Utilização de mutagenese aleatória para obtenção da lipase de Burkholria cepacia com variação nas propriedades catalíticas

Orientador : David Alexander Mitchell Co-orientadores : Emanuel Maltempi de Souza e Nadia Kriger Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia As lipases, classificadas como carboxilester hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são enzimas largamente aplicadas em biocatálise. Uma das lipases com maior aplicação é a lipase de Burkholderia cepacia. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver a metodologia de evolução dirigida para melhorar a estabilidade da lipase de B. cepacia em dimetil formamida 80 % (v/v) em água.O gene lip que codifica para a lípase de B. cepacia foi modificado in vivo na estirpe mutagênica E. coli XL-1 Red. Esta estirpe é um triplo mutante dos genes mutS, mutD e mutT, genes envolvidos na replicação do DNA e no reparo de erros de pareamento, e por este motivo tem a sua taxa natural de mutagênese aumentada cerca de 5000 vezes. A cada 12 h foi realizada uma subcultura com esta bactéria, totalizando 9 subculturas ou 108 h de cultivo. Os plasmídeos da última subcultura foram purificados e transformados em E. coli XL-1 Blue (Stratagene, USA). Dos transformantes obtidos 384 foram submetidos a um screening em DMF 80 %. Juntamente com a geração da biblioteca de mutantes, foi desenvolvido um método de screening utilizando o substrato fluorogênico MUF-butirato (butirato de metilumbeliferila). O ensaio baseou-se na relação do aumento da fluorescência gerado pela reação, com a intensidade luminosa detectada nas imagens. Os ensaios foram executados em placas de 96 poços irradiando-se as placas com luz UV, a 365 nm, anteriormente à captura das imagens. Para capturar as imagens utilizou-se uma câmera CCD (charge-coupled device) com um tempo de exposição de 6,9 segundos. A quantificação de luminosidade foi determinada utilizando o software LabWorks4®. As principais vantagens apresentadas por este ensaio foram a rapidez e sua sensibilidade, em relação ao método de hidrólise do pNPP (palmitato de p-itrofenila). Da triagem inicial de 386 transformantes, não foi possível selecionar mutantes com maior estabilidade ao DMF com a população de transformantes avaliada. A análise de sequenciamento de DNA do operon liphp mostrou que a lipase selvagem utilizada neste trabalho é 100 % similar a lipase previamente seqüenciada (KORDEL et al, 1991). Somente para a proteína auxiliadora ou foldase é que foram encontradas alterações em duas posições, arginina13 e glutamina301. A mesma seqüência, quando submetida ao alinhamento frente seis outras proteínas foldases de espécies do gênero Burkholderia, apresentou homologia quanto a estes dois aminoácidos, sugerindo que a seqüência deste trabalho difere da seqüência previamente depositada no GENBANK (QUYEN; SCHMIDT-DANNERT; SCHMID, 1999). Resumo: As lipases, classificadas como carboxilester hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são enzimas largamente aplicadas em biocatálise. Uma das lipases com maior aplicação é a lipase de Burkholderia cepacia. O objetivo deste trabalho foi o de desenvolver a metodologia de evolução dirigida para melhorar a estabilidade da lipase de B. cepacia em dimetil formamida 80 % (v/v) em água.O gene lip que codifica para a lípase de B. cepacia foi modificado in vivo na estirpe mutagênica E. coli XL-1 Red. Esta estirpe é um triplo mutante dos genes mutS, mutD e mutT, genes envolvidos na replicação do DNA e no reparo de erros de pareamento, e por este motivo tem a sua taxa natural de mutagênese aumentada cerca de 5000 vezes. A cada 12 h foi realizada uma subcultura com esta bactéria, totalizando 9 subculturas ou 108 h de cultivo. Os plasmídeos da última subcultura foram purificados e transformados em E. coli XL-1 Blue (Stratagene, USA). Dos transformantes obtidos 384 foram submetidos a um screening em DMF 80 %. Juntamente com a geração da biblioteca de mutantes, foi desenvolvido um método de screening utilizando o substrato fluorogênico MUF-butirato (butirato de metilumbeliferila). O ensaio baseou-se na relação do aumento da fluorescência gerado pela reação, com a intensidade luminosa detectada nas imagens. Os ensaios foram executados em placas de 96 poços irradiando-se as placas com luz UV, a 365 nm, anteriormente à captura das imagens. Para capturar as imagens utilizou-se uma câmera CCD (charge-coupled device) com um tempo de exposição de 6,9 segundos. A quantificação de luminosidade foi determinada utilizando o software LabWorks4®. As principais vantagens apresentadas por este ensaio foram a rapidez e sua sensibilidade, em relação ao método de hidrólise do pNPP (palmitato de p-nitrofenila). Da triagem inicial de 386 transformantes, não foi possível selecionar mutantes com maior estabilidade ao DMF com a população de transformantes avaliada. A análise de sequenciamento de DNA do operon liphp mostrou que a lipase selvagem utilizada neste trabalho é 100 % similar a lipase previamente seqüenciada (KORDEL et al, 1991). Somente para a proteína auxiliadora ou foldase é que foram encontradas alterações em duas posições, arginina13 e glutamina301. A mesma seqüência, quando submetida ao alinhamento frente seis outras proteínas foldases de espécies do gênero Burkholderia, apresentou homologia quanto a estes dois aminoácidos, sugerindo que a seqüência deste trabalho difere da seqüência previamente depositada no GENBANK (QUYEN; SCHMIDT-DANNERT; SCHMID, 1999).