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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As leishmanioses são doenças que afetam indivíduos em cinco continentes, sendo endêmicas em 98 países, incluindo o Brasil. A cada ano são reportados oficialmente 58.000 novos casos de leishmaniose visceral (LV) e 220.000 novos casos de leishmaniose cutânea. A espécie Leishmania amazonensis é um dos agentes causadores das leishmanioses, podendo levar a uma ampla variedade de manifestações clínicas da doença. O objetivo desse estudo foi analisar a relação entre o cultivo axênico de L. amazonensis por longos períodos de tempo e a variação da capacidade infectiva dos parasitas, no intuito de identificar proteínas que possam estar envolvidas nesse processo. Para isso, parasitas em fase estacionária foram cultivados por 150 dias e amostras foram coletadas a cada 50 dias. As amostras foram utilizadas para avaliar a infecciosidade dos parasitas por meio de experimentos in vitro e in vivo, e para uma caracterização proteômica. Em relação aos resultados obtidos, após a realização da eletroforese bidimensional, 315 spots apresentaram variação de intensidade ao longo do cultivo, sendo que 258 spots foram identificados por espectrometria de massa. Das 56 proteínas selecionadas, 37 e 19 apresentaram diminuição ou aumento significativo de sua expressão, respectivamente, ao longo do cultivo. Dessas proteínas, cinco tiveram sua variação de expressão validada por Immunoblotting. As análises da eletroforese bidimensional associada com a espectrometria de massas e estudos por bioinformática indicaram que a diminuição de infecciosidade em parasitas cultivados por longos períodos sob condições axênicas pode ser ocasionada pelo controle de vias metabólicas específicas, da atuação de proteínas envolvidas no sistema redox do parasita, ou de proteínas do citoesqueleto. As informações apresentadas nesse estudo podem contribuir para um melhor entendimento dos processos biológicos envolvidos com a diminuição da infecciosidade de L. amazonensis quando submetida a culturas axênicas por longos períodos de tempo. Essas descobertas representam uma contribuição para o descobrimento de novos candidatos vacinais, agentes para diagnóstico e/ou alvos imunoterapêuticos contra as leishmanioses, usando as proteínas conhecidas e/ou hipotéticas que apresentaram variação significativa de sua expressão ao longo das culturas axênicas. Leishmaniasis is an endemic disease that affects people in five continents and 98 countries, including Brazil, being officially reported 58,000 new cases of visceral leishmaniasis and 220,000 new cases of cutaneous leishmaniasis each year. Leishmania amazonensis , a causative agent of leishmaniasis, can cause a wide variety of clinical manifestations of the disease. The aim of this study was to analyzethe relationship between the L. amazonensis axenic cultivation for long periods with the infectivity ability of the parasite in order to identify proteins that may be involved in this process. For that purpose, L. amazonensis stationary phase was grown for 150 days and aliquots were collected every 50 days, been used to analysis of of infectivity of the parasite by in vitro and in vivo experiments, and to proceed with proteomic characterization. After 2-DE, from the 315 spots with variation in intensity throughout the cultivation, 258 were identified by mass spectrometry. From the 56 selected proteins, 37 have possible decreased of expression over the passages and 19 different proteins showed possible increased of expression during the parasite cultivation. The expression variation of five of these proteins was validated by Immunoblotting. Twodimensional electrophoresis associated with mass spectrometry and bioinformatics analyzes showed that loss of infectivity observed in cultured parasites for prolonged periods under axenic conditions may be caused by the control of specific metabolic pathways, as well as by the control of the performance of the proteins involved with the parasite redox system or by changes in cytoskeletal proteins. The information presented in this study may help to a better understanding of biological processes involved in the reduction of infectivity of L. amazonensis when subjected to axenic cultures for long periods of time. Moreover, these findings may represent a contribution to the elucidation of novel vaccine candidates, diagnostic agents and / or immunotherapeutic targets against the parasite-induced disease, using known and hypothetical proteins with significant changes in their expression along the axenic cultures.

O Trypanosoma cruzi e considerado um dos eucariotos mais resistentes a Radiação ionizante, suportando doses sub-letais de ate 1,0 kGy. A radiação ionizante do tipo gama promove a quebra das fitas simples e duplas do DNA, além de gerar espécies reativas de oxigênio (ROS). Apos a irradiação, os parasitos cessam o seu crescimento por ate 96 horas, retomando-o em seguida e atingindo a fase estacionaria em ate 240 horas apos irradiação. O padrão de bandas cromossomais, que são extensamente fragmentadas pela radiação, e restabelecido cerca de 48 horas apos o estresse. Para tolerar tais danos, e necessário um eficiente aparato de reconhecimento e reparo de lesões. Neste trabalho, investigamos a radioresistencia em T.cruzi, mediante a análise do seu perfil de expressão protéica e da sua atividade mitocondrial em diferentes tempos apos uma dose de 500 Gy de radiação gama. Utilizando a metodologia 2D-DIGE, foram encontrados 543 spots protéicos diferencialmente expressos apos a exposição do T. cruzi a radiação. A partir destes spots, 53 proteínas foram identificadas por espectrometria de massas (MS/MS) e classificadas de acordo com sua função biológica. Analisando a anotação funcional das 53 proteínas, observamos uma tendência para a superexpressão de proteínas com peso molecular abaixo do predito. Esta tendência indica a possível existência de modificações pos-traducionais e/ou de mecanismos de processamento das proteínas identificadas, que geraria polipeptídios mais curtos do que o predito em resposta a radiação gama. Outras tendências observadas em nossas analises de proteômica incluem alterações nos seguintes processos biológicos: regulação positiva do processo de síntese de proteínas, repressão de proteínas envolvidas no processo de enovelamento (exceto pela indução de duas chaperonas do retículo endoplasmático), repressão das vias de geração de ATP por fosforilação oxidativa, da glicolise, e do metabolismo de aminoácidos. Nossos resultados também indicam que a síntese protéica de#novo e essencial para a recuperação do T. cruzi apos o estresse por exposição a radiação gama, pois o tratamento com inibidores de tradução interfere drasticamente no retorno ao crescimento dos parasitos irradiados. Ao avaliarmos a atividade mitocondrial de T. cruzi, xvi! verificamos que parasitos irradiados produzem mais ATP do que parasitos não irradiados, alem de consumirem mais O2. Adicionalmente, a análise da expressão gênica de T. cruzi irradiado por qRT-PCR mostrou que os genes do maxicírculo mitocondrial foram induzidos apos a irradiação. Ambos os resultados indicam uma maior atividade da mitocôndria apos o estresse. Entretanto, observamos uma menor produção de H2O2 nos parasitos irradiados, indicando assim a existência de um mecanismo eficiente de eliminação de radicais livres. O presente estudo revela a resposta peculiar de T. cruzi a radiação ionizante e suscita questionamentos pertinentes sobre como este organismo e capaz de modificar seu perfil de expressão protéica e sua atividade mitocondrial para possibilitar a sobrevivência em condições tão adversas. The Trypanosoma cruzi is considered as one of the eukaryotes most resistant to ionizing radiation, enduring sub-lethal doses of up to 1.0 kGy. The ionizing radiation by gamma rays promotes double-strand and single-strand breaks on the DNA and, additionally, generates reactive oxygen species (ROS). After irradiation the parasites cease growing for as long as 96 hours, further resuming growth and reaching the stationary phase no later than 240 hours after irradiation. The pattern of chromosomal bands which are extremely fragmented by radiation exposure is restored approximately 48 hours after the stress. To enable the parasite to tolerate such damage condition, an efficient apparatus to recognize and repair lesions is necessary. In the present work we investigate T. cruzi radioresistance by analyzing its protein expression patterns and mitochondrial activity in different time points after a dose of 500 Gy of gamma rays. Using the 2DTDIGE methodology, 543 spots were identified as significantly differentially expressed after T. cruzi exposure to radiation. From these 543 spots, 53 different proteins were identified by mass spectrometry (MS/MS) and classified according to biological function. When the functional annotation of these 53 proteins was analyzed, a tendency of overexpression of proteins with molecular weight lower than predicted was observed. This tendency suggests the presence of post-translational modifications and/or processing mechanisms acting upon the identified proteins, leading to the emergence of peptides which are shorter than predicted in response to gamma radiation exposure. Other tendencies observed on proteomic analysis include alterations on the following biological processes: positive regulation of the protein synthesis process, repression of proteins involved with folding processes (except for two endoplasmic reticulum chaperones, which are induced), repression of ATP generation through oxidative phosphorylation, of glycolysis, and of the amino acids metabolism. Our results also indicate that the de novo protein synthesis is essential for T. cruzi recovery from gamma radiation exposure, since the treatment with translation inhibitors drastically interferes with the growth resumption on irradiated parasites. When the mitochondrial activity of T. cruzi xviii was evaluated, we verified that irradiated parasites generate higher levels of ATP than their non-irradiated counterparts, with an associated higher O2 consumption by the former. Additionally, the gene expression analysis of irradiated T. cruzi using qRT-PCR showed that genes from the mitochondrial maxicircle were induced after radiation exposure. Both of these results point to a higher mitochondrial activity after irradiation-caused stress. Nevertheless, we have also observed a lower H2O2 production by irradiated parasites, thus indicating the existence of an efficient mechanism for free radicals clearance in the organism. The present study unravels the peculiar response of T. cruzi to ionizing radiation and evokes questions about the manner in which this organism is capable of performing drastic changes on its protein expression profile and mitochondrial activity to enable its survival in such adverse conditions.

O conhecimento da estrutura tridimensional de enzimas nos permite determinar seus mecanismos de ação, atuar de forma orientada na estrutura destas moléculas e, eventualmente, alterar propriedades físico-químicas objetivando alguma aplicação biotecnológica específica,além de contribuir para o conhecimento básico da relação estrutura-função de proteínas. As enzimas cis-naftaleno dihidrodiol desidrogenase (NahB) e salicilato hidroxilase (NahG) dePseudomonas putida G7 estão envolvidas na degradação do naftaleno, um hidrocarboneto aromático policíclico (HAPs). A maioria dos HAPs são tóxicos, mutagênicos e carcinogênicos. A biorremediação é uma estratégia para a eliminação dos HAPs do meio ambiente, a qual utiliza enzimas ou microorganismos que possuem a capacidade de metabolizar esses compostos e transformá-los em substâncias menos tóxicas. No presente trabalho foram feitas a caracterização estrutural da proteína NahB e as caracterizações bioquímica e estrutural da NahG. Os genes nahB e nahG foram clonados e expressos em células de Escherichia coli RosettaTM (DE3) cultivadas a 18º C por 16 horas. A análise do pellet e do sobrenadante revelou que as proteínas estavam na fração solúvel. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. A proteína NahB recombinante apresenta massa molecular de 29,5 kDa e foi denominada 6xHis- NahB, a NahG recombinante possui massa molecular de 48,9 kDa e foi denominada 6xHis- NahG. Para obter as proteínas corretamente enoveladas, estáveis e monodispersas foramtestados diferentes protocolos de lise celular e de purificação, além da adição de ligantes. Após otimização, foram obtidos cristais de ambas as proteínas, os quais foram submetidos à difração de raios-X. Um cristal da 6xHis-NahB difratou até 1.64 Å e sua estrutura foi resolvida pelo método de Substituição Molecular. A enzima 6xHis-NahB apresenta o clássico motivo de Rossman de ligação de nucleotídeo, formado por uma folha beta central constituída por sete fitas- e por nove -hélices, sendo que são 3 hélices de cada lado flanqueando a folha beta. Para resolução da estrutura tridimensional da 6xHis-NahG foi utilizado o método dos átomos pesados. Um cristal nativo da enzima 6xHis-NahG difratou até 2.20 Å e um cristal derivado com iodo até 2.00 Å. Esta enzima foi caracterizada pela presença de três folhas beta constituída por oito, quatro e três fitas- e por quatorze -hélices, sendo estruturalmente similar a outras hidroxilases dependentes de FAD. A 6xHis-NahG converte ácido salicílico em catecol via hidroxilação descarboxilativa e os valores de KM para a enzima sem cauda de seis histidinas foram 27,31; 1,26 e 22,74 M para o substrato ácido salicílico e para as coenzimas FAD e NADH, respectivamente. The three dimensional structure of enzymes allows us to determine their action mechanism, to act in a targeted manner in the structure of these molecules and eventually change physicochemical properties in favor of any specific biotechnological applications, and contribute to a basic understanding of the proteins structure-function. cis-Naphthalenedihidrodiol dehydrogenase (NahB) and salicylate hydroxylase (NahG) enzymes from Pseudomonas putida G7 are involved in degradation of naphthalene, a polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH). Most PAHs are toxics, mutagenics and carcinogenics. Bioremediation is a strategy for the removal of PAHs from the environment, which uses enzymes ormicroorganisms that have the ability to metabolize these compounds and turn them into less toxic substances. In the present study the structural characterization of the NahB protein and the biochemical and structural characterizations of NahG were done. The nahB and nahG genes were cloned and expressed in Escherichia coli RosettaTM (DE3) cells at 18° C for 16 hours, leading to expression of the enzymes in the soluble fraction. The recombinant proteins were purified by affinity and molecular exclusion chromatographies. In order to obtain folded, stable and monodisperse proteins, different protocols for cell lysis and purification were tested, besides the addition of ligands. After optimization, protein crystals of both enzymes were obtained and analyzed using a X-ray diffraction experiment. 6xHis-NahB crystal diffracted to 1.64 Å and its structure was solved by the Molecular Replacement method. The6xHis-NahB enzyme has the classic Rossman motif of nucleotide binding, comprising a central beta-sheet consisting of seven -strands and nine -helices, having three helices each side flanking the -sheet. The heavy atoms method was used to solve the 6xHis-NahG threedimensional structure. A native crystal of the 6xHis-NahG enzyme diffracted to 2.20 Å and an iodine derivative to 2.00 Å. This enzyme is characterized by the presence of three -sheets composed of eight, four and three -strands and fourteen -helices, and is structurally similarto other FAD-dependent hydroxylases. The 6xHis-NahG converts salicylic acid to catechol by descarboxylative hydroxylation and KM values of the enzyme without six histidines tag were 27.31, 1.26 and 22.74 M for the substrate salicylic acid, FAD and NADH coenzymes, respectively.

Estudos sobre a cristalização em extratos biológicos realizados em meados do século XIX contribuíram para a descoberta das proteínas. Na segunda metade do século XX foram desenvolvidas técnicas da Biologia Molecular que possibilitam a produção em larga escala de proteínas e a difração de raios X tornou-se a principal ferramenta de investigação de estrutura destas moléculas. Desde os primeiros experimentos até os dias atuais, o processo de cristalização tem sido o grande gargalo para a realização de estudos estruturais de proteínas. Os protocolos de cristalização utilizados atualmente consistem em misturar um conjunto de soluções de precipitantes, aditivos e soluções tampão com a solução de proteína para promover a cristalização, desprezando diversos parâmetros físicos. Amostras cristalinas são obtidas por tentativa e erro e com grande taxa de irreprodutibilidade. O objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos da temperatura no processo de cristalização de proteínas. Foram realizados ensaios de cristalização com a proteína lisozima em diferentes temperaturas nos quais foram observados uma dramática mudança de regime de crescimento, com impacto sobre o número e tamanho médio de cristais obtidos acima e abaixo de 12oC. Para avaliar a influência da temperatura na dinâmica de formação dos cristais de lisozima, foram realizados ensaios de cristalização com monitoramento in situ pela técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS). Esta técnica permitiu determinar o tamanho médio dos agregados de proteínas em solução durante a cristalização. Os resultados obtidos indicam que a temperatura não altera a evolução temporal das raios dos agregados e que a quantidade deles em solução é maior para temperaturas mais baixas. Cristais obtidos em diferentes temperaturas foram analisados utilizando difração de raios X e as estruturas obtidas não apresentaram nenhuma mudança relevante. Ainda há lacunas nas teorias que descrevem a dinâmica do processo de cristalização de proteínas que justificam estudos posteriores sobre este fenômeno visando, sobretudo, a elaboração de protocolos de cristalização mais assertivos. Studies on crystallization in biological extracts made in the mid-nineteenth century contributed to the discovery of proteins. In the second half of the twentieth century Molecular Biology techniques enabled large-scale production of proteins and X-ray diffraction became the main tool for the investigation of protein structure. From the earliest experiments to the present day, the crystallization process has been the major bottleneck to structural studies of proteins. The current crystallization protocols consist of mixing the precipitating agents, buffers, and additives to the protein solution to promote crystallization discarding various physical parameters. Crystalline samples are obtained by trial and error and with a great rate of non-reproducibility. The aim of this work was to study the effects of the temperature on the protein crystallization process. Crystallization trials with the protein lysozyme at different temperatures showed change of the growth regime, with a remarkable change in the number and in the average size of crystals obtained above and below 12oC. In order to study the influence of temperature on the dynamics of the formation of crystals of lysozyme, crystallization trials with the in situ monitoring by Dynamic Light Scattering technique (DLS) were performed. This technique allowed the determination of the average size of the protein aggregates in solution during crystallization. The results indicated that the temporal evolution of the radii of the aggregates is not affected by temperature. However the amount of aggregates in solution is higher for lower temperatures. Crystals obtained at different temperatures were finally analyzed by X-ray diffraction techniques and the structures obtained did not show any significant change. There are still gaps in the theories that describe the dynamics of the protein crystallization process that justify further studies of this phenomenon, targeting above all, more assertive crystallization protocols.

As redes corporativas atuais são compostas de diversos equipamentos e aplicações. O aumento da escala de uma rede corporativa faz com que as interações entre as aplicações se tornem mais complexas e envolvam diversos elementos de hardware e software, como: enlaces, switches, roteadores, servidores e sistemas operacionais. Consequentemente, determinar corretamente quais elementos foram utilizados no processamento de uma requisição nesse ambiente se torna uma tarefa extremamente desafiadora. Diferentes técnicas de como determinar os elementos de hardware e software utilizados no processamento das requisições foram propostas na literatura. Esses elementos são agrupados em um conjunto denominado caminho causal. As técnicas de construção de caminhos causais são incorporadas em ferramentas de detecção de anomalias. Essas ferramentas detectam falhas ou sobrecargas nos elementos dos caminhos causais. Além disso, essas ferramentas são divididas em dois grandes grupos: as intrusivas e as não intrusivas. A principal diferença entre os grupos é que nas intrusivas as aplicações precisam ser modificadas para se inserir informações de controle, enquanto nas não intrusivas não há essa necessidade. O objetivo comum, entretanto, é mapear o caminho causal de uma requisição. Todas as ferramentas de construção de caminhos causais e, consequentemente, para detecção de anomalias até então conhecidas foram concebidas para a arquitetura atual da Internet. Essa arquitetura tem sido fortemente criticada por ser de difícil alteração e evolução, sendo inclusive rotulada de ossificada por alguns pesquisadores. O novo paradigma de Rede Definida por Software (SDN - Software Defined Network) foi proposto para contornar os problemas da arquitetura atual da Internet. SDN proporciona a dissociação entre o plano de controle e o plano de dados, permitindo que elementos externos de software exerçam funções do plano de controle e alterem o comportamento do plano de dados. Este trabalho propõe S-Trace, uma ferramenta não intrusiva de construção de caminhos causais que explora aspectos positivos das ferramentas de construção de caminhos causais e de detecção de anomalias intrusivas e não intrusivas, além da separação de planos fornecida por SDN. S-Trace intercepta chamadas de função de bibliotecas para correlacionar os eventos de comunicação inter-processo (IPC - Inter-Process Communication) utilizados ao processar uma requisição. Além disso, S-Trace explora a separação de planos de SDN para realizar a reprodução de tráfego de rede e, assim, aprimorar os caminhos causais construídos. Os resultados da avaliação mostram que S-Trace constrói caminhos causais corretamente, capturando o comportamento das aplicações ao processar as requisições. A avaliação utilizou duas aplicações que abrangem grande parte dos diferentes modelos de implementação utilizados pelas aplicações distribuídas de rede. Durante a avaliação, S-Trace foi capaz de construir caminhos causais mesmo na presença de falhas e de dispositivos NAT que modificam os endereços IP das conexões das requisições, fatores que dificultam significativamente a construção dos caminhos. ABSTRACT - Today’s enterprise networks are composed of several devices and applications. The increase in scale of an enterprise network makes the interactions between applications more complex because they may include a significantly large number of hardware and software elements, such as links, switches, routers, servers and operating systems. Consequently, correctly determining the elements used in processing a request in this environment becomes an extremely challenging task. Several techniques to determine the hardware and software elements used to process a request have been proposed in the literature. These elements are grouped into a set called causal path. Techniques for building causal paths are incorporated in anomaly detection tools in order to detect faults and overloads on elements of the causal paths. These tools are divided into two major groups: intrusive and non-intrusive. The main difference between the groups is that the intrusive tools modify applications to insert control information, while non-intrusive ones do not. However, the common goal is to build the causal path of a request. Tools for building causal paths and, consequently, detecting anomalies were designed for the current Internet architecture. This architecture has been heavily criticized for being difficult to change and evolve, even being labeled as “ossified” by some researchers. The new paradigm of Software Defined Networking (SDN) was proposed to overcome the problems of the current Internet architecture. SDN provides a decoupling between control and data planes, allowing external software elements to perform functions of the control plane and to modify the behavior of the data plane. This paper proposes S-Trace, a non-intrusive tool for building causal paths that explores the positive features of intrusive and non-intrusive tools for anomaly detection and the separation of planes provided by SDN. S-Trace intercepts library function calls to correlate Inter-Process Communication (IPC) events used to process a request. Moreover, S-Trace explores the control and data plane decoupling of SDN to replay network traffic for improving the causal paths constructed. The evaluation results show that S-Trace builds correct causal paths which capture the behavior of the applications during the processing of a request. The evaluation uses two applications that cover a large spectrum of implementation models used for building distributed applications. During evaluation, S-Trace was able to build the causal paths even with fault injection and in the presence of techniques that modify the IP addresses of a connection like NAT, issues that make the building process much harder.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-12T18:55:33Z No. of bitstreams: 1 Mauricio Gabriele.pdf: 1281603 bytes, checksum: 3c8170f77773637b426fe466cc74c7c7 (MD5) Made available in DSpace on 2016-05-12T18:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mauricio Gabriele.pdf: 1281603 bytes, checksum: 3c8170f77773637b426fe466cc74c7c7 (MD5) Previous issue date: 2013-12-18 The present study aims at analyzing the relation involving the judiciary crisis, the access to justice and the notarial protest, proposing a careful thought on each of these issues. At first, it analyses the judiciary crisis rationalizing the fact that this crisis is beyond the judiciary powers, and that it is already involving the State and the society as well, thus one may affirm that the judiciary on its own will not be able to find a solution. Hence, there is the need to search other means to do deal with this issue and especially alternative means for solving conflicts. Secondly, it analyses the crisis of reaching justice, originated by the judiciary crisis itself, it is proposed a re-interpretation of the institute aiming at clarifying the difference between access to justice and access to the judiciary system, taking into consideration the existing alternative means to solve conflicts. At last, it analyses the characteristics and the operation of notarial protest, in order to verify its capacity, as an alternative mean of solving conflicts, thus helping the judiciary system as well as easing the access to justice. In the very end, it presents statistics and data concerning notarial protest in Brazil. It confirms the first hypothesis of this work, which affirms that the protest itself is a great tool in solving conflicts, and one of the consequences of its daily use is the easing of a clogged judiciary system. Combining these thoughts, it is likely to conclude that notarial protest is an effective alternative and sui generis mean of conflict solving. The present study is based on qualitative and quantitative data as well as on previous studies over the subject matter, culminating at its conclusion by an inductive research approach. O presente estudo tem por objetivo analisar a relação que pode ser legitimamente estabelecida entre a crise do Judiciário, o acesso à justiça e o protesto notarial, propondo uma reflexão sobre cada um desses três objetos. Primeiramente, analisa-se a crise do Judiciário ponderando que esta transcendeu os limites deste Poder, envolvendo todo o Estado e a Sociedade; assim, considera-se que o Judiciário, por si só, não poderá sanear sua crise devendo-se buscar subsídios em outros seguimentos, dos quais se destacam os meios alternativos para solução de conflitos. Em seguida, analisa-se a crise de acesso à justiça, motivada pela própria crise do Judiciário, e procura-se uma releitura deste instituto a fim de diferenciar o acesso à justiça do acesso ao Judiciário, que, muitas vezes, pode ser propiciado por meios alternativos de solução de conflito. Foram analisadas as características e operacionalidade do protesto notarial, com o propósito de verificar seu potencial enquanto meio alternativo de solução e pacificação de conflitos, socorrendo, assim o Judiciário e o acesso à justiça, e promovendo a desjudicialização de litígios. Por fim, apresenta estatísticas da experiência de protesto no Brasil, as quais confirmam a hipótese deste trabalho, em dizer, ao final que, constitui-se o protesto em importante ferramenta para a solução de conflitos e, por consequência, para desafogar (e agilizar) o Judiciário, perfazendo-se como um método alternativo sui generis de solução de conflitos. O presente trabalho serviu-se de pesquisa bibliográfica e empírica, com estatísticas, utilizando-se do método indutivo.

O objetivo deste trabalho é mostrar a estrutura de semigrupos numéricos e suas características, mostrando a finalização destes em uma P:A: (progressões aritméticas).Em seguida mostrar a curiosidades de alguns semigrupos e realizar muitos exemplos para facilitar o entendimento desta estrutura. Por fim mostramos a estrutura para generalizar o número de Frobenius em alguns semigrupos e para a quantidade de elementos presente nos semigrupos até a chegada deste número. The objective of this work is to show the structure of numerical semigroups and their characteristics, showing the completion of these in a P:A: (arithmetic progressions). Then we show the curiosities of some semigroups and many examples to facilitate understanding of this structure is presented. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Estudamos uma classe de campos de vetores seccionalmente lineares no plano denotada por X. Tais campos aparecem frequentemente em modelos matemáticos aplicados à engenharia. Baseados no trabalho de J. Sotomayor e R. Garcia [SG03], impondo condições sobre as singularidades, órbitas periódicas e separatrizes, definimos um conjunto de campos de vetores que são estruturalmente estáveis em X. Provamos que esse conjunto é aberto, denso e tem medida de Lebesgue total em X, o qual é um espaço vetorial de dimensão finita. We study a class of piecewise-linear vector fields in the plane denoted by X. These vector fields appear often in mathematical models applied to Engineering. Based on Jorge Sotomayor and Ronaldo Garcia paper [SG03], we impose conditions on singularities, periodic orbits and separatrices, to define a set of vector fields structurally stable in X. We give a proof that this set is open, dense and has full Lebesgue measure in X, that is a finite dimensional vector space.

Neste trabalho estudamos as linhas assintóticas na vizinhança de um ponto singular, as linhas de curvatura na vizinhança das curvas de pontos singulares das frentes de ondas do elipsóide e as linhas de curvatura na vizinhança dos pontos umbílicos Darbouxianos das frentes de ondas de uma superfície regular. In this work we study asymptotic lines in the neighborhood of a singular point, lines of curvature in the neighborhood of singular curves of ellipsoid wave fronts and the lines of curvature in the neighborhood of the Darbouxian umbilic points. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A cristalografia de raios-X, em relação ao número de estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB), é o método mais utilizado para se obter informações estruturais de macromoléculas biológicas. Tais informações são úteis para o entendimento dos sistemas biológicos dos quais essas macromoléculas participam. Nesse trabalho, duas proteínas com interesse biotecnológico foram estudadas do ponto de vista bioquímico e estrutural: a proteína antigênica Pb27 de Paracoccidioides brasiliensis e a enzima NahF de Pseudomonas putida. O fungo P. brasiliensis é o agente causador de uma das mais importantes micoses sistêmicas do Brasil, a paracoccidioidomicose (PCM) e a proteína Pb27, apesar de já ter sido utilizada com alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico e como adjuvante no tratamento da PCM, tem sua função ainda desconhecida e não apresenta proteínas similares com estrutura terciária resolvida. Com o intuito de resolver sua estrutura por cristalografia de raios-X, a proteína Pb27 recombinante (Pb27r) foi expressa em bactérias E. coli BL21(DE3) e purificada por cromatografia de afinidade e gel filtração de onde eluiu com volume equivalente a um monômero (24 kDa após remoção da cauda de histidinas N-terminal). Estudos de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e dicroísmo circular (CD) mostraram essa proteína estava monodispersa e enovelada. Cristais da Pb27 foram obtidos em MgCl2 0,25 M, PEG 4000 25%, Tris-Cl 100 mM pH 7,0, com grupo espacial P212121 e difrataram com resolução de 1,9 Å. Para a obtenção de cristais derivados para a resolução da estrutura da Pb27r por espalhamento anômalo ou substituição isomórfica, foram realizados soaking e co-cristalização com sais de átomos pesados (NaI, CsCl, GdCl3, sais de Hg e Pt) além de marcação com Se-Met, no entanto, ainda não foram obtidos cristais com diferença isomórfica/anômala suficiente para determinação da estrutura da Pb27. Já a enzima NahF catalisa a oxidação do salicilaldeído em salicilato utilizando NAD+ como cofator, última reação da via superior de degradação do naftaleno em P. putida. O naftaleno é o composto mais abundante e tóxico do petróleo e tem sido utilizado como modelo em estudos de biorremediação. Para a compreensão dos determinantes estruturais da atividade dessa enzima, a proteína NahF recombinante (NahFr) foi expressa em E. coli Arctic Express a 12 oC e purificada por cromatografias de afinidade e gel filtração de onde eluiu em três frações. A fração principal, que continha a proteína em sua forma dimérica e monodispersa (dados obtidos por DLS) foi utilizada em ensaios cinéticos e estruturais. A NahFr apresentou maior atividade em pH 8,5 e 60 oC. EDTA, DTT e SDS inibiram a atividade enzimática enquanto Ni2+ a elevou em quase 20%. A enzima apresentou altos valores de kcat/KM e preferência para aldeídos aromáticos e por aldeídos alifáticos de cadeia longa. A sua estrutura mostrou um enovelamento do tipo / com os domínios de oligomerização de ligação ao cofator e catalítico bem definidos. O salicilaldeído estava presente em um bolsão profundo na estrutura da enzima onde também estavam a Cys284 e o Glu250 catalíticos. Os resíduos Arg157, Gly150 e Trp96 se mostraram importantes para a especificidade por aldeídos aromáticos. O entendimento das características da enzima NahF que são responsáveis por sua atividade e especificidade e, também, suas diferenças para outras ALDHs de outros organismos pode abrir possibilidades para, por exemplo, o aumento da sua estabilidade e outras características por mutações sistemáticas, tornando possível o seu uso e o de outras enzimas relacionadas em processos biotecnológicos According to the number of structures deposited on Protein Data Bank (PDB), the X-ray crystallography is the main method used to obtain structural information of biological macromolecules. Such information is useful for understanding the biological systems of which these macromolecules participate. In this study, two proteins with biotechnological interest were studied from the structural and biochemical view: the antigenic protein Pb27 from Paracoccidioides brasiliensis and the enzyme NahF from Pseudomonas putida. The fungus P. brasiliensis is the agent of one of the most important systemic mycoses in Brazil, paracoccidioidomycosis (PCM) and the protein Pb27, despite having been used with high sensitivity and specificity in the diagnosis and as an adjuvant in the treatment of PCM, Pb27s function is still unknown and this protein has no similar proteins with tertiary structure solved. Aiming to solve its structure by X-ray crystallography, recombinant Pb27 protein (Pb27r) was expressed in bacteria E. coli BL21(DE3) and purified by affinity chromatography and gel filtration, which was eluted with a volume equivalent to a monomer (24 kDa after removing the N-terminal Histag). Studies of dynamic light scattering (DLS) and circular dichroism (CD) revealed that protein is monodisperse and folded. Pb27 crystals were obtained in 0.25 M MgCl2, 25% PEG 4000, 100 mM Tris-Cl pH 7.0, with space group P212121 and diffracted up to 1.9 Å of resolution. In order to obtain crystals derivatives for solving the structure of Pb27r by anomalous scattering or isomorphous substitution it was performed soaking and co-crystallization with heavy atom salts (NaI, CsCl, GdCl3, Hg and Pt salts) were performed in addition to Se-Met labeling. However, derivative crystals with isomorphic/anomalous difference enough to determine Pb27 structure were not obtained yet.The NahF enzyme catalyzes the oxidation of salicylaldehyde to salicylate using NAD+ as a cofactor, the last reaction of the degradation upper pathway of naphthalene in P. putida. The naphthalene is the most abundant and toxic compound in oil and has been used as a model for bioremediation studies. To understand the structural determinants of activity of this enzyme, the recombinant protein NahF (NahFr) was expressed in E. coli Arctic Express at 12 oC and purified by affinity chromatography and gel filtration in which it eluted in three fractions. The main fraction contained the protein in its dimeric form and monodisperse (data obtained by DLS) and was used for kinetic and structural studies. NahFr was most active at pH 8.5 and 60 oC. EDTA, DTT and SDS inhibited the enzymatic activity while the Ni2+ increased by almost 20%. The enzyme showed high values of kcat/KM and preference for aromatic and long chain aliphatic aldehydes. The structure showed an / folding with the oligomerization, cofactor binding and catalytic domains well defined. The salicylaldehyde was present in a deep pocket in the structure where the catalytic Cys284 and Glu250 were seen. Moreover, the residues Arg157, Gly150 and Trp96 were important to specificity for aromatic aldehydes. The understanding of the characteristics of the enzyme NahF that are responsible for its activity and specificity and also its differences for other ALDHs from other organisms may open up possibilities for, for example, increased stability and other characteristics by systematic mutations, making it possible its use and other related enzymes in biotechnological processes

Submitted by Emanuel Varela Cardoso (emanuel.varela@ufcg.edu.br) on 2018-11-22T14:59:30Z No. of bitstreams: 1 WEIDSON DO AMARAL LUNA – DISSERTAÇÃO (PPGMAT) 2013.pdf: 693058 bytes, checksum: f3978e2e162a05649a24e187030ec992 (MD5) Made available in DSpace on 2018-11-22T14:59:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WEIDSON DO AMARAL LUNA – DISSERTAÇÃO (PPGMAT) 2013.pdf: 693058 bytes, checksum: f3978e2e162a05649a24e187030ec992 (MD5) Previous issue date: 2013-03 Capes Este trabalho consta das biografias resumidas sobre Tales, Pitágoras e René Descartes, bem como as suas devidas contribuições para o estudo e progresso da geometria. Nele constam as demonstrações das principais fórmulas da Geometria Analítica como: Razão entre Dois Segmentos, Cálculo do Ponto Médio, Distância entre Dois Pontos, Condição de Alinhamento de Três Pontos, Equação Reduzida da Reta, Equação Segmentária da Reta, Distância entre Ponto e Reta, entre outras; evidenciando que estas têm por base os Teoremas de Tales ou o Teorema de Pitágoras, instigando, deste forma, a uma reflexão sobre a Geometria Analítica estar relacionada aos Teoremas enunciados. Ao final do trabalho, relatamos uma experiência vivenciada em sala de aula, numa turma do 3 o ano do ensino médio, em que as fórmulas da Geometria Analítica são apresentadas aos alunos, relacionando-as com o Teorema de Tales ou de Pitágoras, visando, desta forma, superar a rejeição à matemática, em especial a este conteúdo, por grande parte dos alunos. Por fim, concluímos que a base da Geometria Analítica está relacionada aos Teoremas citados, pois é possível demonstrar as fórmulas da Geometria Analítica a partir deles. This work consists of a brief biographies of Thales, Pythagoras and René Descartes, as well as their contributions to the study and advancement of geometry. It comprises the proofs of the main formulas of Analytic Geometry such as: Ratio of Two Segments, Calculation of Midpoint, Distance Between Two Points, Three Point Alignment Condition, Linear Equation: Slope-Intercept Form, Linear Equation: Intercept Form, Distance from a Point to a Line, among others; showing that they are based on the Thales’s Theorem or on the Pythagorean Theorem, instigating, this way, a reflection on Analytic Geometry being related to the enunciated Theorems. At the end of the work, report an experience in the classroom, a class of 3rd year of high school, where the formulas of Analytic Geometry are presented to students, linking them with the Thales’s Theorem or Pythagorean Theorem, aiming, this way, to overcome the rejection of mathematics, particularly this content, for much of the students. Finally, we conclude that the basis of Analytical Geometry is related to the cited Theorems, because it is possible to demonstrate the formulas of analytical geometry from them.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior In this work, the endophytic fungus Fusarium verticillioides was evaluated in relation to its potential to produce cellulases and hemicellulases aiming to its application on biomass saccharification for ethanol production. The culture medium used for cellulase and xylanase production was optimized. Optimum levels of carbon source concentration (corn straw), nitrogen source concentration (sodium nitrate) and time of cultivation were obtained. Endoglucanase and xylanase activities increased from 2.8 U/mL to 8.0 U/mL and from 3.4 U/mL to 114.0 U/mL, respectively. The optimal pH and temperature were determined for endoglucanase (5.6, 80 °C), cellobiase (5.6, 60 °C), FPase (6.0, 55 °C) and xylanase (7.0, 50 °C). The optimized crude extract was applied in saccharification and fermentation of sugarcane bagasse from which 9.7 g/L of ethanol was produced at an ethanol/biomass (g/g) yield of 0.19. A second cultivation medium containing different nitrogen sources (urea, yeast extract, peptone and ammonium sulfate) and forage as carbon source was established throught Plackett Burman design for cellulases production. Two contrasting media, M1 and M2 were defined for higher endoglucanase and cellobiase production, respectively. Mixtures of these two extracts were tested on a sugarcane bagasse saccharification and extract M1 presented the best performance, yielding 26.6 % of glucan conversion and 40.4 % of xylan conversion. Different dosages of protein (10 mg/g, 20 mg/g and 40 mg/g of dry biomass) were tested intending to improve the hydrolysis performance of M1 extract. Saccharification rates of 43.4 % and 73.1 % were observed for glucan and xylan fractions respectively when 40 mg/g was used. A high protein adsorption on substrate was observed during saccharification assays employing M1 extract and that can explain de lower sugar productivity in the saccharification process along the time. The fungus F. verticillioides and the fungus Acremonium zeae were evaluated in relation to its abilities to ferment simple sugars and lignocellulosic biomass. The fungus Fusarium verticillioides produced ethanol from glucose, xylose and a mixture of these two sugars in limited oxygen conditions with yields of 0.47 g/g, 0.46 g/g and 0.50 g/g of ethanol per sugar utilized. The fungus Acremonium zeae produced ethanol from glucose, xylose and mixture of these two sugars with yields of 0.37 g/g, 0.39 g/g and 0.48 g/g of ethanol per sugar utilized. Both fungi were able to co-ferment glucose and xylose. Fusarium verticillioides and A. zeae produced high endoglucanase and xylanase activities using sugarcane bagasse as substrate. Ethanol production from 40 g/L of pre-treated sugarcane bagasse was 4.6 g/L and 3.9 g/L for Fusarium verticillioides and A. zeae, respectively. Both fungi showed features suitable for consolidated bioprocessing. Great interest was generated by the biochemical characteristics of the endoglucanase activity, as activity in high temperatures and stability in various pHs. Then it was developed a purification and characterization study of endoglucanase activity from the fungus F. verticillioides. A multienzyme complex, E1C, and a free endoglucanase, E2 were purified. The E1C contained two endoglucanases (GH6 and GH10), one cellobiohydrolase (GH7) and one xylanase (GH10). The temperature of maximal activity was 80 °C for both E1C and E2. The free enzyme and the complex were very thermostable at 50 °C and 60 °C. The activation energies for E1C and E2 were 21.3 KJ/mol and 27.5 KJ/mol, respectively. Maximum activity of E1C was encountered at pH 4.5 and of E2 was at pH 5.5; E1C presented high stability after 24 h of pre-incubation at pH ranging from 2.6 to 8.0. The KM value for E1C was 10.25 g/L while for E2 was 6.58 g/L using carboxymethylcellulose as substrate. Both E1C and E2 were significantly activated by Mn2+, CoCl2, furfural, hydroxymethylfurfural and dithiothreitol while they were inhibited by SDS, CuSO4, FeCl3, AgNO4, ZnSO4 and HgCl2. Both E1C and E2 presented higher activity towards barley-β-glucan than carboxymethylcellulose (CMC), indicating endo-β-1,3-1,4-glucanase activity. The enzymes were able to hydrolyze cellopentaose, cellotetraose and cellotriose, however, in different mode of action. In all the assays evaluating stability and efficiency E1C showed better performance than E2, suggesting advantages generated by the physical interaction between proteins. Neste trabalho o fungo endofítico Fusarium verticillioides foi avaliado quanto ao seu potencial para produção de enzimas celulases e hemicelulases visando sua aplicação no processo de sacarificação da biomassa para produção de etanol. O meio de cultivo utilizado para produção de celulases e xilanase por F. verticillioides foi otimizado. Níveis ótimos de fonte de carbono (palha de milho), fonte de nitrogênio (nitrato de sódio) e tempo de cultivo foram determinados. As atividades de endoglicanase e xilanase aumentaram de 2,8 U/mL para 8,0 U/mL e de 3,4 U/mL para 114,0 U/mL, respectivamente. Temperatura e pH ótimos foram determinados para endoglicanse (5,6; 80 °C), celobiase (5,6; 60 °C), FPase (6,0; 55 °C) e xilanase (7,0; 50 °C). O extrato enzimático otimizado foi usado na sacarificação e fermentação simultâneas de bagaço de cana. Neste processo 9,7 g/L de etanol foram obtidos com um rendimento de etanol/ biomassa (g/g) de 0,19. Um segundo meio de cultivo contendo diferentes fontes de nitrogênio (ureia, extrato de levedura, peptona e sulfato de amônio) e forrageira como fonte de carbono foi estabelecido por meio de delineamento de Plackett Burman para produção de celulases. Dois meios contrastantes, M1 e M2, foram definidos para maior produção de endoglicanase e celobiase, respectivamente. Misturas destes dois extratos foram testadas para a sacarificação do bagaço de cana e o extrato M1 apresentou o maior rendimento para conversão de glicanas 26,6 %, e de xilanases 40,4 %. Dosagens diferentes de proteína (10 mg/g, 20 mg/g e 40 mg/g de biomassa seca) do extrato M1 foram avaliadas em relação à sacarificação de bagaço de cana. Rendimentos de 43,4 % e 73,1 % foram observados para conversão de glicanas e xilanas, respectivamente quando 40 mg/g foi utilizado. Adsorção de proteína foi observada durante a sacarificação o que pode explicar a observada diminuição da produtividade durante o processo de sacarificação. O fungo F. verticillioides e o fungo Acremonium zeae foram avaliados em relação as suas capacidades de fermentação de açúcares simples e de biomassa lignocelulósica. Fusarium verticillioides produziu etanol a partir de glicose, xilose e de uma mistura dos destes dois açúcares com rendimentos de 0,47 g/g, 0,46 g/g e 0,50 g/g de etanol por açúcar utilizado. O fungo Acremonium zeae produziu etanol a partir de glicose, xilose e da mistura com rendimento de 0,37 g/g, 0,39 g/g e 0,48 g/g de açúcar utilizado. Os dois fungos foram capazes de co-fermentar glicose e xilose. Fusarium verticillioides e A. zeae produziram altas atividades de endoglicanase e de xilanase utilizando bagaço de cana como fonte de carbono. A produção de etanol a partir de 40 g/L de bagaço de cana foi de 4,6 g/L e 3,9 g/L para F. verticillioides e A. zeae, respectivamente. Grande interesse foi gerado pelas características bioquímicas da atividade de endoglicanase, como atividade em temperaturas elevadas e estabilidade em diversos pHs. Assim, foi desenvolvido um estudo de purificação e caracterização da atividade de endoglicanase do fungo F. verticillioides. Um complexo multienzimático, E1C, e uma endoglicanase livre, E2, foram purificados. O complexo E1C contém duas endoglicanases (GH3 e GH10), uma celobiohidrolase (GH7) e uma xilanase (GH10). A temperatura de máxima atividade foi 80 °C para E1C e para E2. A enzima livre e o complexo foram termoestáveis a 50 °C e 60 °C. A energia de ativação para E1C e E2 foram 21,3 KJ/mol e 27,5 KJ/mol, respectivamente. Atividade máxima de E1C foi em pH 4,5 e de E2 foi em pH 5,5; E1C apresentou alta estabilidade após 24 h de préincubação em pHs variando de 2,6 a 8,0. O valor de KM para E1C foi 10,25 g/L enquanto para E2 foi 6,58 g/L usando carboximetilcelulose como substrato. Tanto E1C quanto E2 foram significativamente ativadas por Mn2+, CoCl2, furfural, hidroximetilfurfural and ditiotreitol enquanto foram inibidas por SDS, CuSO4, FeCl3, AgNO4, ZnSO4 e HgCl2. O complexo E1C e a enzima livre E2 apresentaram atividade mais alta utilizando o substrato glicana de cevada (Barley-β-glucan) do que utilizando o substrato padrão carboxymetilcelulose (CMC), indicando atividade de endo-β-1,3-1,4-glicanase. As enzimas foram capazes de hidrolisar celopentaose, celotetraose e celotriose, entretanto com modos de ação diferentes. Em todos os ensaios que avaliavam estabilidade e eficiência, E1C apresentou melhores resultados do que E2, o que sugere vantagens geradas pela interação física de proteínas presente nos complexos.

Diagnosticar anomalias em grandes redes corporativas consome tempo considerável das equipes de suporte técnico, principalmente pela complexidade das inúmeras interações existentes entre as aplicações e os elementos de rede (servidores, roteadores, enlaces, etc.). Nos últimos anos, vários trabalhos cientí cos propuseram ferramentas automatizadas para detecção de anomalias em ambientes distribuídos. As ferramentas são divididas em dois grandes grupos: as que usam abordagens intrusivas, em que as aplicações precisam ser alteradas para registrar eventos de comunicação e facilitar o rastreamento de problemas; e as não intrusivas, em que pacotes são capturados diretamente da rede e técnicas estatísticas são aplicadas para inferir, com um certo grau de con ança, as possíveis causas dos problemas. As duas abordagens possuem vantagens e desvantagens. Entretanto, as técnicas não intrusivas são mais aceitas pela facilidade de implantação e também por não exigirem que aplicações já desenvolvidas sejam alteradas para incluir mecanismos de registro de eventos. A abordagem mais completa e promissora para a solução desse problema, denominada Sherlock, utiliza traços de rede para construir automaticamente um Grafo de Inferência (GI) que modela as múltiplas interações e dependências presentes em um ambiente distribu ído. Apesar do progresso feito por Sherlock na modelagem do problema, o seu tempo de execução para inferir as possíveis causas e a precisão dos resultados de detecção das anomalias ainda deixam a desejar. Este trabalho propõe Nemo, uma ferramenta que explora conhecimento especí co do domínio do problema e uma propriedade teórica de Redes Bayesianas para reduzir signi- cativamente um GI e, consequentemente, o tempo de execução. Resultados de simulação utilizando dados reais e sintéticos mostram que Nemo reduz o tempo de execução de Sherlock em mais de 90% e melhora sua precisão em todos os cenários simulados. Além disso, este trabalho também apresenta uma extensa revisão bibliográ ca sobre o assunto e compara ções qualitativas dos principais métodos propostos na literatura.

Neste trabalho é descrito um algoritmo usado para predizer pares de resíduos de aminoácidos em proteínas alvo (com estrutura tridimensional conhecida) que poderiam ser mutados por pares diferentes de resíduos de aminoácidos com o objetivo de introduzir uma nova/diferente interação entre estes resíduos. Isto resulta em um mutante in silico com possibilidades estereoquímicas de existir in vitro com o aumento da estabilidade conformacional e térmica. Para alcançar isso, foi criado um banco de dados baseado no PDB composto de pares de resíduos de aminoácidos interagentes observados em proteínas de estrutura conhecida. As mutações são propostas de forma a manter o enovelamento da proteína alvo (e consequentemente sua função) através, basicamente, da conservação da conformação da cadeia principal dos resíduos mutados. Neste trabalho também são apresentados os aspectos principais dessa base de dados, a forma como encontrar os pontos de mutação e alguns resultados. Uma busca completa na estrutura de uma proteína alvo foi realizada para identificar cada par que poderia ser mutado usando alguns dos pares do banco. Pretende-se com este procedimento, verificar um número de possíveis mutantes em diferentes enzimas com potencial de aplicação em processos de biorremediação, onde condições ambientais agressivas são esperadas. É apresentada a ferramenta RID (Residue Interaction Database), uma nova base de dados e algoritmo para propor mutação de pares de resíduos em uma proteína objetivando aumentar sua estabilidade focando na manutenção da conformação de sua cadeia principal. São descritos os detalhes do algoritmo para gerar a base de dados dos resíduos de aminoácidos interagentes e o método para otimizar a busca. Comparado com outros métodos, RID aumenta as alternativas de proposição de mutação devido à variedade de interações usadas para criar o banco de dados e que irão contribuir para o aumento da estabilidade proteica. A ferramenta se encontra disponível em http://www.bioest.icb.ufmg.br/RID. In this work we describe an algorithm which is used to predict amino acid residue pairs in target proteins (with known 3D structure) that could be replaced by a different amino acid residue pair in order to introduce a new/different interaction between residues. This might result in an in silico mutant with stereochemistry possibilities to exist in vitro with increased thermo and conformational stability. To address this, we have created a PDB-based database composed of pairs of interacting amino acid residues observed in proteins with known structure. The mutations are proposed in a way to maintain the target protein's fold (and function) as, basically, the main chain conformation of mutated residues are supposed to be conserved. In this work we also present the main aspects of this database, the way to find the mutation points and some results. A complete search in a target protein structure was performed to identify each residue pair that could be mutated using some of the pairs in the database. We intend to use this procedure to verify a number of possible mutations in different enzymes with potential application in bioremediation processes, where aggressive environmental conditions are expected. We present RID (Residue Interaction Database), a novel database and algorithm to propose a residue pair mutation in a protein aiming to increase its stability focusing in the conformation maintainability. We describe the details of the algorithm do generate the database of interacting amino acid residues and the method to optimize the database for quick searches. Compared to other methods, RID increases the alternatives to propose mutation because of the variety of the interactions used to create the database and that will contribute to increase the protein stability. The tool is available at: http://www.bioest.icb.ufmg.br/RID.

Neste trabalho, estudamos as Singularidades das folheações mutuamente ortogonais, numa variedade orientada M^3 de dimensão 3, cujas folhas são as curvas integrais dos campos de direções de curvatura principal associadas a uma imersão : M^3 R^4. Damos aqui continuidade às contribuições de R. Garcia referente ao estudo das singularidades genéricas das folheações principais. Apresentamos as configurações principais numa vizinhança dos pontos parcialmente umbílicos de codimensão 1, ou seja, as singularidades das folheações principais que aparecem genericamente em famílias a 1 parâmetro de hipersuperfícies imersas em R^4, e os diagramas de bifurcação pertinentes. Enfraquecendo a condição de genericidade, da maneira mais simples possível, encontramos oito tipos genéricos: D_1^ 1, D^1_ 2, D^1_ 3, D^1_, D^1_{1h,p}, D^1_{1h,n}, D^1_p e D^1_c , definidos ao longo do trabalho. Nesta tese consubstanciamos matematicamente a seguinte conclusão: As singularidades das folheações principais, que aparecem genericamente em famílias a 1 parâmetro de hipersuperfícies imersas em R^4, são os pontos parcialmente umbílicos D_1^ 1, D^1_ 2, D^1_ 3, D^1_, D^1_{1h,p}, D^1_{1h,n}, D^1_ e D^1_ , cujas definições e propriedades serão apresentados aqui. A parte central desta tese é estabelecer, analítica e geometricamente, a configuração principal destes pontos incluindo seus diagramas de bifurcação. In this work we study the mutually ortogonal foliations, in oriented three dimensional manifolds M^3, whose leaves are the integral curves of the principal curvature direction fields associated to immersions : M^3 R^4. We focus on behavior of these foliation around singularities. Here we extend the contributions of R. Garcia concerning the study of generic singularities. To this end we establish the principal configurations in a neighborhood of partially umbilic points of codimension one. These are the singularities which appear generically in one parameter families of hypersurfaces and give their bifurcation diagrams. We express the condition of genericity by minimally weakening those given by R. Garcia and by adding instead new higher order ones. This procedure leads to the novel generic types: D^1_1, D^1_2, D^1_3, D^1_, D^1_{1h,p}, D^1_{1h,n}, D^1_p and D^1_c , studied in this work. The central part of this thesis is to establish, analitically and geometrically, the local principal configurations at these points, including their bifurcations diagrams.

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva que causa a Linfadenite Caseosa (LC), uma doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes, promovendo a redução da produtividade dos animais infectados. A doença se caracteriza pela formação de abscessos em nódulos linfáticos superficiais e/ou órgãos internos. Vários métodos para o diagnóstico da LC subclínica foram desenvolvidos, porém não alcançaram eficácia e praticidade satisfatórias. Assim, nesse trabalho selecionamos seis alvos protéicos dos 104 previamente descritos, caracterizamos os produtos gênicos das Open Reading Frame(ORFs) e produzimos as proteínas recombinantes para a otimização de um Teste Intradérmico de Hipersensibilidade (TIH) paraa LC. Os insertos das seis ORFs foram amplificados após a extração do DNA genômico da linhagem 1002 de C. pseudotuberculosiscom a utilização de iniciadores específicos, que ligados aos vetores pAE e pET-28a foram transformados em Escherichia coliDH5para a clonagem molecular. Para verificar a expressão das proteínas recombinantes, os clones foram transformados em E. coli C43 pLysSe a cinética de expressão realizada. Duas proteínasrecombinantes foram produzidas e submetidas a Western blotcom soros de caprinos infectados com C. pseudotuberculosis, demonstrando antigenicidade nesses testes preliminares. Novos testes de caracterização das proteínas recombinantes serão realizados e esperamos que as mesmas possam ser utilizadas na otimização de um TIH de elevada acurácia, para o controle da LC nos rebanhos de ovinos e caprinos. Corynebacterium pseudotuberculosisis a Gram-positive bacterium that causes caseous lymphadenitis (CLA), a chronic infectious disease that affects small ruminants, promoting the reduction of productivity of infected animals. The disease is characterized by the formation of abscesses in the lymph nodes surface and/or internal organs. Several methods for the diagnosis of subclinical CLA been developed, but have not reached satisfactory efficacy and practicability. Thus, this study selected six of the 104 proteins targets previously described, we characterize the genics products of the Open Reading Frame(ORF) and produce recombinant proteins for the optimization of an Intradermal Hypersensitivity Test (IHT) to LC. The inserts of the six ORFs were amplified after extraction of genomic DNA from strain 1002 of C. pseudotuberculosiswith the use of specific primers which bound to vectors pAE and pET-28a were transformed into Escherichia coliDH5for molecular cloning. To verify the expression of recombinant proteins, clones weretransformed into E. coliC43 pLysS and expression kinetics performed. Two recombinant proteins were produced and subjected to Western blotwith sera from goats infected with C. pseudotuberculosis, demonstrating antigenicity in these preliminary tests. New tests for characterization of recombinant proteins will be made and hopefully they can be used in the optimization of an IHT high accuracy for control of CLA in flocks of sheep and goats.

Neste trabalho, consideramos classes de sistemas lineares por partes descontínuos no plano e contínuos no espaço. No plano, analisamos sistemas do tipo foco-foco (FF), parabólico-foco (PF) e parabólico-parabólico (PP) separados pela reta x = 0 e demonstramos que podem aparecer até dois ciclos limite, dependendo de variações de parâmetros. Também estudamos um sistema específico, linear por partes, com duas selas (uma sela fixa na origem e outra na vizinhança do ponto (1;1)) separadas pela reta y= -x+1 , e mostramos que podem aparecer até dois ciclos limite dependendo de variações de parâmetros. Por fim, examinamos um sistema linear por partes contínuo em R³ e demonstramos a existência de cones invariantes e, através destas estruturas, determinamos alguns comportamentos estáveis e instáveis. In this work, we consider classes of discontinuous piecewise linear systems in the plane and continuous in the space. In the plane, we analyze systems of focus-focus (FF), focusparabolic (FP) and parabolic-parabolic (PP) type, separated by the straight line x = 0, and we prove that can appear until two limit cycles depending of parameters variations. Also we study a specific system, piecewise, with two saddles (one fixed in the origin and the other in the neighborhood of point (1;1)) separated by the straight line y= -x+1, and we show that can appear until two limit cycles depending of parameters variations. Finally, we examine a continuous piecewise linear system in R³ and we prove the existence of invariant cones and, through this structures, we determine some stable and unstable behavior.

O principal objetivo deste trabalho é estudar as curvas geradas pelas rodas traseira e dianteira de uma bicicleta do ponto de vista da Geometria diferencial. The main objective is to study the curves generated by the front and rear wheels of a bicycle from the standpoint of differential geometry.

Devido ao uso do petróleo e seus derivados, diversos tipos de poluentes são liberados no meio ambiente. Alguns deles são classificados como Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (HAPs). A maioria dos HAPs, ou seus metabólitos, são capazes de interagir com bases nitrogenadas causando lesões no DNA, potencializando mutações e, consequentemente, o desenvolvimento de câncer. Como resultado disso, houve nas últimas décadas um aumento substancial na atenção dada às contaminações de solos e lençóis freáticos por HAPs. Inúmeros microrganismos possuem a capacidade de utilizar essas moléculas tóxicas como fontes de carbono e energia. O uso de determinadas bactérias (ou de suas enzimas) através de técnicas de biorremediação é uma estratégia em potencial para eliminação dos HAPs do ambiente. O HAP mais comum e tóxico é o naftaleno, e graças à capacidade da bactéria Pseudomonas putida em degradá-lo completamente, ela tem sido o foco de inúmeras pesquisas. Neste trabalho foram estudadas duas enzimas de P. putida envolvidas na degradação de naftaleno: NahE (uma hidratase-aldolase) e NahK (uma decarboxilase). O objetivo principal do trabalho foi a amplificação e clonagem dos genes nahE e nahK, expressão e purificação das respectivas enzimas para ensaios bioquímicos e estruturais. Os genes foram clonados inicialmente no vetor de expressão pET28a-TEV e expressos em Escherichia coli. A proteína recombinante NahE foi detectada em fração insolúvel e diversas estratégias foram utilizadas, sem sucesso, para obtenção da proteína expressa em fração solúvel. NahE solúvel foi obtida utilizando purificação em condições desnaturantes seguida por reenovelamento. Por outro lado, a proteína recombinante NahK foi detectada em fração solúvel e purificada por cromatografias de afinidade e de exclusão molecular. As proteínas purificadas foram submetidas a ensaios de Espalhamento Dinâmico de Luz e Dicroísmo Circular. Também foram realizados ensaios de cristalização com NahK visando o crescimento de cristais para a elucidação de sua estrutura tridimensional por cristalografia de Raios-X. Many pollutants are released to the environment due the use of petroleum and its derivatives. Some of them are classified as Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs). Most of PAHs, or their metabolites, can interact with nitrogenous bases or cause lesions in DNA, potentiating mutations and consequently inducing the development of cancer. As a result of this, in the last decades, the concerns about contamination of soil and groundwater by PAHs have substantially increased. Various microorganisms have the capacity to use these hazardous molecules as carbon and energy source. The use of these microorganisms and/or their enzymes for the elimination of PAHs to the environment is a potential strategy for bioremediation. One of the most common and hazardous PAH is naphthalene, and because of the bacteria Pseudomonas putida ability to completely degrade it, it has been the focus of numerous studies. This work was focused in the study of two enzymes from P. putida involved in naphthalene degradation: NahE (a hydratase-aldolase) and NahK (a decarboxylase). The main objectives of this work were the amplification and cloning of nahE and nahK genes, expression and purification of NahE and NahK enzymes for biochemical and structural assays. The genes were initially cloned into the expression vector pET28a-TEV and expressed in Escherichia coli. The recombinant protein NahE was mainly detected in insoluble fraction and different trials were performed to obtain the protein in the soluble fraction, without success. Soluble NahE was obtained only when using denaturizing conditions of purification followed by a refolding protocol. On the other hand, NahK was detected in the soluble fraction and was purified by affinity and size-exclusion chromatographies. The purified proteins were submitted to Dynamic Light Scattering and Circular Dichroism experiments. Crystallization assays were also performed with NahK aiming crystal growth for elucidation of its three-dimensional structure by X-Ray Crystallography.

Pontos quadráticos (ou pontos hiperbólicos especiais) são pontos em que uma superfície pode ser aproximada por uma quádrica até os termos de ordem três. Trataremos de uma conjectura que afirma que toda superfície hiperbólica fechada em RP3 não tem menos que oito pontos quadráticos distintos. Provaremos um resultado que afirma que; se uma superfície genérica em RP3 contém um disco hiperbólico delimitado por uma curva parabólica de Jordan, então existe um número ímpar de pontos quadráticos no interior deste disco. Estudamos curvas formadas pelos pontos de inflexão das folheações assintóticas e principais no domínio hiperbólico. Estudamos o comportamento da curva de inflexão da folheação assintótica próxima de um ponto parabólico especial (ponto em que a direção assintótica é tangente a curva parabólica), e o comportamento da curva de inflexão da folheação principal próxima de um ponto umbílico. Quadratic points (or special hyperbolic points) are points where a surface can be approximated by a quadric to the terms of order three. We will deal with a conjecture that asserts that every closed hyperbolic surface in RP3 has not less than eight distinct quadratic points. We prove a result which states that; if a generic surface in RP3 contains a hyperbolic disk bounded by a Jordan parabolic curve, then there is an odd number of quadratic points inside this disc. We study curves formed by the inflection points of asymptotic foliations and principals in the hyperbolic domain.We studied the behavior of the inflection curve of the asymptotically foliation near a special parabolic point (the point where the asymptotic direction is tangent to the parabolic curve), and the behavior of the inflection curve of the principal foliation near a umbilic point.

Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são compostos orgânicos formados por dois ou mais anéis aromáticos fundidos. A maioria deles é mutagênico e carcinogênico aos homens e animais. Os HAPs são liberados no meio ambiente principalmente por atividades antropogênicas, relacionadas à extração, ao transporte, ao refino, à transformação e ao uso do petróleo e seus derivados. A biorremediação é uma estratégia para a eliminação dos HAPs do meio ambiente, a qual utiliza enzimas ou microorganismos que possuem a capacidade de metabolizar esses compostos e transformá-los em substâncias inertes. O naftaleno é um dos HAPs mais comumente encontrado no ambiente. A degradação do naftaleno por Pseudomonas sp. é uma alternativa para a remediação de ambientes com esse poluente. Em Pseudomonas putida G7, os genes catabólicos são organizados em dois óperons no plasmídeo NAH7: um deles codifica as enzimas da via superior envolvidas na conversão do naftaleno a salicilato, o segundo codifica as enzimas da via inferior envolvidas na conversão do salicilato a intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico. O gene nahB é responsável pela codificação da proteína cis-1,2-dihidro-1,2-dihidroxinaftaleno-1,2-desidrogenase (NahB), a qual é a segunda enzima da via superior. Nesse trabalho foi feita a clonagem do gene nahB em vetor pCR®2.1-TOPO e a subclonagem nos vetores de expressão pET-28a-GST-TEV e pET-28a-TEV. A expressão heteróloga da enzima NahB foi feita em RosettaTM (DE3) e ArticExpressTM (DE3). O vetor de expressão pET-28a-GST-TEV-NahB, responsável pela codificação da enzima GST-NahB, foi seqüenciado e a proteína recombinante está correta. Esta foi expressa na fração solúvel a baixas temperaturas, em RosettaTM (DE3) a 20ºC e em ArticExpressTM (DE3) a 12ºC. A purificação foi feita por cromatografia de afinidade e cromatografia de troca aniônica. Após a purificação, foi realizada a clivagem com a protease TEV. A proteína NahB proveniente da GST-NahB, permanece com três resíduos de aminoácidos além da sequência nativa e foi denominada GGS-NahB. A massa molecular dessa enzima recombinante foi determinada por espectrometria de massa e o valor foi bem próximo do teórico. Características estruturasis da enzima GGS-NahB foram determinadas por Espalhamneto Dinâmico da Luz e por Dicroísmo Circular. Pelo DLS, verificou-se que a proteína apresenta-se monodispersa e na forma tetramérica em solução. Os experimentos de CD evidenciaram uma enzima com aproximadamente 25% de -hélice, 30% de fita- paralela e antiparalela, 15 % de volta beta e 40% de estrutura randômica. Novas purificações estão sendo conduzidas para a realização de ensaios de cristalização. O vetor de expressão pET-28a-TEV-NahB, também foi seqüenciado e a proteína recombinante His-NahB apresenta, após a clivagem com a protease TEV, ao invés de dois resíduos de aminoácidos além da sequência nativa, 21 resíduos. O gene nahB será, novamente, subclonado no vetor pET-28a-TEV para expressão da enzima His-NahB. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are organic compounds consisting of two or more fused aromatic rings. Most of them are mutagenic and carcinogenic to humans and animals. PAHs are released through the environment mainly by anthropogenic activities related to the extraction, transport, refine, transformation and use of petroleum and its derivatives. Bioremediation is a strategy for PAHs elimination from the environment which uses enzymes or microorganisms displaying the capacity to metabolize these compounds and transform them into inert substances. Naphthalene is one of the most commonly found PAHs in the environment. The degradation of naphthalene by Pseudomonas sp. is an alternative procedure for the remediation of the environment with this pollutant. In Pseudomonas putida G7 the catabolic genes are organized in two operons on NAH7 plasmid: one encoding the upper-pathway enzymes involved in the conversion of naphthalene to salicylate, the second encoding the lower-pathway enzymes involved in the conversion of salicylate to tricarboxylic acid cycle intermediates. The nahB gene is responsible for codification of the protein cis-1,2-dihydro-1,2-dihydroxynaphthalene-1,2-dehydrogenase (NahB), which is the second enzyme from the upper-pathway. In the present work we present the cloning of nahB gene into the vector pCR®2.1-TOPO and the subcloning into the expression vectors pET-28a-GST-TEV and pET-28a-TEV. The heterologous expression was performed in RosettaTM (DE3) and ArticExpressTM (DE3). The expression vector pET-28a-GST-TEV-NahB, responsible for encoding the enzyme GST-NahB, was sequenced and the recombinant protein is correct. This was expressed in the soluble fraction at low temperatures in RosettaTM (DE3) at 20ºC and in ArticExpressTM (DE3) at 12ºC. The purification was performed by affinity chromatography and anion exchange chromatography. After purification, was conducted the cleavage with protease TEV. The protein NahB from the GST-NAHB remains with three amino acid residues than the native sequence and was called GGS-NAHB. The molecular mass of this recombinant enzyme was determined by mass spectrometry and the value was very close to theoretical. Structural characteristics of the enzyme GGS-NahB were measured by Dynamic Light Scattering and Circular Dichroism. By DLS, it was found that the protein is monodisperse and in tetrameric form in solution. CD experiments revealed an enzyme with approximately 25% -helix, 30% of parallel and antiparallel -sheet, 15% of beta turn and 40% of random coil. Further purification is being conducted for protein crystallization assays. The expression vector pET-28a-TEV-NahB, was also sequenced and the recombinant protein His-NahB presents, after cleavage with TEV protease, instead of two amino acid residues than the native sequence, 21 residues. The gene nahB will again subcloned into vector pET-28a-TEV for expression of His-NahB.

Neste trabalho, estamos interessados em estudar a solução do seguinte problema: Seja Y = ( f ,g) um campo de vetores, de classe C1, em R2. Suponha que (x, y) = (0,0) é um ponto singular de Y e suponha que, para todo q ∈ R2, os autovalores de DY tem parte real negativa, isto é, det(DY) > 0 e tr(DY) < 0. Então, a solução (x, y) = (0,0) de Y é globalmente assintoticamente estável. Para este fim, mostramos que este problema é equivalente ao seguinte: Seja Y : R2 →R2 uma campo de vetores de classe C1. Se det(DY) > 0 e tr(DY) < 0, então Y é globalmente injetora. Esta equivalência foi demonstrada por C. Olech em [1]. Desta forma, a estratégia é estudar a injetividade do campo Y sob as condições det(DY)> 0 e tr(DY) < 0. Na verdade, apresentamos um resultado um pouco mais forte, o qual foi obtido por C. Gutierrez e pode ser encontrado em [4]. Este resultado é dado por: Qualquer campo de vetores X : R2 →R2 de classe C2 satisfazendo a condição de r-autovalor, para algum r ∈ [0,¥), é injetora. In this work we are interested in the solution of the following problem: Let Y = ( f ,g) be a vector field of class C1 in R2. Suppose that (x, y) = (0,0) is a singular point of Y and assume that for any q ∈ R2, the eigenvalues of DY have negative real part, this is, det(DY) > 0 and tr(DY) < 0. Then, the solution (x, y) = (0,0) of Y is globally asymptotically stable. To this end, we show that this problema is equivalent to the following: Let Y : R2 →R2 be a C1 vector field. If det(DY) > 0 and tr(DY) < 0, then Y is globally injective. This equivalence was proved by C. Olech [1]. So we show the injectivity of the vector field Y under the conditions det(DY) > 0 and tr(DY)

A família gênica masp (proteína de superfície associada a mucina), identificada durante a anotação do genoma do Trypanosoma cruzi, é a segunda maior família mutligênica neste parasito, consistindo de aproximadamente 1400 membros. Membros da família MASP contêm domínios N- e C-terminais conservados que codificam para um peptídeo sinal e um sítio de adição de âncora de GPI, respectivamente. A região central é variável em comprimento e em sequência de aminoácidos, e contém um grande repertório de motivos repetitivos, os quais sugerem que MASP esteja envolvida em interações parasito-hospedeiro. Uma vez que nenhum membro da família MASP foi caracterizado até o momento, decidiu-se estudar as estruturas secundária e terciária de diferentes MASPs. Para este objetivo, optou-se por clonar e expressar em Escherichia coli a região central das sequências de quatro membros MASP. Para isso, algumas características das proteínas alvo foram consideradas, tais como curto comprimento da sequência de aminoácidos, em torno de 170 resíduos, baixo conteúdo de sítios potenciais de glicosilação e baixo grau de desordem estrutural. Uma vez que regiões de baixa complexidade normalmente correspondem a segmentos desenovelados ou estruturas extendidas, foi utilizado o servidor PONDR VL-XT para predizer regiões desordenadas nos quatro membros MASP. Proteínas nativamente desenoveladas têm sido descritas por possuírem elevada taxa de resíduos carregados e baixa taxa de resíduos hidrofóbicos. Gráficos de carga líquida média versus taxa de hidrofobicidade foram obtidos para as regiões centrais das quatro MASPs. Estas análises revelaram a presença das quatro regiões centrais no espaço designado para proteínas nativamente desenoveladas. As sequências foram amplificadas por PCR, clonadas nos sistemas de clonagem TOPO e/ou pGEM-T e submetidas ao sequenciamento de DNA. Posteriormente, os produtos de PCR foram transferidos para dois vetores de expressão derivados do vetor pET-28a (Novagen), que foram modificados no Centro de Biologia Molecular e Estrutural (CeBiME, Campinas / SP). Em ambos os vetores, o sítio de reconhecimento por trombina foi substituído pelo sítio de reconhecimento da protease TEV (tobacco etch vírus). As quatro proteínas MASP em fusão a cauda de histidina N-terminal foram expressas na forma solúvel, enquanto que aquelas fusionadas a GST N-terminal foram expressas como corpos de inclusão insolúveis, exceto a recombinante MASP1:GST. A purificação da MASP 3 fusionada a cauda de histidina foi realizada por cromatografia de afinidade. Após a clivagem da etiqueta por TEV, a proteína foi purificada por cromatografia de troca iônica. O estudo da estrutura tridimensional de proteínas MASP permitirá uma compreensão mais detalhada destas moléculas, tal como a localização de seus epítopos e seu enovelamento, o que pode contribuir para a identificação de sua função biológica no T. cruzi. The Trypanosoma cruzi masp (mucin associated surface protein) gene family was identified during the annotation of the genome as the second largest gene family in this human pathogen, consisting of approximately 1400 members. MASP members contain N- and C- terminal conserved domains that encode a putative signal peptide and a GPI-anchor addition site, respectively. The central region is variable both in length and in amino acid sequence and contains a large repertoire of repetitive motifs, which suggests MASP may be involved in parasite-host cell interaction. Since no member of the MASP family has been characterized to date, we have decided to study the secondary and tertiary structures of distinct MASPs. For this purpose, we have decided to clone and express in E. coli the central region sequences of four MASP members. For this, some features of the target proteins were considered such as short amino acid sequence length, around 170 residues, low content of potential glycosylation sites and low intrinsic disorder degree. Knowing that sequence regions with low complexity nearly always correspond to nonfolding segments or extended structures, we have used the web server PONDR VL-XT to predict disordered regions in MASPs. Natively unfolded proteins have been described to possess a high ratio of charged residues and a low ratio of hydrophobic residues. The mean net charge versus mean hydrophobicity ratio was ploted for the four MASPs central region. This analysis showed that the four central regions falls in the phase space of natively unfolded proteins. After that, the sequences were PCR amplified and cloned into TOPO and/or pGEM-T cloning systems and submitted to DNA sequencing. Subsequently, the PCR products were transferred to two expression vectors derived from pET-28a vector (Novagen), which were modified in the Center of Molecular and Structural Biology (CeBiME, Campinas/SP). In both vectors, the thrombin recognition site was replaced by a TEV (tobacco etch virus) protease recognition site. The four N-terminal fusion His-tag MASP proteins were expressed in the soluble forms, whereas the N-terminal GST fusion MASPs were expressed as insoluble inclusion bodies, except the recombinant GST:MASP1. Purification of the Histidine-tagged MASP3 was carried out by affinity chromatography. After His-tag cleavage by TEV, the protein was purified by ion exchange chromatography. The study of the three-dimensional structure of MASP proteins will enable a more detailed understanding of these molecules, such as the location of their epitopes and its fold, which may contribute to the identification of its biological function on T. cruzi.

Orientador: Marco Antonio Teixeira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matematica, Estatistica e Computação Cientifica Resumo: Neste trabalho sistemas dinâmicos descontínuos em variedades tridimensionais são estudados. Descrevemos uma classe de tais sistemas que são localmente estruturalmente estáveis em uma vizinhança de uma singularidade típica. Exibimos nessa etapa uma sub-família de campos do tipo dobra-dobra que é estruturalmente estável. Introduzimos os conceitos de A e L-estabilidade, que são pequenas generalizações dos conceitos clássicos de estabilidade assintótica e estabilidade no sentido de Lyapunov, respectivamente. Através de formas normais para as famílias de campos descontínuos de codimensão zero e um, exibimos os subconjuntos de sistemas descontínuos que são A e L-estáveis em uma vizinhança da origem. Destacamos um dos principais objetos de estudo desse trabalho: a singularidade dobra-dobra caso elíptico (T-singularidade). Discutimos algumas propriedades de sua dinâmica como a A-estabilidade para campos do tipo dobra-dobra de codimensão zero, um e dois. Investigamos também a presença de alguns invariantes topológicos, como separatrizes e famílias de órbitas periódicas. Finalmente, analisamos os chamados sistemas com relê. Em especial um sistema com dois relês acoplados é discutido. Abstract: In this work non-smooth dynamical systems in IR are considered. We describe a class of such systems that are locally structurally stable around a typical singularity. One of our contributions is to exhibit within these class of fold-fold systems a subclass which is structural stable. We also introduce the concept of A and L-stability which generalizes the classical concept of asymptotic and Lyapunov stability, respectively. Using normal forms for families of non smooth dynamical systems of codimension zero and one we exhibited subsets of non smooth dynamical systems which are A and L-stable in a neighborhood of the origin. We emphasize that the main object of study within this work is the fold-fold singularity in the elliptical case (T-singularity). We discuss some of its dynamical properties such as A-stability for codimension zero, one and two systems. We also investigate the presence of topological invariants such as séparatrices and families of periodic orbits. Finally we analyze two coupled relay systems. Doutorado Sistemas Dinâmicos Doutor em Matemática

Apesar de inúmeros esforços nos últimos anos, buscas complexas ecientes em redes P2P de grande escala permanecem um problema em aberto e desaador. Replicações massivas de dados e de mensagens de buscas são duas estratégias comuns utilizadas para melhorar taxas de sucesso e tempos de resposta das diversas técnicas propostas. Entretanto, estratégias de replicação pró-ativas podem gerar uma quantidade signicativa de tráfego na rede se não forem tratadas com cuidado. Este trabalho propõe SplitQuest, um protocolo de busca exaustiva e controlada que utiliza uma estrutura leve para evitar replicações desnecessárias e acelerar a propagação de mensagens de buscas em redes P2P. Em SplitQuest, os pares da rede são organizados em grupos de replicação, nos quais cada par compartilha seu conteúdo com todos os demais membros e mensagens de buscas são propagadas uma única vez para cada grupo existente na rede. Ao evitar duplicações de mensagens de buscas, direcionar as mensagens para grupos disjuntos e explorar a heterogeneidade dos pares, SplitQuest é capaz de atingir altas taxas de sucesso e baixos tempos de resposta a custo bem mais baixo em termos do número de mensagens que a melhor soluções atualmente conhecida. O protocolo SplitQuest foi avaliado em diferentes cenários de simulação. Esses cenários incluem topologias sintéticas e traços de representações de redes reais com os mais variados tamanhos e características de dinamismo. Apresenta-se também neste trabalho, uma análise matemática da solução proposta para se estabelecer um limite superior no número de pares que uma mensagem de busca pode alcançar na rede.

Neste trabalho realizamos um estudo sobre as equações do tipo dx dt = nå i=0 ai(t)xi; (A) onde ai 2 C1, i = 0; ;n e 0 t 1. Uma equação da forma (A) é denominada equação de Abel generalizada. Nosso estudo se refere ao problema proposto por C. Pugh: existe um número natural N dependendo apenas de n, tal que a equação (A) possui no máximo N ciclos limites? Inicialmente estudamos o problema de C. Pugh para n=1 e n=2, para os quais a equação (A) possui, no máximo, um e dois ciclos limite, respectivamente. Para n = 3, A. Lins Neto mostra que, se a3(t) não muda de sinal em [0;1], então a equação (A) possui no máximo três ciclos limite. Além disso A. Lins Neto mostra que, dado um número natural l, é possível construir uma equação da forma (A) com n = 3 que possui no mínimo l ciclos limites. Ainda para n = 3, A. Gasull e J. Llibre estudam o problema de C. Pugh considerando que a2(t) não muda de sinal em [0;1], e M. J. Álvarez, A. Gasull e H. Giacomini também estudam o problema de C. Pugh considerando que existem números reais a e b tais que aa3(t)+ba2(t) não muda de sinal em [0;1] e a1(t) = a0(t) = 0. Além destes resultados, estudamos alguns resultados mais gerais estudados por A. Gasull e A. Guillamon. In this work we conducted a study on the equations of the type dx dt = nå i=0 ai(t)xi; (A) where ai 2 C1, i = 0; ;n and 0 t 1. An equation of the form (A) is called a generalized Abel equation. Our study refers to the problem proposed by C. Pugh: There is a natural number N depending only on n, such that the equation (A) has at most N limit cycles? Initially we study the problem of C. Pugh for n = 1 and n = 2, for which the equation (A) has at most one and two limit cycles, respectively. For n = 3, A. Lins Neto shows that if a3(t) does not change sign on [0;1], then the equation (A) has at most three limit cycles. Also A. Lins Neto shows that, given a natural number l, it is possible to construct an equation of the form (A) with n = 3 that has at least l limit cycles. Still for n = 3, A. Gasull and J. Llibre study the problem of C. Pugh considering that a2(t) does not change sign on [0;1], and M. J. Alvarez, A. Gasull and H. Giacomini also study the problem of C. Pugh considering that there are real numbers a and b such that aa3(t)+ba2(t) does not change sign on [0;1] and a1(t) = a0(t) = 0. Besides this, we study some more general results studied by A. Gasull and A. Guillamon. Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Leucurolisina-a (leuc-a) e uma metaloprotease de veneno de serpente (SVMP) de classe P-I presente no veneno de Bothrops leucurus. A leuc-a teve sua estrutura primaria completamente sequenciada, apresentando uma unica cadeia polipeptidica com 202 residuos de aminoacidos e alta similaridades com outras SVMPs de classe P-I ja descritas. A leuc-a, mesmo em altas concentracoes, nao provoca hemorragia, apresentando apenas atividade proteolitica em proteinas de matriz extracelular. Essa enzima foi cristalizada, pelo metodo de difusao de vapor, e dois conjuntos de dados de difracao de raios-x, um a 1,8 eoutro a 1,6 A, foram coletados. Os dados mostraram que os cristais pertencem ao grupo espacial P212121, com parametros de celula unitaria muito similares A estrutura cristalografica da leuc-a foi resolvida pelo metodo de substituicao molecular usando o modelo da metaloproteinase BaP1 (PDB code 1ND1) purificada do veneno da serpente Bothrops asper. O modelo da leuc-a, a 1,8 A de resolucao, foi refinado ate um Rfator final = 0,168 e Rlivre = 0,235. A estrutura apresenta o conservado motivo de ligacao ao zinco H142E143XXH146XXG149XXH152 assim como o motivo gmet turn h C164I165M166, caracteristico da superfamilia metzincina. Um atomo de zinco foi observado no sitio catalitico da enzima sendo estabilizado pelos NÃ2 dos tres aneis imidazolicos dos residuos de histidinas H142H146H152 e uma molecula de agua entre o espaco do atomo de zinco e a cadeia lateral do residuo E143. Um ion calcio tambem foi observado unido das extremidades N e C-terminais da estrutura. Esse atomo e estabilizado por duas moleculas de agua e cinco atomos presentes nas cadeias laterais de residuos conservados: o oxigenio da carbonila do residuo Glu9; os dois oxigenios do carboxilato do residuo Asp93, o oxigenio da carbonila do residuo Cys197 e o oxigenio da carboxamida do residuo Asn200. A leuc-a possui seis residuos de cisteina (Cys117-Cys197, Cys157-Cys164, and Cys159-Cys181) envolvidos na formacao de pontes dissulfeto. A resolucao de outro conjunto de dados, com 1,6 A de resolucao, apresentou uma densidade eletronica desconhecida no sitio catalitico da enzima. Esse ligante foi identificado, sintetizado e utilizado com sucesso em ensaios de inibicao da atividade proteolitica da leuc-a. Leucurolysin-a (leuc-a) is a P-I class snake venom metalloproteinase (SVMP) from the venom of Bothrops leucurus, a poisonous snake which is responsible for the majority of snakebites in the northeast of Brazil. It has been shown that leuc-a degrades fibrin clots directly in vitro without activating plasminogen (Pg), and does not elicit any hemorrhagic response. Leuc-a is a single chain zinc binding endopeptidase composed of 202 amino acids residues, which shows high similarity with other P-I SVMPs. In this work, leuc-a was crystallized using the hanging-drop vapour-diffusion method. Two data set were collected,one with 1.8 A, and other with 1.6 A. Data sets showed that the crystals belongs to the orthorhombic P212121 space group, with unit-cell parameters very similar. The crystallographic structure of leuc-a was solved by Molecular Replacement technique using the Bothrops asper metalloproteinase (BaP1) structure (PDB code 1ND1) as template.Leuc-a model was refined to a final Rfactor of 0.168 and Rfree of 0.235 against diffraction data of 1.80 A of resolution. The structure displayed the zinc binding motif H142E143XXH146XXG149XXH152 as well as the C164I165M166 motif ( gMet-turn h), which characterize the metzincin superfamily of metalloproteinases. A Zn2+ ion was observed inthe active site cleft of the enzyme and one structural Ca2+ ion was assigned on the molecular surface close to its C-terminal. The Zn2+ ion was tetra-coordinated by three imidazole NÃ2 atoms from H142, H146 and H152 and one catalytic water molecule anchored to the side-chain carboxyl group of E143. Leuc-a has six cysteine residues involved in threedisulfide bridges (Cys117-Cys197, Cys157-Cys164, and Cys159-Cys181). The other data set, with 1.6 A of resolution, was was refined to a final Rfactor of 0.178 and Rfree of 0.231. This model showed a unknown electron density at active site. This ligand was identified, synthesized and tested with leuc-a. The results showed a inhibition of proteolitic activity leuc-a over dimethyl casein.

Seja M um conjunto compacto e conexo do plano que seja a união dos subconjuntos conexos N e S. Seja Z_L=(X_L,Y_L) uma família a um parâmetro de campos vetoriais descontínuos, onde X_L está definida em N e Y_L em S. Ambos os campos X_L e Y_L, assim como as suas dependências em L, são suaves i. e. de classe C^\\infty; a descontinuidade acontece na fronteira comum entre N e S. O objetivo deste trabalho é estudar as bifurcações que ocorrem em certas famílias de campos vetoriais descontínuos seguindo as convenções de Filippov. Aplicando o método da regularização, introduzido por Sotomayor e Teixeira e posteriormente aprofundado por Sotomayor e Machado à família de campos vetoriais descontínuos Z_L obtemos uma família de campos vetoriais suaves que é próxima da família descontínua original. Usamos esta técnica de regularização para estudar, por comparação com os resultados clássicos da teoria suave, as bifurcações que ocorrem nas famílias de campos vetoriais descontínuos. Na literatura há uma lista de bifurcações de codimensão um, no contexto de Filippov, apresentada mais completamente, no artigo de Yu. A. Kuznetsov, A. Gragnani e S. Rinaldi, One-Parameter Bifurcations in Planar Filippov Systems, Int. Journal of Bifurcation and Chaos, vol. 13, No. 8: 2157--2188, (2003). Alguns dos casos dessa lista já eram conhecidos por Kozlova, Filippov e Machado. Neste trabalho nos propomos a estudar as bifurcações de alguns dos casos, apresentados no artigo de Kuznetsov et. al, através do método da regularização dessas famílias. Nesta Tese consubstanciamos matematicamente a seguinte conclusão: As bifurcações das famílias descontínuas analisadas ficam completamente conhecidas através das bifurcações apresentadas pelas respectivas famílias regularizadas, usando recursos da teoria clássica suave. Let M be a connected and compact set of the plane which is the union of the connected subsets N and S. Let Z_L=(X_L,Y_L) be a one-parameter family of discontinuous vector fields, where X_L is defined on N and Y_L on S. The two fields X_L, Y_L and their dependences on L are smooths, i. e., are of C^\\infty class; the discontinuity happens in the common boundary of N and S. The objective of this work is to study the bifurcations which occurs in certains families of discontinuous vector fields following the conventions of Filippov. Applying the regularization method, introduced by Sotomayor and Teixeira, to the family of discontinuous vector fields Z_L we obtain a family of regular vector fields which is close to the original family of discontinuous vector fields. In the literature there is a list of codimension one bifurcation, in the Filippov sense, presented more completely, in the article of Yu. A. Kuznetsov, A. Gragnani e S. Rinaldi, One-Parameter Bifurcations in Planar Filippov Systems, Int. Journal of Bifurcation and Chaos, vol. 13, No. 8: 2157--2188, (2003). Some of those cases was already known by Kozlova, Filippov and Machado. In this work we propose to study the bifurcations of some of those cases, presented in the article of Kuznetsov et. al, by the method of regularization of those families. In this thesis we justify mathematically the following conclusion: The bifurcations of the analysed discontinuous families are completelly known by the bifurcations contained in the respective regularized families, using the methods of the classical theory of regular vector fields.

A geometria de teias dedica-se ao estudo de invariantes locais para uma determinada configuração de folheações. Uma d-teia é uma coleção de folheações que estão em posição geral. Desta forma, uma d-teia plana, definida em \'R POT.2\' ou \'C POT.2\', nada mais é que uma família de d folheações por curvas. Apresentamos neste trabalho os principais conceitos da teoria clássica de teias, iniciada por W. Blaschke por volta de 1930, bem como uma abordagem atual utilizada no estudo de teias planas. São abordados dois tipos de problemas importantes na teoria: os problemas de linearização e de algebrização de teias. Provamos um resultado clássico no que concerne ao problema de linearização, e um resultado de algebrização de teias empregando métodos desenvolvidos mais recentemente Web geometry is devoted to the study of local invariants of a certain configuration of foliations. A d-web is a collection of foliations in general position. Therefore, a d-web defined in \'R POT. 2\' or \'C POT. 2\' is just a family of d foliations by curves. We present in this work the main concepts of classical theory of webs, initiated by W. Blaschke around 1930, as well as newer methods used in the study of plane webs. We approach two important types of problems in the theory: problems of linearization and that of algebrization of webs. We prove a classical result concerning the linearization problem, and a result of algebrization of webs using recently developed methods

Estudamos singularidades de famílias de matrizes simétricas. O objetivo é classificar as singularidades simples de tais famílias e estudar a geometria de alguns objetos associados a elas We study the singularities of families of symmetric matrices. The aim of this work is to classify simple singularities of such families and study the geometry of some objects associated to them

Após a descoberta dos primeiros peptídeos potenciadores de bradicinina (PPBs) no início dos anos 70, por Sérgio Ferreira e colaboradores, várias moléculas similares foram identificadas na peçonha de artrópodes e vertebrados. Utilizando ferramentas proteômicas, uma nova família de peptídeos foi isolada da peçonha do escorpião Tityus serrulatus e denominada T. serrulatus Hipotensinas (TsHpts). Estes peptídeos são lineares e capazes de potenciar os efeitos hipotensivos da bradicinina (BK). Foi realizado um estudo de minimização da estrutura primária de TsHpt-I (AEIDFSGIPEDIIKQIKETNAKPPA), um membro desta família, para inferir os resíduos de aminoácidos cruciais para a atividade biológica das Hipotensinas, além de avaliar a estrutura primária mínima capaz de manter esta atividade. Utilizando a extremidade C-terminal de TsHpt-I como molde, foram sintetizados os peptídeos TsHpt-I[17-25] (KETNAKPPA); TsHpt-I[21-25] (AKPPA); TsHpt-I[22-25] (KPPA); TsHpt-I[23-25] (PPA); TsHpt-I[22-24] (KPP); TsHpt-I[22-23] (KP); TsHpt-I[23-24] (PP); TsHpt-I[24-25] (PA) e TsHpt-I[ac22-24] (acKPP), que não contém uma carga positiva na sua cadeia lateral. Todos os peptídeos que apresentam as duas prolinas C-terminais foram capazes de potenciar a BK, sendo que a carga positiva do radical da lisina se mostrou crucial para que estes peptídeos induzam uma hipotensão imediata e transiente, quando administrados intravenosamente. O efeito vasodilatador, dependente de endotélio e da síntese de NO, também foi afetado pela ausência da carga positiva deste resíduo de aminoácido. Diferentemente da grande maioria dos PPBs descritos, TsHpt-I e seus análogos sintéticos não foram capazes de inibir a ECA. Este estudo também revelou que a minimização estrutural de TsHpt-I não alterou significativamente os seus efeitos cardiovasculares, muito importante do ponto de vista biotecnológico, pois peptídeos de baixa massa molecular apresentam poucos, ou nenhum ponto de clivagem proteolítica, além de terem baixo custo de síntese. Using a proteomic approach, a new structural family of peptides was put in evidence in the venom of the yellow scorpion Tityus serrulatus. T. serrulatus Hypotensins (TsHpt) are random-coiled linear peptides that act as bradykinin potentiating peptides (PPBs). Aiming to better understand the relationship between the primary structure of TsHpt-I (AEIDFSGIPEDIIKQIKETNAKPPA) and its capacity to potentiate the hypotensive effect of BK, some synthetic peptides were constructed using the C-terminal portion of TsHpt-I as model; TsHpt-I[17-25] (KETNAKPPA); TsHpt-I[21-25] (AKPPA); TsHpt-I[22-25] (KPPA); TsHpt-I[23-25] (PPA); TsHpt-I[22-24] (KPP); TsHpt-I[22-23] (KP); TsHpt-I[23-24] (PP); TsHpt-I[24-25] (PA) and TsHpt-I[ac22-24] (acKPP), which do not have the positive charge in the lysine radical. All synthetic peptides holding the doublet PP at the C-terminal could potentiate the hypotensive effect of BK, but only the analogs that have the lysine residue, could induce a transient hypotension when intravenously administrated in male rats, indicating that the positive charge located towards the radical of this amino acid residue is crucial for this cardiovascular effect. The capacity of these peptides to induce an endothelium and NO dependent vasorelaxating effect was either affected by the absence of this positive charge. Despite several PPBs inhibit ACE, TsHpt-I and the synthetic analogs could not inhibit this enzyme. This study has also demonstrated that the reduction of the primary structure of TsHpt-I does not significantly alter the biological effects of this native peptide, which could be interest by biotechnological purpose, as minimization of enzymatic hydrolysis points, as well as lowering production costs.

COITINHO, J. B. Caracterização estrutural da forma recombinante da proteína Pb27 de Paracoccidioides brasiliensis. 2009. Dissertação (Mestrado) - Departamento de Bioquímica e Imunologia. Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, 2009. Paracoccidioidomicose (PCM) é uma das mais importantes micoses sistêmicas do Brasil. O agente etiológico da doença é o fungo termo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. A infecção causa lesões nos pulmões e pode disseminar para outros órgãos e tecidos. No entanto, ainda não existe um protocolo específico de controle da doença nem diagnóstico padronizado ou protocolo de tratamento. O antígeno recombinante de 27k-Da (Pb27r) tem sido utilizado com alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico da PCM, mas sua função biológica no fungo é desconhecida. Além disso, nenhuma outra proteína similar foi descrita nos bancos de dados. O gene para a Pb27 foi inicialmente clonado em nosso laboratório no vetor de expressão fusionado à GST, mas as tentativas de cristalizar a proteína purificada falharam e construções diferentes foram preparadas. O gene para a Pb27 foi subclonadono vetor de expressão pET-DEST42 com cauda de histidinas C-terminal.Pb27r-CHis foi expressa em E. coli BL21 e purificada utilizando cromatografia de afinidade. Para confirmar a expressão da proteína, foi realizado um Western blot utilizando soro de camundongos anti-Pb27. Ensaios de cristalização da Pb27r-CHis foram inicialmente realizados através de kits de cristalização utilizando a técnica de difusão de vapor, mas nenhum cristal de proteína foi observado. Outras 544 condições foram testadas automaticamente, mas novamente, cristais não se formaram. Nesse meio tempo, o gene da Pb27 foi subclonado em outro vetor de expressão (pDEST 17) com cauda de histidina N-terminal (Pb27r-NHis). Essa proteína foi expressa e purificada seguindo omesmo protocolo para a Pb27r-CHis, mas, novamente, nenhum cristal foi observado. Os resultados dos experimentos de espalhamento dinâmico da luz (DLS) e dicroísmo circular (CD) indicaram que as duas proteínas, apesar de parcialmente polidispersas em solução, apresentavam-se estruturadas, com cerca de 40 % de -hélices. Na tentativa de facilitar a formação de cristais pela minimização da entropia de superfície da proteína Pb27r, foi realizada mutação sítio dirigida para trocar dois resíduos teoricamente de superfície, K e E por duas A. Essa proteína (Pb27r-mut) foi clonada no vetor pDEST 17 mas se tornou insolúvel. Para remover regiões protéicas mais flexíveis que dificultam aformação de cristais, as proteínas Pb27r-CHis e Pb27r-NHis foram submetidas à proteólise limitada com tripsina. Uma região de aproximadamente 25 kDa se manteve constante nas duas construções quando analisadas por SDS-PAGE e MALDI-MS. Como até o momento, todas as tentativas de cristalizar a Pb27 recombinante não foram bem sucedidas, tentavas de cristalização da proteína nativa através de sua purificação por afinidade utilizando anticorpos anti-Pb27 obtidos da imunização de coelho serão realizadas. O estudo da estruturatridimensional desta proteína permitirá um entendimento mais detalhado desta molécula, tal como a localização de seus epitopos e seu dobramento. Além disso, a informação estrutural dessa proteína provavelmente ajudaria a identificar sua função no fungo P. brasiliensis. COITINHO, J. B. Structural characterization of recombinant form of theprotein Pb27 from Paracoccidioides brasiliensis. 2009. Dissertation(Masters). Departamento de Bioquímica e Imunologia. Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, 2009. Paracoccidiodomycosis (PCM) is one of the most important systemic mycoses in Brazil. The etiologic agent of the disease is the thermal dimorphic fungusParacoccidioides brasiliensis. The infection causes lesions in the lungs and can disseminate to other organs and tissues. So far, there is no specific control program, standardized diagnostic or treatment protocol for this disease. The recombinant 27-kDa antigen (Pb27r) has been used with high sensibility and specificity in the diagnosis of PCM but its biological function in the fungus is unknown. Besides, no other similar protein has been described so far in databases. The gene of Pb27 was initially cloned in our laboratory into the expression vector pGEX with a GST-tag, but the attempts to crystallize the purified protein were unsuccessful and different constructs have been prepared. The gene was subcloned into the expression vector pET-DEST42 with a His-tagat the C-terminus. Pb27r-CHis was expressed in E. coli BL21 and purified using a metal-affinity chromatography. To confirm the Pb27r expression, a Western blot using mouse anti-Pb27 serum was performed. Crystallization of Pb27r-CHis was initially performed with commercially available sparse-matrix screens using the hanging-drop vapour diffusion technique. So far, no protein crystals have been observed and others 544 conditions were tested automatically, but nocrystals were formed again. In the mean time, the Pb27 gene was alsosubcloned into another expression vector (pDEST 17) with an N-terminal Histag (Pb27r-NHis). This protein was expressed and purified using the same protocol for Pb27r-CHis but the initial crystallization attempts did not produce crystals. The results of the experiments of dynamic light scattering (DLS) and circular dichroism (CD) showed that the proteins, although partially polydisperses in solution, were structured, with about 40% of -helix. In an attempt to facilitate the formation of crystals by minimizing the entropy of the Pb27r surface, site directed mutation was held to exchange two theoretically surface residues, E and K for two A. This protein (Pb27r-mut) was cloned in the vector pDEST 17 but became insoluble. To remove more flexible protein regions that hinder the formation of crystals, the proteins Pb27r-CHis and Pb27r-NHis were subjected to limited proteolysis with trypsin. A region of approximately 25 kDa remained constant in the two constructs when analyzed by SDS-PAGE and MALDI-MS. As so far, all attempts to crystallize therecombinant Pb27 failed, the crystallization of the native protein through its affinity purification by using anti-Pb27 antibodies obtained from theimmunization of rabbits will be performed. The study of the three-dimensional structure of this protein will enable a more detailed understanding of this molecule, such as the location of their epitopes and its folding. Besides, structural information about this protein could probably help to identify its biological function on P. brasiliensis.

Neste trabalho, desenvolvemos o artigo On the motion under focal attraction in a rotating medium de J. Sotomayor [9] que trata de um sistema de equações diferenciais bidimensional que modela o seguinte problema na Biologia: num recipiente raso de seção circular, com líquido, girando a uma velocidade angular ω, existem platelmintos, organismos vermiforme, eles s ao atra´ıdos por um ponto luminoso fixo perto da borda do recipiente e nadam com uma velocidade v em direçãoa este ponto. O problema é mostrar que existe um ponto de equilíbrio onde os platelmintos vão se aglomerar com o passar do tempo. É analisada a dinâmica da modelagem: existência de pontos de equilibrio e estabilidade do sistema e bifurcaçoes. Analisamos tambem tres modificaçoes desse sistema. Na parte final, e discutido um criterio para determinaçao da ausencia de orbitas periodicas em campos vetoriais planares. In this work, we develop the article On the motion under focal attraction in a rotating medium , of J. Sotomayor, which deals with a bidimensional differential system that model the following Biological problem: in a shallow recipient with circular section, with liquid in, spinning with angular speed ω, there are platyhelminthes, flatworms organisms, they are attracted by a fix lighting point near of the border of the recipient and they swim with a speed v in the direction of the this point. The problem is to show that there exists an equilibrium point where platyhelminthes go to cluster by the time passing. It s analyzed the dynamic of the model: existence of critical points and stability of the system and bifurcations. We analyzed three modifications of this system too. In the last part, it s discussed a criterium for non existence of periodic orbits of a planar vector fields in a simply connected region.

Algumas relações entre A-invariantes de germes de aplicações de coposto 1 equidimensionais f : \'C POT. n\' , 0 \'SETA\' \"C POT.n\', 0 são descritas. O principal resultado estabelece que a soma alternada de números de Milnor dos fechos dos conjuntos Ai na fonte de f é igual a multiplicidade local de f menos n + 1. E existem fórmulas correspondentes para os s-tipos estáveis locais A(\'k IND.1\' ,...\'k IND.s\'). As relações nos garantem condiçõoes para a A-finitude de f e para a A-trivialidade topológica de deformações de f. Também classificamos os germes de aplicações A-simples f : \'C POT.2\', 0 \'SETA\' \'C POT.5\', 0, para multiplicidades 1, 2 e 3 Some new relations between A-invariants of equidimensional corank-1 map germs f :\'C POT.n\', 0 \' \'ARROW\' \'C POT.n\', 0 are described. The main local result states that the alternating sum ofthe Milnor numbers of the closures of the Ai sets in the source of f is equal to the local multiplicity of f minus n + 1. And there are corresponding formulas for the s-local stable types A(\'k IND.1\' ,...,\'k IND.s\'). The realations provide simplified (or weaker) conditions for the A-finiteness of f and for the topological A-triviality of deformations of f. We also classify the A-simple germs f : \'C POT.2\', 0 \'ARROW\' \'C POT.5\', 0 for multiplicities 1, 2, and 3

Neste trabalho foi feita uma análise comparativa entre duas metodologias clássicas no estudo de contatos em proteínas: a dependente de um delimitador de distância (CD - CutoffDependent) e outra que não é dependente de um delimitador, a decomposição de Delaunay (DT Delaunay Tessellation). Essas técnicas foram avaliadas usando-se duas formas diferentes de representação de resíduos (centróides): pelo carbono alfa (CA) e pelo centro geométrico da cadeia lateral (GC). Um banco de dados foi montado, compreendendo dois conjuntos chamados ALPHA e BETA contendo cadeias das duas principais classes do sistema de classificação CATH: all-alpha e all beta, respectivamente. Um delimitador em 7.0 Å emergiu como um importante parâmetro de distância na análise dos contatos inter-resíduos em proteínas. Este valor marca o ponto de bifurcação no comportamento das curvas decontatos entre as técnicas CD e DT. Até 7,0 Å, as propriedades CD e DT são unificadas numa mais abrangente: nesta distância, todos os contatos (arestas) são totais e verdadeiro-positivos (completos e não-oclusos). A distância de 7,0 Å é o ponto também em que a primeira camada de vizinhos encontra-se otimamente separada das demais, constituindo-se principalmente de contatos de primeira-ordem. É demonstrado que 7,0 Å é um ponto de transição entre os comportamentos lineares e quadráticos da curva do número total de vizinhos por resíduo. Também é mostrado que a técnica DT tem uma conhecida anomalia em sua contagem de arestas que, em proteínas, pode produzir omissões indesejáveis e sistemáticas afetandoprincipalmente a rede de contatos de proteínas betas com centróides em CA. Uma técnica auxiliar reconhecida por tratar essa anomalia é o quase-Delaunay (AD Almost Delaunay). É observado que mesmo AD não se mostra uma técnica proveitosa em proteínas. É empiricamente demonstrado que DT+AD convergem para CD, na medida que o parâmetro de perturbação em AD cresce. Isto alerta que DT e técnicas correlatas devem ser usadas com precaução em proteínas. Como conseqüência, no estrito intervalo de 0,0 Å a 7,0 Å, CD revela-se uma metodologia mais simples, completa e confiável. Por fim, é evidenciadotambém que a redução na representação dos resíduos aos centróides CA e GC pode introduzir tendências estatísticas na análise de vizinhos em delimitadores até 6,8 Å, com CA em favor ALPHA e GC em favor de BETA. Para valores acima de 6,8 Å, este viés parece ser eliminado. Isto provê um argumento a mais em benefício do limite em 7,0 Å, como umparâmetro de referência, robusto e de carácter geral, a ser usado de forma segura como um confiável delimitador de distância nos estudos em massa de contatos de proteínas. In this study we carried out a comparative analysis between two classical methodologies used to prospect residue contacts in proteins: the traditional cutoff dependent (CD) approach and the cutoff free Delaunay tessellation (DT). Additionally, two alternative coarse-grained forms to represent protein residues were tested: using alpha carbon (CA) and using side chain geometric center (GC). A database was built, comprising two top classes according to CATH classification: all alpha and all beta. We found that the cutoff value at about 7.0 Å emerges asan important distance parameter in analysis of contacts in proteins. This value was not only independent of residue representation and of protein class but it was also the point where CD and DT methods diverged regarding their results. Up to 7.0 Å, CD and DT properties areunified, which implies that at this distance all identified contacts (edges) are fully truepositives (complete and not occluded). This unification may also imply that the edges distribution up to 7.0 Å is constituted mainly by contacts involving buried sites of the first coordination shell. We also have shown that DT techniques have a known anomaly, comprehending points near the degenerate condition, which in proteins may producedangerous and systematic errors affecting mainly the contact network in beta chains with CA residue representation. The almost-Delaunay (AD) approach has been proposed to solve this DT anomaly. We found that even AD may not be an advantageous solution. We empiricallydemonstrated that the DT+A results converge to CD, as the AD threshold perturbation parameter grows. This warns that DT and correlated techniques should be used with care in contacts analysis of proteins. As a consequence, in the strict range up to 7.0 Å, the CD approach revealed to be a simpler, more complete and reliable technique than DT (or DT+AD) to prospect protein contacts. Finally, we have shown that coarse-grained residue representation may introduce bias in the analysis of neighbors in cutoffs up to 6.8 Å, with CA in favor of all alpha proteins and GC in favor of all beta proteins. Beyond 6.8 Å, this bias isapparently eliminated. This provides an additional argument in benefice of the value 7.0 Å as an important lower bound cutoff to be used in contact analysis of proteins, for both CA and GC coarse-grained models.

Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri The enzyme α-galactosidase (α-D-galactoside galactohydrolase, EC 3.2.1.22) catalyzes the cleavage of α-1,6-galactosyl terminal residues present in different substrates, including linear and branching oligosaccharides, polysaccharides and synthetic substrates such as p-hitrophenyl-α-1,6-galactosyl -D- galactopyranoside (ρNPαGal). The α-galactosidase is very important because of its potential industrial uses. Among these uses, it stands out the capacity to hydrolyze raffinose oligosaccharides (RO), which are the main responsible factors for gastrointestinal disorders related with the ingestion of soybean-derived products. The intestinal mucous membrane of humans and monogastric animals lacks the α-galactosidase enzyme, which is essential for the hydrolysis of these oligosaccharides. The reduction of these soybeanderived sugars can therefore improve the nutritional quality of these foods. The objective of this work was to produce, purify and characterize α-galactosidases from Aspergillus terreus, evaluating its hydrolytic capacity on raffinose oligosaccharides (RO) found in soybean products. The fungus Aspergillus terreus grew in mineral liquid medium containing wheat bran as carbon source for 168 hours at 28° C. Gel-filtration, hydrophobic interaction, ion exchange and affinity chromatographies were used to obtain purified α-galactosidase E1 and partially purified E2. Native gel was also used as the last stage of α-galactosidase E1 purification. Maximum activities of α-galactosidases E1 and E2 were detected at pH 5 and 5.5 and at the temperatures 60 and 50 oC, respectively. Enzyme α-galactosidase E1 maintained 90% of its initial activity when pre-incubated for 12 hours at 55 °C, whereas α-galactosidase E2 maintained only 5% of its activity when pre-incubated in the same conditions. KM values for ρNPαGal, mellibiose, stachyose and raffinose for α-galactosidase E1 were 0.66, 1.92, 10.94 and 27.93 mM, respectively, whereas for α- galactosidase E2 the KM for ρNPαGal and mellibiose was 0.20 and 20.14 mM, respectively. The α-galactosidases showed specificity for galactose at α position, hydrolyzing synthetic ρNPαGal substrate, mellibiose, stachyose and raffinose. Copper sulfate, mercury chloride, silver nitrate and SDS totally inactivated the two enzymes, whereas zinc sulfate totally inactivated α-galactosidase E1 and reduced α-galactosidase E2 activity by 48%. The α-galactosidase E2 in the presence of ρNPαGal substrate underwent competitive inhibition by galactose (Ki 0.76 mM). Activation energy of ρNPαGal substrate was found to be 51.17 and 36.71 kJ/mol for α-galactosidases E1 and E2, respectively. The mellibiose substrate had activation energy for α- galactosidase E1 and E2 of 53.83 and 39.83 kJ/mol respectively. Substrates raffinose and stachyose had activation energy of 55.18 and 42.81 kJ/mol respectively, for α-galactosidase E1. The treatments of defatted soybean extract with α-galactosidases E1 and E2 resulted in 100% reduction in stachyose after 12 hours of incubation, however raffinose still remained 24% higher than the initial level, which can be explained by the fact that this sugar is one of the products of stachyose hydrolysis, causing therefore its accumulation. After 12 hours of incubation of α-galactosidase E2 with the defatted extract, 18 and 25% of raffinose and stachyose were hydrolyzed, respectively. Therefore, it can be concluded that α- galactosidase E1 can be preferably used to reduce RO, being indicated for the industrial processing of these sugars. A enzima α-Galactosidase (α-D-galactosideo galactohidrolase, EC 3.2.1.22) catalisa a clivagem de resíduos terminais α-1,6- galactosil presentes em vários substratos, incluindo oligossacarídeos lineares e ramificados, polissacarídeos e substratos sintéticos tal como o p-nitrofenil-α-D- galactopiranosídeo (ρNPαGal). A α-galactosidase é de grande importância devido seu potencial em aplicações industriais. Dentre estas a capacidade em hidrolisar os oligossacarídeos de rafinose (RO) que são os principais fatores responsáveis por distúrbios gastrintestinais relacionados com a ingestão de produtos derivados de soja. A mucosa intestinal de humanos e animais monogástricos não possui a enzima α-galactosidase, essencial para a hidrólise desses oligossacarídeos. Portanto a redução desses açúcares nos derivados de soja poderá melhorar as qualidades nutricionais desses alimentos. O objetivo deste trabalho foi produzir, purificar e caracterizar α- galactosidases de Aspergillus terreus, avaliando sua capacidade hidrolítica sobre os oligossacarídeos de rafinose (RO) presentes em produtos de soja. O fungo Aspergillus terreus cresceu em meio mineral líquido contendo farelo de trigo como fonte de carbono por 168 horas a 28 °C. Para obtenção da α-galactosidase purificada E1 e parcialmente purificada E2, foram utilizadas cromatografias de gel filtração, interação hidrofóbica, troca iônica e afinidade. Foi também utilizado gel nativo como última etapa de purificação da α-galactosidase E1. Atividades máximas das α-galactosidases E1 e E2 foram detectadas em pH 5,0 e 5,5 e nas temperaturas de 60 e 50 oC, respectivamente. A enzima α-galactosidase E1 manteve 90% de sua atividade inicial quando pré-incubada por 12 horas a 55 °C e a α-galactosidase E2 manteve apenas 5 % da sua atividade quando pré-incubada nas mesmas condições. Os valores da KM para ρNPαGal, melibiose, estaquiose e rafinose para a α-galactosidase E1 foram de 0,66, 1,92, 10,94 e 27,93 mM, respectivamente, enquanto que, para a α-galactosidase E2 o KM para ρNPαGal e melibiose foram de 0,20 e 20,14 mM, respectivamente. As α-galactosidases apresentaram especificidade para galactose em posição α, hidrolisando o substrato sintético ρNPαGal, estaquiose, rafinose e melibiose. Sulfato de cobre, cloreto de mercúrio, nitrato de prata e SDS inativaram totalmentes as duas enzimas, enquanto que sulfato de zinco inativou totalmente a α-galactosidase E1 e reduziu 48 % a atividade da α-galactosidase E2. A α-galactosidase E2 na presença do substrato ρNPαGal sofreu inibição competitiva com galactose (Ki 0,76 mM). Para o substrato ρNPαGal foi encontrada uma energia de ativação igual a 51,17 e 36,71 kJ/mol para as α-galactosidases E1 e E2, respectivamente. Para o substrato melibiose a energia de ativação para a α-galactosidase E1 foi de 53,83 kJ/mol e para a E2 foi 39,83 kJ/mol. Para os substratos rafinose e estaquiose, a energia de ativação encontrada foi de 55,18 e 42,81 kJ/mol, respectivamente, para a α-galactosidase E1. Os resultados dos tratamentos do extrato desengordurado de soja com as α-galactosidases E1 e E2 mostraram uma redução de 100% da estaquiose após 12 horas de incubação, porém a rafinose ainda permaneceu 24 % a mais que o teor inicial, fenômeno que pode ser justificado pelo fato deste açúcar ser um dos produtos da hidrólise da estaquiose havendo então um acúmulo de rafinose. Para a α-galactosidase E2, ao final de 12 horas de incubação com o extrato desengordurado, 18 e 25 % dos açúcares rafinose e estaquiose foram hidrolisados, respectivamente. Portanto, observa-se que preferencialmente a α-galactosidase E1 pode ser utilizada para redução dos RO, sendo indicada para utilização industrial no processamento destes açúcares.

As aminoacil tRNA sintetases (AaRSs) são enzimas essenciais na síntese de proteínas assegurando a correta relação entre os aminoácidos e seus tRNA cognatos. O genoma mitocondrial dos tripanossomatídeos perdeu os genes codificantes dos tRNAs, assim os tRNA mitocondriais são codificados no núcleo e importados do citoplasma. O código genético do kinetoplasto desvia do código genético pela utilização do códon de terminação UGA para a decodificação do códon do triptofano. Um único gene codificando o tRNATrp(CCA) observado no genoma de Leismania é responsável pela incorporação do aminoácido triptofano durante a síntese proteíca na mitocôndria. Para decodificar os dois códons do Trp (UGA e UGG) a base na posição 34 do tRNATrp(CCA) passa por um evento de editoração, convertendo o ribunuclotídeo C34 em U34, produzindo o tRNATrp(UCA) capaz de decodificar o códon UGA. Nesse trabalho foram caracterizadas duas triptofanil tRNA sintetases de Leishmania major. De acordo com experimentos de ?western blotting? e análises ?in silico? das seqüências de aminoácidos, uma enzima tem localização citoplasmática (LmTrpRS1) enquanto a outra mitocondrial (LmTrpRS2). Os mRNAs dos dois genes foram definidos por experimentos de 5? e 3? RT-PCR. As duas enzimas foram clonadas em diversos vetores de expressão procariotos e eucariotos. A LmTrpRS1 foi obtida somente na fração insolúvel, já a LmTrpRS2 foi obtida na fração solúvel quando clonada no vetor de expressão pET28a. Esta porém mostrou-se instável precipitando rapidamente após sua purificação. Os ensaios enzimáticos realizados com a mesma mostraram que ela é capaz de reconhecer os tRNAsTrp editado e não editado. Modelagem molecular por homologia com as duas proteínas foi realizada usando a proteína citoplasmática humana como molde, para estudar a interação entre a proteína e o tRNATrp. Xylella fastidiosa é um bactéria gram negativa limitada ao xilema, responsável por um grande número de doenças economicamente importantes, como a doença de Pierces em videiras, Clorose variegata do Citrus (CVC) e a doença da requeima das folhas em outras plantas incluindo, amendoeira, ameixeira, louro, amoreira e café. Em todos os casos a X. fastidiosa afeta o xylema da planta causando redução na produção de frutos. Nesse trabalho nós mostramos a estrutura da Xylellaína, uma cisteíno protease desse patógeno. A estrutura foi resolvida por dispersão anômala a um único comprimento de onda, utilizando cristais de xylellaína selenometionina substituídos. A estrutura da Xylellaína foi refinada até 1,65 Å de resolução, mostrando enovelamento similar às proteínas da família da papaína, porém algumas características interessantes como uma região N-terminal composta por 38 aminoácidos cobrindo o sulco ativo da enzima, um intrigante ribonucleotídeo encontrado fora do sítio ativo da enzima e um ?loop? semelhante ao ?loop? de oclusão presente na catepsina B. The aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs) are essential enzymes in protein synthesis that ensure the correct match between amino acids and their cognate tRNAs. The mitochondrial (kinetoplast) genome of trypanossomatids lacks tRNA genes, and therefore nucleus-encoded tRNAs are imported from the cytoplasm, the kinetoplast genetic code deviates from the universal code in that UGA instead of UGG encodes for tryptophan. A single nucleus-encoded tRNATrp(CCA) is responsible for Trp insertion during organellar protein synthesis. To decode both Trp codons (UGA and UGG), tRNATrp(CCA) undergoes a single C to U editing event at position 34 of the anticodon yielding to versions of the tRNA in the mitochondria with anticodon CCA and UCA, permitting UGA decoding. This work have characterized two Leishmania major tryptophanyl-tRNA synthetase, acording western blotting experiments and ?in silico? sequence analisis one of cytoplasmatic localization (LmTrpRS1) and another from mitochondria localization (LmTrpRS2). The mature mRNA transcripts for both genes were defined by 5? and 3? RT-PCR. Both enzymes were cloned into several expressions vectors. LmTrpRs1 was obtained as an insoluble protein and LmTrpRs2 expressed into the soluble fraction in pET28a expression system. LmTrpRS2 protein, however, is unstable precipitating shortly after purification. The enzymatic assay showed that this enzyme is able to recognize both tRNATrp. Molecular modeling for LmTrpRS1 and LmTrpRS2 were constructed using the cytoplasmatic human tryptophanyl tRNA synthetase as a model, to study the interaction between proteins and tRNATrp. Xylella fastidiosa is a xylem-limited, gram-negative bacteria responsible for a large number of economically important plant diseases, such as Pierces disease in grapevines, citrus variegated chlorosis (CVC) in sweet oranges and leaf scorch diseases in other plants, including almond, plum, oleander, mulberry and coffee. In all cases, X. fastidiosa infects the plant xylem and impairs fruit production. Here, we report the crystal structure of xylellain, a cystein protease from X. fastidiosa. The structure was solved by single-wavelength anomalous dispersion (SAD) using seleno-methionine containing xylellain crystals. The final structure of Xylellaína was refined against the best native data set (1.65 Å) showing R/Rfree= 17/21. Xylellain shares fold similar to Papain like Family, but contains some interesting features, like a 38 N-terminal tail covering the active site cleft; one intriguing ribonucleotide found outside the active site and one loop that resemble the ocluding loop from cathepsin B.

Brucella abortus é uma bactéria intracelular facultativa, Gram-negativa, que infecta animais domésticos e o homem, causando a brucelose. O LPS presente em sua membrana é um dos principais fatores de virulência. Esta estrutura determina a morfologia das colônias que podem ser lisas ou rugosas. Este trabalho tem como objetivo a inativação do gene wbkC, que codifica uma enzima formiltransferase envolvida na biossíntese do LPS, das linhagens selvagem e vacinal da B. abortus visando o desenvolvimento de uma nova cepa vacinal. Por recombinação homóloga dupla foram obtidos os mutantes B. abortus wbkC S2308 e B. abortus wbkC S19. A confirmação da mutação no gene wbkC foi avaliada pelas técnicas de PCR e Southern blot. As colônias destes mutantes apresentaram morfologia rugosa quando coradas com cristal violeta. Através da técnica de imunoblotting utilizando anticorpo específico para o LPS rugoso, o LPS das cepas mutantes foi reconhecido, porém com um padrão de bandas diferenciado do LPS liso das cepas parentais. Os mutantes obtidos foram avaliados em modelos animais em camundongos C57BL/6 e camundongos deficientes para o gene que codifica o fator regulador de interferon do tipo 1 (IRF-1(-/-)). As cepas mutantes da B. abortus apresentaram uma menor persistência quando comparadas com as cepas parentais B. abortus S2308 e S19, e uma virulência bastante semelhante à cepa vacinal RB51. A capacidade dos mutantes conferirem proteção ao desafio com a cepa selvagem B. abortus S2308 também foi avaliada. B. abortus wbkC S2308 induziu uma proteção em camundongos IRF-1(-/-) semelhante à observada naqueles animais vacinados com as cepas vacinais B. abortus S19 e RB51. Pode-se concluir que os mutantes da B. abortus para o gene wbkC apresentaram reduzida virulência quando comparados às linhagens selvagem e vacinais. Além disso, o mutante B. abortus wbkC S2308 induziu uma proteção em camundongos IRF(-/-) semelhante às cepas vacinais mostrando-se ser um candidato em potencial para compor uma vacina viva contra a brucelose. Brucella abortus is a Gram-negative facultative intracellular pathogen that affects several domestic animals and occasionally man, causing brucellosis. Brucella LPS is one of the main virulence factors of this bacterium. Additionally, the wbkC gene product, the focus of this study, participates in LPS biosynthesis as a formyltransferase enzyme. Alterations in wbkC may cause modifications in LPS structure altering bacterial colony morphology from smooth (S) to rough (R). The main goal of this study was to inactivate the wbkC gene of the B. abortus wild type and vaccine strains in order to generate a new vaccine strain. Mutants B. abortus wbkC S2308 and B. abortus wbkC S19 were obtained by double homologous recombination. Characterization of these mutants was performed by PCR using specific primers. Southern blot confirmed that the wild type wbkC gene was disrupted within Brucella mutants. Morphology of mutant colonies presented rough phenotype demonstrated by crystal violet staining. Immunobloting analysis of Brucella mutants was performed and their LPS were recognized by rough LPS specific monoclonal antibodies. Persistence of the mutants were studied in both murine models: IRF(-/-) and C57BL/6. Brucella wbkC mutants were shown to be less virulent than wild type and B. abortus S19 strains and similar phenotype to B. abortus RB51 strain. Regarding protective immunity, the mutant B. abortus wbkC S2308 strain was able to induce similar protection when compared to S19 and RB51 vaccine strains in IRF(-/-) mice. In conclusion, wbkC mutants were less virulent than the wild type and vaccine strains, but only B. abortus wbkC S2308 induced similar protection level as induced by the vaccine strains commercially available. This data suggests that B. abortus wbkC S2308 is a potential candidate for the development of a live vaccine against brucellosis.

Estudaremos as singularidades genéricas de superfécies regradas em R3. O objetivo do trabalho é mostrar que as singularidades genéricas que ocorrem no conjunto das superfícies regradas são as mesmas que ocorrem no conjunto das aplicações diferenciáveis de R2 em R3, enquanto que as singularidades genéricas das superfícies desenvolvíveis, que formam um subconjunto das superfícies regradas, são mais degeneradas. We study generic singularities of ruled surfaces in R3. In this work we show that generic singularities appearing in the set of ruled surfaces are the same that occur in the set of map germs from R2 to R3, while the generic singularities of developable surfaces are more degenerate.

O objetivo desta tese é estudar a geometria diferencial plana local de uma hipersuperfície regular M em R4, usando a teoria de singularidades. Esta geometria é obtida através do estudo do contato de M com retas, planos e hiperplanos. O contato com hiperplanos (respectivamente, retas e planos) é medido através das singularidades dos elementos da família de funções altura H : M x S3 → R (respectivamente, família de projeções P M x S3 → R3 e II : M x G(2,4) → R2), onde S3 é a esfera unitária em R4, e G(2,4) é a Grassmaniana de 2-planos em R4. Escrevendo M localmente na forma de Monge w = f(x,y,z) obtemos as condições sobre os coeficientes da expansão de Taylor de f para identificar as singularidades genéricas de Hu , Pu e nu. Estudamos as estruturas dos conjuntos em M de um dado tipo de singularidade, usando a aplicação Monge-Taylor e os teoremas de transversalidade de Thom. Além disso, mostramos que existe uma relação de dualidade entre certos estratos dos conjuntos de bifurcações de H e P, e deduzimos propriedades geométricas sobre estes conjuntos. Estudamos também o comportamento de P em um ponto umbílico plano parcial. A família II é de 4 parâmetros, portanto as singularidades genéricas que ocorrem são aquelas de codimensão ≤ 4. Precisamos então completar a tabela de singularidades dos germes R3, O → R2, O em [45]. Fizemos isso usando o programa \"Transversal\" feito por Neil Kirk [26]. Obtemos critérios geométricos para reconhecer as singularidades de codimensão ≤ 1 e para estabelecer quando II é um desdobramento versal de IIu. We initiate in this thesis the study of the local flat geometry of smooth hypersurfaces M in R4 using singularity theory. This geometry is obtained by studying the contact of M with lines, planes and hyperplanes. The contact with hyperplanes (respectively, lines and planes) is measured by the singularities of the elements of the family of height functions H: M x S3 → R (respectively, projections to hyperplanes P : M x S3 → R3, and projections to planes II: M x G(2,4) → R2), where S3 is the unit sphere in R4, and G(2,4) is the Grassmanian of 2-planes in R4. We write locally M in Monge form w = f(x, y, z) and obtain the conditions on the coefflcients of the Taylor expansion of f for identifying the generic singularities of Hu, Pu and IIu. We study the local structures of the set of points in M of a given singularity type using the Monge-Taylor map and Thom\'s transversality theorems. We also show that there is a duality relation between some strata of the bifurcation sets of H and P, and deduce geometric properties about these sets. We study in more details the behaviour of P at a partial flat umbilic point. The family II is of 4 parameters, so the generic singularities that occur in IIu are of codimension ≤ 4. Therefore we need to complete the list of singularities of germs R2, O → R2, O given in [45]. We do this using \"Transversal\", a program elaborated by Neil Kirk [26]. We also obtain geometric criteria for recognizing the codimension ≤ 1 singularities of IIu and for establishing when II is a versal unfolding of IIu.

O objetivo central deste trabalho é estudar a geometria extrínseca de superfícies em R4. Um dos aspectos centrais de nosso trabalho é estender os resultados de dualidade obtidos por Bruce e Romero-Fuster em [11] para superfícies e curvas em R4. Usando então estes resultados, obtemos informações sobre a geometria de M relacionando, via dualidade, as singularidades das famílias de funções altura, projeções em planos e projeções em 3-espaços. Os resultados obtidos permitem estender o conceito de dualidade também para superfícies com fronteira em R4. In this work we study some aspects of the extrinsic differential geometry of surfaces in R4. Our main purpose is to extend de duality results obtained by Bruce and Romero-Fuster in [11] for surfaces and curves in R4. We use these duality results to obtain information about the geometry of the surface, by relating the singularities of the three families of orthogonal projections. These results allow us to extend the concept of duality for surfaces with boundary in R4.

Consideremos a classe de equações diferenciais-diferenças singularmente perturbadas εx(t) = Σlr=0 αr x (t-r), ε > 0 (1ε e seu limite formal quando ε → 0: 0 = Σlr=0 α r x (t-r). (10). Utilizando um método introduzido por Carvalho [5], exibimos soluções periódicas de (1ε) e (10) e definimos hipersuperfícies de bifurcação dessas soluções no espaço dos parâmetros (α0, α 0 (1ε) and its formal limit as ε → 0: 0 = Σlr=0 αr x (t-r). (10). Using a method due to Carvalho [5], we exhibit periodic solutions of (1ε) and (10) and define bifurcation hypersurfaces for these solutions in the parameter space (α0, α1,...αl). Aiming to establish relations between the dynamics of (1ε) and (10) in case / = 2, α0 = 1, we prove that the stability region of (1ε) in the space (α1, α2) approaches the stability region of (10), as ε → 0, in a precise sense given in Theorem 4.1.1.

Uma equação diferencial binária é uma equação diferencial implícita da forma a(x, y)dy2 + 2b(x, y)dxdy + c(x, y)dx2 = O, onde a, b, c são funções diferenciáveis de x e y. Em um ponto (x, y) onde seu discriminante, Δ (x, y) = b2 (x , y) - a(x ,y)c(x, y), é maior que zero, a equação define um par de direções no plano. Uma maneira natural de estudar esta equação é levantar este par de campos de linhas a um único campo definido num espaço de recobrimento associado ao conjunto Δ = {(x, y)/b2(x, y) - a(x ,y)c(x , y) > 0}. A. Davydov [Dv], seguindo o trabalho pioneiro de L. Dara [Dr], classificou pares de campos genéricos quando o conjunto Δ é uma curva diferenciável. J. W. Bruce e F. Tari estudam em [BT - 1] a classificação topológica das curvas integrais da equação quando a função Δ(x, y) apresenta uma singularidade do tipo Morse. Esta classificação é feita reduzindo a equação implícita à sua forma normal. O objetivo deste trabalho é estudar as equações diferenciais binárias, na vizinhança de um ponto singular isolado. A análise destas singularidades é feita através de informações dadas pelo polinômio de Taylor das funções a, b e c, sem reduzir a EDB à sua forma normal. Os resultados são aplicados ao estudo das linhas de curvatura de superfícies em R3 e ao estudo das linhas assintóticas de mergulhos convexos de superfícies em R4. A binary differential equation is an implicit differential equation of the form a(x, y)dy2 + 2b(x,y)dxdy + c(x , y)dx2 = O, where a, b, c are smooth functions of x and y. At a point (x, y) where the discriminant, Δ(x, y) =b2 (x, y) a(x,y)c(x,y), is greather or equal than zero, the equation defines a pair of directions in the plane. A natural way to study this equation is to lift these bivalued direction fields to a single field defined on a covering space associated to the set Δ = {(x, y)/b2(x, y) a(x,y)c(x,y) > 0}. A. Davydov [Dv], following the pioneer work of L. Dara classified generic bivalued fields when the set Δ is a smooth curve. J. W. Bruce e F. Tari estudied in [BT a topological classification of the integral curves of the equation when the function Δ(x, y) presents singularity of Morse type. Their approac,h is to reduce the implicit equation to a normal form. The purpose of this work is to study the binary differential equations, in the neighbourhood of one isolated singular point. An analysis of these singularities is made through informations given by the Taylor\'s ,polynomial of the functions a, b e c, without reducing the EDB to a normal form. The results are applied to the study of the lines of curvature of surfaces in R3 and to the study of the asymptotic lines of convex embeddings of surfaces em R4.

Orientador: Marco Antonio Teixeira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matematica, Estatistica e Computação Científica Resumo: Neste trabalho, estudamos as singularidades simétricas de campos veto­riais reversíveis sobre um espaço de dimensão três, e tal que a dimensão do espaço de pontos fixos da involução associada é dois. Apresentamos todos os tipos topológicos de singularidade simétricas de codimensão zero, um e dois, e suas respectivas formas normais, usando a noção de CO-equivalência. Abstract: Not informed. Doutorado Doutor em Matemática

Não disponível We study the geometry of m-submanifolds embedded in Rm+k, k ≥ 2, through their generic contacts with hyperplanes. Our approach to this problem is to relate the geometric properties of the submanifold to the ones of the canal hypersurface associate to it. We consider the Gauss mapping defined on the canal hypersurface and the relationship between its generic singularities and the corresponding singularities of the families of height functions defined on the manifold. We give definitions of osculating hyperplanes and binormal directions of an m-submanifold of Rm+k, and as a consequence of the setting we analyse the existence of binormal directions in terms of the generic geometry of the submanifold. We also show that for a generic embedding, the restriction to the parabolic set of the natural projection of the hypersurface to the submanifolds is a stable mapping. We use this mapping to define asymptotic directions on the submanifolds and to obtain a duality relationship between binormal directions and asymptotic directions of the submanifold. This result extend the local aspects of a result due to Bruce and Romero Fuster in [11]. The generic embeddings of surfaces in R4 are studied in great detail the inflection points of then are shown to be the umbilic points of their families of height functions. As a consequence of the generic behavior of the umbilic points of locally convex embeddings of surfaces in R4, we prove that for such embeddings, 2 | x{M) ≤ the number of inflection points of M. In particular locally convex embedded surfaces with non-zero Euler characteristic have at least 4 inflection points (this is an extension to 4-space of a result of Feldman in [21]).