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Orientador : Prof. Dr. Renato Marques Coorientadores : profª. Drª. Fátima Maria de Souza Moreira, Prof. Dr. Emanuel Maltempi de Souza Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Florestal. Defesa: Curitiba, 15/07/2016 Inclui referências Área de concentração : Conservação da Natureza Resumo; A diversidade, a abundância e a dinâmica da microbiota do solo em florestas dependem, em grande parte, do processo de transformação da matéria orgânica do solo, cujas características dependem da vegetação florestal. Acredita-se que a presença de diferentes espécies florestais sobre o solo pode influenciar a BMS e a atividade microbiana; e entre outros, o processo de mineralização do N no solo. Os objetivos deste trabalho foram investigar as relações entre espécies arbóreas leguminosas (Andira anthelmia, Inga edulis, Inga striata, Pterocarpus rorhii) nativas da Floresta Atlântica do Sul do Brasil e parâmetros edáficos de natureza microbiológica. Avaliou-se C da biomassa microbiana (CBM) e N microbiano (Nmic), respiração basal do solo (RBS), quociente metabólico (qCO2) e a mineralização do nitrogênio; e caracterizou-se genotipicamente as comunidades microbianas do solo em áreas de regeneração natural em diferentes estágios sucessionais. A extração do CBM e Nmic foi realizada pelo método de irradiação-extração, a RBS por incubação das amostras com retenção de CO2 por NaOH e o qCO2 pela razão entre RBS e CBM; taxa de N mineralizado foi avaliada pelo método de incubação anaeróbica; e a diversidade de bactérias diazotróficas foi realizada pelo método de diluição seriada e cultivo em placa com os meios LGI, NFb e JNFb, purificação das colônias, amplificação e sequenciamento do 16S. Os resultados CBM e Nmic foram mais elevados no solo sob Inga edulis e Andira anthelmia; a RBS foi mais elevada no outono; qCO2 foi menor na primavera. Os valores de CBM e Nmic foram mais elevados no solo sob Inga edulis e Andira anthelmia; a RBS foi mais elevada no outono; qCO2 foi menor na primavera. Os valores de N mineralizado foram mais elevados nos solos sob I. edulis, assim como na camada superficial do solo e variaram conforme as estações do ano; indicando, assim, influência da espécies florestal, da profundidade de amostragem e das condições meteorológicas sobre a atividade microbiana. A caracterização genotípica mostrou que as bactérias encontradas pertencem aos filos Proteobacteria (90,4%), Firmicutes (4,8%) e Actinobacteria (4,8%). A maior diversidade de gêneros ocorreu nos solos sob A. anthelmia (14 gêneros); Burkholderia, Cupriavidus, Pseudomonas e Rhizobium foram mais frequentes, somando 37,5% da frequência total de gêneros; observou-se distinção das espécies florestais, com características como valores de pH, P, K, Ca e Mg agrupadas ao I. edulis; e, por fim, a distinção da floresta primária quanto as características químicas do solo. Assim, o estudo conclui que os fatores clima, espécies florestais e formação florestal podem influenciar o desenvolvimento e atividade microbiana do solo. Palavras-chave: Biomassa Microbiana do Solo, mineralização de N, bactérias diazotróficas, atividade microbiana e Fixação Biológica de Nitrogênio. Abstract: The diversity, abundance and dynamics of soil microbiota in forests depends to a large extent on the process of transformation of soil organic matter, the characteristics of which depend on forest vegetation. It is believed that the presence of different forest species on the soil can influence BMS and microbial activity; and among others, the process of N mineralization in the soil. The objectives of this work were to investigate the relationships between tree species (Andira anthelmia, Inga edulis, Inga striata, Pterocarpus rorhii) native to the Atlantic Forest of southern Brazil and edaphic parameters of a microbiological nature. It was evaluated the carbon of the microbial biomass (CMB) and microbial nitrogen (Nmic), basal respiration of the soil (BRS), metabolic quotient (qCO2) and the mineralization of the nitrogen; and the microbial communities of the soil were characterized genotypically in areas of natural regeneration in different successional stages. The extraction of the CMB and Nmic was carried out by the irradiation-extraction method, the BRS by incubation of the samples with retention of CO2 by NaOH and the qCO2 by the ratio between BRS and CMB; mineralized N rate was evaluated by anaerobic incubation method; and the diversity of diazotrophic bacteria was performed by the serial dilution method and plaque culture with the LGI, NFb and JNFb media, colonization purification, 16S amplification and sequencing. The CMB and Nmic results were higher in the soil under Inga edulis and Andira anthelmia; BRS was highest in the fall; qCO2 was lower in spring. The values of mineralized N were higher in the soils under I. edulis, as well as in the superficial layer of the soil and they varied according to the seasons of the year; indicating, therefore, the influence of the forest species, the depth of sampling and the meteorological conditions on the microbial activity. The genotypic characterization showed that the bacteria found belong to the phyla Proteobacteria (90,4%), Firmicutes (4,8%) and Actinobacteria (4,8%). The greatest diversity of genera occurred in soils under A. anthelmia; Burkholderia, Cupriavidus, Pseudomonas and Rhizobium were more frequent, accounting for 37.5% of the total frequency; was observed the distinction between forest species, with characteristics such as pH, P, K, Ca and Mg values grouped with I. edulis; and, finally, the distinction of the primary forest as the chemical characteristics of the soil. Thus, the study concludes that the factors climate, forest species and forest formation may influence the development and microbial activity of the soil. Key-words: Soil Microbial Biomass, mineralization of N, diazrotrofic bacterial, microbial activity and Biological Nitrogen Fixation.

Orientadora : Profª Drª Emanuel Maltempi de Souza, Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo Co-orientadores : Dr.Helisson Faoro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2014 Inclui referências Resumo: Celulases apresentam diversas utilidades industriais, desde uso em etapas de polimento de tecidos até produção de biocombustíveis, especialmente de bioetanol de 2ª geração. Na busca por novas celulases, a prospecção em bactérias colonizadoras de plantas pode levar a identificação de enzimas particulares. Este trabalho teve como objetivo identificar, expressar e caracterizar genes de possíveis celulases e hemicelulases presentes no genoma de Azospirillum brasilense, uma bactéria colonizadora de rizosfera de gramíneas. Genes codificando glicosil-hidrolases foram identificados por comparação de sequências. Os genes identificados foram posteriormente clonados e expressos em E. coli. Dos 10 genes codificando prováveis glicosil hidrolases, 4 foram clonados em vetor de expressão. Dois dos plasmídeos obtidos, contendo genes de uma celulase e uma hemicelulase, permitiram superexpressar as proteínas recombinantes em E.coli que foram purificadas com sucesso. Porém, as 4 enzimas não demonstraram atividade de degradação celulolítica ou hemicelulolítica. Com a finalidade de se identificar se realmente há enzimas com atividade de degradação de celulose ou xilana em A. brasilense, a bactéria foi cultivada em meios específicos contendo apenas celulose ou xilana como fonte de carbono. Evidência de crescimento foi observada apenas na presença de xilana, o que leva a crer que há maquinaria ativa capaz de degradar este polímero em A. brasilense estirpe FP2. Palavras-chave: celulases, xilanases, Azospirillum brasilense. Abstract: Cellulases have many industrials uses, from polishing fabrics to biofuel production, especially second generation bioethanol. Searching for new cellulases, bioprospection in plant-root-colonizing bacteria could lead to discover novel enzymes. This study aimed to identify and characterize possible cellulolytic and hemicellulolytic enzymes in genome of Azospirillum brasilense. Sequence comparison was used for identification of glycosyl hydrolases (cellulases and xylanases) in the A. brasilense draft genome. Four out of 10 selected genes were cloned and overexpressed in E. coli. Of these four, a probable cellulase and a hemicellulase were purified successfully. However, the four enzymes had no degradation activity. In order to determine if A. brasilense is capable of degrading cellulose or xylan, the bacterium was grown in media containing either cellulose or xylan as sole carbon source. Only xylan sustained A. brasilense growth, suggesting the presence of active machinery capable for degrading this polymer in A. brasilense strain FP2. Key-words: cellulases, xylanases, Azospirillum brasilense.

Orientador : Prof. Dr. Geraldo Picheth Co-orientador : Prof. Dr. Emanuel Maltempi de Souza Co-orientador : Prof. Dr. Philippe Gillery Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 19/03/2014 Inclui referências Área de concentração: Análises clínicas Resumo: O diabetes mellitus gestacional (diabetes gestacional, DMG) é definido como a intolerância à glucose diagnosticada durante a gestação e que claramente não é diabetes prévio ou manifesto. No Brasil afeta cerca de 4-7% das gestações sendo fator predisponente para o aumento da morbidade na gestante, feto e neonato. O objetivo do trabalho foi associar a variabilidade genética de sítios polimórficos A3243G do mtDNA, rs10885122 do gene ADRA2A, rs2237892 do gene KCNQ1, rs1801282 do gene PPARg, rs5393 do gene SLC2A2 e rs3758947 do gene ABCC8 com o diabetes gestacional, bem como buscar biomarcadores para a patologia. A amostra foi composta de 814 gestantes (89,7% Euro-Brasileiras), classificadas em gestantes saudáveis (CTRL, n=506) e portadoras de diabetes gestacional (DMG, n=308). O projeto teve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com seres Humanos do HC-UFPR (CEP/SD: 927.052.10.05 e CAAE: 1924.0.000.091-10). As gestantes do grupo DMG apresentaram (mediana) idade (32 vs 26 anos, P

Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria diazotrófica e endofítica, encontrada em associação com gramíneas de grande importância para a alimentação humana e animal como o milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa), sorgo (Sorghum bicolor), cana-de-açúcar (hibridos interespecíficos de Saccharum), e também algumas espécies tropicais como a bananeira (Musa spp) e o abacaxizeiro (Ananas comosus). O H. seropedicae é uma bactéria promotora do crescimento vegetal (PGPR-Plant Growth Promoter Rhizobacteria), sendo, portanto utilizada como biofertilizante. As análises da expressão gênica através dos níveis de RNA mensageiro (mRNA) ou dos níveis protéicos, são ferramentas importantíssimas para se compreender o funcionamento dos sistemas biológicos e a interação entre plantas e bactérias. Na análise proteômica, um conjunto de técnicas permite a análise e identificação de proteínas diferencialmente expressas em condições distintas. Usando tais técnicas é possível traçar um perfil da interação entre plantas e bactérias já que os mecanismos moleculares da interação entre cana-de-açúcar e Herbaspirillum seropedicae não são entendidos inteiramente. Neste trabalho utilizou-se a técnica de eletroforese 2D-PAGE e espectrometria de massa do tipo MALDI-ToF para separar e identificar as proteínas de H. seropedicae diferencialmente expressas na fase exponencial de crescimento na presença de 5% de extrato de cana-de-açúcar. As proteínas diferencialmente expressas foram validadas pela técnica de qRT-PCR. Um total de 16 proteínas diferencialmente expressas por H. seropedicae foram identificadas (1 exclusivamente expressa, 7 ausentes, 5 com expressão aumentada e 3 com expressão diminuída) na presença do extrato de cana-de-açúcar. Assim o extrato de cana foi capaz de induzir e reprimir genes específicos de H. seropedicae. As proteínas diferencialmente expressas sugerem que a exposição ao extrato de cana-de-açúcar induz mudanças metabólicas e adaptações em H. seropedicae presumivelmente em preparação para estabelecer uma interação com a planta.

Resumo: O arroz é alimento básico para aproximadamente metade da população mundial. O aumento desta população, portanto, demanda de uma maior produção de arroz. Nesse sentido, o melhoramento na cultura deste cereal e novas tecnologias de cultivo é de suma importância para aumentar a produtividade sem aumento da área de plantio. Herbaspirillum seropedicae coloniza arroz e outras plantas e promove o seu crescimento e produtividade. Os mecanismos envolvidos nessa interação benéfica entre H. seropedicae e plantas de arroz não são bem compreendidos e fatores moleculares envolvidos permanecem desconhecidos. Para compreender melhor essa interação, o transcriptoma de raízes de arroz (Oryza sativa L. cv. Nipponbare) inoculadas e não inoculadas com H. seropedicae foi determinado. Para isto foi utilizado técnica de sequenciamento de cDNA (RNA-seq) em uma plataforma de sequenciamento SOLiDTM. O mapeamento da biblioteca de RNA-seq de raízes de arroz 3 dias após inoculação produziu um total de 22 milhões de sequências mapeadas apenas uma vez no genoma de O. sativa representando 13.838 transcritos expressos com pelo menos duas vezes de cobertura do gene. Foram obtidos 1019 genes diferencialmente expressos (valor-p< 0,05), sendo que destes 256 possuem diferença de expressão entre controle e inoculado de pelo menos duas vezes. Entre os genes regulados observou-se um grande número de genes codificando proteínas relacionadas ao sistema de defesa da planta, tais como, proteínas induzidas por probenazol, proteínas de resistência a doenças e enzimas envolvidas na biossíntese de flavonóides. Todos esses genes estão reprimidos pela presença de H. seropedicae em raízes de arroz. Além disso, genes relacionados à síntese e efluxo de fitossideróforos (PS) e transporte do complexo PS-Fe foram induzidos em raízes de arroz. Genes relacionados à via de sinalização de auxina e a 1-aminociclopropano oxidase, que catalisa a biossíntese de etileno, também são regulados pela inoculação com H. seropedicae. As leituras de sequências foram também mapeadas no genoma de H. seropedicae. Genes relacionados à fixação de nitrogênio, motilidade celular e biogênese da parede celular foram expressos pela bactéria. Os resultados indicam que o sistema de defesa da planta é reprimido pela presença da bactéria enquanto que o sistema de aquisição de Fe está ativado. Os resultados obtidos e as vias metabólicas discutidas neste trabalho poderão contribuir para elucidar o mecanismo de interação planta-bactéria.

Resumo: A cana-de-acucar e um importante produto agricola no Brasil, com uma producao de mais de 500 milhoes de toneladas ao ano. A cana-de-acucar e alvo de intensas pesquisas no campo da diversidade bacteriana. O conhecimento das bacterias integrantes das comunidades associadas com culturas agricolas e da situacao do solo e um passo decisivo para compreender como microrganismos influenciam a producao. No entanto, a maioria destes estudos visam isolar bacterias endofiticas ou bacterias rizosfericas associadas a planta em uma abordagem dependente de cultivo. Atualmente, as abordagens independentes de cultivo permitem uma visao mais abrangente de toda a comunidade de bacterias no ambiente estudado. No presente trabalho, utilizou-se uma abordagem independente de cultivo para a avaliacao da comunidade bacteriana associada ao solo rizosferico sob cultivo de cana em diferentes tempos de coleta e de adubacao nitrogenada. Em niveis taxonomicos mais elevados, diferencas significativas entre as amostras nao foram observadas, predominando os filos Proteobacterias (29,5%), Acidobacteria (23,4%), Bacteroidetes (12,2%), e Firmicutes (10,2%). No entanto, em niveis taxonomicos mais baixos, uma diversidade maior foi encontrado associado a administracao de fertilizantes nitrogenados. Bacillus foi o genero predominante, respondendo por 19,7% de todos os generos observados. Generos classicamente descritos, contendo fixadoras de nitrogenio ou promotoras de crescimento das plantas tambem foram encontradas, com representantes dos generos Azospirillum, Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, e Burkholderia.

Resumo: Diversas espécies do gênero Herbaspirillum são organismos fixadores de nitrogênio atmosférico capazes de se associar endofiticamente com plantas de interesse econômico, como milho, arroz, trigo, sorgo e cana-de-açúcar. Herbaspirillum seropedicae e Herbaspirillum rubrisubalbicans são espécies próximas e apresentam um padrão de colonização contrastante quando inoculadas na variedade B-4362 de cana-de-açúcar. H. seropedicae é um diazotrofo que promove o crescimento vegetal e aumenta a produtividade, enquanto H.rubrisubalbicans é o causador da doença da estria mosqueada na variedade B-4352 de cana de açúcar e da estria vermelha em variedades susceptíveis de sorgo. Com o objetivo de entender o fenótipo contrastante e identificar os fatores possivelmente relacionados com a interação planta bactéria foram feitas comparações in silico entre os genomas das estirpes M1 e SmR1 de H.rubrisubalbicans e H. seropedicae, respectivamente. Entre as diferenças genômicas observadas foram encontrados genes envolvidos com o metabolismo de lipopolissacarídeos, genes que codificam para adesinas e proteínas efetoras do Sistema de Secreção do Tipo III. Também foi identificado, apenas em H.rubrisubalbicans,um cluster envolvido com a biossíntese de celulose (wss). A expressão dos genes relacionados com a biossíntese de celulose é aumentada quando a estirpe M1 está aderida a superfície de plântulas de milho. Neste trabalho foi construída uma estirpe mutante de H.rubrisubalbicans no gene wssD e a análise do seu fenótipo mostrou que a capacidade de formação de biofilme, o número de bactérias colonizando epifiticamente e endofiticamente raízes de milho diminuiu em comparação com a estirpe selvagem M1.. Estes dados mostram que a biossíntese de celulose está relacionada aos processos de interação planta bactéria e que a presença deste cluster de genes em H.rubrisubalbicans pode estar envolvido com as diferenças fenotípicas observadas entre as bactérias estudadas

Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais frequente no mundo, depois do câncer de pele não melanoma, e a principal causa de morte por câncer entre as mulheres. Os carcinomas do tipo ductal e o lobular são os tipos histológicos de câncer de mama que ocorrem com maior frequência na população. Os carcinomas lobulares invasivos (CLIs) representam em torno de 10-15 % dos casos de câncer de mama, são de difícil identificação e podem ocasionar metástases para alvos pouco comuns como, por exemplo, o sistema gastrointestinal. A perda da expressão de E-caderina reflete a morfologia histológica dos CLIs, entretanto, há uma variação da expressão dessa proteína nos carcinomas lobulares (0-45%). Em um estudo recente foi determinado que o gene ADAM33 apresenta sua expressão diminuída em CLIs devido ao silenciamento por hipermetilação do seu promotor e portanto, a proteína ADAM33 poderia ser um marcador molecular de CLIs. Com o objetivo de avaliar a utilização em imunohistoquímica da proteína ADAM33 como um biomarcador de CLIs, uma parte do gene ADAM33 contendo o domínio rico em cisteínas foi clonado em vetor pGEM T e em seguida subclonado em vetor pET28a. A proteína recombinante foi expressa em sistema procarionte em E. coli BL21 Ai e purificada por cromatografia de afinidade por níquel. A proteina purificada foi utilizada para imunização de camundongos Balb-c e foi produzido soro policlonal com título de 1:25.600. Além disso, o soro policlonal apresentou especificidade para a proteina ADAM33 expressa por linhagens tumorais de mama que expressam o gene ADAM33. O soro policlonal apresentou também especificidade para carcinoma lobular de mama invasivo por ensaio de imunohistoquímica demonstrando, assim, a possibilidade da utilização do anticorpo anti-ADAM33 como biomarcador molecular de carcinoma de mama, mais especificamente do tipo lobular.

Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é catalisada pelo complexo enzimático nitrogenase. Este complexo contém duas metaloproteínas: as proteínas Fe e MoFe e sofre modificação pós-traducional. Em Azospirillum brasilense, objeto deste estudo, a regulação pós-traducional envolve a modificação covalente de uma das subunidades da proteína Fe por ADP-ribosilação. Esta ADP-ribosilação inativa reversivelmente a proteína Fe e é catalisada pela DraT em resposta ao aumento de íons amônio ou depleção da energia celular. O grupo ADP-ribosil é removido pela DraG, promovendo reativação da proteína Fe e consequentemente, da nitrogenase. Além das proteínas DraT e DraG, as proteínas PII estão diretamente envolvidas neste processo de desligamento da nitrogenase. Neste trabalho são apresentados resultados referentes ao controle de DraT exercido pelas proteínas PII. Um protocolo alternativo para a purificação de PII nativas foi desenvolvido com a utilização de um tratamente térmico (80°C/15 min) anterior a injeção na coluna. Este tratamento térmico melhorou a homogeneidade da GlnB de A. brasilense de 70 para 99%. A alta estabilidade térmica foi uma característica comum de proteínas PII de várias Proteobactérias. Os valores de Tm utilizando Sypro Orange foram maiores do que 77°C. Experimentos 1H RMN mostraram que a GlnB de A. brasilense foi estável até 70°C. Além disso, experimentos 1H-15N TROSY confirmaram que as amostras de GlnB obtidas com e sem a etapa de tratamento térmico mantiveram a mesma conformação global. A partir destes resultados, o protocolo de purificação de proteínas PII de Proteobactérias foi desenvolvido com a utilização de uma etapa de tratamento térmico de 70°C/15 min anterior a injeção na coluna que promoveu aumento da homogeneidade de 70 para 95%, com maior quantidade de GlnB após cromatografia. Para avaliar o envolvimento de GlnB e GlnZ de A. brasilense na regulação de DraT, a proteína Fe de Azotobacter vinelandii foi utilizada como substrato para atividade in vitro de DraT complexada ou não com as proteínas PII. Nas condições estabelecidas, GlnB foi necessária para a atividade de DraT na presença de Mg-ADP. O efetor de PII 2-oxoglutarato, na presença de Mg-ATP, inibiu a atividade do complexo DraT-GlnB, possivelmente induzindo a dissociação do complexo. A DraT também foi ativada por GlnZ, bem como ambas proteínas uridililadas. Entretanto, uma variante com deleção parcial na volta T não foi capaz de ativar DraT, sugerindo que este seja o sítio de interação entre DraT e GlnB. Estudos cinéticos revelaram que o complexo DraT-GlnB de A. brasilense é, pelo menos, 18 vezes mais eficiente do que DraT purificada de R. rubrum, mas com um valor de Km para NAD+ similar. Finalmente, os resultados mostraram que a ADPribosilação da proteína Fe não afeta o estado eletrônico do seu centro metálico, mas impede a associação da proteína Fe com a MoFe, consequentemente inibindo a transferência de elétrons.

Resumo: O Herbaspirillum rubrisubalbicans é uma bactéria diazotrófica e endofítica pertencente a classe ? das proteobacterias que é capaz de se associar com várias Poaceae de interesse econômico como milho, arroz, sorgo, trigo e cana-de-açúcar. Esta bactéria é capaz de causar a doença da estria mosqueada na variedade B- 4362 de cana-de-açúcar e a doença da estria vermelha em algumas variedades de sorgo. Em várias plantas a virulência das bactérias patogênicas é em parte dependente de um grupo de proteínas que são injetadas nas células do hospedeiro pelo Sistema de Secreção do Tipo III (SST3). Esta é uma maquinaria altamente conservada capaz de injetar proteínas bacterianas dentro de células eucarióticas. Recentemente, genes hrp/hrc que codificam as proteínas do SST3, foram identificados no genoma de H. rubrisubalbicans. Neste trabalho também identificamos prováveis proteínas efetoras e possíveis regiões promotoras dentro deste cluster. Os genes hrpE e hrcN que foram mutagenizados gerando os mutantes TSE e TSN que foram incapazes de causar a doença da estria mosqueada na cana de açúcar B-4362. A cana-de-açúcar B-4362 quando inoculada com a estirpe selvagem M1 materna apresenta sintomas da doença. A caracterização do funcionamento do SST3 foi feita inoculando os mutantes em outras variedades de gramíneas, como o arroz e milho. Sua capacidade de colonização e de promover o crescimento vegetal foi determinado, permitindo que o mutante no SST3 além de não ter conseguido colonizar arroz, cana de açúcar e milho com tanta eficiência quanto o selvagem, também não foi capaz de promover o crescimento destas plantas. O secretoma de H. rubrisubalbicans foi realizado afim de determianrmos quais proteínas estariam sendo secretadas na presença do caldo da cana B-4362 durante o cultivo, diferentes padrões proteicos foram encontrados sendo que 5 proteínas diferentemente expressas nas duas condições puderam ser identificadas. Estes resultados mostram que o produto dos genes hrpE ou hrcN é essencial para o funcionamento do SST3 em H. rubrisubalbicans ou ainda que este produto faz reação cruzada com outros sistemas interferindo assim na fisiologia da interação desta bactéria com as plantas.

Orientadora : Profa. Dra. Rose Adele Monteiro Co-orientador : Prof. Dr. Emanuel M. de Souza Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 13/12/2013 Inclui bibliografia Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma beta-proteobactéria encontrada em associação com várias plantas economicamente importantes e pode promover o aumento do crescimento e produtividade vegetal. Este estímulo efetivo do crescimento vegetal depende de uma colonização eficiente da planta hospedeira. A associação com o hospedeiro inicia-se com a adesão da bactéria à superfície radicular, seguida de colonização de pontos de emergência de raízes secundárias e penetração através de descontinuidades da epiderme. Ocorre então uma rápida ocupação dos espaços intercelulares, procedendo com colonização do xilema e porções aéreas. Entretanto, a natureza molecular da colonização não está claramente compreendida. Nestas associações, o evento chave parece ser a colonização da rizosfera. Portanto, a identificação e análise dos produtos gênicos envolvidos na colonização de bactérias promotoras do crescimento vegetal (PGPRs) como H. seropedicae em plantas tem importância científica e interesse econômico para potencializar sua aplicação. Assim, este trabalho descreve que o lipopolissacarídeo de H. seropedicae atua como molécula de ancoragem em lectinas radiculares durante adesão, e que o exopolissacarídeo atua como matriz na formação de biofilme em superfícies abióticas. Outros fatores moleculares foram também identificados por análise transcriptômica dessa bactéria durante colonização de milho, discriminando as adaptações moleculares de H. seropedicae para perceber o ambiente, aderir à superfície radicular e sobreviver nos primeiros estágios da colonização da rizosfera. Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a betaproteobacteria found in association with several crops and can promote plant growth and increase productivity. This effective stimulus of plant growth depends on an efficient colonization of the host plant. The association with the host begins with the bacterial attachment onto the root surface, followed by the colonization on points of secondary root emergency and penetration through epidermis discontinuities. A rapid occupation of intercellular spaces then occurs, proceeding with xylem and aerial portions colonization. However, the molecular nature of the colonization is not clearly understood. In these associations, the key event seems to be the rhizosphere colonization. Therefore, the identification and characterization of genic products involved in the plant colonization by plant growth promoting rhizobacteria (PGPRs) such as H. seropedicae has scientific importance and economic interest to potentiate its application. This way, this work describes that the H. seropedicae lipopolysaccharide act as anchoring molecule to radicular lectins during attachment and that the exopolysaccharide act as matrix in biofilm formation on abiotic surfaces. Other molecular factors were also identified by transcriptomic analyses of bacteria during maize colonization, discriminating the molecular adaptations of H. seropedicae when perceiving the environment, attaching onto root surface and surviving in the first stages of rhizosphere colonization.

Resumo: H. seropedicae foi estudado no contexto do metabolismo de fontes alternativas de nitrogênio. A provável existência de um gene do tipo nac no genoma deste organismo foi investigada. Para isso inicialmente caracterizamos o crescimento da estirpe mutante ntrC, DCP286A, em fontes alternativas de nitrogênio porque sabia-se através do estudo em outros organismos que o gene nac é dependente da proteína NtrC-P para sua expressão. Os resultados da análise fisiológica da utilização de fontes alternativas de nitrogênio mostraram a dependência parcial ou total da proteína NtrC-P para o catabolismo da uréia, Lalanina, L-serina e L-prolina. Um modelo de regulação foi proposto mostrando o provável envolvimento da proteína NtrC-P na utilização dessas fontes de nitrogênio. Uma pesquisa no banco de dados do Genopar indicou a presença de três prováveis proteínas do tipo Nac (Nacl, Nac2 e Nac3) e as análises comparativas revelaram que essas proteínas estão em regiões distintas do genoma. As seqüências de aminoácidos das proteínas do tipo Nac de H. seropedicae foram traduzidas e comparadas entre si e os dados revelaram apenas 7,8% de identidade e 23 % de similaridade. Estas seqüências foram também alinhadas com as ortólogas Nac de E. coli e K. aerogenes. Os dados revelaram maior identidade para a proteína do tipo Nacl (27% de identidade), seguida da Nac2 (22%) e Nac3 (16%). Essas proteínas são pertencentes à família LysR de reguladores transcricionais e apresentam um motivo hélice-voltahélice na região N-terminal que é o fragmento mais conservado dessas três proteínas e portanto, característica de todas LTTRs. A provável região promotora do gene do tipo Nacl foi clonada no vetor de transcrição pMP220 originando a fusão pnacl::/acZ. A análise da expressão de pnacl revelou que a proteína NtrCP não é um ativador da transcrição desse gene. Os resultados sugerem que as proteínas do tipo Nacl, Nac2 e Nac3 apresentam funções diferentes das proteínas Nac já estudadas e talvez e provavelmente sem envolvimento com o metabolismo de nitrogênio em H. seropedicae.

Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é um processo essencial para a vida na Terra e é realizada apenas por procariotos. Entre os fixadores de nitrogênio, as bactérias da ordem Rhizobiales são capazes de formar simbiose com leguminosas utilizadas na alimentação humana e animal, como soja e feijão. Nesta associação, a bactéria sofre diferenciação para uma forma bacterióide e ocupa um órgão específico, chamado de nódulo, onde ocorre a fixação de nitrogênio fornecendo os nutrientes necessários à planta. Em termos econômicos, associação de soja e Bradyrhizobium é a mais importante deste tipo de simbiose, representando uma economia estimada para os agricultores brasileiros de cerca de 1,7 bilhão de dólares por ano. Neste estudo, foi obtida a sequência preliminar do genoma de Bradyrhizobium elkanii estirpe 587, utilizada como inoculante para soja no Brasil. Cerca de 6 milhões de leituras Illumina-Solexa, representando uma profundidade de cobertura entre 28x e 32x, foram montadas usando o montador Velvet. Além disso, aproximadamente 40 mil leituras Sanger (profundidade de cobertura entre 4x e 5x) foram montadas com o montador Phrap. Os scaffolds produzidos pelo montador Velvet foram alinhados utilizando o programa MUMmer e o genoma de Bradyrhizobium japonicum USDA 110 como referência. Finalmente, as falhas foram fechadas manualmente utilizando Consed. Palavras

Resumo: Bactérias fixadoras de nitrogênio ou diazotróficas são organismos capazes de reduzir o dinitrogênio atmosférico em amônia, um processo chamado fixação biológica de nitrogênio que é catalisado pela enzima nitrogenase. Azospirillum brasilense é uma bactéria fixadora capaz de se associar a raízes de gramíneas como trigo e arroz, e promover o crescimento do vegetal e aumento de produtividade. Neste trabalho utilizamos 5.768.466 milhões de seqüência de nucleotídeos obtidas em seqüenciador Solexa/Illumina e 112.782.028 milhões de seqüências de nucleotídeos obtidas em seqüenciador SOLID que foram utilizadas para obter uma seqüência parcial do genoma da espécie Azospirillum brasilense estirpe FP2. Para a montagem foi utilizado o montador Velvet para os dados Solexa e um pacote de programas adaptados para a montagem SOLID. Para finalização e correção da montagem, as montagens parciais de cada um dos métodos de seqüenciamentos foram mescladas, resultando em preenchimento de falhas. Como resultado final obtivemos uma sequência com 6.931.925 pb (386 scaffolds e 57 contigs) com aproximadamente 103.630 pb não determinadas. A sequência foi ordenada e alinhada ao genoma de A. brasilense estirpe Sp245 que foi utilizada como sequência de referência. A anotação parcial da sequência permitiu identificar 6119 genes, entre estes os envolvidos no metabolismo do nitrogênio.

Orientador : Prof. Dr. Emanuel M. de Souza Coorientadoras : Profa. Dra. Leda S. Chubatsu, Luíza Maria de Araújo Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 15/02/2012 Bibliografia: fls. 63-72 Resumo: A fixação biológica de nitrogênio é fundamental para disponibilizar este elemento em uma forma que seja metabolicamente utilizável pela maioria dos organismos. Este processo é catalizado pela enzima nitrogenase, que reduz o dinitrogênio gasoso a amônia. A transcrição dos genes envolvidos neste processo é ativada pela proteína NifA, que tem sua atividade controlada pelos níveis de nitrogênio fixado e oxigênio. A proteína NifA é uma proteína ativadora de transcrição da família das EBP, composta por três domínios estruturais. Em A. brasilense, o domínio N-terminal está envolvido na regulação por íons amônio, enquanto um provável grupo Fe-S localizado nos domínios central e C-terminal está envolvido com a sensibilidade ao oxigênio. Para testar a habilidade de uma proteína NifA N-truncada (sem o domínio N-terminal) em ativar a transcrição dos genes nif, nós usamos as estirpes de E. coli YMC10 (estirpe selvagem), RB9060 (glnB-), WCH30 (glnK-) e UNF3435 (glnB- e glnK-), que possuem uma fusão nifH-lacZ cromossomal. A proteína NifA N-truncada de A. brasilense foi capaz de ativar a fusão nifH-lacZ apenas na ausência de oxigênio, confirmando que os domínios central e C-terminal estão envolvidos na regulação por O2. A atividade foi semelhante tanto na presença quanto na ausência de amônio. Houve uma diminuição da atividade da proteína NifA N-truncada de A. brasilense quando esta é co-expressa com seu domínio N-terminal, revelando que esta porção tem a função de controlar negativamente a atividade da proteína NifA na presença de íons amônio. A expressão da proteína NifA N-truncada de A. brasilense e de seu domínio N-terminal foram confirmadas através de imunodetecção. A proteína His-NifA N-truncada foi purificada em anaerobiose e apresentou baixa afinidade pela coluna contendo Ni+2 em ambiente livre de oxigênio. A proteína His-NifA N-truncada purificada apresentou atividade, sendo capaz de se ligar ao promotor do gene nifH de A. brasilense. Abstract: The biological nitrogen fixation is essential to provide the element nitrogen in a form that is metabolically usable by most organisms. This process is catalyzed by the nitrogenase, which reduces dinitrogen to ammonia. The transcription of genes involved in this process is activated by the NifA protein which is controlled by fixed nitrogen and oxygen levels. The NifA protein is a transcriptional activator protein of the EBP family, consisting of three structural domains. In A. brasilense, the N-terminal domain is involved in regulation by ammonium ions, while a putative Fe-S cluster located at the central and C-terminal domain is involved in oxygen sensitivity. To test the ability of an N-truncated NifA protein (without the N-terminal domain) to activate the nif gene transcription, we used the E. coli strains YMC10 (wild type), RB9060 (glnB-), WCH30 (glnK-) and UNF3435 (glnB- and glnK-) carrying a chromosomal nifH-lacZ fusion. The A. brasilense N-truncated NifA protein was able to activate the nifH-lacZ fusion only in the absence of oxygen, confirming that the central domain and C-terminal are involved in O2 regulation. The activity was similar both in the presence or absence of ammonium. There was a decreasing activity when the A. brasilense N-truncated NifA protein was co-expressed with its N-terminal domain, revealing that this portion has the function of negatively controlling NifA activity in the presence of ammonium ions. Expression of the A. brasilense N-truncated NifA protein expression and N-terminal domain were confirmed by immunodetection. The His-N-truncated NifA protein was purified anaerobically and showed low affinity to a Ni+2 bound column in an oxygen-free environment. The purified His-N-truncated NifA protein showed activity, being able to binding to the A. brasilense nifH promoter.

Resumo: RNA-Seq é uma técnica que permite quantificar os níveis de expressão de uma forma muito mais precisa do que os métodos empregados anteriormente. Estudos que utilizaram esse método já alteraram a visão da extensão e da complexidade de transcriptomas eucarióticos. Portanto, para este trabalho, foram utilizadas plantas de arroz como organismo modelo, devido a sua importância global como cultura alimentar. Foram usadas sequências curtas de mRNA obtidas de plantas de arroz (Oryza sativa subs. japonica) inoculada ou não com a bactéria fixadora de nitrogênio Herbaspirillum seropedicae (Brusamarello-Santos et al., dados não publicados). As sequências foram separadas de acordo com as amostras sequenciadas: dois grupos correspondem às amostras de três e sete dias após inoculação, composta por 328.409.635 de sequências de RNA-Seq trimadas. Assim, foi possível reportar o número de TSS's (Transcriptional Start Sites) e os TSS's diferencialmente expressos. Além disso, transcritos montados foram comparados com as estruturas gênicas dos genes anotados na base de dados RAP-DB (transcritos idênticos ou splicing alternativo) ou sem anotação (como os transcritos novos). Um total de 202.770.984 (61,7%) reads mapearam no genoma do arroz: 216.980.165 (75,2%) são reads exônicas, e 71.493.386 (24,8%) mapearam em junções de éxons. Esses números totalizam 288.473.551 de reads alinhadas, evidenciando que 85.702.567 dessas mapeavam em mais de um lugar. Um total de 6.942 (16,4%) e 4.915 (11,6%) genes obtiveram cobertura nas bibliotecas CR3 e IR3; e 6.733 (15,9%) e 3.807 (9%) genes para as bibliotecas CR7 e IR7, respectivamente. Posteriormente, foi possível reportar o número total de genes mapeados, anotados, não-anotados e transcritos com splicing alternativo para o genoma total, realizando a análise até mesmo por cromossomos em separado. Finalmente, após o alinhamento com o BLAST, 691 (3,31%) transcritos não-anotados obtiveram match com as proteínas do banco de dados NR. Em análises futuras, o restante, 20.185 (96,7%) transcritos não-anotados poderão ser comparados com as regiões de microRNA conhecidas no genoma do arroz. Aqueles que não mapearem nessas regiões devem ser sujeitos a uma análise de predição de estrutura secundária, a fim de verificar quanto a possíveis novas moléculas de microRNA reguladoras presentes neste conjunto de dados.

Orientadora : Profa. Dra. Cyntia M.T. Fadel Picheth Co-orientador: Prof. Dr. Emanuel M. de Souza Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 13/12/2012 Bibliografia: fls. 73-87 Resumo: Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) compreende estirpes diarreogênicas de E. coli que são caracterizadas pela produção de toxinas Shiga, seu principal fator de virulência. O objetivo deste trabalho foi determinar o perfil proteômico de STEC M03 crescida na presença e na ausência do sal biliar desoxicolato de sódio (DCS), sob baixos níveis de oxigênio, compará-lo ao de E. coli ATCC 25922, uma estirpe não diarreogênica e identificar as proteínas diferencialmente expressas. As bactérias foram crescidas em meio LB na ausência e na presença de 2,5 mM de DCS, e as células utilizadas para o preparo do extrato de proteínas. O padrão de expressão proteica das estirpes foi determinado através de eletroforese bi-dimensional. Foram realizados 4 ensaios independentes, cada um em duplicata, para cada estirpe. Os géis foram analisados com o programa ImageMaster. As proteínas que apresentaram expressão diferencial em presença de DCS, em ambas as estirpes, foram identificadas por espectrometria de massas do tipo MALDI-ToF/ToF-ToF. Em STEC M03 a proteína fator de elongação Tu (EF-TU) teve sua expressão induzida em presença de DCS. Essa proteína atua na síntese de proteínas e também como chaperona. Duas enzimas tiveram a expressão reprimida pelo DCS: fosfato acetiltransferase (Pta) e glicerol dehidrogenase (GldA). A primeira enzima está envolvida no metabolismo do acetato, e GldA não tem sua função claramente definida em E. coli. Ambas já foram associadas com virulência. Nas condições avaliadas no presente estudo a enzima frutose bifosfato aldolase classe 2 (FbaA2) foi detectada apenas na estirpe M03. Essa enzima atua na via glicolítica e gliconeogênese. Em E. coli ATCC 25922 a proteína Cold Shock Protein A (CspA) teve sua expressão induzida pelo DCS. Dentre os papéis desempenhados por CspA destaca-se o de RNA chaperona. As enzimas: L-treonina dehidratase (TdcB) e glicerofosforil diéster fosfodiesterase (GlpQ) tiveram a expressão reprimida pelo DCS. A primeira participa da degradação de aminoácidos e do metabolismo anaeróbio do propanoato/propionato, enquanto GlpQ participa do metabolismo de glicerofosfolipídeos e do glicerol. Nas condições do presente trabalho, pode-se concluir que as estirpes STEC M03 e E. coli ATCC 25922 apresentam respostas diferentes frente ao agente estressante DCS e que proteínas associadas com o metabolismo e sobrevivência tiveram sua expressão mais afetada. Abstract: Escherichia coli Shiga toxin-producing (STEC) are diarrheagenic strains of E. coli characterized by production of Shiga toxins, their main virulence factor. The objective of this work was to determine the proteomic profile of the STEC E. coli M03 and E. coli ATCC 25922, a non-diarrheagenic strain, grown in the absence and in the presence of the biliar salt sodium deoxycholate (DOC) under low oxygen levels, and to identify the differentially expressed proteins. The bacteria were grown in LB medium in the absence and in the presence of 2.5 mM DOC, and cells were used to prepare the protein extract. The protein profile was determined using 2D-electrophoresis. Four independent assays, in duplicates, were performed for both strains. The 2D gels were analyzed with the software ImageMaster. The proteins that were differentially expressed in response to bile in both bacteria were identified using mass spectrometry MALDI-ToF/ToF-ToF. In STEC M03 the protein elongation factor Tu (EF-TU) was induced in the presence of DOC. This protein has a role in translation and also acts as a chaperone. Two enzymes were repressed by DOC: phosphate acetyltrasferase (Pta) and glycerol dehydrogenase (GldA). The first is involved in the acetate metabolism, and the last has not its role clearly defined in E. coli. Both were also associated with virulence. In the conditions analyzed at this study, the enzyme fructose bisphosphate aldolase class II (FbaA2), was detected only in strain M03. This enzyme acts in the gluconeogenesis and in the glicolysis. In E. coli ATCC 25922 DOC induced the expression of cold shock protein A (CspA). This protein have many cellular functions, one of them is the RNA chaperone activity. Yet in the same condition, this strain repressed the expression of two enzymes: L-threonine dehydratase (TdcB) and glycerophosphoryl diester phosphodiesterase (GlpQ). TdcB is involved in the amino acid degradation and anaerobic propanoate/propionate metabolism. GlpQ is involved in the glycerol and glycerophospholipids metabolisms. At this work conditions, we can conclude that STEC M03 and E. coli ATCC 25922 answered differently to the stress agent DOC. The proteins which more affected expression were metabolic enzymes and those related to survival.

Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria fixadora de nitrogênio capaz de se associar a plantas com interesse econômico. A proteína NifA desse organismo é responsável por regular a síntese das proteínas de estrutura e montagem do complexo enzimático da nitrogenase. A atividade da proteína NifA é regulada por dois sinais ambientais: oxigênio molecular e nitrogênio fixado. O sítio de sensibilidade ao oxigênio é provavelmente um motivo de cisteínas, que é conservado apenas em proteínas NifA sensíveis ao oxigênio. A sensibilidade ao nitrogênio fixado está relacionada com a inibição da atividade da proteína pelo seu domínio N-terminal GAF. O exato mecanismo de inibição da atividade da proteína NifA por esses dois sinais ambientais ainda é desconhecido. O presente trabalho teve por objetivo fornecer dados que auxiliem o melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na regulação da atividade da proteína NifA de H. seropedicae. Para esclarecer o papel do motivo conservado de cisteínas da proteína NifA, a tividade de ligação ao DNA in vitro de uma série de mutantes pontuais neste motivo foi testada. Esse experimento demonstrou que esse motivo não está relacionado com a ligação da proteína ao DNA promotor. Com o emprego de proteínas quiméricas observou-se que o domínio N-terminal GAF da proteína NifA de H.seropedicae não está relacionado com a sensibilidade ao oxigênio, mas sim com nitrogênio fixado. Além disso, foi demonstrado que a proteína GlnK é responsável por transduzir os níveis de nitrogênio fixado para o domínio N-terminal GAF por interação direta proteína-proteína. A avaliação do efeito de efetores metabólicos na formação do complexo GAF/GlnK mostrou que o aumento na concentração de 2-OG pode desestabilizá-lo. Foi avaliado ainda o efeito dos efetores metabólicos na estrutura secundária da proteína GlnK. Utilizando a técnica de ITC foi possível determinar as constantes de afinidade da proteína GlnK de H. seropedicae pelos efetores metabólicos. Com os resultados aqui apresentados foi possível elaborar um modelo de regulação da atividade da proteína NifA de H. seropedicae pelos níveis de nitrogênio fixado e melhorar o entendimento sobre o papel do motivo conservado de cisteínas na atividade da proteína.

Orientadora : Profa. Dra. Rose Adele Monteiro Co-orientador : Prof. Dr. Emanuel M. de Souza Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2011 Bibliografia: fls. 103-118 Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria diazotrófica e endofítica, encontrada associada ao milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa), sorgo (Sorghum bicolor), cana de açúcar (hibridos interespecíficos de Saccharum), e também à algumas espécies tropicais como a bananeira (Musa spp) e o abacaxizeiro (Ananas comosus). O H. seropedicae é uma bactéria promotora do crescimento vegetal (PGPR-Plant Growth Promoter Rhizobacteria), sendo portanto utilizada como biofertilizante. Tadra-Sfeir (2008), construiu uma biblioteca de mutantes aleatórios da estirpe SmR1 de Herbaspirillum seropedicae, que podem ser utilizados para determinar o padrão de expressão do gene mutado, em diferentes condições fisiológicas, devido a inserção do gene lacZ sem promotor. Cinco mil estirpes mutantes tiveram o seu padrão de expressão gênica testado na presença do flavonoide naringenina. Em vinte e duas estirpes mutantes a inserção do gene lacZ ocorreu em genes cuja expressão é regulada por naringenina. Dentre esses vinte e dois, foram encontrados genes que codificam para: proteínas envolvidas na biossíntese de exopolissacarídeos (EpsB) e lipopolissacarídeos (O-antígeno acetilase e aciltransferase); provável proteína membrana, glicosiltransferase e muropeptídeo permease. Dezesseis estirpes mutantes foram caracterizadas através da sua capacidade de formar biofilme e de colonizar epifiticamente e endofiticamente raízes de milho. O perfil eletroforético do LPS sintetizado pelas estirpes mutantes também foi analisado. O mutante MHS05, que possui mutação no gene ampG, apresentou perfil de LPS e estrutura do Lipídio-A diferente da estirpe selvagem SmR1 e também colonizou endofiticamente dez vezes menos raízes de milho do que a estirpe selvagem. Todos os genes com expressão diferencial na presença de naringenina foram validados por PCR em Tempo Real. Neste trabalho também foi utilizada a metodologia de seqüenciamento em larga escala (RNA-seq), utilizando o seqüenciador de nova geração SOLiD, para determinar o transcriptoma total de H. seropedicae na presença de naringenina. O RNA total foi extraído de células que cresceram na ausência (controle) e presença de naringenina (100 ?mol/L). Sessenta e seis milhões de leituras da amostra controle e 61 milhões da amostra naringenina foram obtidas, e destes 50 milhões de leituras (controle) e 47 milhões de leituras (naringenina) foram mapeados com o genoma de referência de H. seropedicae SmR1. As análises dos dados mostraram que 336 genes são regulados por naringenina, sendo 150 genes induzidos e 186 reprimidos pela presença do flavonóide. Dentre esses identificamos genes envolvidos no metabolismo de compostos aromáticos, como os genes pcaFJI, que são fortemente induzidos pela presença do flavonóide indicando que estes podem estar envolvidos com a degradação de naringenina em H. seropedicae. Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a diazotrophic bacterium found in endophytic association with maize (Zea mays), rice (Oriza sativa), sorghum (Sorghum bicolor), sugar cane (Saccharum officiarum) and some tropical species like banana (Musa sp) and pineapple (Ananas comosus). The H. seropedicae is a plant growth promoter bacteria (PGPR - Plant Growth Promoter Rhizobacteria) and can be used as biofertilizer. Tadra-Sfeir (2008) constructed a mutant strains library using the SmR1 strain of H. seropedicae. These mutant strains can be used to determine the pattern of the mutated gene in differential physiological conditions due to insertion of lacZ gene without promoter region. Five thousand mutant strains were screened for differential expression in the presence or absence of naringenin. In twenty two strains the insertion of lacZ gene was found in genes that responded to naringenin. Among these twenty two strains found genes that code to: protein involved in exopolyssacharides biosynthesis (EpsB), lipopolyssacharides (O-antigen acetylase and acyltransferase), putative membrane protein, glycosyltransferase, and muropeptide permease (AmpG). Sixteen mutant strains were analysed by biofilm formation and epiphytic and endophytic colonization in maize roots. The mutant strains LPS profile was also analyzed. One mutant MHS05 (mutated gene codes a muropeptide permease (ampG)), presented the LPS profile and the fine structure of Lipid A different from the wild-type strain SmR1 and this same mutant colonize endophytically maize roots ten times less than the wild type. All the genes with differential expression in the presence of naringenin were validated by real time PCR. We also used a high-throughput sequencing based method (RNA-Seq) using the next-gene sequencer SOLiD to analyse the influence of naringenin on the whole transcriptome profile of H. seropedicae. Total RNA was extracted from cells grown in the absence (control) and presence of naringenin (100 ?mol/L). A total of 66 million reads of the control sample and 61 million of the test sample were obtained and out of these 50 million and 47 million in the control and test sample were mapped to the bacteria. Data analysis demonstrated that 336 genes are regulated by naringenin, 150 genes are induced and 186 are repressed. Genes involved in aromatic metabolism such as pcaFJI are strongly induced, indicate that these genes can be involved in naringenin degradation in H. seropedicae.

Orientadora : Profa. Dra. Liu Un Rigo Co-orientador : Prof. Dr. Emanuel Maltempi de Souza Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 28/02/2011 Bibliografia: fls. 68-77 Resumo: O presente trabalho teve como objetivo quantificar a expressão de genes responsáveis pelo metabolismo de nitrato em H. seropedicae, estirpes SmR1 e DCP286A (ntrC-), por PCR quantitativo em tempo real. A quantificação dos níveis de expressão nas estirpes SmR1 e DCP286A demonstraram que o transportador de nitrato NasFED tem sua expressão dependente de nitrato, possivelmente controlada pela proteína NtrC e ativação dependente da proteína NasR. Os genes narK1UnarGHJI estão organizados em um operon e sua expressão depende de NtrC, da proteína FNR e ainda da proteína NarL. Os genes narKnirBDCnasA também estão organizados em um operon e sua expressão possivelmente está sob o controle de NtrC e de NasR. A expressão genes do sistema de dois componentes narXL parece ser dependente de NtrC, porém os sítios promotores encontrados são fracos. A expressão do gene nasR ainda não está clara, porém a presença de grampos terminadores de transcrição sugerem uma possível auto-regulação. A expressão do gene ntrY na estirpe SmR1 se demonstrou constitutiva e a diminuição da expressão na estirpe DCP286A sugere uma possível dependência da proteína NtrC para expressão de ntrY, porém os dados obtidos não são suficientes para elucidar o papel deste gene no metabolismo de nitrato em H. seropedicae. Abstract: The aim of this work is to study the regulation of nitrate metabolism genes of the diazotrophic bacterium Herbaspirillum seropedicae. Previous work showed that the mutant strain DCP286A (ntrC) is unable to grow using nitrate, indicating that that the ntrC gene is crucial for the regulation of nitrate metabolism. The expression levels of the genes narK, nasA, nirD, narU, narG, nasF, ntrY, nasR and narX were determined in the wild type and DCP286A (ntrC) strains of H. seropedicae grown in the presence of nitrate (10 mM) or ammonium chloride (20 mM).The expression levels were normalized by the expression of the 16S rRNA gene. The results showed that the genes nasF, narK, nasA, nirD, narU, narG are strongly induced by nitrate in the wild type strain but not in the ntrC strain, confirming the role of NtrC in activating the expression of nitrate utilization genes. Sequence analysis of the promoter region of nasFED operon revealed an NtrC and an RpoN binding sites, and a termination hairpin, suggesting that the regulation of the nasFED operon in H. seropedicae is mediated by the NtrC and the anti-terminator NasR proteins. The expression of the narX was also upregulated by nitrate, but at lower extent. In contrast nasR seems to be self-regulated and ntrY expression was neither regulated by nitrate or depedent on NtrC.

Orientador : Prof. Dr. Geraldo Picheth Co-orientadores : Profa. Drª Fabiane G. de M. Rego, Prof. Dr. Emanuel M. de Souza Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba,18/02/2011 Bibliografia: fls. 88-95 Área de concentração: Insumos, medicamentos e correlatos Resumo: O Diabetes mellitus Gestacional (DMG) e definido como qualquer grau de intolerancia a glucose com primeira deteccao durante a gravidez. A patologia tem prevalencia em cerca de 7% das gestacoes e pode promover complicacoes para gestante e feto. A Glucoquinase (GCK) e uma enzima que fosforila a glucose na posicao 6 e atua como sensor para liberacao de insulina do pancreas. Polimorfismos no gene da GCK estao associados ao diabetes monogenico do tipo MODY-2 (Maturity-Onset Diabetes of the Young Type 2). O objetivo deste trabalho foi procurar polimorfismos no gene da GCK em exons e suas regioes flanqueadoras. O estudo tem a aprovacao do Comite de Etica e Pesquisa da Universidade Federal do Parana (UFPR). Foram analisadas por PCR-SSCP (polimorfismo de conformacao de fita simples) e sequenciamento de DNA em 200 amostras de gestantes classificadas em grupo controle (Saudaveis, n=100, CTRL) e diabeticas gestacionais (DMG, n=100). Os grupos apresentaram idade media de 24,9„b6,2, 31,7„b6,3, respectivamente para CTRL e DMG. Enquanto o grupo CTRL foi composto apenas por Euro-Brasileiras, o grupo DMG contempla 10% de Afrodescendentes. As gestantes diabeticas apresentaram IMC superior ao grupo controle, respectivamente, 33,5„b6,3 e 25,2„b4,2. As concentracoes de glucose em jejum, perfil lipidico foram significativamente maiores no grupo com diabetes exceto para o LDL-colesterol que nao diferiu. As determinacoes de ureia e creatinina apontam que ambos os grupos nao demonstram evidencia de lesao renal. A analise molecular obtida de 14 amplicons que cobriram as regioes genicas em estudo mostrou variacoes, todas do tipo transicao, em quatro regioes intronica em 13 das amostras estudadas (6,5%). As variacoes identificadas foram: c.43441A>G (Intro3, nao descrita), c.44702T>C (Intron6, rs2268574), c.48935C>T (Intron9, rs2908274) e c.49620G>A (Exon10, regiao nao codificadora, rs13306388). As frequencias estimadas, bem como 95% de Intervalo de Confianca (95% IC) para os alelos raros das variantes descritas foram: alelo-G, 0,3% (0-1%); alelo-C, 3,3% (2-5%), alelo-T, 0,8% (0-2%) e alelo-A, 1% (0-2%), respectivamente para as variantes detectadas nos Introns4, 6, 9 e Exon10. Para nenhuma das variantes foi observado associacao com processos patologicos. Em sintese, o gene da Glucoquinase nao apresentou variante do tipo ¡§hotspot¡¨ associada com o diabetes gestacional na populacao em estudo e uma nova variante, no Intron3 (c.43441A>G), foi identificada no presente estudo. Abstract: Gestational Diabetes mellitus (GDM) is defined as any degree of glucose intolerance with first detection during pregnancy. The disease is prevalent in about 7% of pregnancies and may lead to complications for mother and fetus. Glucokinase (GCK) is an enzyme that phosphorylates glucose in position 6 and acts as a sensor for the release of insulin from the pancreas. GCK gene polymorphisms are associated with monogenic diabetes type MODY-2 (Maturity Onset Diabetes of the Young Type 2). The aim of this study was investigate for GCK gene polymorphisms in exons and their flanking regions. The study was approved by the Ethics Committee by Federal University of Parana (UFPR). Were analyzed by PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism) and DNA sequencing 200 samples from pregnant women classified in control group (healthy, n=100, CTRL) and gestational diabetes (GDM, n=100). The groups had a mean age of 24.9„b6.2, 31.7„b6.3, respectively for CTRL and DMG. While the CTRL group was composed only of Euro-Brazilian, DMG group has 10% for Afro-descendants. Diabetic women had a BMI (kg/m2) greater than the control group, respectively, 33.5„b6.3 and 25.2„b4.2. The concentrations of fasting glucose and lipid levels were significantly higher in the group with diabetes except for LDL-cholesterol that did not differ. Measurements of urea and creatinine showed that in both groups there was no evidence of renal failure. Molecular analysis obtained from 14 amplicons that comprehends the genetic regions studied showed variations, all in transition form, in four noncoding regions in 13 of the studied samples (6.5%). The variations were identified: c.43441A> G (intron3, not described), c.44702T>C (Intron6, rs2268574), c.48935C>T (Intron9, rs2908274) and c.49620G>A (Exon10 noncoding region, rs13306388). Estimated frequencies and 95% confidence interval (95% CI) for the rare alleles of the variants described were: G-allele, 0.3% (0-1%), C-allele, 3.3% ( 2-5%), T-allele, 0.8% (0-2%) and allele-A, 1% (0-2%) respectively for the variants found in Introns 3, 6, 9 and Exon10. For none of the variants were observed association with disease processes. In summary, the Glucokinase gene variant did not show associated-"hotspot" variant with gestational diabetes in the study population and a new variant in Intron3 (c.43441A>G) was identified in this study.

Resumo: As enzimas nicotinamida adenina dinucleotídeo sintetase (NadE) catalisam o último passo da biossíntese do cofator NAD utilizando como substratos o ATP, o ácido nicotínico adenina dinucleotídeo (NaAD) e uma fonte doadora de grupamento amino, que pode ser a glutamina ou a amônia. O interesse nessa enzima surgiu com a hipótese de uma possível relação funcional entre NadE1 e a proteína transdutora de sinal GlnB devido à conservação filogenética da proximidade física entre os genes que codificam estas proteínas. Em Herbaspirillum seropedicae o gene nadE1 encontra-se a montante do gene glnB. Em H. seropedicae foi identificado um gene homólogo a nadE1, denominado de nadE2. Os genes nadE1 e nadE2 foram amplificados por PCR e clonados no vetor pET28a; versões contendo uma fusão de 6 histidinas na porção N-terminal de NadE1 e de NadE2 foram superexpressas em Escherichia coli e purificadas através de cromatografia de afinidade usando a resina Hi-trap chelating. As proteínas purificadas foram utilizadas em ensaios de atividade enzimática in vitro. A síntese de NAD foi monitorada indiretamente adicionando a enzima álcool desidrogenase ao sistema para reduzir o NAD a NADH, que pode ser quantificado por espectrofotometria. A enzima NadE2 não apresentou atividade in vitro. NadE1 apresentou atividade específica de 1756 mU/mg e 600 mU/mg usando como fonte de grupo amino a amônia e a glutamina, respectivamente. Foram determinadas as constantes de Michaelis para os substratos ATP, glutamina, amônia e o NaAD. Os dados obtidos sugerem que NadE1 utiliza preferencialmente glutamina como fonte de grupos amino. A presença da proteína GlnB uridililada ou desuridililada ao sistema de reação não alterou a atividade de NadE1.

Orientadora: Cyntia Maria Telles Fadel Picheth Co-orientador: Emanuel Maltempi de Souza Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 31/03/2008 Inclui bibliografia e anexo Área de concentraçao: Análises clínicas

Inclui apęndices Orientador : Emanuel Maltempi de Souza Co-orientadora : Rose Adele Monteiro Inclui bibliografia

Orientadora : Marileia Scartezini Co-orientador: Emanuel Maltempi de Souza Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 2006 Inclui bibliografia e anexos Área de concentraçao: Análises clínicas

Orientadora : Cyntia M. T. Fadel Picheth Co-orientador: Emanuel Maltempi de Souza Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia Área de concentraçao: Análises clínicas

Orientador : Emanuel Maltempi de Souza Co-orientadora : Gisele Klassen Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia Resumo: Azospirillum brasilense é um diazotrofo aeróbio encontrado em associação com raízes de diversas plantas de interesse comercial. Em Azospirillum brasilense as proteínas da família PII, GlnB e GlnZ, participam da regulação do metabolismo de nitrogênio, atuando como sinalizadoras dos níveis de amônio intracelular. Mutantes glnB são incapazes de fixar nitrogênio. Neste trabalho, a participação destas proteínas no metabolismo de nitrogênio foi examinada utilizando estirpes mutantes de A. brasilense e plasmídeos expressando genes glnB e glnZ contendo mudanças discretas de um ou dois resíduos de aminoácidos nas respectivas proteínas. As estirpes mutantes utilizadas foram A. brasilense 7628 (glnB negativo), 7611 (glnZ negativo) e 2812 (glnBglnZ negativo). Os derivados dos genes glnZ e glnB de A. brasilense obtidos foram glnZY51-F, glnZI45-T,R101-C, glnBL13-P; glnBV100-A. Os resultados obtidos revelaram que GlnB é essencial para a regulação normal de sistema Ntr, provavelmente regulando a concentração de NtrC-P de acordo com os níveis celulares de amônio. A proteína GlnZ, por outro lado, aparentemente substitui parcialmente GlnB no mutante 7628. Os resultados mostraram também que resíduo V100 da proteína GlnB é importante, embora não essencial, para a interação de GlnB com NtrB, uma vez que essa proteína mutante complementou parcialmente o mutante glnB negativo de A. brasilense. Entretanto, o gene mutante glnBV100-A não complementou o fenótipo Nif negativo do mutante 7628, sugerindo que esta forma de GlnB não interage com a proteína NifA de A. brasilense. O resíduo L13 é essencial para a atividade de GlnB: a sua substituição por P causa a perda da capacidade de GlnB ativar NifA e sinalizar níveis de nitrogênio para o sistema Ntr. O plasmídeo contendo o gene mutante glnZY51-F não foi capaz de complementar o fenótipo de reativação da nitrogenase após choque de amônio (0,2 mmol/L) e o transporte de metil amônio no mutante glnZ negativo 7611 de A. brasilense, sugerindo que a uridililação desta proteína é essencial para a sinalização dos níveis de nitrogênio intracelular no sistema DraT/DraG e para o transporte de amônio. Os resíduos I45 e R101 da proteína GlnZ, altamente conservados nas proteína da família PII, são importantes para a transdução de sinal para o sistema DraT/DraG, mas não alteraram a capacidade de GlnZ em controlar o transporte de metilamônio em A. brasilense. O desligamento parcial da nitrogenase por adição de íons amônio do mutante AmtB reforça a hipótese da existência de um segundo sistema de transporte de amônio em A. brasilense. Os resultados desse trabalho reforçam a diferença funcional das proteínas PII de A. brasilense e apoiam a sugestão de que GlnB é o regulador primário da atividade do sistema de dois componentes NtrB-NtrC e que GlnZ controla o transporte de amônio de alta afinidade via AmtB. Finalmente, a análise do conjunto dos resultados implica que a concentração intracelular destas proteínas e a regulação temporal de sua síntese são elementos importantes de controle de suas atividades. RESUMO: Azospirillum brasilense é um diazotrofo aeróbio encontrado em associação com raízes de diversas plantas de interesse comercial. Em Azospirillum brasilense as proteínas da família PII, GlnB e GlnZ, participam da regulação do metabolismo de nitrogênio, atuando como sinalizadoras dos níveis de amónio intracelular. Mutantes glnB são incapazes de fixar nitrogênio. Enquanto que mutantes glnZ são capazes de fixar nitrogênio. Neste trabalho, a participação destas proteínas no metabolismo de nitrogênio foi examinada utilizando estirpes mutantes de A. brasilense e plasmídeos expressando genes glnB e glnZ contendo mudanças de uma ou duas bases. As estirpes mutantes utilizadas foram A. brasilense 7628 (glnB negativo), 7611 (glnZ negativo) e 2812 (glnBglnZ negativo). Os derivados dos genes glnZ e glnB de A. brasilense obtidos foram g/"ZY51-F, g/"ZI45-T,R101-C, g/"i?L13-P; glnBV 100-A. Os resultados obtidos revelaram que GlnB é essencial para a regulação normal de sistema Ntr, provavelmente regulando a concentração de NtrC-P, de acordo com os níveis celulares de amónio. A proteína GlnZ, por outro lado, aparentemente substitui parcialmente GlnB no mutante 7628. Os resultados mostraram também que resíduo V I00 da proteína GlnB é importante, embora não essencial, para a interação de GlnB com NtrB, uma vez que essa proteína mutante complementou parcialmente o mutante glnB negativo de A. brasilense. Entretanto, o gene mutante glnBVlOO-A não complementou o fenótipo N if negativo do mutante 7628, sugerindo que esta forma de GlnB não interage com a proteína NifA de A. brasilense. O resíduo L13 é essencial para a atividade de GlnB: a sua substituição por P causa a perda da capacidade de GlnB ativar NifA e sinalizar níveis de nitrogênio para o sistema Ntr. O plasmídeo contendo o gene mutante glnZY51-¥ não foi capaz de complementar o fenótipo de reativação da nitrogenase após choque de amónio (0,2 mmol/L) e o transporte de metilamônio no mutante glnZ negativo 7611 de A. brasilense, sugerindo que a uridililação desta proteína é essencial para a sinalização dos níveis de nitrogênio intracelular no sistema DraT/DraG e para o transporte de amónio. Os resíduos 145 e R101 da proteína GlnZ, altamente conservados nas proteína da família PII, são importantes para a transdução de sinal para o sistema DraT/DraG, mas não alteraram a capacidade de GlnZ em controlar o transporte de metilamônio em A. brasilense. O desligamento parcial da nitrogenase por adição de íons amónio do mutante AmtB reforça a hipótese da existência de um segundo sistema de transporte de amónio em A. brasilense. Os resultados desse trabalho reforçam a diferença funcional das proteínas PII de A. brasilense e apóiam a sugestão de que GlnB é o regulador primário da atividade do sistema de dois componentes NtrBNtrC e que GlnZ controla o transporte de amónio de alta afinidade via AmtB. Finalmente, a análise do conjunto dos resultados implica que a concentração intracelular destas proteínas e a regulação temporal de sua síntese são elementos importantes de controle de suas atividades.

Orientador : Emanuel Maltempi de Souza Co-orientador : Leonardo Magalhaes Cruz Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçao em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia Resumo: Bactérias endofíticas vivem no interior das plantas sem causar sintomas aparentes. As bactérias endofíticas podem beneficiar as plantas. Entretanto, dependendo das condições, como interação entre comunidades bacterianas ou competição por nutrientes, uma bactéria endofítica pode se tornar patogênica. A diversidade de endófitos tem sido avaliada em muitas plantas, mas na cana-de-açúcar os estudos têm focado nas bactérias diazotróficas. No presente estudo, a diversidade bacteriana endofítica de colmo e folha de cana-de-açúcar foi pesquisada utilizando métodos bioquímicos e moleculares. Colmo e folha de cana-de-açúcar foram esterilizados superficialmente com etanol 70% (folhas) ou álcool 70% seguida flambagem (colmo). Extratos foram feitos de cada parte da planta e foram inoculados em placas de agar batata e incubados a 30ºC. Quarenta e quatro colônias foram isoladas do colmo e das folhas. O DNA dessas estirpes foi purificado e a porção Y1-Y2 do gene 16S rRNA foi amplificada e seqüenciada. Análises de identidade de seqüência foram feitas pelo programa BLASTn, CLUSTALW e análises filogenéticas pelo MEGA3. Para a caracterização fisiológica foram feitas colorações de gram e perfil bioquímico e fisiológico. A maioria das estirpes isoladas de colmo pertence à família Enterobacteriaceae e a maioria dos isolados da folha é da família Pseudomonaceae, sugerindo que alguns grupos de bactérias ocupem nichos preferenciais. Os isolados foram divididos em cinco grupos, sendo os dois maiores pertencentes à sub-divisão gama-proteobacteria. O grupo I, pertencente à família Enterobacteriaceae e o grupo II, à família Pseudomonaceae. Entre os isolados da família Enterobacteriaceae, a maioria foi identificada como Enterobacter spp, ocorrendo também representantes dos gêneros Pantoea spp., Kluyvera sp., Klebsiella sp, e um provável Citrobacter sp. Os isolados pertencentes à família Pseudomonaceae foram identificados como Pseudomonas spp. Um único isolado de colmo da cana-de-açúcar foi identificado como Brevibacillus sp, e outros dois como Staphyloccocus spp. Dois representantes do gênero Curtobacterium spp. foram isolados, um do colmo e outro da folha da cana-de-açúcar. Em relação à capacidade de fixação de nitrogênio, foram encontrados dois isolados do gênero Enterobacter e um do gênero Pseudomonas capazes de reduzir acetileno a etileno. Esses resultados sugerem que a diversidade endofítica da cana-de-açúcar seja maior do que aquela descrita anteriormente. Os organismos identificados nesse trabalho têm potencial para promoção de crescimento, controle biológico e fixação de nitrogênio

Orientador : David Alexander Mitchell Co-orientadores : Emanuel Maltempi de Souza e Nadia Kriger Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia As lipases, classificadas como carboxilester hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são enzimas largamente aplicadas em biocatálise. Uma das lipases com maior aplicação é a lipase de Burkholderia cepacia. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver a metodologia de evolução dirigida para melhorar a estabilidade da lipase de B. cepacia em dimetil formamida 80 % (v/v) em água.O gene lip que codifica para a lípase de B. cepacia foi modificado in vivo na estirpe mutagênica E. coli XL-1 Red. Esta estirpe é um triplo mutante dos genes mutS, mutD e mutT, genes envolvidos na replicação do DNA e no reparo de erros de pareamento, e por este motivo tem a sua taxa natural de mutagênese aumentada cerca de 5000 vezes. A cada 12 h foi realizada uma subcultura com esta bactéria, totalizando 9 subculturas ou 108 h de cultivo. Os plasmídeos da última subcultura foram purificados e transformados em E. coli XL-1 Blue (Stratagene, USA). Dos transformantes obtidos 384 foram submetidos a um screening em DMF 80 %. Juntamente com a geração da biblioteca de mutantes, foi desenvolvido um método de screening utilizando o substrato fluorogênico MUF-butirato (butirato de metilumbeliferila). O ensaio baseou-se na relação do aumento da fluorescência gerado pela reação, com a intensidade luminosa detectada nas imagens. Os ensaios foram executados em placas de 96 poços irradiando-se as placas com luz UV, a 365 nm, anteriormente à captura das imagens. Para capturar as imagens utilizou-se uma câmera CCD (charge-coupled device) com um tempo de exposição de 6,9 segundos. A quantificação de luminosidade foi determinada utilizando o software LabWorks4®. As principais vantagens apresentadas por este ensaio foram a rapidez e sua sensibilidade, em relação ao método de hidrólise do pNPP (palmitato de p-itrofenila). Da triagem inicial de 386 transformantes, não foi possível selecionar mutantes com maior estabilidade ao DMF com a população de transformantes avaliada. A análise de sequenciamento de DNA do operon liphp mostrou que a lipase selvagem utilizada neste trabalho é 100 % similar a lipase previamente seqüenciada (KORDEL et al, 1991). Somente para a proteína auxiliadora ou foldase é que foram encontradas alterações em duas posições, arginina13 e glutamina301. A mesma seqüência, quando submetida ao alinhamento frente seis outras proteínas foldases de espécies do gênero Burkholderia, apresentou homologia quanto a estes dois aminoácidos, sugerindo que a seqüência deste trabalho difere da seqüência previamente depositada no GENBANK (QUYEN; SCHMIDT-DANNERT; SCHMID, 1999). Resumo: As lipases, classificadas como carboxilester hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são enzimas largamente aplicadas em biocatálise. Uma das lipases com maior aplicação é a lipase de Burkholderia cepacia. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver a metodologia de evolução dirigida para melhorar a estabilidade da lipase de B. cepacia em dimetil formamida 80 % (v/v) em água.O gene lip que codifica para a lípase de B. cepacia foi modificado in vivo na estirpe mutagênica E. coli XL-1 Red. Esta estirpe é um triplo mutante dos genes mutS, mutD e mutT, genes envolvidos na replicação do DNA e no reparo de erros de pareamento, e por este motivo tem a sua taxa natural de mutagênese aumentada cerca de 5000 vezes. A cada 12 h foi realizada uma subcultura com esta bactéria, totalizando 9 subculturas ou 108 h de cultivo. Os plasmídeos da última subcultura foram purificados e transformados em E. coli XL-1 Blue (Stratagene, USA). Dos transformantes obtidos 384 foram submetidos a um screening em DMF 80 %. Juntamente com a geração da biblioteca de mutantes, foi desenvolvido um método de screening utilizando o substrato fluorogênico MUF-butirato (butirato de metilumbeliferila). O ensaio baseou-se na relação do aumento da fluorescência gerado pela reação, com a intensidade luminosa detectada nas imagens. Os ensaios foram executados em placas de 96 poços irradiando-se as placas com luz UV, a 365 nm, anteriormente à captura das imagens. Para capturar as imagens utilizou-se uma câmera CCD (charge-coupled device) com um tempo de exposição de 6,9 segundos. A quantificação de luminosidade foi determinada utilizando o software LabWorks4®. As principais vantagens apresentadas por este ensaio foram a rapidez e sua sensibilidade, em relação ao método de hidrólise do pNPP (palmitato de p-nitrofenila). Da triagem inicial de 386 transformantes, não foi possível selecionar mutantes com maior estabilidade ao DMF com a população de transformantes avaliada. A análise de sequenciamento de DNA do operon liphp mostrou que a lipase selvagem utilizada neste trabalho é 100 % similar a lipase previamente seqüenciada (KORDEL et al, 1991). Somente para a proteína auxiliadora ou foldase é que foram encontradas alterações em duas posições, arginina13 e glutamina301. A mesma seqüência, quando submetida ao alinhamento frente seis outras proteínas foldases de espécies do gênero Burkholderia, apresentou homologia quanto a estes dois aminoácidos, sugerindo que a seqüência deste trabalho difere da seqüência previamente depositada no GENBANK (QUYEN; SCHMIDT-DANNERT; SCHMID, 1999).

Orientadora : Marileia Scartezini Co-orientador: Emanuel Maltempi de Souza Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia e anexos Área de concentraçao: Análises clínicas

Orientadores: Dr. Emanuel M. de Souza e Dr.ª Cynthia M. T. Fadel Picheth Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular Inclui referências: p. 76-94 Resumo: A organização genômica das alfa-proteobactérias é altamente variável e geralmente muito complexa. O genoma da rizobactéria A. brasilense é composto de vários replicons variando de 100 a 3000 kb. Quatro destes replicons hibridizam com a sonda do gene 16S rDNA, sugerindo que A. brasilense possui vários cromossomos. O perfil eletroforético em campo pulsado do DNA intacto de Azospirillum brasilense estirpe FP2 obtido neste trabalho revelou dois novos replicons (de 745 e 785 kb), que não haviam sido descritos anteriormente, sugerindo que o tamanho genoma do Azospirillum brasilense estirpe FP2 é de aproximadamente 8,2 Mpb. O replicon de 630 Kb, denominado pAZ6, de A. brasilense é o menor da estirpe FP2 que hibridiza com a sonda do gene 16S rDNA. Neste estudo foi realizado o seqüenciamento parcial deste replicon. O pAZ6 foi isolado e purificado por eletroforese em campo pulsado utilizando o sistema CHEF-DRIII (Bio-Rad) e, posteriormente, o DNA extraído do gel de agarose foi amplificado usando o sistema TempliPhi (Amersham Biosciences), uma técnica não-PCR. O DNA amplificado foi utilizado para construir uma biblioteca genômica no vetor pCR4Blunt-TOPO. Os plasmídeos (1858) foram seqüenciados e as leituras de seqüências montadas em contíguos pelos programas PHRED/PHRAP e, em seguida, os contíguos formados foram analisados utilizando os programas FramePlot e BlastP. Os resultados revelaram que o replicon pAZ6 apresenta genes envolvidos em processos biossintéticos (parede celular, de vitamina BI2, lipídeos e nucleotídeos), metabolismo de piruvato, produção de energia, degradação de aminoácidos, metabolismo de carboidratos e de lipídeos, regulação transcricional, metabolismo nitrogenado, transporte de solutos e quimiotaxia. A categoria funcional mais representada entre os prováveis produtos gênicos do replicon foi a de transportadores. Os resultados sugerem fortemente que o replicon pAZ6 é parte essencial do genoma de A. brasilense estirpe FP2.