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Orientador: Ana Carolina Migliorini Figueira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O hormônio tireoidiano regula diversas funções do sistema endócrino por meio da interação deste com seu receptor (receptor nuclear de hormônio tireoidiano ¿ TR). Na presença de um ligante esse receptor sofre uma mudança conformacional que permite sua interação com proteínas coativadoras, como a GRIP (proteína de interação com o receptor de glucocorticóide - glucocorticoid receptor interacting protein). A associação do TR com coativadores auxilia na abertura da estrutura da cromatina, através do recrutamento de acetilases de histonas, resultando na ativação da transcrição de diversos genes, principalmente dos genes ligados à produção de proteínas que regulam o metabolismo basal. Este projeto teve como principal objetivo estudar a formação e a caracterização do complexo receptor nuclear com coativador para mapear possíveis interfaces de interação adicionais e entender melhor sua formação. Para isso foram realizados ensaios que possibilitaram avaliar a estequiometria dos complexos, a afinidade entre essas proteínas e também a influência dos ligantes desses receptores na formação dos complexos. Foram desenvolvidos os ensaios de purificação das proteínas e montagem dos complexos (por ensaios de pull down ou coexpressão). Ensaios de anisotropia de fluorescência possibilitaram a verificação da afinidade entre receptroes nucleares (NRs) e a GRIP e do mecanismo de ação do ligante do RXR (Retinoid X Receptor) (ácido 9-cis retinóico ¿ 9C) no complexo TR:RXR:GRIP. Além destes, também foram realizados outros experimentos de caracterização biofísica para avaliar a qualidade das amostras e a estabilidade da estrutura secundária das proteínas e complexos. Como principais resultados, obtivemos dados sobre a afinidade dos complexos e sua estabilidade, que nos mostraram que a presença de construções mais completas são importantes na sua estabilização. Através da anisotropia de fluorescência observamos que o 9C atua no complexo, auxiliando no desligando correpressores. É importante mencionar que este trabalho resultou no maior detalhamento do mecanismo de ativação do TR o que poderá fornecer subsídios, por exemplo, para o planejamento de fármacos Abstract: The thyroid hormone regulates many functions of the endocrine system through the interaction with its receptor (nuclear receptor thyroid hormone - TR). In the presence of its ligand, the receptor undergoes a conformational change that allows the interaction with coactivator proteins, asGRIP. The combination of TR with coactivators assists in opening the chromatin structure via the recruitment of histone acetylases. These results in the activation of transcription of many genes, particularly genes linked to the expression of proteins that regulate the basal metabolism. This project aimed to study the formation and characterization of nuclear receptor with coactivator complex to map possible additional interaction interfaces and to better understand their formation. We performed assays which enabled us to evaluate the stoichiometry of the complex, the affinity between these proteins; and, also, the activity of the ligands of these receptors. We developed protocols for protein purification and formation of complex (as pull down-like and coexpression). Fluorescence anisotropy assays made possible to verify the affinity between TRs and GRIP, and also to study the mechanism of action of RXR ligand (9C) in the complex TR: RXR: GRIP. In addition, other biophysical characterization experiments were made to evaluate the quality of the samples and the stability of the secondary structure of proteins and complexes. The main results gave information of the affinity of the complexes and their stability, which showed that the presence of more complete constructions of these receptors are important in their stabilization. By fluorescence anisotropy we observed that the 9C operates in the complex helping to dissociate correpressores. It is worth to highlight that this research helped to get more detail about TR¿s mechanism of action, which could be useful, for example, for drug design Mestrado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Mestra em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos FAPESP 2013265074

Orientador: Ana Carolina Migliorini Figueira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Receptores Nucleares (RNs) são proteínas ativas na presença de moléculas pequenas e hidrofóbicas, os quais atuam na regulação direta sobre a transcrição de genes. Os Receptores de Hormônios Tireoidianos (TRs) são RNs que possuem efeitos na taxa metabólica e consumo de oxigênio, e também funções únicas em diversos órgãos. Os TRs possuem duas isoformas: TR? e TR?, e sua expressão é diferenciada em vários tecidos. Os hormônios que se ligam aos TRs são a tiroxina (T4) e a triiodotironina (T3). Atualmente, um melhor entendimento sobre a regulação da transcrição por estes receptores tem se tornado uma necessidade para o mapeamento de diferenças que poderiam resultar em novos alvos para a regulação de diversas patologias. Para isso, usamos screenings de duplo-híbrido (y2h) e imunoprecipitação (IP) seguida de espectrometria de massas (LC-MS/MS) para identificar o maior número possível de parceiros de interação, buscando diferenças entre suas isoformas e a influência do T3 nestas interações. Primeiramente, concluímos que TR? faz mais interações com outras proteínas, se comparado à isoforma ?. Em segundo lugar, observamos a diminuição da expressão de TRs após tratamento com T3. Em terceiro lugar, foram montadas redes de interação nas quais foram evidenciados os processos biológicos nos quais os candidatos participam. Em seguida, algumas interações encontradas com proteínas reguladoras de ciclo celular foram confirmadas por co-imunoprecipitação (Co-IP), sendo uma delas formada por TR-PDI. Esta interação foi investigada mais profundamente e nossos resultados demonstram que a PDI é capaz de interferir na expressão regulada por TR, sendo que o knockdown de PDI revelou a alteração na expressão de alguns genes. Este complexo foi caracterizado através de ensaios biofísicos e observamos que a formação do complexo não altera o recrutamento de coativadores por TR. Por fim, modelos in silico demonstraram as possíveis interfaces de interação do complexo. Com isso, sugerimos que TRs podem ter um papel muito importante em vias pouco estudadas como ciclo celular, e que mecanismos redox podem ser importantes para alterar a regulação gênica mediada por TR Abstract: Nuclear Receptors (NRs) are proteins activated by small hydrophobic molecules that act directly in regulation of gene expression. Thyroid Hormone Receptors (TRs) are NRs involved in maintaining metabolic rates, oxygen consumption and have unique functions in different organs. There are two isoforms of TRs: TR? and TR?, each one has different expression among human tissues. The small hydrophobic molecules responsible for TRs regulation are triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4) hormones. Nowadays, a deeply understanding of indirect non-classical transcription regulation by TRs could lead to a better mapping of the main differences between normal and pathological states of the cell. To do so, we performed screenings in yeast two-hybrid system (y2h) and immunoprecipitation (IP) followed by Mass Spectrometry (LC-MS/MS) to identify novel interactors for TRs and to elucidate possible differences between both isoforms plus and minus T3. The results showed TR? binding a superior number of interactors in comparison with TR?. In second place, treatment with T3 decreases TR expression. In third place, we build interactomes for TRs and we classified the protein candidates by biological process (BP). Following, important candidates from cell cycle regulation BP were confirmed by Co-immunoprecipitation (Co-IP) with TRs. One of those interactions, TR-PDI was further investigated and our results showed that PDI changes TR-gene regulation in reporter gene assays. In addition, PDI knockdown alters expression of some genes. In Biophysical Assays we characterized TR-PDI complex and measure binding affinities (Kd). We observed that complex formation do not change coactivator recruitment. Finally, we built in silico models in order to elucidate TR-PDI possible interfaces of interaction. Overall, we suggest that TRs have important roles in less studied pathways, as cell cycle regulation, and TRs could be regulated by redox mechanism to change gene expression Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutora em Ciências FAPESP 2011/23659-2, 2014/22215-1, 2013/08743-2

Orientador: Sandra Martha Gomes Dias Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os processos celulares são largamente mediados pela interação entre proteínas. Além disso, interações da mesma proteína com diferentes parceiros podem levar a respostas de natureza distinta na célula, muitas vezes envolvendo processos antes não previstos para a mesma. A enzima glutaminase é responsável pela conversão de glutamina em glutamato reabastecendo o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e dando suporte ao seu funcionamento e geração de metabólitos essenciais para a síntese de macromoléculas, tendo particular importância para diversos tipos tumorais. O gene GLS codifica para as isoformas kidney-type glutaminase (KGA) e glutaminase C (GAC). Embora compartilhem do mesmo domínio catalítico, a isoforma KGA possui outros domínios distintos contendo sequências consenso do tipo LXXLL (L = Leucina e X = qualquer aminoácido), também chamada de Nuclear Receptor box (NR box), tipicamente presentes em correguladores de fatores de transcrição do tipo receptores nucleares. Duplo híbrido em levedura revelou o receptor nuclear Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR?) como potencial parceiro de interação da KGA. Neste trabalho, também por duplo híbrido, definiu-se que a interação ocorre entre o domínio N-terminal de KGA, que contém o NR box 1 (10LXXLL14) e, os domínios de ligação ao DNA e de ligação ao ligante (DBD/LBD) de PPAR?. Nossos dados mostram que a maior presença de PPAR? no citoplasma está relacionada com o menor estado proliferativo das linhagens de câncer de próstata. Além disso, estudos de imunofluorescência em células de câncer de mama e próstata mostraram que KGA e PPAR localizam-se na mitocôndria, resultado confirmado por fracionamentos celulares seguidos de immunoblotting. Por fim, estudos de q-PCR array mostraram que o aumento da expressão de KGA levou ao aumento da expressão de 4 genes e a diminuição da expressão de 1 gene alvo de PPAR?. Estes genes estão diretamente envolvidos ao consumo de fontes alternativas de energia ou diminuição de estresse oxidativos. Neste sentido a parceria entre KGA e PPAR? pode estar ligada a melhor capacidade de sobrevivência das células tumorais em condições de privação de nutrientes Abstract: Cellular processes are largely mediated by the interaction between proteins. Moreover, the same protein interactions with different partners may lead to distinct cell responses in nature, often involving processes not previously scheduled for the same. The glutaminases isoenzymes are responsible for the glutamine conversion into glutamate replenishing the tricarboxylic acid cycle (TCA) and supporting its operation and generation of metabolites essential for the synthesis of macromolecules having particular importance for various tumor types. The GLS gene codes for isoforms kidney-type glutaminase (KGA) and glutaminase C (GAC). Although they share the same catalytic domain KGA isoform has other distinct domains containing sequences consensus LXXLL type (L = leucine and X = any amino acid), also called Nuclear Receptor boxes (NR box) typically present in coregulators of transcription factors of the type nuclear receptors. Yeast two hibrid assays revealed the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR?) as a potential interaction partner of KGA. In this work, also by yeast two hybrid, it was defined that the interaction occurs between the N-terminal domain KGA that containing the NR box 1 (10LXXLL14) and domains of the DNA binding and ligand binding (DBD/LBD) of PPAR?. Our data showed that the increased presence of PPAR? in the cytoplasm is associated to a less proliferative state of prostate cancer cell lines, which was also obtained by overexpression of KGA. Moreover, in immunofluorescence studies of breast and prostate cancer cells, showed that KGA and PPAR? were localized in the mitochondria, which results was confirmed by cell fractionation followed by immunoblotting. Finally, studies with q-PCR array showed that the increased expression KGA led to upregulation 4 gene expression and downregulation expression 1 target gene of PPAR?. These genes are directly involved in the use of alternative energy sources or decreased oxidative stress. Accordingly, partnership between KGA and PPAR? may be linked to best survival capacity of tumor cells in nutrient deprivation conditions Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutora em Ciências FAPESP 2011/10127-2

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Sandra Martha Gomes Dias Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O fungo Moniliophthora perniciosa desperta grande interesse agroeconômico, pois é o agente etiológico da Vassoura-de-Bruxa do cacau. A cultura do cacaueiro é de grande importância no cenário nacional e na América Latina, sendo o entendimento dos mecanismos moleculares desta doença de grande valia. Durante a interação entre patógeno e hospedeiro, o primeiro produz moléculas para evadir ou alterar as respostas normais de defesa do segundo. O sequenciamento do genoma de M. perniciosa levou à identificação de proteínas-chave potencialmente envolvidas no processo patogênico do fungo, dentre as quais, estão: proteínas pertencentes à família das Cerato-plataninas (MpCPs), bem como proteínas pertencentes à família das Necrosis- and Ethylene-inducing Proteins (MpNEPs). As CPs são amplamente associadas à interação fungo-hospedeiro, agindo como toxinas, indutoras de resposta de defesa ou alergenos. As NEPs induzem morte celular e necrose em plantas dicotiledônes através da permeabilização da membrana celular. O objetivo desse projeto foi caracterizar funcionalmente as MpCPs e as MpNEPs, determinando assim sua relevância durante a Vassoura-de-Bruxa. A partir do transcriptoma de M. perniciosa e da análise filogenética das doze MpCPs encontradas, foi revelada uma correlação entre grupos de MpCPs e sua expressão diferencial ao longo da doença. Quatro MpCPs foram clonadas, expressas em sistema heterólogo e tiveram sua estrutura cristalográfica resolvida. Ensaios bioquímicos e biofísicos confirmaram que as MpCPs presentes em diferentes grupos filogenéticos apresentam capacidades distintas no tocante à interação com o açúcar N-acetilglicosamina e de formar agregados ordenados. Estudos funcionais indicaram que estas características estão potencialmente relacionadas ao bloqueio de resposta de defesa da planta e ao crescimento do fungo, respectivamente. Quanto às MpNEPs, somente a isoforma MpNEP2 foi detectada durante a Vassoura-de-Bruxa. A partir da estrutura cristalográfica dessa proteína e ensaios de mutação sítio-dirigida, foi identificado um hairpin hidrofóbico exposto ao solvente, possivelemte associado à ancoragem da MpNEP2 na membrana celular, o qual é tão importante quanto o sítio ativo da proteína para a atividade biológica da mesma Abstract: Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches' Broom Disease of cocoa and a major agroeconomic concern in Brazil and Latin America. In order to efficiently control this disease, it is crucial to understand the molecular basis underlying its progression. During the attack to the plant, a pathogen releases molecules to suppress or alter the regular defense response of the host. Results obtained from the genome sequencing of M. perniciosa lead to the identification putative virulence factors belonging to the Cerato-platanin protein family (MpCPs), and to the Necrosis- and Ethylene-inducing Proteins (MpNEPs). CPs are important to fungus-host interaction process, acting as toxins, defense response-inducing molecules or allergens. NEPs are toxin-like pore-forming proteins, which affect only dicot plants. This project aimed at the functional characterization of the MpCPs and MpNEPs, as well as understanding their importance for the Witches' Broom Disease progression. Twelve MpCP-coding genes were identified, and comprehensive transcriptome and phylogenetic analyses showed a correlation between MpCPs evolutionary clusters and their expression patterns throughout the disease. Four representative MpCPs had their crystal structure resolved. Biophysical and biochemical characterizations showed a correlation between the MpCP clusters, regarding sugar (N-acetylglucosamine) binding and protein self-assembling, which are possibly related to plant defense response suppression and hyphal growth, respectively. As for the MpNEPs, only the isoform MpNEP2 was shown to be expressed during the Whitches' Broom Disease. Its crystalloghaphic structure, along with site-directed mutagenesis and functional assays revealed that, besides the protein's active site, an hydrophobic hairpin exposed to te solvent is important to the necrosis-promoting activity, probably mediating the contact of MpNEP2 with the cell membrane Mestrado Genética de Microorganismos Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Diversos tipos celulares respondem ao estresse mecânico ativando sinais que culminam com remodelamento e sobrevivência. O estresse mecânico pode atuar como agente modulador da homeostase celular e de numerosos processos patológicos. Evidências sugerem que a Quinase de Adesão Focal (FAK) medeia a resposta de miócitos cardíacos ao estresse mecânico. Contudo, os mecanismos moleculares que regulam a função da FAK ainda não são totalmente conhecidos. No presente trabalho foi demonstrado que a small heat shock protein ?B-Cristalina interage de forma direta e protege a FAK da degradação pela calpaína 2. Ensaios de pull down, cross-linking acoplado a espectrometria de massas, mutagênese sítio dirigida, docking e modelagem molecular demonstraram que as ?-hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interage no sítio de ligação constituído pelas folhas ?4 e ?8 da ?B-Cristalina. Os dados funcionais e estruturais obtidos indicaram que ocorre um aumento da associação da ?B-Cristalina e o domínio FAT da FAK após mudanças conformacionais associadas com a fosforilação dependente de Src da tirosina 925. Experimentos de pull down demonstraram que a associação com a ?B-Cristalina protege a FAK da proteólise mediada pela calpaína 2. Miócitos cardíacos submetidos ao silenciamento gênico da ?B-Cristalina apresentaram uma menor quantidade de FAK detectada em 125 KDa, indicando que esta interação protege FAK da proteólise. A submissão dessas células ao estiramento cíclico revelou uma maior taxa de morte celular por apoptose, sendo que a superexpressão da FAK restaurou a viabilidade celular. Os achados deste trabalho indicam que o complexo formado entre FAK e ?B-Cristalina apresenta papel fundamental na proteção da FAK da proteólise durante o estresse mecânico, sendo importante na manutenção da sobrevivência celular Abstract: Cell types of diverse function respond to mechanical stress by triggering downstream signals for remodelling and survival. As such, mechanical stress impacts organismal homeostasis and numerous pathologic processes. Evidence suggests that focal adhesion kinase (FAK) mediates the responses of myocytes to mechanical stress, yet the molecular mechanisms to regulate FAK function are unclear. We find that FAK is recognized and protected from calpain-induced degradation by the small heat shock protein alpha-B crystalline (CryAB). A model based in the pull down, crosslinking technology coupled with mass spectrometry, site-directed mutagenesis, molecular docking and molecular modeling indicated that a cleft formed by ?4 and ?8 sheets of ?B-Crystalline is critical to the interaction with ?-helix 1 and ?-helix 4 of FAK. Functional and structural data indicated that CryAB binds directly the FAT domain of FAK upon changes in conformation associated with Src-dependent phosphorylation of tyrosine 925 induced by cell stretch. Pulldown assay indicated that ?B-Crystalline interacts and protects from calpain-induced degradation FAK. Cardiomyocytes depleted of CryAB show reduced FAK quantity detected in 125KDa, indicating that this interaction protects degradation of FAK. The submission of such cells to stretch cyclic revealed a higher rate of cell death via apoptosis, whereas restoration of FAK expression restored cell viability. Our findings highlight a new role for CryAB in forming a complex with FAK that is essential for regulating cardiomyocyte survival in response to mechanical stress Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Ciências

Orientador: José Andres Yunes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A leucemia linfóide aguda (LLA) é o câncer mais frequente na infância, e destas, 15% são do tipo T (LLA-T). A hiperativação da via PI3K/Akt tem sido amplamente descrita em tumores e em linhagens celulares de LLA-T. PTEN é o principal regulador negativo dessa via e frequentemente encontra-se inativado em cânceres humanos. Com frequência, pacientes com LLA-T apresentam mutações ativadoras de NOTCH1. NOTCH1 pode regular transcricionalmente PTEN, contudo ainda não está claro como as mutações ativadoras de NOTCH1 influenciariam a expressão de PTEN nas LLA-T. Nós encontramos uma ocorrência de 11 (17,7%) mutações no éxon 7 do PTEN em 62 casos de LLA-T estudados consecutivamente. Contudo, nenhuma mutação foi encontrada na análise de 71 casos de LLA-B derivada. A maioria das mutações de PTEN apresentavam inserções/deleções de mais de 3 nucleotídeos. Não encontramos associação entre mutações em PTEN e o gênero, a idade e a contagem de glóbulos brancos ao diagnóstico. Pacientes com alterações no PTEN apresentaram uma tendência a pior sobrevida global (OS, p=0.07). Dentre os pacientes de LLA-T classificados como alto risco (n=56), aqueles possuindo anormalidades no PTEN mostraram-se associados significativamente a menor OS (p=0.019) e sobrevida livre de leucemia (LFS 47% vs 76%; p=0.045). As curvas de LFS foram significativamente diferentes (p=0.003), mesmo considerando apenas pacientes que atingiram a remissão no dia 28 do tratamento para a análise. Nosso estudo também mostrou que pacientes com mutações em NOTCH1 apresentavam aumento na transcrição de MYC e menor expressão de PTEN mRNA comparados a pacientes com NOTCH1 selvagem. Nós recentemente demonstramos que células de LLA-T apresentavam fosforilação de PTEN mediada por CK2, resultando na estabilização e consequentemente inativação da proteína PTEN. Corroborando ao estudo anterior, os casos de LLA-T analisados, independente do status de mutação em NOTCH1, expressam níveis significativamente mais altos de proteína PTEN do que controles normais. Para avaliar o impacto da regulação transcricional de NOTCH e a inativação postranscricional por CK2 de PTEN, nós tratamos as células de LLA-T com inibidores de gamma-secretase (DAPT e de CK2 (DRB/TBB). Nosso estudo enfatiza a relevância biológica e clínica da regulação do PTEN em LLA-T. E sugerimos o uso combinado de inibidores de gamma-secretase e CK2 devem possuir potencial terapêutico nas LLA-T Abstract: T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) accounts for approximately 15% of pediatric ALL. Patients with T-ALL are at increased risk of relapse compared with children treated for B-cell precursor ALL. Mutations in the phosphatase and tensin homolog (PTEN) gene leading to PTEN protein deletion and subsequent activation of the PI3K/Akt signaling pathway are common in cancer. PTEN is the main negative regulator of the PI3K/Akt survival pathway. T-ALL patients frequently display NOTCH1 activating mutations and Notch can transcriptionally down-regulate the tumor suppressor PTEN. However, it is not clear whether NOTCH1 mutations associate with decreased PTEN expression in primary T-ALL. We report that PTEN exon 7 mutations occurred in 11 (17.7%) out of 62 consecutive pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) but in none of 71 precursor B-ALL patients. Most PTEN mutations were insertions/deletions of more than 3 nucleotides. No associations were found between PTEN mutation and age, gender, WBC at diagnosis, early response to therapy and remission rate. Patients with PTEN mutation (n=11) had a tendency toward worse overall survival (OS, p=0.07). Remarkably, PTEN mutations were significantly associated with lower OS (p=0.019) and leukemia-free survival (LFS 47% vs 76%, p=0.045) within patients classified in the high risk group (n=56). LFS curves were significantly different (p=0.003) even if only patients who reached remission on day 28 were considered for analysis. We compared patients with or without NOTCH1mutations and report that the former presented higher MYC transcript levels and decreased PTEN mRNA expression. We recently showed that T-ALL cells frequently display CK2-mediated PTEN phosphorylation, resulting in PTEN protein stabilization and concomitant functional inactivation. Accordingly, the T-ALL samples analyzed, irrespectively of their NOTCH1 mutational status, expressed significantly higher PTEN protein levels than normal controls. To evaluate the integrated functional impact of NOTCH transcriptional and CK2 post-translational inactivation of PTEN, we treated TALL cells with both the gamma-secretase inhibitor DAPT and the CK2 inhibitors DRB/TBB. Our data suggest that combined use of gamma-secretase and CK2 inhibitors may have therapeutic potential in T-ALL. And emphasize the biological and clinical relevance of PTEN regulation in pediatric T-ALL Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Jörg Kobarg Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O objetivo deste projeto foi estudar genes ativados em células do estroma da medula óssea, induzidos pela co-cultura com blastos leucêmicos, na tentativa de uma melhor compreensão sobre o crostalk entre estas células no microambiente tumoral. Nós identificamos Stanniocalcina-1 (STC1) como um potencial marcador molecular do microambiente tumoral, uma vez que sua expressão foi aumentada cerca de 7 vezes em células do estroma co-cultivadas com blastos leucêmicos primários. STC1 humana é uma glicoproteína secretada e tem sido descrita participando em diferentes processos fisiológicos, incluindo a angiogênese, hipóxia e principalmente, a carcinogênese. Nós produzimos a proteína recombinante STC1 no sistema baculovírus e também anticorpos monoclonais, usados em um ensaio ELISA, que agora será testado como um novo kit de diagnóstico de leucemia por uma empresa brasileira. Além disso, identificamos novos parceiros de interação para STC1 através do sistema de duplo hibrido em levedura sendo que algumas destas interações foram confirmadas por GST-pull down. A região Nterminal foi identificada como sendo a região responsável pela interação de STC1 com seus parceiros. Estudos de localização sub-celular por microscopia, revelaram uma deposição ubíqua citoplasmática e puntiforme nuclear, lembrando corpúsculos nucleares relacionados a SUMOilação. Embora STC1 interaja com a proteína SUMO1 e tenha uma predição de alta probabilidade para ser SUMOilada, ensaios in vitro e in vivo não conseguiram detectar STC1 SUMOilada. No entanto, observamos que STC1 regula a SUMOilação de forma significativa em três outras proteínas. Essas descobertas sugerem um novo papel para STC1 no ciclo de SUMOilação, agindo como uma SUMO E3 ligase. Observamos também que STC1 possui um receptor na membrana plasmática em linhagem de células leucêmicas K562 e que a incubação de STC1 com outras células leucêmicas parece favorecer a proliferação destas células ao passo que estimula uma maior produção da própria STC1 intracelular em células do estroma. Juntos, todos estes resultados abrem novas pistas promissoras a serem exploradas no futuro, uma vez que todos os resultados mostram ligações interessantes com estudos funcionais anteriores em STC1 Abstract: The aims of this project is to study upregulated genes on bone marrow stromal cells, induced by the co-culture with leukemic blasts, trying to have a better understand about the crosstalk between these cells in the tumor microenvironment. We identified Stanniocalcin-1 (STC1) as a putative molecular marker for the leukemic microenvironment, once its expression was increased around 7 times in stromal cells co-cultivated with primary leukemic blasts. Human STC1 is a secreted glycoprotein that has been implicated in different physiological process, including angiogenesis, hypoxia and mainly in carcinogenesis. We produced the recombinant protein STC1 in baculovirus system and monoclonal antibodies for an ELISA assay that now will be tested as a new leukemia diagnostic kit by a Brazilian company. Moreover, we identified new interacting protein partners for STC1 by yeast two hybrid system and some of these interactions were confirmed by GST-pull down assays. The N-terminal region was mapped to be the region that mediates the interaction between STC1 and its partners. Microscopic subcellular localization, revealed an ubiquitous cytoplasmic and dot-like nuclear deposition, resembling SUMOylation related nuclear bodies. Although STC1 interacts with SUMO-1 and has a high theoretical prediction score for a SUMOylation site, in vitro and in vivo assays could not detect STC1 SUMOylation. However, we found that STC1 significantly regulates the SUMOylation of three other proteins. These ??ndings suggest a new role for STC1 in SUMOylation cycle, acting as a SUMO E3 ligase. We either observe that STC1 has a plasmatic membrane receptor in K562 leukemic cell lines and the incubation of STC1 with other leukemic cells suggest a increase of proliferation of these cells and stimulates the production of more intracellular STC1 at stromal cells. Together, all of these findings open promising new avenues to be explored in future detailed studies, since they all show interesting connections with previous functional studies on STC1 Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular