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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O direcionamento dos primeiros passos para a realização da transferência nuclear de célula somática (TNCS) em catetos garantirá uma ferramenta efetiva na conservação da espécie, perante sua acelerada diminuição populacional e sua atividade ecológica indispensável para o ecossistema. Para tanto, a presente tese foi dividida em duas etapas (três experimentos por etapa), sendo a primeira etapa o estudo das células doadoras de núcleo ou carioplastos e a segunda etapa, o estudo das células doadoras de citoplasma ou citoplastos. Assim, diante da importância de carioplastos de qualidade reconhecida para a TNCS, nós inicialmente estabelecemos cinco linhagens de fibroblastos de catetos, monitorando a viabilidade, atividade metabólica e estresse oxidativo, de acordo com os efeitos do número de passagens (primeira, terceira e décima) e criopreservação. Embora não haja efeito desses critérios sobre a viabilidade, células em décima passagem tiveram uma redução de seu metabolismo. Adicionalmente, células congeladas/descongeladas tiveram um aumento no número de espécies reativas de oxigênio e potencial de membrana mitocondrial. Além disso, sabendo da importância de manter estas células armazenadas em um biobanco de maneira adequada, nós otimizamos a solução crioprotetora utilizada na congelação lenta de fibroblastos de catetos. Deste modo, a solução composta por 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) com 0,2 M de sacarose e 50% de soro fetal bovino (SFB) foi considerada a solução mais eficiente em manter a viabilidade, atividade proliferativa, metabolismo e níveis adequados de estresse oxidativo de células somáticas de catetos, quando comparada a soluções na ausência de sacarose e com 10% de SFB em diferentes combinações. Finalmente, um passo essencial no estabelecimento dos carioplastos para a TNCS consiste na sincronização das células em G0/G1 do ciclo celular. Deste modo, nós avaliamos diferentes métodos de sincronização do ciclo celular: (i) supressão de soro (SS) por um a quatro dias, (ii) inibição por contato (IC) por um a três dias e (iii) agentes químicos [DMSO, 6-dimetilaminopurina (6-DMAP), ciclohexamida (CHX), e citocalasina B (CB)] por um a dois dias, em termos de seus efeitos sobre a sincronização em G0/G1 e viabilidade. Assim, nós observamos que a IC por três dias foi o método mais eficiente para sincronização do ciclo celular e manutenção da viabilidade de fibroblastos de catetos. Portanto, com estes três experimentos, nós estabelecemos a etapa de carioplastos da TNCS de catetos, obtendo células de qualidade e aptas a serem usadas como doadoras de núcleo. Na segunda etapa, nós, inicialmente, adequamos as condições de maturação in vitro (MIV) de oócitos de catetos, avaliando o tempo de MIV e o efeito do fator de crescimento epidermal (EGF) sobre a habilidade meiótica. Assim, nós concluímos que 48 h é o período adequado para a MIV de oócitos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico. Ainda, observou-se que o EGF pode ser utilizado para otimizar o meio de MIV. Finalmente, no terceiro experimento, nós avaliamos a habilidade de desenvolvimento destes oócitos após ativação artificial, usando a ionomicina como ativador primário e comparando diferentes ativadores secundários (6-DMAP, CHX e CB). Nós verificamos que a ativação química usando ionomicina e 6-DMAP foi a mais eficiente combinação, tendo esta tese alcançado como resultado significativo, uma taxa de 27,6% de blastocistos de catetos derivados da ativação oocitária artificial. Em síntese, nós obtivemos carioplastos e citoplastos que poderão ser empregados na TNCS de catetos, deixando a ponto as etapas fundamentais para a clonagem desta espécie. Ainda, destaca-se que os conhecimentos aqui gerados poderão ser aplicados em estudos de fecundação in vitro, compreensão do desenvolvimento embrionário, produção de células induzidas à pluripotência, e ensaios de toxicidade. Portanto, este trabalho foi um grande passo para a conservação de catetos The direction of the first steps for the achievement of somatic cell nuclear transfer (SCNT) in collared peccary will guarantee an effective tool in the conservation of the species, in view of its accelerated population decrease and its essential ecological activity for the ecosystem. Therefore, the present thesis was divided into two steps (three experiments per step), being the first step the study of the donor cells of nucleus or karyoplast and the second stage, the study of the donor cells of cytoplasm or cytoplasts. Thus, in view of the importance of acknowledge quality karyoplast for SCNT, we initially established five cell lines of collared peccary fibroblasts, monitoring viability, metabolic activity and oxidative stress, according to the effects of the number of passages (first, third and tenth) and cryopreservation. Although there is no effect of these criteria on viability, cells in tenth passage had a reduction in their metabolism. Additionally, frozen/thawed cells had an increase in the number of reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential. Moreover, knowing the importance of maintaining these cells stored in a biobank properly, we optimize the cryoprotectant solution used in the slow freezing of collared peccary fibroblasts. Thus, the solution composed of 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) with 0.2 M sucrose and 50% fetal bovine serum (FBS) was considered the most efficient solution in maintaining the viability, proliferative activity, metabolism and adequate levels of oxidative stress of somatic cell cells, when compared to solutions in the absence of sucrose and with 10% FBS in different combinations. Finally, an essential step in establishing the karyoplast for SCNT is the synchronization of cells in G0/G1 of the cell cycle. Thus, we evaluated different cell cycle synchronization methods: (i) serum suppression (SS) for one to four days, (ii) contact inhibition (CI) for one to three days and (iii) chemical agents [DMSO, 6-dimethylaminopurine (6-DMAP), cyclohexamide (CHX), and cytochalasin B (CB)] for one to two days, in terms of their effects on G0/G1 synchronization and viability. Thus, we observed that the IC for three days was the most efficient method for synchronizing the cell cycle and maintaining the viability of collared peccary fibroblasts. Consequently, with these three experiments, we have established karyoplast stage of SCNT in collared peccary, obtaining quality cells and able to be used as nuclear donors. In the second stage, we initially adjusted the in vitro maturation (IVM) conditions of collared peccary oocytes, evaluating the IVM time and the effect of the epidermal growth factor (EGF) on the meiotic ability. Thus, we concluded that 48 h is the appropriate period for oocyte IVM when compared to 24 h, according to meiotic potential. Still, it was observed that EGF can be used to optimize the IVM medium. Finally, in the third experiment, we evaluated the developmental ability of these oocytes after artificial activation, using ionomycin as the primary activator and comparing different secondary activators (6-DMAP, CHX and CB). We found that chemical activation using ionomycin and 6-DMAP was the most efficient combination, with this thesis achieving as a significant result, a rate of 27.6% of blastocysts of collared peccaries derived from oocyte artificial activation. In summary, we got karyoplast and cytoplasts that may be employed in the SCNT of collared peccary, leaving the point the fundamental steps for the cloning of this species. Furthermore, it is emphasized that the knowledge generated here can be applied for in vitro fertilization, studies understanding of embryonic development, production cells induced to pluripotency, and toxicity assessments. Therefore, this work was a great step for the conservation of collared peccaries

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2020. As celulases desempenham um papel significativo no processo industrial de degradação da celulose. Neste estudo, foi relatado a clonagem e a expressão heteróloga de uma β-glicosidase recombinante a partir do cDNA de T. licus licus (TlicB-gluc1) e uma β-1,4-endoglucanase recombinante do cDNA de A. grandis (AgraGH45-1). Os genes foram expressos em sistema heterólogo de Pichia pastorisTM.Baseado na predição de proteínas e busca por domínios conservados, foram clonadas as sequências gênicas TlicB-gluc1com identidade na família GH1 (Glicosil Hidrolase 1) e AgraGH45-1 com identidade na família GH45 (Glicosil Hidrolase 45). Os transcritos do gene clonado TlicB-gluc1apresentaram uma expressão gênica diferencial na fase larval adulta e no intestino médio em relação a carcaça e outras fases da vida do inseto. O perfil proteico do sobrenadante da colônia recombinante apresentou uma proteína diferencial de peso molecular estimado de aproximadamente 50 kDa. A enzima recombinante expressa mostrou-se ativa em pH 4,5 a 45 °C, de acordo com a faixa de pH e temperaturas das enzimas comerciais utilizadas nas indústrias. Também apresentou atividade β-glicosídica na degradação da carboximetilcelulose (CMC) e celobiose. No ensaio de açúcares redutores, observou-se a liberação de glicose no meio (4,76 mM) duas vezes superior em relação ao controle (2,13 mM). Os transcritos do gene clonado AgraGH45-1 apresentaram maior expressão gênica no intestino em ambos os estágios adulto e larval. O perfil protéico apresentou uma proteína de peso molecular estimado de aproximadamente 35 kDa. A enzima recombinante expressa mostrou-se ativa em pH 5,0 a 50 °C na degradação de CMC e Hidroxietilcelulose (HEC). As enzimas recombinantes produzidas enste estudo mostraram-se eficientes na degradação de celuloses amorfas. Estes dados reforçam a importância de identificar a bioquímica digestiva desses insetos-praga, visando o potencial na produção de ferramentas biotecnológicas. Cellulases play a significant role in the industrial process in the degradation of cellulose. In this study, we report the cloning and heterologous expression of a recombinant β-glucosidase from the Telchin licus licus cDNA (TlicB-gluc1), and a recombinant β-1,4-endoglucanase from the A. grandis cDNA (AgraGH45-1). The genes were expressed in a heterologous Pichia pastorisTM. Based on protein prediction and search for conserved domains, the TlicB-gluc1gene sequences with identity in the GH1 family (Glycosyl Hydrolase 1) and AgraGH45-1with identity in the GH45 family (Glycosyl Hydrolase 45) were cloned. The transcripts of the cloned TlicB-gluc1gene showed differential gene expression in the adult larval stage and in the midgut in relation to the carcass and other stages of the insect's life. The protein profile of the recombinant colony supernatant showed a differential protein with an estimated molecular weight of approximately 50 kDa. The recombinant enzyme expressed was active at pH 4,5 at 45 ° C according to the pH range and temperatures of the commercial enzymes used in the industries. It also showed β- glycosidic activity in the degradation of carboxymethylcellulose (CMC) and cellobiose. In the reducing sugar assay, glucose was released into the medium (4,76 mM) twice as high as the control (2,13 mM). The transcripts of the cloned AgraGH45-1gene showed higher gene expression in the intestine in both the adult and larval stages. The protein profile showed a protein with an estimated molecular weight of approximately 35 kDa. The expressed recombinant enzyme was active at pH 5,0 at 50 °C in the degradation of CMC and Hydroxyethylcellulose (HEC).The recombinant enzymes produced in this study proved to be efficient in the degradation of amorphous celluloses. These data reinforce the importance of identifying the digestive biochemistry of these insect-pests, aiming its application in the production of biotechnological tools.

Bamboo species are an alternative for the composition of forest plantations. However, their potential has not been explored due to the hard time in producing large-scale clonal plants. Thus, the aim this work was to evaluate the in vitro establishment, bud multiplication and ex vitro rooting of Bambusa vulgaris. The first experiment tested different systemic and contact fungicide solutions, based on exposure time, during the establishment phase. Established explants were subjected to evaluation of residual fungicide effect on subcultures during the multiplication and elongation phases. The second experiment evaluated the influence of activated carbon on ex vitro survival and on adventitious rooting. Explant immersion in liquid culture medium added with 1.0 mL of fungicide for 120 hours has favored the in vitro establishment and reduced fungal contamination. On the other hand, it favored the shoot emission of shoots per explant during the multiplication phase. Both rooting induction culture medium and mini-incubator system use were effective in enabling adventitious root formation. The presence of activated carbon in the rooting induction culture medium resulted in a higher clonal plant survival rate. As espécies de bambus são uma alternativa para a composição de plantios florestais. Entretanto, esse potencial não tem sido explorado devido à dificuldade de produção de mudas clonais em larga escala. Assim, objetivo deste trabalho foi avaliar o estabelecimento in vitro, a multiplicação e o enraizamento ex vitro de Bambusa vulgaris. No primeiro experimento foram testadas diferentes soluções de fungicida sistêmico e de contato em relação ao tempo de exposição durante a fase de estabelecimento. Os explantes estabelecidos foram avaliados quanto ao efeito residual do fungicida durante subcultivos nas fases de multiplicação e alongamento. No segundo experimento, foi avaliada a influência do carvão ativado sobre a sobrevivência e enraizamento ex vitro. Durante o estabelecimento in vitro, a imersão de explantes em meio de cultura líquido contendo alíquota de 1,0 mL de fungicida durante 120 horas favoreceu o estabelecimento e reduziu a contaminação fúngica, enquanto na fase de multiplicação, houve o favorecimento da emissão de brotos por explante. O meio de cultura de indução ao enraizamento e uso de sistema de mini-estufim foram efetivos para a formação de raízes adventícias e a presença de carvão ativado resultou em uma maior sobrevivência das mudas clonais.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior ? Brasil (CAPES) ? C?digo de Financiamento 001. Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2021-03-15T21:00:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) vitoria_souza_cangucu.pdf: 1889929 bytes, checksum: b7870b053c3cb56c876470c4e0397a3c (MD5) Approved for entry into archive by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2021-03-16T13:19:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) vitoria_souza_cangucu.pdf: 1889929 bytes, checksum: b7870b053c3cb56c876470c4e0397a3c (MD5) Made available in DSpace on 2021-03-16T13:19:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) vitoria_souza_cangucu.pdf: 1889929 bytes, checksum: b7870b053c3cb56c876470c4e0397a3c (MD5) Previous issue date: 2020 Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) Na silvicultura, a propaga??o vegetativa ? amplamente utilizada, pois oferece vantagens como ganho gen?tico relativamente r?pido, maior efici?ncia de manejo florestal e melhor utiliza??o do produto final. A sazonalidade ambiental desempenha um papel fundamental nos processos de forma??o de ra?zes e, consequentemente na propaga??o clonal para fins comerciais. Algumas tecnologias, como o uso do estufim, v?m sendo empregadas com o objetivo de reduzir interfer?ncias ambientais e aumentar a produtividade de mudas, com resultados promissores. Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de diferentes modelos de estufim na propaga??o clonal de dois clones h?bridos de eucalipto, em duas esta??es do ano. Os experimentos foram conduzidos na Empresa Aperam Bioenergia, em Itamarandiba - MG, de julho de 2019 a fevereiro de 2020, cujos trabalhos foram divididos em tr?s cap?tulos, todos avaliando tr?s modelos de estufim: com 35 cm, 55 cm, 55 cm tubular e sem cobertura (controle). No primeiro, os modelos foram avaliados, em duas esta??es do ano (frio e calor), na produ??o de miniestacas por minicepas. A esta??o do ano e o uso do estufim, juntos, influenciaram a produtividade de miniestacas de ambos os clones e o uso do estufim resultou em maior produtividade de miniestacas por minicepas. No segundo, foi avaliado o efeito dos modelos de estufim no enraizamento das miniestacas durante sua perman?ncia na casa de vegeta??o. Este variou de acordo com o material gen?tico. No terceiro, foi testado os modelos de estufim na produ??o de mudas, em duas esta??es do ano (frio e calor). A esta??o do ano tem grande influ?ncia na sobreviv?ncia e qualidade das mudas. Mudas produzidas no per?odo quente apresentaram desenvolvimento superior. A reposta das mudas quanto ao uso do estufim variou de acordo com o material gen?tico. Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Ci?ncia Florestal, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2020. In forestry, vegetative propagation is widely used because it offers advantages such as relatively rapid genetic gain, greater efficiency in forest management, and better use of the final product. Environmental seasonality plays a fundamental role in root formation processes and, consequently, in clonal propagation for commercial purposes. Some technologies, such as the use of the greenhouse, have been used in order to reduce environmental interference and increase seedling productivity, with promising results. This work aimed to evaluate the effect of different models of mini-tunnels on the clonal propagation of two hybrid eucalyptus clones, at two times of the year. The experiments were conducted at the Aperam Bioenergia Company, in Itamarandiba - MG, from July 2019 to February 2020, whose works were divided into three chapters, all evaluating three models of the stove: with 35 cm, 55 cm, 55 cm tubular and without coverage (control). In the first, the models were evaluated, at two times of the year (cold and hot), in the production of minicuttings by mini-stacks. The time of the year and the use of the mini-tunnels, together, influenced the productivity of mini-cuttings of both clones and the use of the mini-tunnels resulted in higher productivity of mini-cuttings per mini-stump. In the second, the effect of the mini-tunnels models on the rooting of the minicuttings during their stay in the greenhouse was evaluated. This varied according to the genetic material. In the third, the greenhouse models were tested in the production of seedlings, in two seasons (cold and hot). The time of year has a great influence on the survival and quality of seedlings. Seedlings produced in the hot period showed superior development. The response of the seedlings to the use of the greenhouse varied according to the genetic material.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior ? Brasil (CAPES) ? C?digo de Financiamento 001. Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2021-02-22T14:31:37Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) sula_janaina_oliveira_fernandes.pdf: 1593413 bytes, checksum: c0f6c214eeae67f803fd4b1fd3c7caaf (MD5) Approved for entry into archive by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2021-02-22T14:40:42Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) sula_janaina_oliveira_fernandes.pdf: 1593413 bytes, checksum: c0f6c214eeae67f803fd4b1fd3c7caaf (MD5) Made available in DSpace on 2021-02-22T14:40:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) sula_janaina_oliveira_fernandes.pdf: 1593413 bytes, checksum: c0f6c214eeae67f803fd4b1fd3c7caaf (MD5) Previous issue date: 2020 Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM) Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico (CNPq) Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) Esp?cies do g?nero Corymbia e alguns de seus h?bridos interespec?ficos s?o importantes fontes de material gen?tico para os programas de melhoramento florestal no Brasil.As principais raz?es s?o os aspectos de qualidade da madeira, boa adapta??o ?s diferentes regi?es edafoclim?ticas, relativo incremento volum?trico de madeira, boa forma e capacidade de brota??o. Por?m, as esp?cies do g?nero Corymbia s?o consideradas de dif?cil propaga??o vegetativa. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a miniestaquia seriada e a micropropaga??o em h?bridos de Corymbia spp. O segundo e o terceiro cap?tulos objetivaram o desenvolvimento de um protocolo para a micropropaga??o de clones h?bridos de Corymbia spp. A desinfesta??o com 2,5% (v/v) de hipoclorito de s?dio por 10 minutos e o meio de cultura MS sem o carv?o ativado foram mais adequados para o estabelecimento dos explantes in vitro. Na fase de multiplica??o, os subcultivos 2 e 6 apresentaram os maiores n?meros de brotos, sendo que os meios de introdu??o in vitro influenciaram de forma vari?vel os clones h?bridos de Corymbia. A concentra??o de 1 mg L-1 de AIB, na fase de enraizamento in vitro, favoreceu o enraizamento dos h?bridos de Corymbia. No quarto e quinto cap?tulo foi avaliada a efici?ncia da miniestaquia seriada para os h?bridos de Corymbia. Foram utilizados quatro subcultivos para a forma??o do minijardim clonal. Avaliou-se a produtividade e o vigor das minicepas, e o percentual de enraizamento e produ??o de mat?ria seca da parte a?rea e da raiz de miniestacas provenientes dos subcultivos estabelecidos em minijardim clonal. Os subcultivos n?o alteraram o vigor das minicepas dos 4 clones h?bridos de Corymbia, visto que as vari?veis avaliadas n?o apresentaram respostas crescentes aos subcultivos realizados. O subcultivo 1 apresentou a maior produ??o de mat?ria seca da parte a?rea e da raiz e o percentual de enraizamento dos clones h?bridos de Corymbia spp. As duas concentra??es de AIB n?o diferiram entre si para o percentual de enraizamento de miniestacas. Tese (Doutorado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Ci?ncia Florestal, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2020. Species of the genus Corymbia and some of its interspecific hybrids are important sources of genetic material for forest improvement programs in Brazil. The main reasons are the aspects of wood quality, good adaptation to different edaphoclimatic regions, relative volume increase of wood, good sprouting form and capacity. However, species of the genus Corymbia are considered difficult to propagate. The general objective of this work was to evaluate the serial minicutting and micropropagation in hybrids of Corymbia spp. The second and third chapters aimed to develop a protocol for the micropropagation of hybrid clones of Corymbia spp. Disinfestation with 2.5% (v / v) sodium hypochlorite for 10 minutes and the MS culture medium without activated charcoal were more suitable for the establishment of explants in vitro. In the multiplication phase, subcultures 2 and 6 showed the highest number of shoots, and the means of in vitro introduction influenced in a variable way according to the hybrid clones of Corymbia. The concentration of 1 mg L-1 of IBA in the in vitro rooting phase favored the rooting of the Corymbia hybrids. In the fourth and fifth chapters, the efficiency of the serial minicutting was evaluated for the Corymbia hybrids. Four subcultures were used to form the clonal minigarden. The productivity and vigor of the minicrafts and the percentage of rooting and production of dry matter from the aerial part and the root of minicuttings from subcultures established in a clonal minigarden were evaluated, since the evaluated variables did not show increasing responses to the subcultures performed. The subculture 1 presented the highest dry matter production of the aerial part and the root and percentage of rooting of the hybrid clones of Corymbia spp., the two concentrations of IBA did not differ among themselves for the percentage of rooting of minicuttings.

The objective of this work was to evaluate the feasibility of early selection of open-pollinated yerba mate (Ilex paraguariensis) progenies, and to classify the best parents and candidates for clones. The germplasm is composed of 140 progenies collected from areas within the natural distribution of the species in Southern Brazil and a commercial genotype (control). The experiment was established in Ivaí, in the state of Paraná, Brazil, in March 1997, in randomized complete blocks, with ten replicates, and linear plots of six plants. The commercial mass (kg per plant) of leaves and branches smaller than 7 mm was harvested at 2.5, 4.5, 6.5, and 18.7 years of age. The statistical evaluation was performed using the mixed model procedure with restricted maximum likelihood/best linear unbiased prediction, using the Selegen software. High selective accuracy, significant progeny effects, and genetic variability for commercial mass production were observed for the four harvesting ages. The application of early selection for leaf mass production is feasible for yerba mate progenies harvested at 6.5 years. The selection of the best trees, either for use as parents or as candidates for cloning, provides significant gains for the genetic breeding of yerba mate. Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade da seleção precoce de progênies de polinização aberta de erva-mate (Ilex paraguariensis) e classificar os melhores genitores e candidatos a clones. O germoplasma é composto por 140 progênies coletadas em áreas de distribuição natural da espécie na região Sul do Brasil e um genótipo comercial (testemunha). O experimento foi implantado em Ivaí, PR, em março de 1997, em blocos ao acaso, com dez repetições, e parcelas lineares de seis plantas. A massa comercial (kg por planta) com folhas e galhos menores que 7 mm foi colhida aos 2,5, 4,5, 6,5 e 18,7 anos de idade. A avaliação estatística foi realizada por meio do procedimento de modelos mistos com máxima verossimilhança restrita/melhor predição linear não viesada, por meio do programa Selegen. Elevada acurácia seletiva, efeitos significativos de progênies e variabilidade genética para a produção de massa comercial foram observados nas quatro idades de colheitas. A aplicação da seleção precoce para a produção de massa foliar é viável para as progênies na colheita aos 6,5 anos. A seleção das melhores árvores, seja para uso como genitoras em cruzamentos ou como candidatas à clonagem, proporciona ganhos significativos para o melhoramento de erva-mate.

RESUMO O vinhático (Plathymenia reticulata Benth) é uma das espécies nativas do Brasil, de interesse econômico e ambiental. Sua propagação tem sido realizada por sementes, entretanto, o difícil acesso às matrizes, os intervalos longos de frutificação e dificuldade de armazenamento destacam a importância de técnicas que permitam a propagação clonal da espécie. Estudos conduzidos com minicepas de vinhático, advindas de mudas produzidas por sementes têm demonstrado que, embora as minicepas apresentem boa brotação, o enraizamento das miniestacas é muito baixo. Com isso, objetivou-se neste trabalho, avaliar a produção de mudas de vinhático por miniestaquia, utilizando diferentes técnicas de manejo para induzir o enraizamento. Foram realizados dois experimentos em casa de vegetação, sendo que, no primeiro, as minicepas foram obtidas a partir de mudas produzidas via semente de progênies de onze matrizes, das quais se promoveu a coleta sucessiva de miniestacas, sendo estas submetidas a diferentes concentrações do regulador de crescimento AIB (0, 2.000, 4.000, 6.000 e 8.000 mg.L-1). No segundo experimento foi utilizado o manejo de luz (sombreamento na base da brotação e sombreamento total da minicepa) e de nutriente, com aplicação de nitrogênio (4 g.L-1 de ureia) nas minicepas. As miniestacas produzidas foram avaliadas quanto à capacidade de enraizamento e anatomia na base da miniestaca. No primeiro experimento verificou-se uma variação de sobrevivência e tolerância à poda apical entre as progênies das matrizes analisadas, com destaque para progênie da matriz DOM, que apresentou o maior percentual na primeira coleta (88,2%), e uma sensibilidade das progênies NELI, ZE1 e ZE2 aos efeitos do manejo e às condições ambientais no minijardim clonal. O vinhático respondeu de forma positiva à coleta sucessiva de brotações, com aumento do número de brotações produzidas a partir do quarto mês de coleta (210 dias). Não houve efeito significativo no enraizamento de mudas de vinhático quando submetido a concentrações crescentes de AIB, nem quanto ao tipo de manejo de luz e nitrogênio utilizados para estimular o enraizamento de miniestacas. Não foram observadas barreiras anatômicas ao enraizamento dos clones nos diferentes tipos de manejos avaliados. ABSTRACT Vinatic (Plathymenia reticulata Benth.) is one of the native species of Brazil, of economic and environmental interest. Its propagation has been carried out by seeds, however, the difficult access to the matrices, long intervals of fruiting and difficulty of storage, emphasize the importance of techniques that allow the clonal propagation of the species. Studies conducted with vinatic minitumps, coming from seedlings have shown that although the ministumps show good sprouting, the minicutting rooting is very low. The aim of this study was to evaluate the production of vinatic seedlings by minicutting using different management to induce rooting. Two experiments were carried out in a greenhouse and, in the first experiment, the minitumps were obtained from seedlings produced from progenies of eleven matrices, from which the successive collection of minicuttings was promoted, these being submitted to different concentrations of the IBA growth regulator (0, 2.000, 4.000, 6.000 and 8.000 mg.L-1). In the second experiment, light management (shading at buds base and total shading of minitump) and nutrient were used, with nitrogen application (4 g.L-1 urea) in the minitumps. The minicuttings produced were evaluated for rooting capacity and anatomy at the base of the minicuttings. In the first experiment there was a variation of survival and tip pruning tolerance among the progenies of the matrices analyzed, with emphasis on progeny of the DOM matrix, which presented the highest survival percentage in the first collection (88,2%), and a sensitivity of NELI, ZE1 and ZE2 progenies to the management in the clonal minigarden. Vinatic responded positively to the successive collection of sprouts, with an increase in the number of sprouts produced from the fourth month of collection (210 days). There was no significant effect on rooting of vinatic plants when submitted to increasing concentrations of IBA, nor on the type of light and nitrogen management used to stimulate the minicuttings rooting. No anatomical barriers were observed to the rooting of the minicuttings in the different managements evaluated.

RESUMO Ilex paraguariensis é uma espécie florestal que apresenta múltiplas potencialidades, sendo utilizada na indústria alimentícia, farmacêutica e cosmética. Contudo, a propagação seminal da espécie é limitada devido à baixa (inferior a 20%) e desuniforme germinação, além do longo período de estratificação das sementes (de quatro a seis meses) necessário para a quebra da dormência embrionária. Diante do potencial uso da miniestaquia como técnica alternativa para superar tais limitações, objetivou-se avaliar o efeito do ácido indolbutírico (IBA) no enraizamento de miniestacas de erva-mate coletadas nas quatro épocas do ano (de julho/2014 a maio/2015). As miniestacas foram confeccionadas com 6 cm (± 1 cm) de comprimento e duas folhas reduzidas à metade e, a porção basal dos propágulos foi imersa durante 10 segundos em diferentes soluções hidroalcoólicas de ácido indolbutírico (0, 2000, 4000, 6000 e 8000 mg L-1). Após 90 dias da permanência do material vegetal em casa de vegetação climatizada, foram avaliados: porcentagem de enraizamento, número de raízes e comprimento médio das três maiores raízes/miniestaca, porcentagem de calogênese, retenção foliar, brotações desenvolvidas e mortalidade. A primavera foi a época mais promissora, proporcionando aproximadamente 70% de enraizamento e, aliada à aplicação de 8000 mg L-1 de IBA, as miniestacas atingiram o maior comprimento (4,3 cm) e número de raízes (9,1) bem como, a menor taxa de calogênese (0%). A coleta das miniestacas na primavera e a aplicação de 8000 mg L-1 de IBA é a mais indicada para miniestaquia de erva-mate. ABSTRACT Ilex paraguariensis is a forest species that has multiple potentialities, being used in the food, pharmaceutical and cosmetic industries. However, the seminal propagation of the species is difficult due to its low (below 20%) and non-uniform germination and the long period (four to six months) stratification of seeds needed for the breaking of embryo dormancy. The minicutting technique is an alternative to overcome such limitations, therefore this study aimed to evaluate the effect of indolebutyric acid (IBA) on rooting of yerba mate minicuttings collected at different seasons (July/2014 to May/2015). Minicuttings were prepared with 6 cm (± 1 cm) long and two leaves reduced by half and, the basal portion of the propagules was immersed for 10 second in different hydroalcoholic solutions of IBA (0,200,400,6000 and 8000 mg L-1). After 90 days of installation of the experiments, we evaluated the percentage of rooting, root number and average length of three major roots, percentage of callogenesis, leaf retention, developed shoots and mortality. The spring was the most promising season, providing approximately 70% of rooting and coupled the application of 8000 mg L-1 of the IBA the minicuttings reached the greatest length (4.3 cm) and root number (9.1) as well as the lower callus induction rate (0%). The minicutting collection in the spring and 8000 mg L-1 of the IBA is the most indicated for minicutting technique of yerba mate.

Vegetative propagation is an alternative for the production of seedlings of native tree species such as Schinus terebinthifolia that presents a high predation rate on its seeds. In order to develop vegetative propagation technology, different concentrations of indolebutyric acid (IBA) were tested in the rooting of apical and intermediate minicuttings of Schinus terebinthifolia. The 2x4 factorial experimental design involved two types of minicuttings (apical and intermediate) and four dosages of the hormone IBA (0, 1000, 2000, and 4000 mg. L-1). The percentages of survival and rooting were evaluated. The intermediate minicuttings (37% and 35%) showed significantly greater survival than the apical cuttings (22% and 9%) respectively at 30 and 60 days, regardless of the IBA concentration. Among the rooting averages at 60 days obtained in the different concentrations of IBA, the treatment of 4000 mg. L-1 generated the highest results (9% for apical and 35% for intermediate). The vegetative propagation by minicuttings of Schinus terebinthifolia demonstrated the viability of intermediate minicuttings with high rooting associated with the highest concentration of IBA. La propagación vegetativa es una alternativa para la producción de plántulas de especies arbóreas nativas como Schinus terebinthifolia que presenta una alta tasa de depredación sobre sus semillas. Para desarrollar la tecnología de propagación vegetativa, se probaron diferentes concentraciones de ácido indolbutírico (IBA) en el enraizamiento de minicortes apicales e intermedios de Schinus terebinthifolia. El diseño experimental factorial 2x4 involucró dos tipos de minicortes (apical e intermedio) y cuatro dosis de la hormona IBA (0, 1000, 2000 y 4000 mg. L-1). Se evaluaron los porcentajes de supervivencia y enraizamiento. Los minicortes intermedios (37% y 35%) mostraron una supervivencia significativamente mayor que los cortes apicales (22% y 9%) respectivamente a los 30 y 60 días, independientemente de la concentración de IBA. Entre los promedios de enraizamiento a los 60 días obtenidos en las diferentes concentraciones de IBA, el tratamiento de 4000 mg. L-1 generó los resultados más altos (9% para apical y 35% para intermedio). La propagación vegetativa por minicortes de Schinus terebinthifolia demostró la viabilidad de minicortes intermedios con alto enraizamiento asociado a la mayor concentración de IBA. A propagação vegetativa é uma alternativa para a produção de mudas de espécies arbóreas nativas como Schinus terebinthifolia que apresenta uma alta taxa de predação de suas sementes. Com o objetivo de desenvolver a tecnologia de propagação vegetativa, diferentes concentrações de ácido indolbutírico (AIB) foram testadas no enraizamento de miniestacas apicais e intermediárias de Schinus terebinthifolia. O delineamento experimental fatorial 2x4 envolveu dois tipos de miniestacas (apical e intermediária) e quatro dosagens do hormônio IBA (0, 1000, 2000 e 4000 mg. L-1). Foram avaliadas as porcentagens de sobrevivência e enraizamento. As miniestacas intermediárias (37% e 35%) apresentaram sobrevivência significativamente maior do que as estacas apicais (22% e 9%), respectivamente, aos 30 e 60 dias, independentemente da concentração de AIB. Dentre as médias de enraizamento aos 60 dias obtidas nas diferentes concentrações de AIB, o tratamento de 4000 mg. L-1 gerou os resultados mais elevados (9% para apical e 35% para intermediário). A propagação vegetativa por miniestacas de Schinus terebinthifolia demonstrou a viabilidade de miniestacas intermediárias com alto enraizamento associadas à maior concentração de AIB.

In the school, the challenge of favoring a meaningful learning process through the mobilization of students' prior knowledge is still persistent. Here we argue the use of a problem situation on cloning in Biology classes as a strategy to (i) identify subsumers in the cognitive structure of students that would be introduced to Genetics contents and (ii) allow the elaboration of an advance organizer. The students' written records were analyzed by Content Analysis. We consider that the problem situation and the subsequent production of an advance organizer were able to highlight students' knowledge and conceptions about the subject, as well as to contribute to reflect on the introduction of bioethical issues in Biology Teaching. En las prácticas escolares, el desafío de favorecer un proceso de aprendizaje significativo aún persiste a través de la movilización de los conocimientos previos de los estudiantes. En este artículo, discutimos el uso de una situación problema sobre clonación en las clases de Biología como una estrategia para (i) identificar subunidades en la estructura cognitiva de los estudiantes que serían introducidos a los contenidos de Genética y (ii) posibilitar el desarrollo de un organizador previo. Los registros de los estudiantes se enviaron a Análisis de contenido. Consideramos que la aplicación de la situación-problema y la posterior producción de un organizador anterior permitió resaltar los conocimientos y conceptos de los estudiantes sobre el tema, además de contribuir a reflexionar sobre la inclusión de cuestiones bioéticas en la Enseñanza de la Biología. Nas práticas escolares ainda é persistente o desafio de favorecer um processo de aprendizagem significativa por meio da mobilização dos conhecimentos prévios dos estudantes. Neste artigo discutimos a utilização de uma situação-problema sobre clonagem nas aulas de Biologia como estratégia para (i) identificar subsunçores na estrutura cognitiva de alunos que seriam introduzidos a conteúdos de Genética e (ii) possibilitar a elaboração de um organizador prévio. Os registros dos estudantes foram submetidos à Análise de Conteúdo. Consideramos que a aplicação da situação-problema e a produção subsequente de um organizador prévio permitiram evidenciar conhecimentos e concepções dos alunos acerca da temática, ademais de contribuir para refletir sobre a inclusão de questões bioéticas no Ensino de Biologia.

Submitted by Guilherme Gonçalves Fabretti Santos (guilherme_fabretti@hotmail.com) on 2019-11-18T13:43:18Z No. of bitstreams: 1 Tese atual Guilherme_corrigida.pdf: 1965922 bytes, checksum: 5d7e05b565baf6965c99548a4a04405f (MD5) Rejected by Ederson Vasconcelos Pereira null (edersonpereira@fmva.unesp.br), reason: Prezado Doutorando Guilherme Gonçalves Fabretti Santos, Solicito que faça as seguintes correções em sua Tese: * Na Folha de Rosto: Nome do Orientador: Alinhado do meio da página para a margem direita. ( vide pg.9 da Normalização) * Na Ficha Catalográfica: Colocar Orientador: Profº Dr. ( está Orientadora). ( vide pg 10 da Normalização) * Em RESUMO e ABSTRACT: Referência do trabalho, elaborada conforme a norma utilizada na lista de referências ( vide pg 14 da Normalização) * No SUMÁRIO: 1 (excluir espaço) 2 (excluir espaço) 3.3.2 Análises bioquímicos 3.3.3 Análises hormonais 3.3.4 Fracionamento eletroforético 3.4 Análise Estatística 4 RESULTADOS 5 (excluir espaço) 6 (excluir espaço) * Todos os Títulos da Tese - alinhados à margem esquerda; * Incluir no SUMÁRIO e colocar seção: Objetivos gerais e objetivos específicos; * Palavra REFERÊNCIAS : Fonte 14; Maiúscula; Negrito; Centralizado ( vide pg 22 da Normalização) Solicito que, após as devidas correções, submeta novamente. Att, Ederson Vasconcelos Pereira Responsável pelo Repositório Institucional UNESP - FMVA on 2019-11-18T20:22:09Z (GMT) Submitted by Guilherme Gonçalves Fabretti Santos (guilherme_fabretti@hotmail.com) on 2019-11-19T19:16:43Z No. of bitstreams: 2 Tese atual Guilherme_corrigida.pdf: 1965922 bytes, checksum: 5d7e05b565baf6965c99548a4a04405f (MD5) Tese atual Guilherme_corrigida_nova_19-11-19.pdf: 1973157 bytes, checksum: acd12f72fd9de3be744bd3aea95ca049 (MD5) Approved for entry into archive by Ederson Vasconcelos Pereira null (edersonpereira@fmva.unesp.br) on 2019-11-19T20:20:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_ggf_dr_araca_int.pdf: 1973157 bytes, checksum: acd12f72fd9de3be744bd3aea95ca049 (MD5) Made available in DSpace on 2019-11-19T20:20:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_ggf_dr_araca_int.pdf: 1973157 bytes, checksum: acd12f72fd9de3be744bd3aea95ca049 (MD5) Previous issue date: 2019-10-18 A transferência nuclear de células somáticas de animais de produção é realizada há mais de 20 anos. No que concerne aos bovinos, uma série de anormalidades tem sido observada, tanto do ponto de vista metabólico como fisiológico. O objetivo deste trabalho foi avaliar os índices de morbimortalidade de bezerros da raça Nelore clonados durante o primeiro mês de vida. Desta forma, foram avaliadas as características clínico-laboratoriais, bem como as principais alterações anatomopatológicas em bezerros da raça Nelore oriundos de transferência nuclear de células somáticas (TNCS)-clonagem, comparando-os com animais desta mesma raça, frutos de fertilização in vitro (FIV). Para tanto, os animais foram alocados em dois grupos, a saber: Grupo I (GI) - 10 animais frutos de TNCS; e, Grupo II (GII) - 10 animais oriundos de FIV. Nos respectivos bezerros, todos obtidos por cesariana, foram realizadas as avaliações físicas, bem como coleta de amostras de sangue nos momentos 0 (ao nascimento), 2, 4, 6 e 12 horas de vida a fim de avaliar os resultados de hemograma, análises bioquímicas e proteinograma sérico, comparando-os entre os grupos e momentos avaliados. Nos animais que vieram a óbito foi realizada a necropsia para investigar a “possível” causa mortis. A mortalidade atingiu 90% dos animais do GI e 20% do GII, durante as primeiras 48 horas de vida. Ao exame físico observou-se que 50% dos bezerros do GI e 10% do GII apresentavam peso excessivo ao nascimento. Ademais, 30% dos animais do GI eram possuidores de deformidades nos membros. O escore de APGAR indicou animais com baixa e moderada vitalidade, perfazendo 80% e 60% dos bezerros do GI e GII, respectivamente. Em adição, notou-se que a baixa pontuação apresentou correlação negativa com a concentração plasmática de lactato, não apresentando, no entanto, analogia significativa com a presença de mecônio ao nascimento em cada grupo individualmente. Essa característica, no GI, esteve envolvida com alterações da frequência respiratória, em virtude da inalação deste. Nesse aspecto, constatou-se uma hiperlactemia em ambos grupos sendo superior no GI a partir da segunda hora de vida persistindo elevada, mesmo após a oxigenioterapia. As alterações laboratoriais no GI incluíram anemia ao longo do período experimental, de origem hemolítica, aumento da creatinina e hipercalcemia. No GII observou-se anemia ferropriva ao fim do período experimental, leucocitose por neutrofilia, hiperinsulinemia e hipoglicemia. O proteinograma sérico denotou diferenças significativas nos valores de IgG a partir das seis horas de vida, sendo superior nos animais do GII. Ao exame anatomopatológico constatou-se atelectasia, edema e enfisema pulmonar bem como visceromegalia acometendo o fígado. Malformações cardíacas e renais também foram denotadas, além de distúrbios de natureza circulatória nos órgãos do trato gastrointestinal. Conclui-se que os animais oriundos da TNCS apresentam alterações fisiológicas, metabólicas e anatomopatológicas, ocasionando, em grande parte, maior taxa de óbitos durante o período perinatal. Over past 20 years, the production animal species have been successfully cloned from somatic cell lines including cattle. In this specie metabolic and physiological complications have been seen. The aim of this study was to evaluate morbity-mortality of Nelore cloned calves during the first 30 days of life. For this clinical, laboratorial and pathological disturbances of Nelore cloned calves derived from somatic cell nuclear transfer (SCNT) was took over and compare them with animals from the same breed from in vitro fertilization (IVF). For this, two groups were formed. Group I (GI): Ten calves derived from SCNT and group II (GII): Ten calves derived from IVF. In both groups delivered by cesarean section, the physical and blood collection for laboratorial assessments was carried out at birth, 2, 4, 6 and 12 hours after delivered to evaluate clinical, hematological, biochemistry and serum proteinogram compared then between the groups and the moments. Necropsy was performed in every animal that died to identify the possible causa mortis. The mortality rate was 90% in GI and 20% in GII during the first 48 hours. Based on physical examination 50% of the GI animals and 10% of the GII animals had overweight at birth. Limb flexural deformity was noted in 30% of calves in GI. At birth 80% and 60% of the calves in GI and GII, respectively had low and moderate APGAR score index. It was noted that the low score was negative correlated with plasma lactate concentration with no relation with meconium-stained at birth in the individual groups. The meconium-stained, in GI was involved with alterations in respiratory rates probably due meconium aspiration. This situation may took to hyperlactemia in both groups but with higher concentrations in GI from 2 hours after birth persisting even oxygen supplementation. Laboratory abnormalities in GI included anemia hemolytic in origin that persists along the experimental period, increased creatinine and hyperlactemia. In GII the anemia was due iron deficiencies only at the final of the experimental period, stress leukogram, hyperinsulinemia and hypoglycemia. The serum proteinogram showed significantly differences in IgG values at six hours with high values in GII. The necropsy finds identified pulmonary atelectasis, edema and emphysema as well as liver visceromegali. Renal and heart abnormalities and circulatory alterations in gastrointestinal organs were noted too. In conclusion cloned calves showed physiological, metabolic and pathological abnormalities leading the high mortality rates during the perinatal period

A Transferência Nuclear de Células Somáticas (TNCS-Clonagem) é uma técnica que se baseia na produção de indivíduos geneticamente idênticos. A TNCS possui potencial aplicação em várias áreas, como na transgênese, na preservação de animais em extinção, na produção animal, nas ciências básicas e na medicina humana. No entanto, sua eficiência ainda é baixa. As taxas de nascimento variam em torno de 0 a 10%. Estudos sugerem que a principal causa dessa baixa eficiência da técnica seja uma reprogramação epigenética inadequada nos estágios iniciais do desenvolvimento. Os genes IGF2 e H19 são genes imprinted, ou seja, caracterizados pela expressão monoalélica e dependente da origem parental do alelo. Esses genes estão relacionados ao desenvolvimento embrionário, da placenta e crescimento fetal. O objetivo desse trabalho foi caracterizar o padrão de metilação de uma região do éxon 10 do gene IGF2 e da Região Controladora de Imprinting (ICR) do gene H19 na placenta de animais clonados. Para a execução do trabalho foram selecionados clones bovinos fêmeas e machos, apresentando diferentes fenótipos. O DNA da placenta desses animais foi extraído, e em seguida foi tratado com bissulfito de sódio e amplificado para os loci ICR/H19 e IGF2. Os produtos da PCR foram clonados em bactérias competentes e por fim sequenciados. Foi encontrada uma diferença significativa entre os controles e os clones com fenótipos saudáveis para a região da ICR/H19. Nesta região, os controles tiveram um padrão hemimetilado, como previsto pela literatura, devido essa região ser imprinted. Enquanto os clones encontravam-se menos metilados. Para a região do éxon 10 do IGF2, não foi encontrada diferença significativa entre controles e clones, e entre clones com fenótipos aberrantes e saudáveis. Estes resultados sugerem que as diferentes regiões do genoma podem se reprogramar independente umas das outras e que falhas na reprogramação do padrão de metilação do DNA de genes imprinted podem ser uma das causas da baixa eficiência da TNCS. Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT- Cloning) is a technique that is based on the production of genetically identical individuals. SCNT has potential application in several areas, such as transgenesis, preservation of endangered animals, animal production, basic sciences and human medicine. However, its efficiency is still low. Birth rates range from 0 to 10%. Studies suggest that the main cause of this low efficiency of the technique is an inadequate epigenetic reprogramming in the early stages of development. IGF2 and H19 genes are imprinted genes that are characterized by monoallelic expression and dependent on the allele's parental origin. These genes are related to embryonic development, placenta and fetal growth. The objective of this study was to characterize the methylation pattern of an exon 10 region of the IGF2 gene and the H19 gene Imprinting Control Region (ICR) in the placenta of cloned animals. For this study female and male cloned calves presenting different phenotypes were used. Genomic DNA from placenta of these animals was isolated, then treated with sodium bisulfite and amplified to the ICR/H19 and IGF2 loci. PCR products were cloned into competent bacteria and finally sequenced. A significant difference was found between controls and clones with healthy phenotypes for the ICR/H19 region. In this region controls showed a hemimethylated pattern, as predicted in the literature due to this region has an imprinted control, while clones were showed less methylated. For the IGF2, no significant differences were found between controls and clones, and between clones with aberrant and healthy phenotypes. These results suggest that different genomic regions in the genome may be independently reprogrammed and that failures in reprogramming the DNA methylation patterns of imprinted genes may be one of the causes of the low efficiency of SCNT. Dissertação (Mestrado)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. Em 1997, foi aprovado especificamente para o tratamento de pacientes com LNH de baixo grau (folicular) ou linfomas foliculares agressivos non-Hodgkin, o anticorpo recombinante anti-CD20: Rituximabe (MabThera®, Rituxan). Esse anticorpo, causa uma depleção seletiva e transitória de ambas subpopulações de células B CD20 positivas, normais ou malignas, dentro de etapas chaves da ontogenia das células B. Neste trabalho, objetivou-se a expressão, produção e purificação de fragmentos de anticorpos na forma FvFc específicos para o antígeno humano CD20, por meio de células de ovário de hamster chinês versão K1 (CHO-K1). Foram selecionadas duas versões scFvs humanizadas, contendo as CDRs do anticorpo monoclonal quimérico Rituximabe e uma versão scFv murina similar ao anticorpo original. Posteriormente, essas versões foram transferidas para o vetor de expressão em células de mamíferos pCOMIRES∆600. Esse vetor possui os genes que codificam os domínios CH2 e CH3 do fragmento cristalizável de imunoglobulina humana IgG, de forma que a proteína liberada pela célula de mamífero corresponda ao fragmento FvFc do anticorpo. Após a finalização das etapas de clonagens, as células CHO-K1 foram utilizadas como sistema de expressão e produção de anticorpos. Essas células foram mantidas na presença do antibiótico geneticina para a seleção da população mista de células CHO-K1 produtoras dos FvFcs recombinantes. Os sobrenadantes de cultura foram avaliados quanto á presença de FvFc por meio de imunodetecção ELISA. Posteriormente, foram submetidos a uma cromatografia de afinidade, utilizando a coluna HITRAP protein A HP. Após a purificação as frações coletadas da coluna, foram analisadas quanto ao grau de pureza destes fragmentos por meio do gel SDS-PAGE e Wersten-Blot. Com esses resultados foi possível realizar análises da capacidade de ligação das proteínas recombinantes por meio de citometria de fluxo. Os resultados também sugerem que é possível propor avaliações das proteínas recombinantes quanto à estabilidade conformacional, e em relação as funções efetoras realizadas pelo rituximabe. In 1997 was approved specifically for treating patients with low-grade NHL (follicular) or aggressive follicular non-Hodgkin lymphomas, anti-CD20 recombinant antibody: Rituximab (MabThera, Rituxan). This antibody causes a selective and transient depletion of both subpopulations of CD20 positive, normal or malignant, within key steps of B cell ontogeny This study aimed to expression, production and purification of antibody fragments in the form FvFc specific to human CD20 antigen, using Chinese hamster ovary cells version K1 (CHO-K1). Two versions of humanized scFvs were selected, containing the CDRs of the chimeric monoclonal antibody Rituximab and a scFv version similar to the original murine antibody. Subsequently, these versions were transferred to the expression vector into mammalian cells pCOMIRES∆600. This vector has the gene encoding the CH2 and CH3 domains of the crystallizable fragment of human immunoglobulin IgG, so that the protein released from the mammalian cell FvFc corresponds to the fragment of the antibody. After completion of cloning steps, the CHO-K1 cells were used as expression system and production of antibodies. These cells were maintained in the presence of the antibiotic geneticin for selecting the mixed population of CHO-K1 cells producing the recombinant FvFcs. The culture supernatants were evaluated for the presence of FvFc by immunodetection ELISA. Subsequently, they were subjected to affinity chromatography using a HiTrap Protein A HP column. After purification the fractions collected from the column were analyzed for purity of these fragments by means of SDS-PAGE and gel blot Wersten. With these results it was possible to perform analyzes of the binding capacity of the recombinant proteins by flow cytometry. The results also suggest that it is possible to propose reviews of recombinant proteins for the conformational stability, and for the effector functions performed by rituximab.

Submitted by MARAYLLA INÁCIO DE MORAES (maraylla.inacio@unesp.br) on 2019-05-22T14:00:06Z No. of bitstreams: 1 tese-folha aprovação e ficha.pdf: 3888292 bytes, checksum: 82ab73133a144298cbb3c05039ef228f (MD5) Approved for entry into archive by Valeria Aparecida Moreira Novelli (valeria.novelli@unesp.br) on 2019-05-30T23:48:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 moraes_mi_dr_araiq_par.pdf: 1713524 bytes, checksum: 99632a899e90ffcd178a3555577cb213 (MD5) Made available in DSpace on 2019-05-30T23:48:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 moraes_mi_dr_araiq_par.pdf: 1713524 bytes, checksum: 99632a899e90ffcd178a3555577cb213 (MD5) Previous issue date: 2019-05-17 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Reações catalisadas enzimaticamente constituem uma alternativa ambientalmente atrativa em relação a catálise metálica e organometálica, pois utiliza catalisadores biodegradáveis e oriundos de fontes renováveis, oferecendo ferramentas apropriadas para a transformação de substâncias naturais ou sintéticas levando-se em conta os preceitos da Química Verde. Neste trabalho, foi realizada a clonagem do gene nitrila hidratase (subunidades α e β e gene ativador) de Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 e Klebisella oxytoca via metodologia de clonagem livre de restrição e posterior expressão em E. coli para realização de reações de biotransformação. A análise da especificidade do substrato da NHase tipo Fe de R. erythropolis ATCC 4277 indica que este aceita uma diversidade de nitrilas. As nitrilas alifáticas foram hidratadas com conversões acima de 99%, com exceção da acrilonitrila. As nitrilas aromáticas foram hidratadas com conversões que variaram de 1% a 88%. As células inteiras de E. coli recombinante hidrataram o 1,4-fenilenodiacetonitrila com elevada regiosseletividade, enquanto o excesso enantiomérico das nitrilas aromáticas 2-amino-2-(4-fluorofenil) acetonitrila e 2-fenilbutironitrila foram de 7% e 60%, respectivamente. A clonagem do gene NHase de Klebisella oxytoca não foi observada. A segunda etapa deste trabalho consistiu na síntese de 4-(cianometil)benzenoacetanamida, um intermediário importante na síntese de compostos de interesse industrial e utilizado como material de partida em reações de Grignard e transamidação. Uma coleção de enzimas do tipo NHase obtidas comercialmente foram empregadas para catalisar as reações de conversão da nitrila na amida correspondente, com altas conversões e rendimentos. Para as reações de Grignard e transamidação não foram obtidos bons resultados nas condições estudadas. De maneira geral foi possível obter amidas, que são de interesse industrial, com conversões variadas através de catálise enzimática. Enzymatically catalyzed reactions are an environmentally attractive alternative for metal and organometallic catalysis, because it uses biodegradable catalysts and from renewable sources, offering appropriate tools for the transformation of natural substances or synthetic taking into account the precepts of Green Chemistry. This work was performed nitrile hydratase gene cloning (α- and β- subunits and activator gene) from Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 and Klebisella oxytoca via restriction-free cloning methodology and subsequent expression in E. coli to perform biotransformation reactions. The analysis of the substrate specificity of the Fe-type NHase of R. erythropolis ATCC 4277 indicates that it accepts a diversity of nitriles. The aliphatic nitriles were hydrated with conversions above 99%, with the exception of acrylonitrile. The aromatic nitriles were hydrated with conversions ranging from 1% to 88%. Whole cells of recombinant E. coli hydrated 1,4-phenylenediacetonitrile with high regioselectivity, while the enantiomeric excess of the aromatic nitriles 2-amino-2- (4-fluorophenyl)acetonitrile and 2-phenylbutyronitrile were 7% and 60%, respectively. The cloning of the gene NHase of Klebisella oxytoca was not observed. The second step of this work consisted in the synthesis of 4-(cyanomethyl)benzeneacetanamide an important intermediate in the synthesis of compounds of industrial interest and used as starting material in Grignard reactions and transamidation. A collection of enzymes NHase type obtained commercially were employed to catalyze the conversion reactions of nitrile to the corresponding amide, with high conversions and yields. For the reactions of Grignard and transamidation have not obtained good results in the conditions studied. In general, it was possible to obtain amides, which are of industrial interest, with high and low conversions by enzymatic catalysis.

Serine protease inhibitors (serpins), a superfamily of protease inhibitors, are known to be involved in several physiological processes, such as development, metamorphosis, and innate immunity. In our study, a full-length serpin cDNA, designated Haserpin1, was isolated from the cotton bollworm Helicoverpa armigera. The cDNA sequence of Haserpin1 is 1176 nt long, with an open reading frame encoding 391 amino acids; there is one exon and no intron. The predicted molecular weight of Haserpin1 is 43.53 kDa, with an isoelectric point of 4.98. InterProScan was employed for Haserpin1 functional characterization, which revealed that Haserpin1 contains highly conserved signature motifs, including a reactive center loop (RCL) with a hinge region (E341–N350), the serpin signature, (F367–F375) and a predicted P1–P1′ cleavage site (L357–S358), which are useful for identifying serpins. Transcripts of Haserpin1 were constitutively expressed in the fat body, suggesting that it is the major site for serpin synthesis. During the developmental stages, a fluctuation in the expression level of Haserpin1 was observed, with low expression detected at the 5th-instar larval stage. In contrast, relatively high expression was detected at the prepupal stage, suggesting that Haserpin1 might play a critical role at the H. armigera wandering stage. Although the detailed function of this serpin (Haserpin1) needs to be elucidated, our study provides a perspective for the functional investigation of serine protease inhibitor genes. Resumo Sabe-se que os inibidores de serina protease (serpinas), uma superfamília de inibidores de protease, estão envolvidos em vários processos fisiológicos, como desenvolvimento, metamorfose e imunidade inata. Neste estudo, um cDNA de serpina de comprimento total, denominado Haserpin1, foi isolado da lagarta Helicoverpa armigera na cultura de algodão. A sequência de ADNc de Haserpin1 tem 1.176 nt de comprimento, com uma grelha de leitura aberta que codifica 391 aminoácidos; existe um éxon, mas nenhum íntron. O peso molecular previsto de Haserpin1 é de 43,53 kDa, com um ponto isoelétrico de 4,98. O InterProScan foi empregado para a caracterização funcional do Haserpin1, que revelou que o Haserpin1 contém motivos de assinatura altamente conservados, incluindo um loop central reativo (RCL) com uma região de dobradiça (E341-N350), a assinatura da serpina (F367-F375) e um local de clivagem previsto de P1-P1' (L357-S358), que são úteis para identificar serpinas. As transcrições de Haserpin1 foram expressas constitutivamente no corpo gordo, sugerindo que é o principal local para a síntese de serpinas. Durante os estágios de desenvolvimento, observou-se uma flutuação no nível de expressão de Haserpin1, com baixa expressão detectada no estágio larval do 5º ínstar. Por outro lado, detectou-se uma expressão relativamente alta no estágio pré-pupal, sugerindo que o Haserpin1 pode desempenhar um papel crítico no estágio errante de H. armigera. Embora a função detalhada dessa serpina (Haserpin1) precise ser elucidada, este estudo fornece uma perspectiva para a investigação funcional dos genes inibidores da serina protease.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A clonagem via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) é uma biotécnica de reprodução assistida em uso comercial, com várias aplicações. Ainda assim é uma técnica de baixa eficiência, possivelmente em consequência do perfil epigenético do genoma somático da célula doadora de núcleo, o que dificulta a reprogramação correta após a transferência nuclear. A memória epigenética da célula diferenciada resulta em alterações na expressão de genes importantes durante o desenvolvimento embrionário. Nesse estudo, analisamos o perfil de metilação do DNA e de expressão gênica de fibroblastos bovinos cultivados in vitro com drogas desmetilantes de DNA, S-Adenosil-L-Homocisteína e procaína. Com relação ao perfil epigenético, foram quantificados os níveis globais de metilação do DNA, bem como os níveis de metilação em uma região de DNA repetitivo. Além disso, foram produzidos embriões e avaliados os níveis de metilação destes para duas regiões repetitivas satélites. Quanto ao perfil de expressão gênica, determinamos os níveis de mRNA para os genes DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, TET1, TET2, TET3 e OCT4, os quais estão relacionados à reprogramação da metilação do DNA e estado de pluripotência. Células tratadas com as substâncias desmetilantes apresentaram níveis menores de metilação do DNA, tanto a nível global quanto para a região satélite I. Os embriões clones produzidos a partir de células tratadas apresentaram menores níveis de metilação em relação aos embriões controles para a região Satelite I. Quanto ao perfil transcricional, verificamos que células tratadas com SAH+procaína, apresentaram redução geral nos níveis de DNMTs. Por outro lado, para a enzima TET3 foi observado maior nível de transcritos em comparação ao controle. Nossos resultados mostraram que o uso desses agentes desmetilantes em células doadoras de núcleo foi capaz de alterar os níveis de metilação do DNA, além de alterar o perfil transcricional dos genes envolvidos na maquinaria epigenética. Portanto, sugere-se que o uso dessas substâncias possa contribuir para que o ovócito consiga reprogramar o núcleo doador de uma forma mais eficiente após a transferência nuclear. Assim, sugerimos que o uso de agentes moduladores de cromatina nos protocolos de cultivo celular para uso na clonagem por transferência nuclear possa contribuir para melhorar a eficiência da técnica. Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a commercially available technique of assisted reproductive technology with broad applications. It is still a low-efficiency technique, possibly as a consequence of the epigenetic profile of the somatic genome of the donor cell, which carries characteristic marks of differentiated cells, which hampers correct reprogramming after nuclear transfer. This differentiated cell memory leads to changes in DNA methylation patterns as well as changes in the gene expression profile of important genes during embryonic development. In this study, we analyzed the DNA methylation and gene expression profile of bovine fibroblasts cultured in vitro with DNA toxicity drugs of low toxicity, SAH and procaine. Regarding the epigenetic profile, the global levels of DNA methylation were quantified as well as the levels of methylation in a satellite repetitive region of the treated cells. In addition, embryos were produced and their methylation levels were evaluated for two repetitive satellite regions. Regarding the gene expression profile, we determined the mRNA levels for the DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, TET1, TET2, TET3 and OCT4 genes, which are related to the reprogramming of DNA methylation and pluripotency state. Cells treated with DNA demethylating substances showed lower levels of DNA methylation, both globally and in the satellite region. The embryonic clones produced from treated cells had lower levels of methylation compared to control embryos for the Satelite I region. Regarding the transcriptional profile, we observed that in cells treated with SAH + procaine, they presented a general reduction in the levels of DNMTs. On the other hand, for the TET3 enzyme, a higher level of transcripts was observed in comparison to the control. Our results showed that the use of demethylating agents in nucleating donor cells is capable of altering their epigenetic profile, in order to modify at the transcriptional level the production of enzymes related to methylation, which can lead the cell to a state of less differentiation. We have discussed, in this research study, the use of chromatin modulating agents as a perspective for use in cloning, medical research in cancer and other diseases. Tese (Doutorado)

In Brazil, there is a growing interest in the crop of the olive tree, especially in those regions considered suitable for cultivation, where low temperatures occur between 8ºC and 10ºC in the period before flowering. The areas with these characteristics are located mainly in the South and Southeast regions of the country, characterized by a temperate climate in function of altitude, with the occurrence of natural vernalization. The propagation is an integral part of the production chain and the first step towards the implantation of the olive tree crop or renovation of the existing orchards. Obtaining quality seedlings, besides guaranteeing uniformity and reliable varietal origin, is a factor that influences the whole life of the orchard, allowing to maximize the effects of climate and soil and mainly of crop treatments adopted for the culture. In the Laboratory of Propagation of Fruit Plants of the Department of Phytotechnology of the Eliseu Maciel School of Agronomy of the Federal University of Pelotas, we have sought to research micropropagation and minipropagation allied to the clonal gardens kept in a protected place, reducing the physical space and improving, mainly, the crop protection control. Olive tree seedlings propagated by different methods of asexual propagation, such as micropropagation, microcutting and minicutting, and they have their completion until the complete development in no-soil cultivation systems. Resumo No Brasil é crescente o interesse pela cultura da oliveira, especialmente naquelas regiões consideradas aptas ao cultivo, onde se têm ocorrência de baixas temperaturas entre 8ºC e 10ºC no período que antecede a floração. As áreas com estas características estão localizadas, principalmente, nas regiões Sul e Sudeste do país, caracterizadas por clima temperado em função da altitude, com ocorrência da vernalização natural. A propagação é parte integrante da cadeia produtiva e o primeiro passo para a implantação da cultura da oliveira ou renovação dos pomares já existentes. A obtenção de mudas de qualidade, além de garantir uniformidade e origem varietal confiável, é um fator que influencia toda a vida do pomar, permitindo maximizar os efeitos de clima e de solo e principalmente de tratos culturais adotados para a cultura. No Laboratório de Propagação de Plantas Frutíferas, do Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da Universidade Federal de Pelotas tem-se buscado pesquisar, a micropropagação e a minipropagação aliado aos jardins clonais mantidos em local protegido, reduzindo o espaço físico e melhorando, principalmente, o controle fitossanitário. As mudas de oliveira propagadas por diferentes métodos de propagação assexuada, como micropropagação, microestaquia e miniestaquia tem sua finalização até o completo desenvolvimento em sistemas de cultivo sem solo.

Background: Production of transgenic animals is still a low-efficiency biotechnology, and simple alternatives should be used to improve the rate of transgenic bovine production by nuclear transfer. One such alternative is selecting the appropriate donor cell type and transfection method. Objective: To investigate the effect of cell type (fetal or adult fibroblasts, and cumulus cells), and gene transfer method (lipofection and lentiviral transduction) on the incorporation, expression, and fluorescence intensity of transgene on bovine cells analyzed by flow cytometry. Methods: Fetal fibroblasts (FF), adult fibroblasts (AF), and cumulus cells (CC) were transfected using lipofection, or transduced using lentiviral particles produced with Green Fluorescent Protein (GFP) expressing plasmids, and analyzed by flow cytometry. Results: Lentiviral transduction resulted in higher transgene expression rates for all cell types (FF: 88.8 ± 0.98; AF: 91.6 ± 2.96; CC: 60.7% ± 14.7) compared to lipofection (FF: 17.8 ± 2.82; AF: 10.66 ± 0.65; CC: 3.9% ± 1.97). Cumulus cells showed lower transgene expression rates than the other cell types. Regarding fluorescence intensity, there was no significant difference between lipofection and lentiviral transduction; in both treatments, higher fluorescence intensity was obtained when adult cells were used instead of fetal cells. Conclusion: Gene transfer efficiency varies according to cell type, and gene transfer method, with lentiviral transduction achieving higher transgene expression rate, and adult fibroblasts showing better transgene expression. Resumen Antecedentes: La producción de animales transgénicos sigue siendo una biotecnología de baja eficiencia, y se deberían utilizar alternativas sencillas para mejorar la tasa de producción de bovinos transgénicos mediante transferencia nuclear. Una de estas alternativas es la selección del tipo mas apropiado de célula donante y método de transferencia génica. Objetivo: Investigar el efecto del tipo celular (fibroblastos fetales o adultos, y celulas del cumulus), y el método de transferencia génica (lipofección y transducción lentiviral) en la incorporación, expresión génica, y la intensidad de fluorescencia del transgén en células bovinas analizadas por citometría de flujo. Métodos: Fibroblastos fetales (FF), fibroblastos adultos (AF), y células del cúmulo (CC) fueron transfectados a través de lipofección o transducidos utilizando partículas lentivirales producidas con plásmidos que expresan la proteína verde fluorescente (GFP). Resultados: La transducción lentiviral dio lugar a mayores tasas de expresión del transgen en todos los tipos de células (FF: 88,8 ± 0,98; AF: 91,6 ± 2,96, CC: 60,7% ± 14,7) en comparación con la lipofección (FF: 17,8 ± 2,82; AF: 10,66 ± 0,65; CC: 3,9% ± 1,97). Las células del cúmulus mostraron menores tasas de expresión del transgen que los otros tipos celulares. En cuanto a la intensidad de fluorescencia, no hubo diferencias significativas entre lipofección y transducción lentiviral; en ambos tratamientos, se obtuvo una mayor intensidad de fluorescencia cuando se usaron células adultas en lugar de células fetales. Conclusión: La eficiencia de la transferencia de genes varía según el tipo de célula y el método de transferencia génica, con la transducción lentiviral se logra una mayor tasa de transfección, y los fibroblastos adultos muestran una mejor expresión transgénica. Resumo Antecedentes: A produção de animais transgênicos é uma biotecnologia que ainda apresenta baixa eficiência e alternativas simples devem ser usadas para o aumento da produção de bovinos transgênicos por transferência nuclear. Uma destas alternativas compreende a seleção do tipo apropriado de célula doadora de núcleo e do método de transferência gênica. Objetivo: Investigar a influência do tipo celular (fibroblastos fetais ou adultos, e células do cumulus), e do método de transferência gênica (transfecção por lipofecção ou transdução lentiviral) na incorporação, expressão, e na intensidade de fluorescência do transgene em células bovinas analisadas por citometria de fluxo. Métodos: Fibroblastos fetais (FF), fibroblastos adultos (AF), e células do cumulus (CC) foram submetidas à lipofecção ou à transfecção lentiviral utilizando plasmídeos expressando a Proteína Fluorescente Verde - GFP). Resultados: A transdução lentiviral resultou em maiores taxas de expressão do transgene em todos os tipos celulares (FF: 88,8 ± 0,98; AF: 91,6 ± 2,96; CC: 60,7% ± 14.7) quando comparada com a lipofeccção (FF: 17,8 ± 2,82; AF: 10,66 ± 0,65; CC: 3,9% ± 1,97). As células do cumulus apresentaram menores taxas de expressão quando comparadas aos outros tipos celulares. Com relação à intensidade de fluorescência, não houve diferença significativa entre a lipofecção e a transdução lentiviral e em ambos os tratamentos as células adultas apresentaram maior intensidade de fluorescência do que as células fetais. Conclusão: A eficiência de transferência gênica varia de acordo com o tipo celular, e com o método de transferência gênica, sendo que a transdução lentiviral resultou em maiores taxas, e que os fibroblastos adultos mostraram melhor expressão do transgene.

Made available in DSpace on 2019-10-31T18:13:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PerfilEpigeneticoETranscricional.pdf: 2945964 bytes, checksum: 078b8cb08bb2226c0f3a664f1636a3a2 (MD5) Previous issue date: 2019 Tese (Doutorado em Genética e Bioquímica) - Universidade Federal de Uberlândia, MG. Orientador: Maurício Machaim Franco, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.

The Myrtaceae family has representatives spread worldwide, and Jabuticaba tree is an important species native to Brazil, which is grown not only in the backyards and domestic orchards, but also in commercial orchards, landscaping projects and in several tropical and subtropical countries. The propagation of this species in a sexual form or by seeds is simple and efficient, being able to reach 100%. However, long juvenile phase and genetic segregation have led to the search for methods that allow the propagation of selected trees and guarantee through their standardized and productive clones, fruit quality and fruiting precocity. Protocols for asexual propagation are still scarce, but they show efficient methods, making possible the commercial use and valorization of this Brazilian fruit tree. Grafting methods have proven to be efficient in more than 70% of cases. Herbaceous cutting in Jabuticaba trees shows rooting around 10%. Air layering shows rooting rates above 80%. Other methods considered for domestic use have shown satisfactory results in the formation of young saplings through woody cuttings. New studies on micropropagation and better control of herbaceous stem cutting processes could stimulate and economically increase the propagation of this fruit tree for commercial crops to produce fruits for fresh consumption or processing. Air layering and grafting are the most currently indicated methods for propagation of jabuticaba tree. This review paper shows the results of other papers and their protocols for obtaining jabuticaba tree seedlings and clonal plants. Resumo Dentre a família Myrtaceae com representantes espalhados por todo o planeta, a jabuticabeira é uma importante espécie nativa do Brasil e que passou a ser apreciada não só nos limites de quintais e pomares domésticos, mas já pode ser encontrada em pomares comercias, projetos de paisagismo e em vários países com clima tropical e subtropical. A propagação desta espécie de forma sexuada ou via sementes é bastante simples e eficiente, podendo chegar a 100%. Porém, o longo período de juvenilidade e a segregação têm levado à busca por métodos que permitam propagar matrizes selecionadas e garantir, em seus clones, plantas padronizadas e produtivas, a qualidade dos frutos e a precocidade na frutificação. Os protocolos para propagação assexuada ainda são escassos, mas mostram métodos eficientes, viabilizando a exploração comercial e a valorização desta frutífera brasileira. O método de enxertia em garfagem têm-se mostrado eficiente em mais de 70% dos casos. A estaquia herbácea mostra enraizamento em torno de 10%. A alporquia com índices de enraizamento acima de 80%. Outros métodos considerados de uso doméstico têm mostrado resultados satisfatórios na formação de mudas de jabuticabeira através de estacas lenhosas. Novos estudos, como a micropropagação e melhor controle nos processos de estaquia herbácea, devem estimular e viabilizar economicamente a multiplicação desta frutífera para cultivos comerciais, seja para produção de frutos frescos, seja para processamento. A alporquia e a enxertia em garfagem são os métodos mais indicados atualmente para propagação de jabuticabeira. Neste artigo de revisão constam resultados de trabalhos e protocolos para obtenção de mudas de jabuticabeira.

The lack of an efficient method of propagation in some cultivars makes it difficult to expand the blueberry culture. In Brazil, we still do not produce seedlings with needed quality and quantity to improve the sector. The cloning of the selected material through mini propagation and micro propagation is an alternative to increase the multiplication and rooting capacity of the blueberries. Allied to this, the use of cultivation system without soil for the development of cloned material facilitates the seedlings production. In addition, we can keep matrices in small spaces with the use of mini-gardens and clonal micro-gardens controlling climatic and nutritional factors. In the Laboratory of Fruit Plants Propagation, of the Phytotechnology Department of the School of Agronomy Eliseu Maciel of the Federal University of Pelotas we have searching for more than ten years the micro propagation and the mini propagation allied to the clonal gardens kept in a protected place, reducing the physical space and improving phytosanitary control. The experiments carried out brought important information regarding to the vegetative propagation of the blueberry to improve the seedling production process for this species. In this way, researches that have been realized seek to generate knowledge about the best way of propagating and conducting this fruit. Resumo A falta de método eficiente de propagação em algumas cultivares dificulta a expansão da cultura do mirtileiro. No Brasil ainda não se produz muda com qualidade e quantidades necessárias para alavancar o setor. A clonagem do material selecionado através de minipropagação e micropropagação é uma alternativa para aumentar a capacidade de multiplicação e enraizamento do mirtileiro. Aliado a isto, o uso dos sistemas de cultivo sem solo, para o desenvolvimento do material clonado, facilita a produção de mudas. Além disso, podemos manter matrizeiros em pequenos espaços com a utilização de minijardins e microjardins clonais, controlando fatores climáticos e nutricionais. No Laboratório de Propagação de Plantas Frutíferas, do Departamento de Fitotecnia da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da Universidade Federal de Pelotas tem-se buscado pesquisar, há mais de dez anos, a micropropagação e a minipropagação aliado aos jardins clonais mantidos em local protegido, reduzindo o espaço físico e melhorando, principalmente, o controle fitossanitário. Os experimentos realizados trouxeram importantes informações em relação a propagação vegetativa do mirtileiro para a melhoria do processo de produção de mudas para esta espécie. Dessa forma, as pesquisas que estão sendo realizadas buscam gerar conhecimento sobre a melhor forma de propagação e condução dessa frutífera.

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - Brasil (CAPES) - C?digo de Financiamento 001. Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2019-12-02T22:28:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) fabiana_miranda_rocha.pdf: 1010507 bytes, checksum: 8e6e3ee9fe573841efb14ffe0c07adca (MD5) Approved for entry into archive by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2019-12-02T22:35:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) fabiana_miranda_rocha.pdf: 1010507 bytes, checksum: 8e6e3ee9fe573841efb14ffe0c07adca (MD5) Made available in DSpace on 2019-12-02T22:35:43Z (GMT). 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MG, de setembro de 2017 a dezembro de 2018, cujos trabalhos foram divididos em quatro cap?tulos. No primeiro, foram testadas cinco concentra??es de AIB (0, 1.000, 3.000, 6.000 e 9.000 mg L-1) e presen?a ou aus?ncia de estufim no enraizamento. A utiliza??o de maiores concentra??es da auxina (6.000 e 9.000 mg L-1) proporcionou melhores respostas ao enraizamento das miniestacas na sa?da da ?rea de pleno sol. No segundo cap?tulo, foram testadas cinco concentra??es de AIB (0, 1.000, 2.000, 4.000 e 8.000 mg L-1) e quatro tempos de estufim (0, 15, 30 e 45 dias) no enraizamento. O uso de 8.000 mg L-1 de AIB e maiores tempos das minicepas sob estufim proporcionaram maior percentual de enraizamento e melhor qualidade do sistema radicular para o material gen?tico em estudo. No terceiro cap?tulo, foram testadas cinco concentra??es de AIB (0, 1.000, 2.000, 4.000 e 8.000 mg L-1) e dois tempos de perman?ncia das minicepas sob o estufim (40 e 70 dias) no enraizamento. O uso de 8.000 mg L-1 de AIB proporcionou melhor resultado das mudas quanto ao enraizamento e qualidade de raiz e o tempo de uso de estufim n?o influenciou de forma significativa na produ??o de mudas. J? no quarto cap?tulo, foram testados quatro tempos de perman?ncia das minicepas sob o estufim (0, 15, 30 e 45 dias) na produtividade de minicepas de E. urophylla x E. pellita. O uso de maiores tempos de estufim ocasionou maior produ??o de miniestacas por minicepa, aumento da altura e do teor de clorofila, al?m de menor ?rea foliar e biomassa seca das miniestacas em rela??o ? n?o utiliza??o, sendo vantajoso na opera??o de manejo do minijardim clonal. Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Ci?ncia Florestal, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2019. Although there is great variability of species and crosses within the Eucalyptus genus, the search for a more productive, less water-demanding, less nutrient-demanding, pest-resistant genetic material, that is also more resistant to diseases and more adaptive to various purposes is constant. However, some species and clones of this genus present difficulties in the seedling production process by rooting cuttings. This work aimed to evaluate minicutting?s rooting and the productivity of minicuttings for miniceps of a hybrid Eucalyptus urophylla x Eucalyptus pellita clone. The experiments were conducted in the seedling nursery of the Aperam Bioenergia Company, located in Itamarandiba ? Minas Gerais, from September 2017 to December 2018, period in which the work was divided in four chapters. In the first, five concentrations of IBA (0, 1.000, 3.000, 6.000 and 9.000 mg L-1) and the presence or absence of mini-tunnels in the rooting were tested. The use of higher concentrations of IBA (6.000 and 9.000 mg L-1) provided better responses to the minicuttings rooting at the exit of the area of full sun. In the second chapter, five concentrations of IBA (0, 1.000, 2.000, 4.000 and 8.000 mg L-1) and four different periods of time the mini-tunnel (0, 15, 30 and 45 days) was used in the rooting were tested. The use of 8.000 mg L-1 of IBA and longer periods of time of miniceps in the mini-tunnel provided higher rooting percentage and higher rooting system?s quality for the genetic material under study. In the third chapter, five concentrations of IBA (0, 1.000, 2.000, 4.000 and 8.000 mg L-1) and two different periods of time in the mini-tunnel (40 and 70 days) were tested. The use of 8.000 mg L-1 of IBA provided improved seedling results in rooting and root quality, and the time of use of the mini-tunnels had no significantly influence on seedling production. As for the fourth chapter, four different periods of time the E. urophylla x E. pellita miniceps were in the mini-tunnel (0 ? control variable, 15, 30 and 45 days) were tested. The use of the mini-tunnels for a larger period of time caused a higher minicuttings for miniceps production, height increase, increase in chlorophyll levels, apart from smaller leaf area and minicutting?s dry biomass in relation to non-use, being advantageous in the management operation of the mini clonal garden.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The evaluation of agronomic characteristics of crops is important because they may be influenced by the height, density and spatial arrangements of eucalyptus in an agroforestry system. These silvicultural characteristics may interfere with height and productivity of crops between the rows of the tree component due to shading, competition for water and nutrients. The objective of this study was to evaluate the effect of the assessed site on some agronomic characteristics such as height, grain yield and effective yield of BRS 655 forage sorghum (Sorghum bicolor (L). Moench) with different clones and arrangements of eucalyptus in the north of Minas Gerais. Experimental randomized block with a split-plot design and five replications was used to evaluate sorghum. The effective productivity and height of sorghum comparing to the average values in the area were low. The GG 100 clone (Eucalyptus urophylla × E. grandis ) showed low adaptation to semi-arid region while the MA 2001 clone (Eucalyptus camaldulensis × E. Tereticornes) presented greater height. The low values of some agronomic characteristics of sorghum were due to the distance between the rows of eucalyptus. The 2 × 3 + (15 m) and 2 × 3 + (20 m) arrangements of eucalyptus generated higher sorghum plants regardless of the clone.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A clonagem por meio da transferência nuclear de células somáticas (TNCS) é uma biotecnologia da reprodução com várias aplicações e já em uso comercial. No entanto, ainda é uma técnica com baixa eficiência devido a alta frequência de anormalidades fetais e placentárias. Para que o embrião se desenvolva normalmente, o perfil epigenético do genoma somático da célula doadora de núcleo deve ser reprogramado corretamente após a transferência nuclear. No entanto, nos embriões clones essa reprogramação não ocorre de forma eficiente, o que leva a alterações no padrão de metilação do DNA, e consequentemente, alterações no perfil de expressão gênica de genes importantes durante o desenvolvimento embrionário e fetal. Nesse estudo, nós determinamos os níveis de mRNA para 6 genes alvos (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, TET1, TET2 e TET3) relacionados à reprogramação da metilação do DNA em cotilédone fetal de 13 bezerros provenientes de TNCS. O RNA total foi extraído das amostras de cotilédone fetal e submetido à transcrição reversa para análises em PCR em tempo real. Os resultados mostraram padrões de expressão gênica diferentes entre os clones e os animais controles produzidos por inseminação artificial para todos os genes avaliados, exceto para a TET3. Os níveis de mRNA de DNMT1 (p=0,0044), DNMT3A (p=0,0044) e TET2 (p=0,0044) foram maiores nos controles, enquanto que, para DNMT3B (p=0,0308) e TET1 (p=0,0308) os níveis foram maiores nos clones. Além disso, foi identificado que os clones que morreram na primeira semana de vida apresentaram diferenças de expressão gênica em relação aos controles para os genes DNMT1 (p=0,0244), DNMT3A (p=0,0279), DNMT3B (p=0,0364), TET1 (p=0,0103) e TET2 (p=0,0184), enquanto que os que sobreviveram foram diferentes dos controles somente para TET1 (p=0,0344). Esses resultados mostraram que os animais clones que sobrevivem não são apenas fisicamente mais saudáveis, mas também relativamente mais próximos dos controles no nível molecular. Isto sugere que uma expressão adequada das enzimas relacionadas com a reprogramação epigenética do DNA na placenta é essencial para a sobrevivência do animal proveniente de TNCS. Cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT) is an assisted reproductive technique with several applications in livestock. However, it is still a technique that shows low efficiency due to the high frequency of fetal and placental abnormalities. The somatic genome must be correctly reprogrammed after nuclear transfer to achieve normal embryo development. However, in cloned embryos this reprogramming does not occur efficiently, leading to changes in DNA methylation patterns and consequently alterations in gene expression profile of important genes for embryo and foetal development. In this study, we determined the mRNA levels for six target genes (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, TET1, TET2 and TET3) related to DNA methylation reprogramming in the placental cotyledon of 13 calves produced by SCNT. Total RNA was extracted from the placental cotyledon samples and subjected to reverse transcription for real-time PCR analysis. Results showed different gene expression profiles, comparing placenta from cloned calves and placenta from animals produced by artificial insemination, except for TET3. The mRNA level of DNMT1 (p=0.0044), DNMT3A (p=0.0044) and TET2 (p=0.0044) were higher in the controls, while DNMT3B (p=0.0308) and TET1 (p=0.0308) were higher in the clones. In addition, it was identified that clones that died in the first week of life had differences in gene expression compared to the controls for the genes DNMT1 (p=0.0244), DNMT3A (p=0.0279), DNMT3B (p=0.0364), TET1 (p=0.0103) and TET2 (p=0.0184), while those that survived were different from controls only for TET1 (p=0.0344). These results showed that surviving clones are not only physically healthier but also relatively closer to the controls at the molecular level. This suggests that an adequate expression profile of enzymes related to epigenetic reprogramming is essential for the survival of cloned animals. Dissertação (Mestrado)

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Esta tese está subdividida em três capítulos e anexos: • Capítulo 1: Fundamentação teórica • Capítulo 2: DNA methylation profile at a satellite region is associated with aberrant placentation in cloned calves • Capítulo 3: DNA methylation and transcriptional profiles of endogenous retroviruses in placenta of cloned cattle • Anexos: Descrição dos protocolos; Artigo e resumos publicados No capítulo 1 é demonstrada a relação intrínseca entre a técnica de clonagem por transferência nuclear e a epigenética, fornecendo a base do conhecimento necessário para o entendimento dos assuntos que serão abordados nos demais capítulos. O capítulo 2 está estruturado no formato de artigo científico e escrito em língua inglesa. Neste capítulo é apresentado estudos de metilação em regiões de DNA repetitivo satélites, as quais estão presentes em múltiplas cópias nas regiões centroméricas e pericentroméricas de cada cromossomo do organismo. Além disso foram também realizadas análises de metilação e hidroximetilação globais do DNA. As avaliações foram realizadas em amostras de placenta de bezerros clonados e os níveis de metilação foram comparados entre animais considerados saudáveis e aqueles apresentando algum fenótipo aberrante. Esse artigo foi recentemente publicado na revista Placenta. O capítulo 3 também foi estruturado no formato de artigo científico e escrito em língua inglesa. Neste capítulo é sugerida a participação de retrotransposons na fisiologia do organismo hospedeiro. Foram realizados estudos de metilação de DNA e expressão gênica de genes originados de retrovírus endógenos envolvidos na placentação, um dos processos críticos na gestação de embriões clones. Esse artigo será submetido para publicação na revista Plos One. Em anexos estão descritos os protocolos que foram utilizados nos experimentos realizados nos capítulos 2 e 3. E estão em anexos o artigo e os resumos publicados. This thesis is subdivided into three chapters and annexes: • Chapter 1: Theoretical rationale • Chapter 2: DNA methylation profile at a satellite region is associated with aberrant placentation in cloned calves • Chapter 3: DNA methylation and transcriptional profiles of endogenous retroviruses in placenta of cloned cattle • Attachments: Description of protocols; Article and published abstracts In Chapter 1 the intrinsic relationship between the nuclear transfer cloning technique and the epigenetic technique is demonstrated, providing the knowledge base necessary to understand the subjects that will be addressed in the other chapters. Chapter 2 is structured as a scientific paper and written in English. In this chapter we present methylation studies in regions of repetitive satellite DNA, which are present in multiple copies in the centromeric and pericentromeric regions of each chromosome of the organism. In addition, global methylation and hydroxymethylation analyzes of DNA were also performed. Evaluations were performed on placental samples from cloned calves and methylation levels were compared between animals considered healthy and those showing some aberrant phenotype. This article was recently published in the journal Placenta. Chapter 3 was also structured in a scientific paper format and written in English. In this chapter the participation of retrotransposons in the physiology of the host organism is suggested. DNA methylation studies and gene expression of genes originating from endogenous retroviruses involved in placentation, one of the critical processes in embryo clones, were carried out. This article will be submitted for publication in Plos One magazine. The protocols used in the experiments carried out in chapters 2 and 3 are described in annexes. The articles and published abstracts are attached. Tese (Doutorado)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O déficit hídrico é o maior limitante à produtividade de Eucalipto, portanto, faz-se necessário incluir análises que permitam a seleção de indivíduos superiores em programas de melhoramento genético com o objetivo de aumentar a produtividade. Contudo, existem muitas variáveis relacionadas à tolerância ao déficit hídrico. Assim, o objetivo desse estudo foi selecionar variáveis que permitam a seleção precoce de indivíduos tolerantes ao déficit hídrico. No primeiro capítulo, características ligadas ao crescimento foram avaliadas e foi observado que as variáveis mais aplicáveis à separação de clones para tolerância foram: peso seco do caule, peso total da planta, taxa fotossintética, condutância estomática, transpiração, incremento % em altura, teor relativo de água, suculência e relação Ci/Ca. No segundo capítulo, variáveis relacionadas ao metabolismo enzimático antioxidante e estresse hídrico foram avaliadas, sendo que as variáveis mais aplicáveis à separação de clones para tolerância foram fotossíntese, relação Fv/Fm, clorofila a, clorofila b e glutationa. No terceiro capítulo, variáveis relacionadas à síntese de metabólitos foram avaliadas. As variáveis mais aplicáveis à separação de clones para tolerância foram fotossíntese, relação Fv/Fm, clorofila a, clorofila b e glutationa, ácido abisisico, metil jasmonato e glicose. No quarto capítulo, variáveis morfoanatômicas e nutricionais foram avaliadas. As variáveis mais aplicáveis à separação de clones para tolerância foram condutância estomática, relação Fv/Fm e concentração de cálcio. As variáveis peso total da planta, incremento em altura %, teor relativo de água são úteis na seleção e, como vantagem adicional, essas análises requerem instrumentos simples como balança, estufa e fita métrica. Para as variáveis fotossíntese, relação Fv/Fm e Condutância estomática é necessário o uso do equipamento IRGA. Assim sendo, essas variáveis podem ser facilmente usadas nas empresas para a seleção precoce de indivíduos com potencial para serem tolerantes em campo, desde que a avaliação do material genético seja feita sob condições de déficit hídrico natural ou simulada. The water deficit is the major limiting factor to Eucalyptus productivity. Therefore, it is necessary to include analyzes that allow the selection of superior individuals in breeding programs with the objective of increasing productivity. However, there are many variables related to water deficit tolerance. Thus, the objective of this study was to select variables that allow the early selection of tolerant individuals to water deficit. In the first chapter, characteristics related to growth were evaluated and it was observed that variables most applicable to clones separation for tolerance were: dry stem weight, total plant weight, photosynthetic rate, stomatal conductance, transpiration, increase % in height, relative water content, succulence and Ci/Ca ratio. In the second chapter, variables related to antioxidant enzymatic metabolism and water stress were evaluated. The most applicable variables to clones separation for tolerance were photosynthesis, Fv/Fm ratio, chlorophyll a, chlorophyll b and glutathione. In the third chapter, variables related to the synthesis of metabolites were evaluated. The most applicable variables to clones separation for tolerance were photosynthesis, Fv/Fm ratio, chlorophyll a, chlorophyll b and glutathione, abscisic acid (ABA), methyl jasmonate (MeJA) and glucose. In the fourth chapter morpho-anatomical and nutritional variables were evaluated. The most applicable variables to clones separation for tolerance were: stomatal conductance, Fv/Fm ratio and calcium concentration. The variables total plant weight, height increase %, relative water content are useful in selection and, as an additional advantage, these analyzes require simple instruments such as scale, greenhouse and tape measure. For the variables photosynthesis, Fv/Fm ratio and stomatal conductance, it is necessary to use the Infra-Red Gas Analysis - IRGA equipment. Therefore, these variables can be easily used in companies for the early selection of individuals with potential to be tolerant in the field, since the evaluation of the genetic material is done under conditions of natural or simulated water deficit.

The mechanisms by which peptidergic signals are terminated have been the center of multiple studies leading to the discoveries of novel proteolytic activities. When studying the catabolic fate of neurotensin (NT) in brain and gastrointestinal tract, we detected a novel activity belonging to the metallopeptidases class and apparently distinct from previously known enzymes. Purification and cloning confirmed that this NT-degrading neutral metalloendopeptidase activity was indeed original. It was named endopeptidase 3.4.24.16 according to the IUBMB nomenclature and later, referred to as neurolysin. This review tells the history of neurolysin from its initial detection to its purification, cloning, design of specific inhibitors as well as in vitro and in vivo pharmacological studies aimed at delineating its role in the control of NT function. Finally, we discuss very recent advances suggesting a potential role of neurolysin in pathologies.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A análise de regressão é fundamental na mensuração florestal para ajustar equações e predizer atributos de árvores, tais como, peso, altura, volume e a produção presente e futura por unidade de área das florestas equiâneas ou inequiâneas. Entretanto, quando os dados apresentam dispersão elevada em torno da média da variável de interesse, pode ocorrer problemas de estimação, sendo recomendado o uso de outros métodos além dos mínimos quadrados ordinários (MQO). Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o uso de regressão quantílica na modelagem da produção de povoamentos de eucalipto. Além disso, objetivou-se predizer o volume/hectare com base em projeções para diferentes percentis da distribuição dos volumes, e comparar essas estimativas com as obtidas por meio do modelo de Clutter (1963). Os dados foram provenientes de plantios clonais de Eucalyptus grandis x E. urophylla, localizados no norte da Bahia, com idades entre 20 a 89 meses. O conjunto total de parcelas permanentes foi dividido em 53 parcelas, destinadas ao processo de modelagem, e 56 parcelas, para a validação. Os ajustes das equações do modelo de Clutter e da regressão quantílica foram realizados empregando-se o software estatístico R. Os sistemas de projeção dos volumes, isto é, Clutter e regressão quantílica, foram avaliados com base em gráficos de dispersão do erro relativo e gráficos dos volumes observados versus estimados, bem como por meio das estatísticas BIAS (%) e raiz quadrada do erro médio (RQEM%). No processo de validação, as projeções de volume por meio da regressão quantílica, da idade inicial de 29 até 89 meses de idade, resultaram em maior precisão e exatidão das estimativas em relação às obtidas através do modelo de Clutter. Sendo assim, a regressão quantílica mostrou-se eficiente para predizer e projetar volumes para diferentes idades de um povoamento florestal. Regression analysis is fundamental in forest mensuration to fit equations and predict tree attributes such as weight, height, volume, and present and future yield per unit area of even-aged or uneven-aged stands. However, when data show high dispersion around the mean of the variable of interest, estimation problems may occur. Therefore, it is recommended to use methods other than the ordinary least squares (OLS). Thus, the objective of this work was to evaluate the use of quantile regression in modeling the production of eucalyptus stands. In addition, we aimed to predict volume/hectare based on projections for different percentiles of volume distribution, and compare these estimates with those obtained using the Clutter model (1963). The data set used originates from clonal plantations of Eucalyptus grandis x E. urophylla, located in the north of Bahia, aged between 20 and 89 months. The total set of permanent plots was divided in 53 plots, allocated for the modeling process, and 56 plots for validation. The fittings of the equations of Clutter model and quantile regression were performed using statistical software R. The volume projection methods, that is Clutter and quantile regression, were evaluated from scatter plots of the relative error and graphs of the observed versus estimated volumes, as well as by the following statistics: mean bias error (BIAS %) and root mean square error (RMSE %). In the validation process, the volume projections by quantile regression, from the initial age of 29 to 89 months old, resulted in greater precision and accuracy of the estimates compared to those obtained by Clutter model. Thus, the quantile regression demonstrated efficiency to predict and project volumes for different ages of a forest stand.