabolismo de los ácidos biliares descritas hasta ahora y estar implicada en la etiología de otros casos de hipertransaminasemia persistente de causa no filiada, así como constituir un factor predisponente a la toxicidad por fármacos. Asimismo, la deficiencia de ACOX2 podría agravar la progresión de enfermedades hepáticas comunes que cursan con inflamación, como la esteatohepatitis no alcohólica. En esta Tesis Doctoral se ha desarrollado un modelo animal “avatar” de la enfermedad, mediante la edición del genoma del ratón con CRISPR/Cas9. Esta valiosa herramienta permitirá el desarrollo de nuevos estudios que ayudarán a caracterizar la fisiopatología de la APD, a evaluar nuevos tratamientos terapéuticos y a determinar el papel de ACOX2 en otras patologías hepáticas.

El objetivo del trabajo fue incrementar el conocimiento de componentes de los mecanismos de partición de la energía (la masa y composición de los órganos, así como de la densidad, función mitocondrial y marcadores de estrés oxidativo hepáticos) y su relación con la eficiencia productiva, en dos modelos bovinos. Modelo 1: Novillos con fenotipos divergentes para consumo residual de alimento (RFI) y Modelo 2: Vacas de cría multíparas puras y cruzas F1 (CR) pastoreando distintas ofertas de forraje de campo natural. Los novillos de alta eficiencia (bajo RFI) tuvieron una mayor eficiencia en el metabolismo de los nutrientes hepáticos, que se asoció fuertemente con una mayor densidad y funcionamiento mitocondrial hepática (principalmente del complejo II), mayor capacidad antioxidante y, por lo tanto menor estrés oxidativo. La disminución del estrés oxidativo hepático reduciría los requisitos de mantenimiento debido a un menor recambio de proteínas y lípidos y una mayor eficiencia en el uso de la energía. En vacas de cría, los animales pastoreando alta oferta de forraje (HI) y CR serían más eficientes en el uso de la energía, mayor rendimiento carnicero y menor relación entre el peso total de órganos y peso de la canal. Además, las vacas HI tuvieron mayor densidad mitocondrial hepática. Sin embargo, las vacas CR presentaron un aumento en los marcadores de daño oxidativo a nivel hepático, lo que podría deberse a una mayor actividad metabólica de este órgano. En los novillos con diferentes RFI la eficiencia energética se ha asociado con mejor función mitocondrial y menor estrés oxidativo hepático sin embargo, esta asociación no es tan clara en el sistema vaca-ternero. Otros factores, como el tamaño de las vísceras, y su actividad metabólica, el consumo de materia seca, masa y composición corporal presentarían mayor asociación con los mecanismos relacionados a demandas de energía de mantenimiento y a la eficiencia energética del sistema vaca-ternero.

Tesis (Magíster en Biotecnología y Ciencias de la Vida) Las mitocondrias son organelos celulares que controlan la producción de ATP, además de la liberación de radicales libres durante la generación del potencial de membrana mitocondrial, entre otras funciones. Los procesos de fusión y fisión son parte del ciclo de vida de las mitocondrias, donde se segregan mitocondrias despolarizadas para su eliminación por medio de la mitofagia, mediada por lisosomas y también se relacionan con las diferentes morfologías mitocondriales presentes en las células, La bioenergética mitocondrial permite mantener mitocondrias bioenergéticamente estables para cubrir las necesidades celulares. La deficiencia en el proceso de mitofagia provoca, la acumulación de mitocondrias disfuncionales que no pueden ser eliminadas afectando la viabilidad celular. En nuestro laboratorio mediante análisis bioinformáticos de microarreglos generados durante la diferenciación eritroide, se identificó al gen fam162A como un potencial nuevo gen involucrado en la mitofagia, ya que presenta un perfil de expresión similar a otros genes reconocidos de la mitofagia como atg8(lc3) y nix, además de un dominio LIR, región de interacción con LC3. Estos antecedentes nos permiten plantear la siguiente hipótesis: La proteína mitocondrial FAM162A posee una nueva función asociada a la mitofagia y a la mantención de la red mitocondrial en cuanto a su conectividad y capacidad bioenergética, siendo relevante para la viabilidad celular. Objetivo general Estudiar la participación de FAM162A tanto en la viabilidad celular como en la fisiología mitocondrial y mitofagia. Observamos que en células silenciadas de FAM162A las mitocondrias presentaron deficiencias en la bioenergética lo que se reflejó en una baja del potencial de membrana y un menor consumo de oxígeno. La morfología mitocondrial mostró efectos por el silenciamiento aumentando las formas puntiformes y disminuyendo las redes mitocondriales. Por último, al observar la mitofagia y el flujo de estas, se encontró que la perdía de función de FAM162A, aumento el número de lisosomas presentes además de presentar un mayor número de autolisosomas que representan la etapa tardía del flujo de la mitofagia. Por lo que FAM162A juega un rol la mitofagia y tiene efectos sobre la fisiología de la mitocondria.

La mitocondria es un orgánulo esencial para la función celular, incluyendo la generación celular de la energía en forma de ATP a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la oxidación de metabolitos. La proteína de unión a RNA, FASTK (Fas activated serine/threonine kinase), tiene dos isoformas, una localizada en la mitocondria (mitoFASTK), y la otra isoforma en citosol y núcleo (cytoFASTK). Se ha demostrado que la isoforma mitoFASTK es necesaria para la biogénesis del mRNA ND6 mitocondrial, que codifica una subunidad esencial del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial (CI, NADH:ubiquinona oxidorreductasa). Este estudio investiga los mecanismos de acción de FASTK en la fagocitosis no opsónica. En nuestro laboratorio se ha observado que los macrófagos de los ratones FASTK KO muestran un aumento en la fagocitosis no opsónica de bacterias y una disminución del ~50 % de la actividad del CI en estas células. Durante el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral, como método de estudio para explorar si la disminución de la actividad del CI explica el fenotipo fagocítico, se empleó el tratamiento con el inhibidor del CI, rotenona, en los macrófagos murinos WT, así como en la línea celular murina RAW 264.7. En paralelo se silenciaron con shRNAs en dicha línea celular, las dos subunidades del CI (NDUFS3 y NDUFS4). Se observó que, tanto el tratamiento farmacológico con rotenona como el silenciamiento de las subunidades NDUFS3 y NDUFS4, resultaba en un aumento en la fagocitosis bacteriana no opsónica. La reexpresión de mitoFASTK en los macrófagos silenciados en FASTK rescata el fenotipo (es decir, la fagocitosis vuelve a ser normal). Asimismo, la disminución de la actividad del CI en los macrófagos FASTK KO está asociada con un aumento en la fosforilación de AMPK, y su inhibición utilizando el compuesto C revierte el fenotipo fagocítico. Finalmente, se ha demostrado que los macrófagos FASTK KO muestran aumento en la producción de mitoROS respecto a los macrófagos WT durante la fagocitosis no opsónica de bacterias. En conclusión, estos resultados, demuestran por primera vez que mitoFASTK tiene un papel regulador negativo en la fagocitosis no opsónica de bacterias por los macrófagos, a través de la función del CI y la activación de AMPK. Es de interés ahondar en el conocimiento sobre los mecanismos que explican el fenotipo observado y trasladarlo a modelos in vivo. Estos estudios pueden contribuir a la generación de tratamientos que aumenten la captación y la eliminación de bacterias antes de que causen reacciones inflamatorias exageradas; también pueden ayudar a combatir la invasión bacteriana en lugares anatómicos con cantidad limitada de opsoninas., Departamento de Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina Legal y Forense, Doctorado en Investigación en Ciencias de la Salud

A encefalopatia hipóxica perinatal (EHP) é considerada uma das principais causas de morte no período neonatal. As consequências a longo prazo incluem dificuldades sociais e de aprendizado, e aumento do risco de transtornos psiquiátricos e neurológicos, como epilepsia. Dado que a informação sobre a influência da EHP no cérebro adulto é muito limitada, nós investigamos a habilidade de peixes-zebra submetidos à hipóxia poderem ser usados como um novo modelo de EHP. Para atender este objetivo nós investigamos os efeitos sobre a interação social, suscetibilidade a crises epiléticas e consumo de oxigênio (O2) dos principais componentes do sistema transportador de elétrons (STE) durante a idade adulta de peixes submetidos à hipóxia na fase larval. Para induzir EHP, larvas de peixe-zebra foram colocadas durante 2 horas em um aquário tipo “nursery” com níveis reduzidos de O2. Depois disso, os animais foram transferidos para um aquário contendo água normóxica para recuperação espontânea da hipóxia por 120 dias. Nós observamos que os animais com EHP exibiram aumento na taxa de mortalidade, diminuíram o tempo de interação com animais co-específicos e aumentaram a suscetibilidade a crises epiléticas induzidas durante a vida adulta. No entanto, o consumo de O2 mitocondrial do STE foi equivalente aos controles. Embora não tenha sido observado qualquer efeito sobre a respiração mitocondrial cerebral, o peixe-zebra submetido a hipóxia na fase larval apresentou os efeitos clássicos da EHP na idade adulta. Portanto, nossos dados indicam o potencial uso deste novo modelo para futuros estudos relacionados à EHP. Perinatal hypoxic encephalopathy (PHE) is a neurological injury considered a major cause of acute neonatal death. The long-term consequences include social and learning disabilities, and increased risk for psychiatric and neurological disorders such as, epilepsy. Given that the information about the influence of PHE on adult brain is very limited, we investigated the ability of zebrafish subjected to hypoxia to be used as a new model of PHE. To meet this purpose, we evaluated the effects on social interaction, seizures susceptibility and oxygen (O2) consumption of the main components of electron transporter system (ETS) during adulthood of fish subjected to hypoxia in larval stage. To induce PHE, zebrafish larvae were placed for 2 hours in a nursery with reduced O2 levels. After that, animals were transferred to an aquarium containing normoxic water for spontaneously recovery from hypoxia for 120 days. We observed that animals with PHE exhibited increase mortality rate, decrease interactive time with conspecific animal and increase susceptibility to seizure like-behavior during adulthood. However, the mitochondrial O2 consumption of ETS was equivalent to controls. Although no effect on brain mitochondrial respiration was observed, zebrafish-undergoing hypoxia in the larval phase showed the classic effects of PHE in adulthood. Therefore, our data indicate the potential use of this new model for future studies related to PHE.

La disfunción en la actividad de la mitocondria está relacionada con múltiples enfermedades crónicas asociadas con la vejez y con muchas patologías metabólicas. Entre ellas algunas enfermedades raras causadas por el déficit en la síntesis de coenzima Q10, el único componente lipídico implicado en la actividad de la cadena de transporte de electrones mitocondrial. El déficit en los niveles de este lípido está asociado con enfermedades muy graves caracterizadas esencialmente por sordera, ataxia, mialgia y disfunción renal entre otros síntomas. Hasta el momento se han identificado 12 proteínas implicadas en la síntesis de coenzima Q10 en humanos de las cuales se han identificado mutaciones que producen letalidad en homocigosis y graves problemas incluso en heterocigosis. Por otro lado, también se han encontrado deficiencias secundarias en los niveles de coenzima Q10 asociadas a mutaciones de otras proteínas mitocondriales o a la disfunción mitocondrial relacionada con el envejecimiento o enfermedades metabólicas. Esta deficiencia secundaria podría entorpecer la actividad mitocondrial no solo por enlentecer la actividad de la cadena de transporte de electrones sino por bloquear la actividad de los supercomplejos mitocondriales, recientemente asociados con ciertas patologías. Como el coenzima Q10 también cumple funciones importantes en otras membranas celulares tales como actuar como antioxidante en éstas y regular la actividad de otros antioxidantes como la vitamina E o C, así como regular procesos de señalización, la deficiencia en este lípido puede causar otras múltiples disfunciones que se agravan con la edad. Si bien el tratamiento con coenzima Q10 puede aliviar de alguna manera algunas patologías debidas a la deficiencia primaria, es muy posible que en el caso de la secundaria pueda ser un buen tratamiento de futuro aunque nunca hemos de perder de vista que se trata de una deficiencia derivada de una disfunción previa de la mitocondria. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología Máster Oficial en Biología Celular y Molecular de la Universidad de Málaga

[eng] Genetically tractable models such as Drosophila melanogaster may help to identify new approaches to halt malignant growth. During my doctoral thesis, I performed a screen to find mitochondrial genes required for the growth of lethal (3) malignant brain tumor. I discovered that several testis-mitochondrial genes, i.e. genes with a mitochondrial function and a maximum expression in testes, were required for the growth of l(3)mbt tumors, rescuing both viability and brain anatomy traits. Nevertheless, inhibition of testis-mitochondrial genes did not affect either wild-type or brat tumor development. One of these testis-mitochondrial genes, ttm2, was found to be expressed both in wild-type and l(3)mbt brains. In addition, when overexpressed in an otherwise wild-type background, Ttm2 produces hyperplasia specifically in the neuroepithelial cells of the medial outer proliferative center (OPC). Yet, ectopic expression of Ttm2 in either central brain or medulla neuroblasts does not affect neuroblast division or number, suggesting that the brain cell types are differentially sensitive to mitochondrial function alteration. The data presented in this thesis project provides novel information about the critical role of mitochondria controlling both cell fate and carcinogenesis., [spa] Durante los últimos años, el uso de Drosophila melanogaster como organismo modelo ha servido para identificar nuevos mecanismos moleculares implicados en el crecimiento tumoral. Durante mi tesis doctoral, descubrí que varios genes mitocondriales son necesarios para el crecimiento del tumor cerebral causado por la falta de función del gen lethal (3) malignant brain tumor (l(3)mbt). En concreto, varios genes mitocondriales testiculares, es decir, genes con función mitocondrial y máxima expresión en el testículo de machos adultos, son imprescindibles para el desarrollo de tumores l(3)mbt. Sin embargo, la función de estos genes mitocondriales testiculares es prescindible tanto para el desarrollo de cerebros “wild-type” como del tumor cerebral brat. Uno de estos genes mitocondriales testiculares, ttm2, se expresa tanto en cerebros normales como en cerebros tumorales l(3)mbt. Además, cuando ttm2 es sobreexpresado en el neuroepitelio del cerebro larvario, produce hiperplasia. Esta hiperplasia es específica de las células mediales del “outer proliferative center” (OPC), sin afectar ni al “inner proliferative center” (IPC) ni a los neuroblastos del cerebro. Estos resultados sugieren que los diferentes tipos celulares del cerebro de la larva de Drosophila tienen requerimientos metabólicos distintos y no reaccionan de igual manera a la alteración de la función mitocondrial. Los resultados presentados en esta tesis doctoral proporcionan nuevos datos que confirman el papel crítico de la mitocondria tanto en el proceso de carcinogénesis como en el mantenimiento de la identidad celular.

Alterações no ambiente intrauterino podem levar a consequências que perduram por toda a vida, algumas estão ligadas ao estresse oxidativo e à função mitocondrial, e podem afetar o desenvolvimento físico e motor dos filhotes, além do comportamento alimentar. Nesse contexto, o sobrepeso na gestação é uma preocupação crescente, que pode aumentar o risco de desenvolvimento de doenças crônicas não transmissíveis na vida adulta. Nesse sentido, a restrição calórica (RC) pode exercer um efeito protetor, se bem controlada, já que a desnutrição na gestação também causa efeitos indesejados. Para avaliar o efeito da RC gestacional, dividimos as ratas grávidas entre os grupos controle e RC. O segundo recebeu 20% menos ração, e o consumo de micronutrientes foi equalizado via gavagem. Cerebelo, córtex pré-frontal, hipocampo e hipotálamo dos filhotes foram avaliados nos dias pósnatais (DPN) 0, 7, 21 e 60. A prole também foi submetida a testes comportamentais aos 21 e 60 dias. Observamos um aumento no conteúdo de oxidantes ao nascimento nas regiões encefálicas avaliadas, exceto no cerebelo. Esse efeito foi praticamente abolido nas idades posteriores. As atividades das enzimas antioxidantes estavam, em sua maioria, diminuídas no DPN0, com algumas enzimas ativadas. No DPN7, as enzimas cujas atividades estavam diminuídas passaram a estar inalteradas, e muitas das que não se alteraram ao nascimento estavam ativadas. No DPN60, muitas enzimas foram ativadas, especialmente no córtex pré-frontal e hipocampo. O conteúdo de glutationa reduzida (GSH) diminuiu em três estruturas avaliadas ao nascimento e aumentou no cerebelo e hipotálamo durante o desenvolvimento e no córtex pré-frontal na idade adulta. Os níveis de vitamina C diminuíram nas primeiras idades e aumentaram nas idades posteriores. A lipoperoxidação aumentou no nascimento na maioria das estruturas, e o efeito foi abolido nas idades subsequentes. No córtex pré-frontal, a peroxidação lipídica diminuiu em DPN7, 21 e 60. A oxidação proteica aumentou em DPN0 e diminuiu em DPN60 nessa estrutura. A oxidação proteica também diminuiu no cerebelo na idade adulta. A função mitocondrial, assim como o conteúdo de superóxido, estava diminuída na maioria das estruturas no DPN0, e adaptou-se nas idades posteriores. Na idade adulta a função mitocondrial estava aumentada e o conteúdo de superóxido inalterado ou diminuído. Os complexos do sistema de transporte de elétrons (STEM) apresentaram atividade diminuída em DPN0 e aumentada na idade adulta no cerebelo. A RC não atrasou o desenvolvimento físico e motor dos filhotes e influenciou positivamente no comportamento alimentar dos mesmos na idade adulta. Nossos resultados demonstram que uma RC bem controlada no período gestacional pode melhorar a homeostase redox e a atividade mitocondrial no encéfalo, especialmente na idade adulta, sem promover desnutrição, ao menos em modelo animal em nossas condições experimentais. Alterations in the intrauterine environment can lead to lifelong consequences, some of them are related to oxidative stress and mitochondrial dysfunction and can affect physical and motor development of the pups. Feeding behavior may also be affected. In this context, maternal overweight demands attention, since disease development in adult life may be increased by this condition. In this sense, caloric restriction (CR) may have protective effect if well controlled avoiding maternal undernutrition. In order to evaluate CR effects, we divided pregnant rats into control and CR groups. The second received 20% less chow, and micronutrients consumption was equalized via gavage. Cerebellum, prefrontal cortex, hippocampus, and hypothalamus were evaluated on offspring’s postnatal days (PND) 0, 7, 21, and 60. Animals were also submitted to behavioral tests on PND21 and 60. We observed increased oxidant levels in all brain regions evaluated, except for the cerebellum on PND0. This effect was abolished on latter ages. Antioxidant enzyme activities were mostly decreased on PND0. On PND7, affected enzymes were either equal to control or presented increased activity. On PND60, most enzymes were activated, especially in the prefrontal cortex and hippocampus. Reduced glutathione (GSH) levels were decreased in three brain regions evaluated at birth, increased in the cerebellum and hypothalamus during development and in the prefrontal cortex at adult age. Vitamin C levels decreased in the first ages and were increased in the latter ones. Concerning to oxidative markers, lipid peroxidation was increased at birth in most regions and the effect was abolished thereafter. In the prefrontal cortex, lipid peroxidation was decreased on PND7, 21 and 60. Protein oxidation was increased on PND0 and decreased on PND60 in this region. In the cerebellum, protein oxidation was also decreased at adult age. Mitochondrial function, as well as the mitochondrial superoxide content, was decreased in most structures on PND0 and went through adaptation. At adult age, mitochondrial function was increased and superoxide levels were either unaltered or decreased. Mitochondrial electron transport system (METS) complexes showed decreased activity on PND0 and were activated on PND60 in the cerebellum. CR did not delay physical or neuromotor development and positively influenced pups’ feeding behavior at adult age. Our results show that maternal CR, if well controlled, may improve redox homeostasis and mitochondrial function in the offspring’s brain, especially at adult age, without promoting undernutrition, at least at our experimental conditions.