Thamiris Gatti Deo, Souza, Anete Pereira de, 1962, Jank, Liana, Vigna, Bianca Baccili Zanotto, Rosa, João Ricardo Bachega Feijó, Chiari, Lucimara, Zucchi, Maria Imaculada, Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, and UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Orientadores: Anete Pereira de Souza, Liana Jank Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O Brasil é destaque no mercado internacional quanto à produção e exportação de carne, visto que possui o maior rebanho bovino comercial do mundo. Dentre as principais gramíneas forrageiras de clima tropical responsáveis por parte da engorda animal a pasto, "Megathyrsus maximus" (Jacq.) B. K. Simon & S. W. L. Jacobs (sinonímia "Panicum maximum" Jacq.) é uma das mais produtivas, estando envolvida na alimentação de caprinos, equinos, ovinos, gado de corte e de leite. A autotetraploidia, a apomixia e o recente processo de domesticação indicam uma maior complexidade envolvida no melhoramento genético dessa espécie, que torna indispensável o esclarecimento dos mecanismos genéticos que podem estar envolvidos. Dessa forma, o melhoramento molecular poderá proporcionar o aumento da eficiência do programa de melhoramento e a redução do tempo nas etapas envolvidas para o lançamento de cultivares. Neste contexto, mapas de ligação têm sido utilizados como base para a compreensão da organização genômica das espécies, principalmente as não-modelo e complexas que não possuem o genoma sequenciado, tais como "M. maximus". Com isto, este trabalho teve como objetivo a construção de um mapa de ligação para a gramínea forrageira "M. maximus" a partir de marcadores SNPs com informação de dosagem alélica, visando detectar a região do locus da aposporia, bem como loci de caracteres quantitativos (QTLs) envolvidos com a produtividade e qualidade nutricional da forragem. A progênie de mapeamento deste trabalho foi obtida pelo programa de melhoramento genético da Embrapa Gado de Corte (Campo Grande, Mato Grosso do Sul), sendo composta por 136 híbridos F1 originados a partir do cruzamento de genitores autotetraploides (2n = 4x = 32), um sexual (S10) e o outro apomítico (cv. Mombaça). A partir do DNA extraído das plantas, bibliotecas de GBS (genotyping-by-sequencing) foram construídas com o uso de duas enzimas de restrição (PstI-MspI). Os dados obtidos com o sequenciamento foram analisados no software Tassel4-poly. O alinhamento das sequências foi realizado com cinco genomas de espécies filogeneticamente próximas: Panicum hallii, P. virgatum, Setaria italica, S. viridis e Urochloa ruziziensis, além de três transcriptomas de "M. maximus". A dosagem alélica dos marcadores SNPs identificados foi estimada por meio dos programas SuperMASSA e Updog, visando incluir no mapa todas as configurações de SNPs para um tetraploide. Marcadores monomórficos e SNPs com mais de 25% de dados perdidos foram removidos manualmente usando o software R. Para a construção do mapa de ligação foram utilizados os programas polymapR e TetraploidSNPMap, os quais possibilitam o uso de SNPs com informação de dosagem alélica. O genoma de P. virgatum apresentou melhor alinhamento aos dados de GBS, sendo utilizado como referência. O mapa de ligação consenso e integrado construído contém 8 grupos de homologia (GH) e 858 marcadores SNPs com todas as doses esperadas para uma progênie F1 tetraploide. A densidade média do mapa genético foi de aproximadamente 1,13 SNPs/cM, sendo o GH 7 o maior (108, 6 cM) e mais denso (159 SNPs), além de ter sido o único GH com todas as doses presentes. As análises de ligação permitiram detectar o evento da redução dupla, um tipo de distorção de segregação que ocorre principalmente em autopoliploides. Com este mapa e por meio de uma análise qualitativa, o locus ligado à aposporia foi mapeado no GH 2 a 65 cM. A partir da análise de similaridade da região aos marcadores adjacentes a esse locus, utilizando como base o genoma de P. virgatum, foi encontrado um gene relacionado à embriogênese somática. Por meio do método de mapeamento por intervalo, foram detectados 10 QTLs para caracteres agronômicos, como capacidade de rebrota e matéria seca total, e 36 QTLs relacionados a qualidade da forragem, como digestibilidade in vitro da matéria orgânica, lignina e celulose. Um total de 55 famílias gênicas foram identificadas por meio da análise de similaridade, com destaque para genes potencialmente envolvidos na regulação de hormônios de crescimento da planta e de síntese de lignina. Esta tese fornece contribuições inéditas para a espécie M. maximus, tais como a identificação do evento de redução dupla, um mapa de ligação de alta resolução construído a partir da informação de dosagem alélica dos SNPs e o mapeamento da região do locus da aposporia e de caracteres agronômicos e nutricionais. Além do avanço sobre o conhecimento da genética, esses resultados promovem informações práticas ao programa de melhoramento genético da espécie. Igualmente, são um incentivo a estudos adicionais sobre a apomixia e a evolução da herança polissômica nesta e em outras gramíneas tropicais Abstract: Brazil has a prominent role in the international meat market for its production and exportation, once it has the largest commercial cattle herd in the world. Among the main forage grasses of tropical climate that are present in ruminant feed on pasture, "Megathyrsus maximus" (Jacq.) B. K. Simon & S. W. L. Jacobs (syn. "Panicum maximum" Jacq.) is one of the most productive, being involved in the feeding of goats, horses, sheep, beef and dairy cattle. Autotetraploidy, apomixis and the recent domestication process indicate a greater complexity involved in the genetic improvement of this species, which makes it essential to clarify the genetic mechanisms that may be involved. Thus, molecular improvement will be able to increase the efficiency of the breeding program and also reduce the time involved in steps on launching cultivars. In this context, linkage maps have been used as basis for understanding the genomic organization of species, mainly non-model and complex ones that do not have sequenced genomes, such as M. maximus. Thus, this work aimed to construct a linkage map for the forage grass M. maximus from SNP markers with allele dosage information. This was intended to detect the genomic region of the apospory locus and quantitative trait loci (QTLs) involved in forage yield and nutritional quality. The mapping progeny of this work was obtained from the breeding program of Embrapa Gado de Corte (Campo Grande, Mato Grosso do Sul), being composed of 136 F1 hybrids originated from the cross between autotetraploid parents (2n = 4x = 32), one sexual (S10) and the other apomictic (cv. Mombaça). The individuals were sampled in genotyping-by-sequencing (GBS) libraries constructed using two restriction enzymes (PstI-MspI). The data obtained with these sequencing were analysed using Tassel4-poly. Sequence alignment was performed with five genomes of phylogenetically close species: Panicum hallii, P. virgatum, Setaria italica, S. viridis and Urochloa ruziziensis, as well as three transcriptomes of M. maximus. Allele dosage for SNPs markers identified was estimated using the SuperMASSA and Updog softwares, aiming to include SNP higher doses (AAaa, AAAa and AAAA) in the map. Monomorphic markers and SNPs with over 25% missing data were manually removed using the R software. For the construction of the linkage map, polymapR and TetraploidSNPMap softwares, were used which enabled the usage of SNPs with allele dosage information. The P. virgatum genome presented better alignment with GBS data, wherein the linkage map obtained with TetraploidSNPMap was based on. The consensus integrated linkage map contains 8 homology groups (GH) and 858 SNP markers with all doses expected in a tetraploid progeny. The average density was about 1.13 SNPs/cM, with GH 7 presenting the largest size (108.6 cM) and the most markers (159 SNPs); only this group contained markers in all doses. Linkage analysis allowed the detection of a double reduction event, a type of segregation distortion that occurs mainly in autopolyploids. One locus in the apomixis region was mapped to HG II at 65 cM, using our linkage map. From similarity analysis to the markers, which are adjacent to the locus linked to apospory, using as base on the P. virgatum genome resulted in a gene related to somatic embryogenesis. Using interval mapping, ten QTLs for agronomic traits, such as regrowth capacity and total dry matter were detected, as well as 36 QTLs related to forage quality, such as in vitro digestibility of organic matter, lignin, and cellulose. A total of 55 gene families were identified by similarity analysis, highlighting putative genes involved in the regulation of plant growth hormones and lignin synthesis. This thesis provides unprecedented contributions to M. maximus, such as the identification of a double reduction event, a high-resolution linkage map constructed from SNPs with allele dosage information, and the mapping of apospory region, agronomic and nutritional traits. In addition to the advance on the knowledge of genetics, these results provide practical information for the breeding program of this species. They are also an incentive for further studies on apomixis and the evolution of polysomic inheritance in this and other tropical grasses Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES 88887.335258/2019-00 FAPESP 2017/17969-5