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Le stade de certaines maladies peut être révélé et suivi par la présence ou la concentration relative de biomolécules spécifiques au sein de tissus ou de fluides biologiques. Cependant, l’identification et la quantification régiosélective de biomolécules restent un défi considérable, pour l'imagerie de tissus lors d’études pathologiques ou d’interactions biomoléculaires. En vue d’atteindre cet objectif, la combinaison de l'imagerie par résonance des plasmons de surface (SPRi) et de l’imagerie par spectrométrie de masse avec désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-iMS) a récemment été proposée pour obtenir des images quantitatives et qualitatives à partir d'une seule empreinte tissulaire, sur une seule et même sonde SPRi. Dans cette technique, l’imagerie MALDI-iMS permet l'identification, le séquençage de biomolécules ainsi que la quantification relative, tandis que l’imagerie SPR fournit une quantification cette fois absolue et régiosélective. Cependant, même si ces deux techniques d’imagerie offrent des informations complémentaires sur la quantité absolue de biomatériel adsorbée sur la surface de la sonde avec une résolution spatiale, il reste toujours impossible, avec le design expérimental actuel, de quantifier localement une protéine cible au sein d’un tissu biologique. Les travaux de ce mémoire présentent les recherches pour le développement d’une méthode reproductible d’imagerie SPR permettant d’obtenir des images quantitatives et régiosélectives de protéines cibles dans des minces coupes tissulaires. La chimie de surface est utilisée afin de greffer un biocapteur spécifique (tel que des anticorps) à la surface de la sonde SPR, pour spécifiquement quantifier une protéine d’intérêt avec régiosélectivité. La quantification et l’identification locale sont effectuées par SPRi lors d’une expérience en deux étapes. Les travaux de ce mémoire portent sur la fonctionnalisation de surface de sonde SPRi sélective, et sur le transfert de protéines cibles à travers une membrane de nylon, d’une coupe tissulaire vers la surface de la sonde., The state of certain diseases can be revealed and monitored by the presence or the relative concentration of specific biomolecule in tissues or biofluids. However, it remains challenging to identify and quantify proteins in biological samples with spatial resolution for imaging of tissues in pathological studies or in biochemical measurements. To achieve this objective, the combination of surface plasmon resonance imaging (SPRi) and matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry (MALDI-iMS) was recently proposed to obtain quantitative and qualitative images from a single tissue imprint, on a single sensor chip. In this technique, MALDI-iMS identify and sequence biomolecules, while SPRi provides absolute and regioselective quantification. Both imaging techniques give complementary information about the absolute amount and the spatial organization of proteins at the surface of the sensor, but it is still impossible with the current experimental design to locally quantify a specific target protein. The work presented in this thesis focuses on the development of a reproducible method allowing the regioselective quantification of target proteins within a thin tissue section. Surface chemistry is used to graft a selective bioreceptor on the surface of the sensor chip (such as antibodies) to specifically quantify a biomolecule with regioselectivity. The local quantification and identification of a target protein is monitored using SPRi, in a two-step assay. This thesis will focus on the functionalization of selective sensor chip surfaces for a targeted protein in different samples, and on the transfer of those proteins from samples to the surface through a nylon membrane.

Scientific reports 9(1), 9568 (2019). doi:10.1038/s41598-019-45709-8, The human parasites Schistosoma mansoni and Leishmania major are co-endemic and a major threat to human health. Though displaying different tissue tropisms, they excrete/secrete similar subsets of intracellular proteins that, interacting with the host extracellular matrix (ECM), help the parasites invading the host. We selected one of the most abundant proteins found in the secretomes of both parasites, protein disulfide isomerase (PDI), and performed a comparative screening with surface plasmon resonance imaging (SPRi), looking for ECM binding partners. Both PDIs bind heparan sulfate; none of them binds collagens; each of them binds further ECM components, possibly linked to the different tropisms. We investigated by small-angle X-ray scattering both PDIs structures and those of a few complexes with host partners, in order to better understand the differences within this conserved family fold. Furthermore, we highlighted a previously undisclosed moonlighting behaviour of both PDIs, namely a concentration-dependent switch of function from thiol-oxidoreductase to holdase. Finally, we have tried to exploit the differences to look for possible compounds able to interfere with the redox activity of both PDI., Published by Macmillan Publishers Limited, part of Springer Nature, [London]

A gold-silver alloy film based spectral surface plasmon resonance imaging (SPRi) sensor has been prepared for in-situ quantitative detection of biochemical analytes at the sensor surface. This novel sensor has lower detection cost yet higher sensitivity relative to the conventional counterpart with a gold film. Using the laboratory-made multifunctional SPR sensing platform, both the resonant color images and the resonant spectra for the Au-Ag alloy film were measured at different incident angles. The quantitative relationship between the resonant wavelength and the average hue of corresponding resonant color image was established. With this relationship the most hue-sensitive spectral range was determined. After setting the initial resonant wavelength in the hue-sensitive spectral range, the refractive-index sensitivity of the Au-Ag alloy film based SPRi sensor was measured as Δhue/Δnc = 29,879/RIU, being 8 times higher than that obtained with the gold-film SPRi sensor. The immunodetection of benzo(a)pyrene (BaP) in water was fulfilled using the Au-Ag alloy film based SPRi sensor. The average hue of the SPR color image linearly increases with increasing the BaP concentration up to C = 0.5 μg/L and the slope is Δhue/ΔC = 132.2/(μg/L). The sensor is responsive to a change of BaP concentration as low as ΔC = 0.01 μg/L.

Induction of apoptosis in cancer cells by therapeutic agents is an important event to detect the potential effectiveness of therapies. Here we explore the potential of Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) to assess apoptosis in cancer cells exposed to therapeutic agents by measuring the cytochrome C release of apoptotic cells. Spots on the SPR sensor were coated with anti-cytochrome C, anti-EpCAM, anti-CD49e monoclonal antibodies and combinations thereof. Cells from the breast cancer cell line MCF7 were introduced into a flow cell, captured on a sensor surface and exposed to culture medium with and without paclitaxel. The cells were followed for 72 h. Clear SPRi responses were observed on the anti-EpCAM coated spots, indicating binding of the MCF7 cells with strong time and drug presence dependent increases in SPRi responses on the spots coated with both anti-EpCAM as well as anti-cytochrome C. This suggests a release of cytochrome C by the MCF7 cells in these specific locations. In addition offline experiments were performed where cultured MCF7 cells were exposed to complete culture medium with paclitaxel, Trastuzumab antibody and Trastuzumab T-DM1 (an antibody drug conjugate). The supernatant of these cells was analyzed and also their drug concentration dependent cytochrome C presence was detected. These preliminary results suggest SPRi to be a unique tool to measure real time response of cancer cells exposed to drugs or drug combinations. Keywords: Apoptosis, Cancer cell lines, Antibody drug conjugate, Cytochrome C, Label free, SPRi

Here the feasibility is demonstrated that by combining Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRi) and self-sorting microwell technology product secretion of individual cells can be monitored. Additionally isolation of the selected cells can be performed by punching the cells from the microwells using coordinates of the positions of microwells obtained with SPRi. Cells of interest can be retrieved sterile from the microwell array for further cultivation.

In this thesis, we briefly describe the techniques used, which are surface plasmon resonanceimaging (SPRi) and surface enhanced Raman scattering (SERS). The main goal of the Piranexproject in which the thesis is based is the development of a bimodal nanostructured biochipallowing the coupling of the two techniques SPRi and SERS. This bio-chip consists of a goldfilm over which we have deposited a square array of gold nanocylinders. A set of studies hasbeen carried out to characterize plasmonic properties of the biosensor in order to optimize theSERS signal. We have thus found that the emission of the signal was strongly anisotropic, due tothe excitation of the Bragg Mode and that the near field was mainly enhanced on the edges of thenanostructure. The properties were also compared with those of identical gratings depositeddirectly on a dielectric substrate. Subsequently a set of plasmonic and SERS studies were carriedout for aluminum, other plasmonic materials of interest. Finally, a detection protocol by SERS ofochratoxin based on an aptamer was developed and allowed the detection of ochratoxin with adetection threshold of 10 pM, well below the limit allowed by food regulatory agencies; Dans cette thèse, nous décrivons sommairement les techniques utilisées qui sont l’imagerie parrésonance plasmon de surface (SPRi) et la diffusion Raman exaltée de surface (SERS). Le butprincipal du projet Piranex dans lequel la thèse s’inscrit consiste au développement d’une biopucenanostructurée bimodale permettant le couplage des deux techniques SPRi et SERS. Cettebiopuce est constituée d’un film d’or par-dessus lequel nous avons déposé un réseau carré denanocylindres en or. Un ensemble d’études ont été effectuées pour caractériser ses propriétésplasmoniques du biocapteur afin d’en optimiser le signal SERS. Nous avons ainsi constaté quel’émission du signal était fortement anisotrope, dus à l’excitation du Mode de Bragg et que lechamp proche était principalement exalté sur les bords de la nanostructure. Les propriétés furentégalement comparées avec celles de réseaux identiques déposés directement sur un substrat diélectrique.Par la suite un ensemble d’études plasmoniques et SERS ont été effectuées pourl’aluminium, autre matériaux plasmonique d’intérêt. Enfin, un protocole de détection par SERSde l’ochratoxine basé sur un aptamère fut développé et a permis la détection de l’ochratoxine dès10 pM, bien en dessous de la limite autorisée par les organismes de régulation en agroalimentaire.

International audience; Organ in vitro synthesis is one of the last bottlenecks between tissue engineering and transplantation of synthetic organs. Bioprinting has proven its capacity to produce 3D objects composed of living cells but highly organized tissues such as full thickness skin (dermis + epidermis) are rarely attained. The focus of the present study is to demonstrate the capability of a newly developed ink formulation and the use of an open source printer, for the production of a really complete skin model. Proofs are given through immunostaining and electronic microscopy that the bioprinted skin presents all characteristics of human skin, both at the molecular and macromolecular level. Finally, the printability of large skin objects is demonstrated with the printing of an adult-size ear.

Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRI) is a powerful technique to study molecular interactions providing a real time, label free and high throughput analysis. The transduction of an interaction between complementary molecules into an optical signal is based on the perturbation of a plasmonic evanescent wave supported by a thin metallic film.However, despite its direct and label free assets, the specificity of SPR measurements is only guaranteed by the probe molecules grafted on the metallic surface and therefore by the quality of the surface chemistry. This limitation becomes an issue when addressing major health concerns relying on the detection of trace molecules. In particular, new systems are required to help early diagnosis and the control of food contaminants.In view of improving measurement’s specificity, this work reports the development of a bimodal instrument coupling SPRI, allowing the quantification of captured molecules, with Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS), adding the precise identification of the molecules by measuring their spectroscopic fingerprint. This PhD is part of an ANR project bringing together academic and industrial partners.This manuscript focuses on the development of the optical instrument combining the two detection systems in a unique prototype. SPRI measurements are performed in the Kretschmann configuration while SERS analysis is implemented from the top, in solution, through a glass window. Nanostructured substrates have been designed and realized to allow the simultaneous experiment.The optical system is described, characterized and validated on the model case of a DNA hybridization. These first results prove the capabilities of the bimodal instrument in the perspective of more complex biological applications.; L’imagerie par Résonance des Plasmons de Surface (SPRI) est une technique d’analyse d’interactions moléculaires présentant de nombreux avantages. Elle peut être appliquée en temps réel et sans marquage, pour étudier un grand nombre d’interactions simultanément sur un même échantillon. La transduction d’un événement d‘interaction entre deux molécules complémentaires en un signal optique, repose sur la perturbation de l’onde plasmonique évanescente créée à la surface d’un film métallique mince.Toutefois, bien que la mesure SPR soit directe et sans marquage, sa spécificité repose entièrement sur celle des molécules sondes déposées à la surface de la puce et donc sur la chimie ayant servi à les immobiliser. Cette limitation devient problématique pour adresser les grands enjeux de santé actuels, liés à la détection de molécules à l’état de traces. En particulier, de nouveaux systèmes d’analyse plus sensibles sont requis pour pouvoir diagnostiquer le cancer au plus tôt, ou encore détecter la présence de contaminants agro-alimentaires en faible concentration.Dans cette perspective d’amélioration de la spécificité de détection, ce travail porte sur la mise au point d’un instrument bimodal couplant la SPRI, capable de quantifier la capture de molécules cibles, à la Spectrométrie Raman Exaltée de Surface (SERS), qui permet d’identifier la nature des molécules capturées en déterminant leur « empreinte » moléculaire. Cette thèse s’inscrit dans un projet ANR regroupant un consortium de partenaires académiques et un industriel.Ce document se concentre sur le développement de l’instrument optique combinant les deux systèmes de détection en un seul prototype. La mesure SPRI est réalisée en configuration Kretschmann, tandis que l’analyse SERS s’effectue par le dessus, en milieu liquide, à travers un hublot. Ces deux mesures simultanées sont rendues possibles grâce à la mise au point d’un substrat métallique nanostructuré. Une caractérisation détaillée du système optique est tout d’abord présentée, puis de premiers résultats de validation de la mesure bimodale sur un cas modèle d’interaction biomoléculaire ADN sont démontrés. Ces expériences prometteuses confirment le fonctionnement de l’instrument bimodal dans la perspective d’applications d’intérêt biologique.

This thesis is focused on gold nanostructuration on glass substrate in order to study and optimize their plasmonic properties for biosensing applications. The main goal was to demonstrate the feasibility of combining on a single biochip, Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRI) and Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) measurements. We have demonstrated that adding a gold film under the nanostructures was highly beneficial for a dual SPRI-SERS characterization. In order to optimize the geometry of the nanostructures and understand the various plasmonic modes, most of the samples were first made by electron beam lithography. Nanoimprinting assisted by UV (UV-NIL) was also developed during this thesis to manufacture samples in large quantities and reply to the future industrial needs for biosensing applications. Performances of these UV-NIL samples were compared with those produced by e-beam lithography. Diameters and periods of gold nanodisks range respectively from 40 nm to 300 nm and 80 nm to 600 nm, depending on the manufacturing technique used. In SERS, enhancement factor of 10^6 to 10^8 were obtained thanks to the presence of the continuous gold film under the nanodisks array. We found that this gain is a function of the thickness of the gold film, the excitation wavelength used and the nanostructures filling factor. In SPRI, we have demonstrated experimentally and theoretically the existence of a coupling between the propagating and localized plasmonic modes, resulting in a new hybrid mode, potentially more sensitive due to its high confinement. Numerical models confirm these results, taking into account the defects found in real samples (rounded edges, imperfect lateral side, adhesion layer). The whole work proposes a better understanding, both experimentally and theoretically, of the plasmonic properties at nanoscale of gold nanostructures with and without an underlying gold film. Moreover, a detailed study of the different technological processes helps to understand which steps significantly impact the plasmonic properties of the samples and their performance as a biosensor. Finally, these samples were characterized and validated on a bimodal instrument SPRI-SERS.; Ce travail porte sur la réalisation de nanostructures d'or sur substrat de verre afin d’en étudier les propriétés plasmoniques et de les optimiser pour des applications dans le domaine des biocapteurs. L'objectif principal a été de démontrer la faisabilité de combiner sur une même biopuce, les biocapteurs à résonance de plasmon de surface propagatif (SPR) et ceux basés sur la diffusion Raman exaltée de surface (SERS). Nous montrons que la présence d’un film d’or sous les nanostructures est très favorable pour une double caractérisation SPR-SERS. Afin d’étudier plus en détails les couplages entre les différents modes plasmoniques existants dans ces substrats et ainsi pouvoir déterminer la structure optimale, l’essentiel des échantillons a été réalisé par lithographie électronique. La nanoimpression assistée par UV (UV-NIL) a aussi été développé au cours de cette thèse afin de réaliser un nombre important d'échantillons et répondre aux futurs besoins de l'industrie des biocapteurs. Les performances de ces échantillons réalisés par UV-NIL ont été comparées avec ceux fabriqués par lithographie électronique. Les diamètres des nanodisques d'or varient de 40 nm à 300 nm et les périodes de 80 nm à 600 nm en fonction de la technique de fabrication. En SERS, des facteurs d’exaltation de 10^6 à 10^8 ont été obtenus grâce à la présence du film d’or continu sous le réseau de nanodisques. Ce gain est fonction de l’épaisseur du film d’or, de la longueur d’onde d’excitation utilisée et du taux de remplissage des nanostructures. En SPR, nous avons démontré expérimentalement et théoriquement la possibilité de couplage entre les modes localisés et propagatifs donnant lieu à un nouveau mode hybride, potentiellement plus sensible car plus confiné. Les calculs numériques développés pour simuler le comportement de structures réelles (présence d’arrondi, de flanc ou de couche d’accroche) confirment les résultats obtenus. L’ensemble de ce travail a permis de manière expérimentale et théorique d’apporter une meilleure compréhension des propriétés plasmoniques aux échelles nanométriques sur des structures constituées de réseaux de nanostructures d'or, notamment sur film d’or. Par ailleurs, une étude précise des différentes étapes technologiques a permis de comprendre quels éléments impactent significativement les propriétés plasmoniques des échantillons et donc améliorent ou dégradent les performances de ces substrats en tant que biocapteur. Au final, les échantillons réalisés ont été testés et validés en tant que biocapteur au sein d'un appareil bimodal SPR-SERS.

The direct detection of specific sequences in genomic DNA samples is very challenging in the biosensor-based approach. In this work we developed an optimized strategy for the direct detection of DNA sequences in human genomic samples by a surface plasmon resonance imaging technology. As model study, the target analyte was identified in a DNA sequence mapping the human ABCB1 gene. The computed-assisted approach was here applied for probe design. After a preliminary evaluation of the probe functioning by the complementary synthetic target, the system was applied to the direct detection of the target sequence in human genomic DNA extracted from lymphocytes. To achieve this result, several steps aimed to improve the analytical performances of the biosensor were studied and optimized. The immobilization chemistry, based on thiolated probes, was adapted here to non-amplified sequence detection. DNA sample pre-treatments, i.e. genomic fragmentation by ultrasounds and dsDNA denaturation by thermal treatment were also investigated. A sandwich-like strategy, by using a secondary probe, was also applied to understand and confirm the selectivity of the developed biosensor in detecting ABCB1 gene in genomic samples. Finally, a reliable calibration curve of ABCB1 was obtained with an experimental detection limit of 140 aM. Furthermore, the biosensor was well regenerable, assuring up to thirty cycles of effective measurements.

International audience; The organized cell adherent array (OC2A) is an integrated tool useful for real-time and label-free detection of secreted molecules. The OC2A novel cell chip is composed of two substrates, one allowing localized cell culture and the other one constituting the sensitive layer detection. These two units are assembled thanks to a thickness controlled spacer (250µm) which forms a microfluidic lumen. In practice, the top layer of the chip is a polycarbonate substrate covered by a poly (ethylene oxide)-like (PEO-like) film deposited by plasma polymerization. This PEO-like film is cells repellent but allows the direct immobilization of protein through low volume spotting. Thus, fibronectin spots were deposited on this PEO-like film in order to create cell adhesive areas surrounded by non-adhesive background. On the sensitive layer part, various antibodies were immobilized in an organized manner on a surface plasmon resonance imaging (SPRi) chip useful for the multiplex label-free detection of proteins. The two units are then assembled and the cells loaded in the chip. After one hour of culture, non-adherent cells are removed by washing and the chip is ready to experiment. Evidences were obtained of the real-time detection of Prostate Specific Antigen (PSA) and β-2-microglobulin (B2M) secreted by LNCaP cells, androgen-sensitive human prostate adenocarcinoma cells, following induction by dihydrotestosterone (DHT). Different kinetics of the two secreted proteins were also demonstrated and precisely determined using the OC2A system.

Plusieurs tests médicaux, comme celui du dépistage du cancer du sein, se basent sur l’observation de section tissulaire sous un microscope. Ces tests se basent sur l’interprétation d’un spécialiste et les résultats peuvent varier d’un expert à un autre dû la subjectivité des observations. L’utilisation d’une technique analytique offrant une quantification et une identification de cibles moléculaires dans une section tissulaire permettrait aux experts de produire des diagnostics plus objectifs et diminuerait possiblement le nombre de faux diagnostics. Les travaux présentés dans ce mémoire portent sur le développement d’une technique SPRi-MALDI-IMS permettant l’imagerie en deux dimensions de protéines contenues dans une section tissulaire. La MALDI-IMS est la technique de choix pour l’imagerie de biomolécules dans les sections tissulaires. Par contre, elle ne parvient pas à elle seule à quantifier de façon absolue le matériel adsorbé à la surface. Donc, le couplage de la MALDI-IMS avec la SPRi permet la quantification absolue de protéines en deux dimensions et crée une technique répondant aux besoins des experts médicaux. Pour ce faire, nous avons étudié, l’effet de la chimie de surface sur la nature et la quantité de matériel adsorbé à la surface du capteur. De plus, la cinétique de transfert des protéines du tissu vers le capteur a dû être optimisée afin de produire des empreintes correspondant au tissu d’origine, afin d’atteindre la gamme dynamique des instruments SPRi et MALDI-IMS. La technique résultante de ces optimisations permet d’obtenir les premières images quantitatives et qualitatives de protéines en deux dimensions d’une seule section tissulaire., Several medical tests, such as breast cancer screening, are based on the observation of tissue section under a microscope. These tests rely on the interpretation of a specialist and the results can vary due to subjectivity of these analyses. Using an analytical technique able to quantify and identify molecular targets in a tissue section would enable experts to produce more objective diagnostic and possibly reduce the number of misdiagnosis. The work presented in this thesis focuses on the development of a SPRi-MALDI-IMS technique for imaging proteins in a tissue section. MALDI-IMS is the contemporary technique of choice for biomolecule imaging in tissue sections. However, absolute quantification of material absorbed to the surface cannot be performed using MALDI-IMS. The absolute quantification of proteins in two dimensions was successfully achieved by coupling of the MALDI-IMS with SPRi. Accordingly, we investigated by studying the nature of the surface chemistry and the amount of material adsorbed on the sensor’s surface. In addition, the kinetics of the protein transfer had to be optimized to produce imprints corresponding to the transferred tissue and to reach the dynamic ranges of both SPRi and MALDI-IMS instruments. The resulting technique led to quantitative and qualitative images of proteins in two dimensions of a single tissue section. It is envisioned that SPRi-MALDI-IMS can eventually meet the needs of medical experts for pathological screening.

International audience; In the present report, we are making the proof of concept of cell small populations (from 1 to 100 cells) spotting, culture and secretion detection on a gold surface. In order to keep the cells in a hydrated environment during the robotized micropipetting and to address different cell lines on a single chip, a biocompatible alginate polymer was used. This approach enables the encapsulation of the cell in a very small volume (30 nL), directly on the substrate and permits a precise control of the number of cells in each alginate bead. After 24 h of culture, the adherent cells are ready for surface plasmon resonance imaging (SPRi) experimentation. To enable the detection of secreted proteins, various antibodies are immobilized in an organized manner on a SPRi sensor and permitted the multiplex detection of different proteins secreted by the different cultured cell lines. Evidence of the real-time detection will be presented for Prostate Specific Antigen (PSA) and β-2-microglobulin (B2M) secreted by prostate cancer cells following induction by dihydrotestosterone (DHT). Different kinetics for the two secreted proteins were then demonstrated and precisely determined using the chip.

The 20S proteasome is a multicatalytic enzyme complex responsible for intracellular protein degradation in mammalian cells. Its antigen level or enzymatic activity in blood plasma are potentially useful markers for various malignant and nonmalignant diseases. We have developed a method for highly selective determination of the 20S proteasome using a Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRI) technique. It is based on the highly selective interaction between the proteasome’s catalytic β5 subunit and immobilized inhibitors (the synthetic peptide PSI and epoxomicin). Inhibitor concentration and pH were optimized. Analytical responses, linear ranges, accuracy, precision and interferences were investigated. Biosensors based on either PSI and epoxomicin were found to be suitable for quantitative determination of the proteasome, with a precision of ±10% for each, and recoveries of 102% and 113%, respectively, and with little interference by albumin, trypsin, chymotrypsin, cathepsin B and papain. The proteasome also was determined in plasma of healthy subjects and of patients suffering from acute leukemia. Both biosensors gave comparable results (2860 ng·mL-1 on average for control, and 42300 ng·mL-1 on average for leukemia patients). Figure The synthetic peptide aldehyde Z-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (PSI) and a microbial α’,β’ epoxyketone peptide epoxomicin was used to develop SPRI biosensor for the highly selective determination of the 20S proteasome concentration, and to evaluate the sensor applicability for the determination of 20S proteasome in human blood plasma.

SPR imaging (SPRi) is at the forefront of optical label-free and real-time detection. It offers the possibility of monitoring hundreds of biological interactions simultaneously and from the binding profiles, allows the estimation of the kinetic parameters of the interactions between the immobilised probes and the ligands in solution. We review the current state of development of SPRi technology and its application including commercially available SPRi instruments. Attention is also given to surface chemistries for biochip functionalisation and suitable approaches to improve sensitivity.

The work reported in this thesis focuses on the development of a multiplexed cell chip for the study of parallelized cellular responses. The lineage of cells from Prostate cancer LNCaP cells, were used as a study model thanks to their ability to secrete prostate-specific antigen (PSA) and β-2-microglobulin (B2M) in response to induction by hormones such as dihydrotestosterone (DHT). We were able to detect in real time these label-free molecules and their secretion by small populations of adherent LNCaP cells (from 1 to 100 cells) at specified positions on a SPRi biochip. Three different approaches were considered for this biochip. The first was to pattern the gold surface of a SPRi slide to obtain microwells whose bottom reveals the gold surface (cytophilic area) and an outer shell composed of polystyrene (cytophobe) to create an adhesive/non-adhesive surface for cell culture. Antibodies were immobilized in a controlled manner in the microwells using a piezo electric spotter. In this miniaturized system, different cell lines were co-cultured on a surface of 1 cm², paving the way for multiplexing. A small population of cells (1 to 100) was deposited in an automated manner into each microwell. In order to maintain the cells in a hydrated environment during deposition, a biocompatible alginate polymer was used. This method allows the encapsulation of cells in a very small volume (, Les travaux présentés dans cette thèse concernent le développement d'une puce à cellules multiplexée pour l'étude de réponses cellulaires parallélisées. La lignée de cellules issues de cancer de la prostate, les cellules LNCaP, ont servi de modèle d'étude grâce à leur capacité à sécréter l'antigène prostate-spécifique (PSA) et la β-2-microglobuline (B2M) en réponse à l'induction par des hormones telles que la dihydrotestostérone (DHT). Nous avons ainsi pu détecter en temps réel et sans marquage ces molécules lors de leur sécrétion par de petites populations de cellules LNCaP adhérentes (de 1 à 100 cellules) à des positions déterminées sur une biopuce SPRi. Trois approches différentes ont été envisagées pour cette biopuce. La première consistait à microtexturer la surface d'or d'un support de SPRi afin d'obtenir des micropuits dont le fond révèle la surface d'or (région cytophile) et dont l'extérieur est composé de polystyrène (cytophobe) afin de créer un contraste d'adhésion pour la culture cellulaire. Des anticorps ont pu être immobilisés de façon contrôlée dans les micropuits grâce à un automate de micro-dépôt non contact. Dans ce système miniaturisé, différentes lignées cellulaires ont pu être co-cultivées sur une surface de 1 cm², ouvrant la voie au multiplexage. Une petite population de cellules (de 1 à 100) a été déposée de façon automatisée dans chaque micropuits. Afin de maintenir les cellules dans un milieu hydraté au cours du dépôt, un polymère d'alginate biocompatible a été utilisé. Cette méthode permet l'encapsulation de cellules dans un très petit volume (< 50 nL). La capacité de cet hydrogel à maintenir les cellules encapsulées à une position donnée sur le support a conduit à la conception d'une deuxième approche pour la fabrication de la biopuce. En effet dans cette approche la surface n'est pas modifiée et les composés biologiques (anticorps et cellules) sont directement déposés de façon automatisée sur la couche d'or. Enfin une dernière approche a été développée en immobilisant cette fois-ci les cellules sur un support microtexturé placé en face de la couche sensible de SPRi. Dans les trois approches, les cinétiques de sécrétion du PSA et de la B2M sécrétées ont pu être suivies par SPRi

The biological diagnosis of type I hypersensitivity reactions is based on the quantification of specific IgEs. However, the IgE titer is not always strongly related to the clinical symptoms or predictive of the evolution of the disease. The specificity and affinity of antibodies of other isotypes may contribute to the allergic status of the patients. The aim of this work was to develop a method that simultaneously detects the complex antibody response to various allergens and measures the avidity of the antibodies directed to each allergen (Cf Journal of immunological Methods, Volume 405, March 2014, Pages 23?28). We developed a tool to detect and measure the avidity of the various antibodies recognizing the major allergens of an allergenic source. Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) is a sensitive label-free method to detect and visualize biomolecular interactions. Our configuration allows the use of a pattern of various immobilized molecules and simultaneously follows up the kinetic curves of each spotted molecule

Prism-based surface plasmon resonance (SPR) microscopy is an optical imaging technique invented in the late 60s'. Its main advantage lies in its high sensitivity to optical index or thickness variations at a metal surface. Therefore, the monitoring of biological reactions can be performed in real-time without labeling agent such as fluorescence or enzymes. Over the last 30 years, SPR microscopy has become the major technique in label-free biodetection. The field of application range from the determination of affinity constant in biochemistry to the detection of pathogenic bacteria via cellular biology. Until now, the propagation length of the surface plasmons has been considered as the spatial resolution limit. However, many examples do not support this statement. In this PhD thesis, we demonstrate that the resolution is also limited by optical aberrations induced by the prism used to couple light and surface plasmons. Thus, we are able to explain why the experimental resolution was usually worse than the predicted one. The analysis of the image formation and the quantification of aberrations lead us to suggest two new optical configurations optimized for resolution. We also analyze which metal exhibits the better trade-off between propagation length and sensitivity. Experimentally, we obtain a resolution between 1.5 and 4 μm depending on the direction, on field-of-view up to several mm2, and with a standard sensitivity for biodetection (monolayer of DNA). We are then able to observe simultaneously several thousands of individual eukaryote and prokaryote cells. Finally, we develop a prototype dedicated to the real-time monitoring of protein secretion by immune cells. The limits of SPR microscopy and the solutions which could allow this kind of study are discussed. Preliminary results on the improvement of bacterial detection are also presented.; La microscopie par résonance de plasmon de surface (SPR) à couplage par prisme a vu le jour à la fin des années 60. Le principal avantage de cette technique d'imagerie optique réside dans sa très grande sensibilité à de faibles variations d'indice optique ou d'épaisseurs à la surface d'un métal. De ce fait, le suivi d'interactions biologiques peut se faire en temps réel sans avoir recours à l'utilisation de marqueurs fluorescents ou enzymatiques. Depuis plus de 30 ans, la microscopie SPR s'est imposée comme la technique de référence de biodétection sans marquage. Ses champs d'application vont de la détermination de constantes d'affinité à la détection de bactéries pathogènes, en passant par la biologie cellulaire. Jusqu'à présent, on pensait la résolution spatiale limitée par la longueur de propagation des plasmons de surface. Or, de nombreux exemples ne corroborent pas cette hypothèse. Dans cette thèse, nous montrons qu'à ce phénomène de propagation se rajoute des aberrations optiques induites par l'utilisation d'un prisme pour coupler la lumière et les plasmons de surface. Nous expliquons ainsi pourquoi les résolutions expérimentales étaient souvent bien moins bonnes que celles attendues. Par l'analyse de la formation des images et la quantification des aberrations, nous aboutissons à deux nouvelles configurations optiques optimisées pour la résolution. Nous analysons ensuite quel métal offre le meilleur compromis entre longueur de propagation et sensibilité. Expérimentalement, nous obtenons une résolution comprise entre 1,5 et 4 μm suivant la direction, sur des champs de vision de plusieurs mm2, et ce, avec une sensibilité standard en biodétection. Nous sommes ainsi en mesure d'observer simultanément plusieurs milliers de cellules individuelles, eucaryotes et procaryotes. Finalement, nous développons un prototype dédié au suivi en temps réel de sécrétions de protéines par des cellules immunitaires. Les limites de la microscopie SPR et les solutions qui permettraient de faire aboutir ce type d'étude sont examinées. Des études préliminaires sont aussi menées sur l'amélioration de la détection de bactéries.

Abciximab (Abci) and eptifibatide (Epti) are antiaggregate drugs which may reduce thrombotic complications in acute coronary syndromes. The aim of this work was the investigation of the interaction between the phospholipid-GPIIb/IIIa glycoprotein complex and Abci or Epti, and the influence of these drugs on the phospholipid ratio in the platelet membrane. The interaction between the phospholipid-GPIIb/IIIa glycoprotein complex and antiaggregate drugs were investigated using the Surface Plasmon Resonance Imaging technique (SPRI). Phospholipids phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserine (PS), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC) and sphingomyelin (SM) were first immobilized onto the gold chip surface. The phospholipid ratio in the platelet membrane was determined by the HPLC. Only PI, PS, PE and PC were determined. Human platelets treated 'in vitro' with Abci or Epti exhibit changes in the phospholipid ratio in the platelet membrane. The ratio of PS decreases and PC rises. The SPRI distinctly shows interactions between phospholipids and glycoprotein GPIIb/IIIa, and between the phospholipid-glycoprotein GPIIb/IIIa complex and Abci or Epti. The interaction between phospholipids and glycoprotein GPIIb/IIIa is growing in the sequence: PI

Manipulation and utilization of magnetic nano/microparticles have raised some interest in the field of biology, biodetection and diagnostics during the last few years. This work explores the uses of magnetic properties of particles in two different axes.In a first part, we used magnetic particles in a bio-barcode assay for the capture and biological target concentration steps. The detection was done using a new evanescent wave biosensor. The aim was to perform a platelet genotyping without polymerase chain reaction (PCR) with the collaboration of the French national blood service (EFS). We used the biallelic system HPA-1 as proof-of-concept, using synthetic oligonucleotides as target in order to validate our protocols. The assay allows to specifically detect single nucleotide polymorphism for HPA-1 gene with a detection of 2 fmol/l of label-free target synthetic oligonucleotides. Our bio-barcode assay allows to lower the inferior limit of detection of our biosensor by a factor of 125 000. We can detect 6.105 copies of synthetic target without using a PCR amplification step. The next step will be to adapt our assay to analyze real biological samples.In a second part, we explored the assemblage of magnetic particles with a magnetic field to create permanent filaments anchored on a surface and that can be actuated. The filaments could be grafted on homogeneous glass or gold supports and also on mixed glass/gold supports with orthogonal functionalization. Filaments could be localized on precise support zones using either metallic tips concentrating locally the magnetic field (500 µm spots) or selective functionalization on mixed supports (1 mm gold squares). Assembling 200 nm diameter particles allowed to typically obtain filaments 5 µm long and 200 - 400 nm wide. The filament formation conditions could still be improved.Permanent magnetic filaments were used for two applications. Firstly, we used magnetic filaments which can be actuated to validate a polarimetric surface resonance imaging biosensor (P-SPRI) developed by the LCFIO (Palaiseau). First measurements tend to show that the anisotropy can be detected by the P-SPRI biosensor. It is necessary to continue this work to better validate the results already obtained. Secondly, we used magnetic filaments biofunctionalized by oligonucleotide probes to type platelets. In non-optimized measurement conditions, the hybridization of fluorescent target oligonucleotides on filaments anchored on a surface allows to multiply by 3 the fluorescence signal compared to hybridization on plane surface by increasing the support specific surface.; La manipulation de micro et nanoparticules magnétiques et leurs applications dans les domaines de la biologie, la biodétection et du diagnostic a continuellement gagné en intérêt ces dernières années. Ce travail de thèse explore l'utilisation des propriétés magnétiques des particules en suivant deux axes distincts.Dans un premier axe, nous avons utilisé des particules magnétiques dans une analyse par biocode barre pour la capture et la concentration de cibles biologiques. La détection a été effectuée à l'aide d'un nouveau biocapteur à onde évanescente. Le but était de pouvoir procéder à un génotypage plaquettaire sans utiliser la " Polymérase Chain Reaction " (PCR), en collaboration avec l'Etablissement Français du Sang Rhône-Alpes. Nous nous sommes servis du système biallélique HPA-1 comme preuve de concept, en utilisant des cibles de type oligonucléotide synthétique pour valider nos protocoles d'analyse. Nous avons réussi à détecter une concentration de 2 fmol/l de cibles non marquées. Notre test permet de discriminer les deux allèles du gène HPA-1, qui ne diffèrent que d'un nucléotide. Notre approche par biocode barre permet d'abaisser le seuil inférieur de détection de notre biocapteur d'un facteur 125 000. Nous avons pu détecter 6.105 copies de cible synthétique, sans passer par une amplification PCR. La prochaine étape consistera à adapter le test pour analyser des échantillons biologiques réels.Dans un deuxième axe, nous avons exploré l'assemblage de particules magnétiques sous champ magnétique, de manière à fabriquer des filaments permanents ancrés sur une surface et orientables. Les filaments ont pu être greffés sur des supports homogènes de verre, d'or et sur des supports mixte verre/or fonctionnalisés de manière orthogonale. Les filaments ont pu être localisés dans des zones précises du support, soit en employant des pointes concentrant le champ magnétique localement (spots de 500 µm), soit en jouant sur la fonctionnalisation sélective sur support mixte (carrés d'or de 1 mm de côté). Typiquement l'assemblage de particules de 200 nm de diamètre a permis d'obtenir des filaments de 5 µm de longueur pour 200 à 400 nm de largeur. Les conditions de formation des filaments restent toutefois à améliorer.Les filaments magnétiques permanents ont été employés pour deux applications. Tout d'abord nous avons employé les filaments magnétiques orientables pour valider un banc d'imagerie polarimétrique par résonance de plasmon de surface (P-SPRI) développé par le LCFIO (Palaiseau). Les premières mesures tendent à montrer que l'anisotropie des filaments peut être détectée par le banc de P-SPRI, il est toutefois nécessaire de poursuivre les travaux pour mieux valider ces résultats. Deuxièmement nous avons employé des filaments magnétiques biofonctionnalisés avec des oligonucléotides sondes, pour procéder à un génotypage plaquettaire. Dans des conditions de mesure non optimisées, l'hybridation d'oligonucléotides cibles fluorescents sur les filaments ancrés sur support permet de multiplier par trois le signal de fluorescence par rapport à une hybridation sur surface plane, grâce à une augmentation de la surface spécifique du support.

DNA lesions contribute to the alteration of DNA structure, thereby inhibiting essential cellular processes. Such alterations may be beneficial for chemotherapies, for example in the case of platinum anticancer agents. They generate bulky adducts that, if not repaired, ultimately cause apoptosis. A better understanding of the biological response to such molecules can be obtained through the study of proteins that directly interact with the damages. These proteins constitute the DNA lesions interactome. This thesis presents the development of tools aiming at increasing the list of platinum adduct-associated proteins. Firstly, we designed a ligand fishing system made of damaged plasmids immobilized onto magnetic beads. Three platinum drugs were selected for our study: cisplatin, oxaliplatin and satraplatin. Following exposure of the trap to nuclear extracts from HeLa cancer cells and identification of retained proteins by proteomics, we obtained already known candidates (HMGB1, hUBF, FACT complex) but also 29 new members of the platinated-DNA interactome. Among them, we noted the presence of PNUTS, TOX4 and WDR82, which associate to form the recently-discovered PTW/PP complex. Their capture was then confirmed with a second model, namely breast cancer cell line MDA MB 231, and the biological consequences of such an interaction now need to be elucidated. Secondly, we adapted a SPRi biochip to the study of platinum-damaged DNA/proteins interactions. Affinity of HMGB1 and newly characterized TOX4 for adducts generated by our three platinum drugs could be validated thanks to the biochip. Finally, we used our tools, as well as analytical chemistry and biochemistry methods, to evaluate the role of DDB2 (a factor involved in the recognition of UV-induced lesions) in the repair of cisplatin adducts. Our experiments using MDA MB 231 cells differentially expressing DDB2 showed that this protein is not responsible for the repair of platinum damages. Instead, it appears to act as a positive mediator of their cytotoxicity. In the near future, the abovementioned microsystems will be adapted to the study of the interactome of other DNA lesions.; La présence de lésions sur l'ADN contribue à déstabiliser sa structure, bloquant certains processus vitaux pour la cellule. Ces altérations peuvent cependant avoir un intérêt thérapeutique, par exemple dans le cas de l'utilisation d'anticancéreux tels que les dérivés du platine. Les adduits volumineux qu'ils génèrent, s'ils ne sont pas réparés, entraînent la cellule vers l'apoptose. La compréhension de la réponse à ces anticancéreux passe par l'étude des protéines qui interagissent directement avec les dommages, et dont l'ensemble constitue l'interactome des lésions de l'ADN. Ce travail de thèse présente le développement d'outils destinés à compléter la liste des protéines associées aux adduits du platine. Dans un premier temps, nous avons utilisé un piège à protéines (ligand fishing) constitué de plasmides lésés fixés sur des billes magnétiques. Trois dérivés du platine ont été sélectionnés pour générer les lésions : le cisplatine (molécule princeps), l'oxaliplatine, et le satraplatine. Ce piège a permis d'obtenir, à partir d'extraits nucléaires issus de cellules cancéreuses HeLa et grâce à une identification par protéomique, une liste de candidats comprenant des protéines déjà connues (HMGB1, hUBF, complexe FACT), mais aussi 29 nouveaux membres de l'interactome. Parmi ceux-ci, nous avons relevé PNUTS, TOX4 et WDR82, qui constituent les sous-unités du complexe PTW/PP, très récemment découvert. La présence de ce complexe a été également validée sur un modèle d'adénocarcinome mammaire MDA MB 231, et les conséquences biologiques de son interaction avec les adduits du platine devront maintenant être précisées. Dans un second temps, nous avons mis au point une biopuce permettant d'étudier les interactions ADN lésé/protéine par SPRi. Les affinités respectives d'HMGB1 et du nouveau candidat TOX4 pour les adduits des trois dérivés du platine ont pu être ainsi confirmées. Dans un dernier temps, nous avons étudié le rôle de DDB2 (acteur de la reconnaissance des photoproduits UV) dans la prise en charge des adduits platinés. Les expérimentations menées sur les cellules MDA MB 231 exprimant DDB2 de façon différentielle nous ont permis de vérifier que cette protéine ne participe pas à la réparation des adduits du cisplatine, contribuant plutôt à potentialiser l'action cytotoxique de cet agent. Dans le futur, nos microsystèmes pourront être adaptés à l'étude de l'interactome d'autres lésions de l'ADN.

DNA lesions contribute to the alteration of DNA structure, thereby inhibiting essential cellular processes. Such alterations may be beneficial for chemotherapies, for example in the case of platinum anticancer agents. They generate bulky adducts that, if not repaired, ultimately cause apoptosis. A better understanding of the biological response to such molecules can be obtained through the study of proteins that directly interact with the damages. These proteins constitute the DNA lesions interactome. This thesis presents the development of tools aiming at increasing the list of platinum adduct-associated proteins. Firstly, we designed a ligand fishing system made of damaged plasmids immobilized onto magnetic beads. Three platinum drugs were selected for our study: cisplatin, oxaliplatin and satraplatin. Following exposure of the trap to nuclear extracts from HeLa cancer cells and identification of retained proteins by proteomics, we obtained already known candidates (HMGB1, hUBF, FACT complex) but also 29 new members of the platinated-DNA interactome. Among them, we noted the presence of PNUTS, TOX4 and WDR82, which associate to form the recently-discovered PTW/PP complex. Their capture was then confirmed with a second model, namely breast cancer cell line MDA MB 231, and the biological consequences of such an interaction now need to be elucidated. Secondly, we adapted a SPRi biochip to the study of platinum-damaged DNA/proteins interactions. Affinity of HMGB1 and newly characterized TOX4 for adducts generated by our three platinum drugs could be validated thanks to the biochip. Finally, we used our tools, as well as analytical chemistry and biochemistry methods, to evaluate the role of DDB2 (a factor involved in the recognition of UV-induced lesions) in the repair of cisplatin adducts. Our experiments using MDA MB 231 cells differentially expressing DDB2 showed that this protein is not responsible for the repair of platinum damages. Instead, it appears to act as a positive mediator of their cytotoxicity. In the near future, the abovementioned microsystems will be adapted to the study of the interactome of other DNA lesions.; La présence de lésions sur l'ADN contribue à déstabiliser sa structure, bloquant certains processus vitaux pour la cellule. Ces altérations peuvent cependant avoir un intérêt thérapeutique, par exemple dans le cas de l'utilisation d'anticancéreux tels que les dérivés du platine. Les adduits volumineux qu'ils génèrent, s'ils ne sont pas réparés, entraînent la cellule vers l'apoptose. La compréhension de la réponse à ces anticancéreux passe par l'étude des protéines qui interagissent directement avec les dommages, et dont l'ensemble constitue l'interactome des lésions de l'ADN. Ce travail de thèse présente le développement d'outils destinés à compléter la liste des protéines associées aux adduits du platine. Dans un premier temps, nous avons utilisé un piège à protéines (ligand fishing) constitué de plasmides lésés fixés sur des billes magnétiques. Trois dérivés du platine ont été sélectionnés pour générer les lésions : le cisplatine (molécule princeps), l'oxaliplatine, et le satraplatine. Ce piège a permis d'obtenir, à partir d'extraits nucléaires issus de cellules cancéreuses HeLa et grâce à une identification par protéomique, une liste de candidats comprenant des protéines déjà connues (HMGB1, hUBF, complexe FACT), mais aussi 29 nouveaux membres de l'interactome. Parmi ceux-ci, nous avons relevé PNUTS, TOX4 et WDR82, qui constituent les sous-unités du complexe PTW/PP, très récemment découvert. La présence de ce complexe a été également validée sur un modèle d'adénocarcinome mammaire MDA MB 231, et les conséquences biologiques de son interaction avec les adduits du platine devront maintenant être précisées. Dans un second temps, nous avons mis au point une biopuce permettant d'étudier les interactions ADN lésé/protéine par SPRi. Les affinités respectives d'HMGB1 et du nouveau candidat TOX4 pour les adduits des trois dérivés du platine ont pu être ainsi confirmées. Dans un dernier temps, nous avons étudié le rôle de DDB2 (acteur de la reconnaissance des photoproduits UV) dans la prise en charge des adduits platinés. Les expérimentations menées sur les cellules MDA MB 231 exprimant DDB2 de façon différentielle nous ont permis de vérifier que cette protéine ne participe pas à la réparation des adduits du cisplatine, contribuant plutôt à potentialiser l'action cytotoxique de cet agent. Dans le futur, nos microsystèmes pourront être adaptés à l'étude de l'interactome d'autres lésions de l'ADN.

This thesis presents screen-printed carbon microarray as immobilisation support for biochips. First, a model of enzymatic biochip based on an electrochemiluminescent detection and allowing the measuring of metabolites in serum samples is presented.Then, an innovative immobilization strategy for biomolecules, leading to a covalent grafting on conductive microarrays is presented. This direct method, involving the electro-addressing properties of aryl-diazonium salts is characterized and used to electro-address antibodies, and to perform immuno-assays. As well, an oligonucleotide biochip is realized based on this model.Gold electro-deposition at the surface of screen-printed electrodes, and its effects on biomolecule electro-addressing and on chemiluminescent detection are presented.A third part presents the biomolecule electro-addressing on gold surfaces in order to realize SPR imaging detection.; Ce travail présente l'utilisation de réseaux d'électrodes de carbone sérigraphiés pour la réalisation de biopuces. Dans un premier temps, un modèle biopuce enzymatique basé sur la détection électrochimiluminescente et permettant le dosage de métabolites sanguins est présenté.Puis, un principe novateur d'immobilisation de biomolécules aboutissant à leur fixation covalente sur les réseaux conducteurs est présenté. Cette méthode directe impliquant les propriétés d'électro-adressage des sels de diazonium est caractérisée. Elle est alors utilisée afin d'électro-adresser des anticorps, et de réaliser des détections immunologiques. Une biopuce à oligonucléotide est également réalisée selon ce modèle. L'électrodéposition d'or à la surface des électrodes ainsi que son effet sur l'électro-adressage et sur la détection chimiluminescente sont présentés.Une troisième partie expose l'électro-adressage de biomolécules sur des surfaces d'or afin de réaliser des détections en imagerie par SPR.

This thesis presents screen-printed carbon microarray as immobilisation support for biochips. First, a model of enzymatic biochip based on an electrochemiluminescent detection and allowing the measuring of metabolites in serum samples is presented.Then, an innovative immobilization strategy for biomolecules, leading to a covalent grafting on conductive microarrays is presented. This direct method, involving the electro-addressing properties of aryl-diazonium salts is characterized and used to electro-address antibodies, and to perform immuno-assays. As well, an oligonucleotide biochip is realized based on this model.Gold electro-deposition at the surface of screen-printed electrodes, and its effects on biomolecule electro-addressing and on chemiluminescent detection are presented.A third part presents the biomolecule electro-addressing on gold surfaces in order to realize SPR imaging detection., Ce travail présente l'utilisation de réseaux d'électrodes de carbone sérigraphiés pour la réalisation de biopuces. Dans un premier temps, un modèle biopuce enzymatique basé sur la détection électrochimiluminescente et permettant le dosage de métabolites sanguins est présenté.Puis, un principe novateur d'immobilisation de biomolécules aboutissant à leur fixation covalente sur les réseaux conducteurs est présenté. Cette méthode directe impliquant les propriétés d'électro-adressage des sels de diazonium est caractérisée. Elle est alors utilisée afin d'électro-adresser des anticorps, et de réaliser des détections immunologiques. Une biopuce à oligonucléotide est également réalisée selon ce modèle. L'électrodéposition d'or à la surface des électrodes ainsi que son effet sur l'électro-adressage et sur la détection chimiluminescente sont présentés.Une troisième partie expose l'électro-adressage de biomolécules sur des surfaces d'or afin de réaliser des détections en imagerie par SPR.