Search

Protein homeostazisi, hücrenin tüm protein bakım işlemlerini kapsayan genel bir terimdir. Protein fonksiyonu doğru katlanmaya bağlı olduğundan, protein kalite kontrolü (PQC), hücrenin hayatta kalmasını sağlayan protein homeostazisinin kurulması için esastır. Salgı ve membran proteinleri, doğru katlanma için endoplazmik retikuluma (ER) yönlendirilir. Tamamen katlanmış proteinler ER'den taşınırken, yanlış katlanmış/katlanmamış proteinler ER stresine yol açarak katlanmamış protein tepkisini (UPR) aktive eder ve dislokasyon yoluyla ER'dan ayrılarak ER-ilişkili yıkım (ERAD) mekanizması aracılığıyla proteolitik yıkım için ubikitin/proteazom sistemine (UPS) hedeflenir. Poli-ubikitin zincirleriyle etiketlenen proteinler RAD23 benzeri adaptör proteinler aracılığıyla proteazoma taşındıktan sonra, poli-ubikitin zincirleri deubikitinleyici enzimler (DUB'ler) yadımıyla kesilir ve proteinler proteolitik degradasyon için proteazomun 19S düzenleyici kapak bölgesinde bulunan AAA+ ATPaz altbirimleri ve/veya VCP/p97 aracılığıyla proteazomun 20S proteolitik çekirdek bölgesine doğru çekilir ve yıkıma uğrar.Çok fonksiyonlu BAG-1 (Bcl-2 ilişkili athanogen-1) proteini, BAG ailesinin ilk keşfedilen üyesidir. Bu protein, 1995 yılında bir hormon reseptörü olan GR'nin ve anti-apoptotik Bcl-2 proteininin etkileşim partneri olarak keşfedilmiştir. Tüm BAG ailesi üyeleri, farklı protein sınıfları ile çeşitli etkileşimler sağlayan ortak karboksil ucu BAG domenleri içerirler. İnsanda BAG ailesi, işlevsel farklılıklara yol açan farklı amino ucu bölgelerine sahip altı proteinden oluşur. İnsan BAG-1 proteininin BAG-1S, BAG-1M ve BAG-1L olarak adlandırılan üç ana izoformu bulunmaktadır ve tüm izoformlar, farklı translasyon başlatma bölgelerinden başlayarak aynı mRNA transkriptinden sentezlenmektedir. BAG-1 izoformları BAG domeni ve ubikitin benzeri domenden (UbL) oluşan ortak karboksil ucu ve farklı amino ucu bölgelerine sahiptir. En büyük izoform BAG-1L bir nükleer lokalizasyon sinyaline (NLS) sahiptir, bu yüzden çoğunlukla nükleusta yer alır. Öte yandan, en küçük izoform BAG-1S sitoplazmada bulunur ve orta uzunluktaki izoform BAG-1M nükleus ve sitoplazma arasında yer değiştirir. Yine de BAG-1 izoformlarının lokalizasyonu, farklı sinyaller sonucunda değişebilir. Ek olarak, BAG-1 ifadesinin farklı tümör tiplerinde, özellikle meme kanserinde normal hücrelere kıyasla daha fazla olduğu bulunmuştur.BAG-1 çok yönlü bir etkileşim ağına sahiptir. BAG-1 etkileştiği Hsc70/Hsp70, Bcl-2, nükleer hormon reseptörleri, Raf-1, E3 ligaz CHIP ve proteazom gibi proteinler aracılığıyla; protein katlanması, protein yıkımı, hücre sağ kalımı, transkripsiyon, translasyon ve apoptoz gibi önemli hücresel mekanizmaların regülasyonuna katkı sağlar. Bununla birlikte BAG-1, Hsc70/Hsp70 şaperon sisteminin nükleotid değişim faktörlerinden (NEF) biri olduğu için, BAG-1'in hücresel mekanizmaların çoğunu Hsp70 etkileşimi aracılığıyla düzenlediği düşünülmektedir. BAG-1:Hsp70 etkileşimi, Hsp70'in ATPaz domeninin IB ve IIB alt domenleri ile BAG-1 BAG domeninin heliks 2 ve heliks 3 bölgeleri arasında gerçekleşmektedir. Diğer taraftan BAG-1'in UbL domeni aracılığıyla ubikitin/proteazom sistemi ile de etkileştiği ve böylece protein katlanması ve protein bozunması sistemleri arasında bir bağlantı sağlayarak hücre içi protein döngüsünü düzenlediği düşünülmektedir.Laboratuvarımızdaki çalışmalarda elde edilen ön bulgular, BAG-1 proteininin ERAD mekanizmasındaki proteinlerle etkileştiğini göstermiştir. Hsp70 şaperonunun da ERAD mekanizması proteinlerinden biri olduğu ve Hsc70/Hsp70 şaperon sisteminin hücre içinde aktif olarak rol aldığı göz önünde bulundurulduğunda, BAG-1 etkileşimlerinin doğrudan ya da Hsp70 üzerinden dolaylı olarak gerçekleşmesi ihtimalleri mevcuttur. Bu çalışmayla, BAG-1:Hsp70 etkileşim bölgesinde BAG domeni üzerinde yapılan nokta mutasyonlar ile etkileşimin bozulması hedeflenmiş ve bu durumun ERAD yolağında görev alan diğer BAG-1 etkileşimlerine olan etkisi hem yapısal hem de deneysel olarak incelenmiştir.Bu amaçla BAG-1:Hsp70 etkileşiminin bozulmasını sağlayacak nokta mutasyonları (BAG domeni üzerinde yer alan R205D, R206E ve R237D) belirlenmiştir. Ayrıca domen kontrolü olarak UbL domeni üzerinde I82K mutasyonu belirlenmiştir. Nokta mutasyonları, Protein Veri Bankası'ndan (PDB) elde edilen üç boyutlu BAG domeni yapısına uygulanmış ve mutasyonların BAG-1:protein etkileşimlerine olan etkisi in siliko olarak PRISM web sunucusu ve FoldX yazılımı aracılığıyla incelenmiştir. Belirlenen mutasyonlar yönlendirilmiş mutagenez yöntemiyle N-ucu TAP etiketli BAG-1S gen dizisine uygulanmış ve mutant plazmitler meme kanseri hücre hattı MCF-7 hücrelerine aktarılmıştır. TAP-etiketi saflaştırma yöntemiyle kompleks halinde saflaştırılan proteinler kütle spektrometresiyle yarı-kantitatif olarak analiz edilerek mutant BAG-1S proteinlerinin etkileşim partnerleri tanımlanmış ve komplekslerdeki proteinlerin miktarları belirlenmiştir. İn siliko analizler sonucunda, BAG domeni üzerinde yapılan nokta mutasyonlarının üçünün de (R205D, R206E, R238D) BAG-1:Hsp70 etkileşiminin stabilitesini azalttığı, öte yandan proteazomal hedeflemede görevli VCP/p97 ile olan olası etkileşimi ise bozduğu saptanmıştır. Yapılan yarı-kantitatif kütle spektrometresi analizleri sonucunda, mutant BAG-1 proteinlerinin Hsp70 şaperonuyla olan etkileşimlerinin azaldığı, buna ek olarak R205D mutasyonunun VCP/p97 etkileşimini bozarken, R206E mutasyonunun VCP/p97 etkileşimini ciddi oranda azalttığı gözlenmiştir. Bu sonuçlar doğrultusunda; yabanıl tip, BAG-1 gen ifadesi durdurulmuş, mutant ve yabanıl tip BAG-1S aşırı ifadesi sağlanmış MCF-7 meme kanseri hücrelerinin 20S ve 26S proteazom aktiviteleri incelenmiştir. Yapılan analiz sonucunda BAG-1 gen ifadesi durdurulmuş hücrelerin 20S ve 26S proteazom aktivitelerinin ciddi oranda azaldığı gözlenmiştir. Ayrıca, olası VCP/p97 etkileşimini bozan R205D ve ciddi oranda azaltan R206E mutantlarının aktarıldığı MCF-7 hücrelerinin proteazom aktivitelerinin de BAG-1 gen ifadesi durdurulmuş hücreler ile benzer bir biçimde azaldığı tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, BAG-1 proteininin ubikitin/proteazom sisteminde VCP/p97 aracılı olarak görev aldığını düşündürmüştür.Elde edilen bulgular BAG-1 proteininin ERAD mekanizmasında oluşan komplekslerde yer aldığını ve bu mekanizmada şaperonlar ve bir AAA+ ATPaz olan VCP/p97 ile kompleks oluşturarak substratların proteazoma taşınımında görev alabileceğini önermiştir. Gelecekte fonksiyon analizlerine yönelik çalışmalar ile bu çalışmadan ortaya çıkan hipotezler test edilerek araştırılacaktır. Uzun vadede hedeflenen, BAG-1:VCP/p97 etkileşiminin bozulmasını sağlayacak terapötik moleküller tasarlayarak meme kanserinde ERAD mekanizması inhibisyonuna yönelik tedaviler geliştirmektir. Proteostasis is referred to all protein maintenance processes of the cell. Since protein function emerges from the correct folding, protein quality control (PQC) is essenetial for proteostasis that results in cell survival. Secretory and membrane proteins are targeted to endoplasmic reticulum (ER) for the correct folding. Fully folded proteins are transported from the ER while misfolded/unfolded proteins are retrotranslocated from the ER and targeted to the ubiquitin/proteasome system (UPS) for proteolytic degradation through ER-associated degradation (ERAD) mechanism.Multifunctional BAG-1 protein is the first discovered member of the BAG family. It was identified as the interacting partner of GR which is an essential hormone receptor and anti-apoptotic Bcl-2 in 1995. All six BAG family members consist of common carboxy-terminal BAG domains providing diverse interactions with different protein classes and distinct amino-terminal domains that give differences in functionality. Human BAG-1 protein has three main isoforms called as BAG-1S, BAG-1M and BAG-1L. All isoforms are translated from the same mRNA transcript starting from the different translation initiation regions. BAG-1 isoforms also have common carboxy-terminal regions consisting of BAG domain and ubiquitin-like domain (UbL) and distinct amino-terminal domains leading to the different cellular localization and functions. Yet, the localization of the BAG-1 isoforms could be changed in response to different signals. In addition, BAG-1 is found to be upregulated in different tumor types.BAG-1 has a diverse network of interaction partners such as Hsc70/Hsp70, Bcl-2, NHRs, Raf-1, CHIP and 26S proteasome that implies the essential role of BAG-1 on cellular mechanisms which are protein folding, protein degradation, cell survival, transcription, translation and apoptosis. However, as BAG-1 is one of the NEFs of the Hsc70/Hsp70 chaperone system, it is thought that BAG-1 regulates most of cellular mechanisms in an Hsp70-dependent manner. The BAG-1:Hsp70 interaction occurs between the BAG domain of BAG-1 and nucleotide binding domain (NBD) of Hsp70. On the other hand, BAG-1 is thought to interact with the 26S proteasome via its UbL and therefore provides a link between the protein folding and protein degradation systems and regulates the protein turnover.Preliminary findings in our laboratory had suggested that BAG-1 interacts with proteins in the ERAD mechanism. Given that the Hsp70 chaperone is also one of the ERAD proteins and Hsp70 chaperone system is actively involved in the cell, BAG-1 interactions could occur either dependent or independent of Hsp70. The aim of this study was to investigate the effects of BAG-1:Hsp70 interaction on BAG-1 complexes in EAD mechanism and UPS.For this purpose, point mutations (R205D, R206E and R237D on the BAG domain) were determined which were thought to interrupt the BAG-1:Hsp70 interaction. I82K mutation on the UbL domain was also selected as a domain-control. The point mutations were applied to three-dimensional BAG domain structures obtained from the Protein Data Bank (PDB) and the effects of mutations on BAG-1:protein interactions were investigated in silico via PRISM web server and FoldX software. After the structural analyses, selected mutations were introduced to the N-terminus TAP-tagged BAG-1S sequence by the site directed mutagenesis approach and mutated plasmids were transfected to MCF-7 breast cancer cells. The protein complexes purified by TAP-tag purification method were semi-quantitatively analysed by mass spectrometry in order to identify the interaction partners and determine their amounts. In silico analyses revealed that, point mutations on the BAG domain decreased the stability of BAG-1:Hsp70 interaction. Moreover, BAG domain mutations disrupted the possible BAG-1:VCP/p97 interaction. After the semi-quantitative mass spectrometry analyses, it was observed that the interactions of mutant BAG-1 proteins with Hsp70 chaperone were decreased. On the other hand, R205D mutation disrupted BAG-1:VCP/p97 interaction, while R206E mutation significantly reduced BAG-1:VCP/p97 interaction. According to 20S and 26S proteasome activity measurements of wild type, BAG-1 knockout, mutant and wild type BAG-1S overexpressed MCF-7 breast cancer cells; BAG-1 knockout cells had significantly lower proteasomal activities. Furthermore, R205D and R206E mutations which disrupted/significantly reduced the possible BAG-1:VCP/p97 interaction had also been found to reduce the proteasome activity in a similar manner to the BAG-1 knockout cells.The results suggested that BAG-1 protein is involved in the ERAD mechanism by forming several complexes with chaperones and VCP/p97 which is an AAA+ ATPase and involved in proteasomal targeting. These BAG-1 complexes may participate in targeting and recruitment of the unfolded/misfolded substrates to the proteasome for degradation. Hypotheses emerged from this study will be tested by future studies on functional analyses. The long-term aim is to develop therapeutic molecules in order to disrupt BAG-1:VCP/p97 interaction for the inhibition of ERAD mechanism in breast cancer treatment. 113

Meme kanseri dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Gelişmiş ülkelerde bile halen kanserden ölümlere neden olan en önemli kanser tiplerinden birisidir. Meme kanserinin özellikle kadınlarda görülme sıklığının artması ve tedaviye yönelik yeni yaklaşımlara olan ihtiyaç artmakta ve bu alandaki araştırmalar hız kazanmaktadır.İnsan hücrelerinde, tek bir mRNA'dan alternatif translasyonla üç fonksiyonel BAG-1 izoformları ifade edilir. Hücrede lokalizasyonları değişen üç BAG-1 izoformlarının, BAG-1S (33 kDa), BAG-M (46 kDa) ve BAG-1L (52 kDa), farklı N-terminalleri mevcuttur. BAG-1L izoformu nükleer lokalizasyon sinyaline sahiptir ve büyük oranda nükleer bir proteindir. Nükleer lokalizasyon sinyalinin bir kısmı BAG1M'nin N-terminalinde bulunur, bu yüzden BAG-1M da nükleusa göç edebilir. Nükleer lokalizasyon sinyalinin çok az kısmını içeren BAG-1S nükleusta bulunmamaktadır fakat bazı koşullar altında bu sinyalin rol oynayabileceği bildirilmiştir. Aynı mRNA üzerinde BAG-1L ve BAG-1M izoformlarının ifadesi uç CUG ve AUG kodonlarıyla başlar, oysa BAG-1S ifadesi bir iç AUG kodonuyla başlar. BAG-1 izoformlarıyla, hücrenin hayatta kalması için sinyal iletiminde hubları oluşturan aday bir proteindir. Tümör hücrelerinde BAG-1L'nin nispeten yüksek ifade seviyeleri gözlemlendiği bildirilmiştir. Hücrenin hayatta kalmasında önemli bir protein olan BAG-1, başta meme kanseri olmak üzere birçok kanser çeşidinde ifade düzeylerinin arttığı gözlenmiştir. Bu yüzden dolayı kanser oluşmasında ve gelişmesinde incelenmesi gereken bir proteindir. Adoptör işlevine sahip BAG-1, bir anti-apoptotik proteindir. Hsp70/Hsc70 şaperonları, proteazom sistemi, Bcl-2 proteini, Raf-1 kinaz, nükleer hormon reseptörleri ve DNA gibi çeşitli moleküler hedeflerle etkileşime girebilir. Bu yüzden, çok çeşitli hücresel süreçlerin düzenlenmesinde yer almaktadır.HSP70/HSP90 hücrede bolca eksprese edilen ve hücre içindeki proteinlerin doğru katlanmasında ve işlevlerini kazanmarında önemli rol oynayan moleküler şaperonlardır. HSP90, HSP-aracılı anormal proteinlerin proteazomal degradasyonunda görevli olduğu bir çok yayında gösterilmiştir. Protein katlanma süreci endoplazmik retikulumda gerçekleşir. Bu sürece ER'de bulunan ısı şoku proteinleri, lektin proteinleri, disülfit izomerazlar katılır. Protein katlanmasında proteinin stabilitesini arttıran N-glikozilasyon gerçekleşir. N-bağlı glikanlar, proteinin çözünürlüğünü arttırır ve protein katlama yollarını doğrudan etkiler. α-glukosidaz I ve α-glukosidaz II enzimleri, katlanan proteinin N-terminalinde bulunan iki glikozu uzaklaştırır. Calnexin (ER membrana bağlı) ve Calreticulin (ER lümeninde) lektin şaperonlarıdır ve protein katlanmasını destekler. ER'deki lektin şaperonları ve BiP şaperonu arasında bir bağlantı vardır. BiP, hidrofilik N-glikanların eklenmesinden önce, yeni sentezlenen proteinin hidrofobik uzantısıyla etkileşir. BiP, N-terminal yakınındaki glikan içeren glikoproteinlerin olgunlaşmasında daha az rol oynaması olasıdır, çünkü bunlar hidrofiliktir, böylece BiP'nin bağlanması önlenir ve lektin şaperonlarının bağlanması teşvik edilir. Lektin şaperonları son glikana bağlanır ve sonra katlama işlemini kontrol ederler. Buna ek olarak, lektin şaperonları oksidoredüktaz ERp57 (PDI) ile kovalent olmayan şekilde etkileşir, böylece substrat üzerinde disülfid bağlarının oluşmasını ve izomerizasyonunu tetikleyebilir. PDI, disülfid izomeraz protein ailesinin bir üyesidir ve ER lümeninde bulunur. Disülfid bağının oluşumu nedeniyle proteinlerin konformasyonel esnekliği sınırlar ve proteinlerin yapısal sertliğini arttırır. ER'deki kalite kontrol mekanizmasına rağmen, protein katlanması yetersiz olduğunda ve protein düzgün bir şekilde katlanamadığında, anormal proteinler ER'de akümüle olur. Bu nedenle, katlanamamış protein cevabı (UPR) yolağının aktivasyonu gerçekleşir. UPR sisteminin bir parçası olan ERAD yolağıyla anormal proteinlerin ER'den sitozole retrotranslasyonu meydana gelir. ERAD yolağı, seçilmiş anormal proteinlerin retrotranslokasyonuna ve ubikuitin bağımlı proteazomal degradasyonuna aracılık eden bir dizi süreçten oluşur. Substrat dislokasyonunu yönlendiren enerji, ubikuitin bağımlı heksamerik AAA+ ATPase VCP (p97) tarafından adenosin trifosfat (ATP) hidrolizinden elde edilir. VCP, ERAD dislokasyon komplekslerine çeşitli ERAD bileşenleri ile doğrudan etkileşirek dahil olur. ERAD substratının polubikuinitinasyonu, VCP ile ekstraksiyonu kolaylaştırılır ve proteazomal degradasyonu için bağlanma bölgesi olarak işlev görür. Ubikuitin, substrat üzerinde N-terminaldeki lizin tortularına kovalent olarak bağlanabilen 76 amino asitten oluşan küçük bir proteindir. Ubikuitin ilavesi, E1 ubikuitin-aktive edici enzimi, E2 ubikitin-konjuge enzimini ve ubikuitinin substrata nihai transferine aracılık eden E3 ubikitin ligazını içeren ardışık enzimatik reaksiyonlar yoluyla gerçekleşir. CHIP (E3 ligaz), yanlış katlanmış proteinleri şaperonlardan proteazomlara yönlendiren bir sistemin parçasıdır. İki modülatör, BAG-1 ve CHIP, sitosolik bozunma yollarında rol oynar, ve moleküler şaperonları, nativ olmayan polipeptidlerin katlanması ve parçalanması arasındaki karar sürecinin merkezine yerleştirir. BAG-1'in etkileşim partneri olan ubikuitin/proteazom sistemiyle yanlış katlanmış ya da katlanamamış proteinlerin degredasyonu gerçekleşir. Proteazom ile ilgili çalışmalarda, proteazom inhibisyonunun toksik etkilerine kanser hücrelerinin, normal hücrelere kıyasla daha hassas olduğu gösterilmiştir. Kanser hücrelerinin daha yüksek hassasiyetinin ardındaki mekanizma belirsiz olmasına rağmen, proliferasyonunu ve anti-apoptotik yolakları düzenlemek için proteazomu kullanma olasılıkları yüksektir. Ubikuitin/proteazom sistemine katılan BAG-1'in kanser tedavisinde hedef molekül olabileceği düşünülmektedir.Retrotranslokasyon sırasında, anormal proteinlerin proteazomal degradasyonu için ubikitinler proteinlerin tanınması için işaret olarak eklenir. Ubikuitinasyon degrede olacak proteinlerin proteazoma iletilmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte etkilidir. BAG-1L izoformunun içerdiği UBL domaininden dolayı ubikuitinin katıldığı biyolojik süreçlerde BAG-1L'nin de rol oynayabileceği düşünülmektedir.Ayrıca, araştırmacılar BAG-1'in östrojen reseptörü üzerindeki etkisini araştırmış ve BAG-1L'nin östrojene bağımlı transkripsiyonu arttırdığını, ancak BAG-1M veya BAG-1S'nin transkripsiyonu artırmadığını bulmuşlardır. Araştırmacılar BAG-1L östrojen reseptörleri ile etkileşirerek reseptör aktivitelerini arttırdını belirtmiştir. Bu çalışmada, meme kanserli (MCF-7) ve epitel hücre hatlarında (MCF-12A) ve aynı zamanda meme dokularında BAG-1L ile ilişkili komplekslerin izolasyonunu içeren proteom-merkezli bir strateji benimsedik. BAG-1L ile ilişkili komplekslere katılan proteinler, C ve N-terminal TAP-etiketli BAG-1L pürifiye proteinlerden yapılan izoform-spesifik LC-MS/MS analizi ile tanımlanmıştır. BAG-1L ile ilişkili komplekslerde yer alan proteinlerin tanımlanması, meme kanserinde BAG-1L'nin adaptör rolünü kesin olarak ortaya çıkarmaktadır. Yaptığımız kanser hücre hattı immünoblotma deneyleriyle BAG-1L'nin ERAD mekanizmasındaki proteinlerle (BiP, HSP70, PDIA3, VCP, RAD23B, CANX ve CALR) kompleks oluşturduğunu ispatladık. Meme epitel hücre hattı imünoblotlama deneyleriyle ise kanser hücre hattına kıyasla farklılıklar gözlemledik. ERAD proteinlerinden HSP90 ve CHIP'in epitel hücrelerde BAG-1L ilişkili komplekste yer almadığını belirledik. Tümörlü ve normal meme dokularıyla yaptığımız immunoblotlama deneyleriyle, tümör dokularında ERAD mekanizması proteinlerinin, HSP70, RAD23, VCP ve CHIP, ifade düzeylerinin arttığını gözlemledik. Ayrıca, yine tümörlü ve normal dokularla yaptığımız immünopresipitasyon deneyleriyle, tümörlü dokularda ERAD proteinlerinin BAG-1 ile birlikte çöktüğünü yani BAG-1 ile etkileştiğini ispatladık.Biyoinformatik araçlarla yapılan diğer analizlerle, protein kalite kontrol sistemine BAG-1L izoformunun katıldığını ve hücre içi homeostazı korumak için ERAD mekanizmasında rol oynadığını belirledik. BAG-1L izoformunun proteazomla etkileşimi zayıf bir şekilde karakterize edittik, ubikitin aracılı proteazomal bozulmada BAG-1L izoformunun rolünün ayrıntılı bir şekilde anlaşılması eksiktir. Özellikle, proteozom mekanizmasının bileşenleri olan VCP/p97 ve RAD23 ile BAG-1L'nin protein-protein etkileşimlerinin bulunması, ubikuitine bağımlı proteazomal degradasyonda BAG-1L'ın rolünün belirlenmesinde kritiktir. An anti-apoptotic protein BAG-1, with its adaptor function, can interact with a diverse array of molecular targets such as Hsp70/Hsc70 chaperones, proteasome machinery, Bcl-2, Raf-1 kinase, nuclear hormone receptors and DNA, and is found to involve in the regulation of a wide variety of cellular processes. In human cells, three functionally distinct and differentially localized BAG-1 isoforms originating from a single mRNA are expressed through alternative translation and these three isoforms include BAG-1S (33 kDa), BAG-1M (46 kDa) and BAG-1L (52 kDa), which have distinct N-terminus. BAG-1L, which possess a nuclear localization signal is a largely nuclear protein, whereas BAG-1M partitions between nucleus and cytoplasm. BAG-1 with its isoforms is a candidate protein to form hubs to transmit signals for survival. It has been reported that relatively high BAG-1L levels are observed in tumor cells.Protein folding process occurs in the endoplasmic reticulum. This folding process involves heat shock proteins, lectin proteins, disulfide isomerases present in the ER. In protein folding, N-glycosylation occurs which increases protein stability. N-linked glycans increase protein solubility and directly affect protein folding pathways. Calnexin (ER membrane bound) and Calreticulin (ER lumen) are lectin chaperones and support protein folding. Lectin chaperones connect to the last glucose and then control the folding process. In addition, lectin chaperones interact non-covalently with oxidoreductase PDI (ERp57), thus triggering disulfide bond formation and isomerization on the substrate. PDI is a member of the disulfide isomerase protein family and is found in the ER lumen. The formation of disulfide bonds limits the conformational flexibility of the proteins and increases the structural stiffness of the proteins. Despite the quality control mechanism in ER, when protein folds are inadequate and the protein can not fold properly, aberrant proteins accumulate in the ER. Therefore, the activation of the unfolded protein response (UPR) occurs. Through ERAD pathway, which is part of the UPR system, abnormal protein retrotranslation from the ER to the cytosol occurs. The ERAD pathway consists of a series of processes that mediate the retrotranslocation of selected aberrant proteins and the ubiquitin-dependent proteasomal degradation. The energy that drives substrate dislocation is derived from adenosine triphosphate (ATP) hydrolysis by the abundant, ubiquitin-dependent hexameric AAA+ ATPase VCP (p97). VCP is recruited to ERAD dislocation complexes through direct interactions with several ERAD components. ERAD substrate polyubiquitination functions as a binding site that facilitates extraction by VCP and acts as the signal for proteasomal degradation. The addition of ubiquitin occurs via sequential enzymatic reactions involving an E1 ubiquitin-activating enzyme, an E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and an E3 ubiquitin ligase that mediates the final transfer of ubiquitin to the substrate. CHIP (E3 ligase) is part of a system that directs misfolded proteins from chaperones to proteasomes. Two modulators, BAG-1 and CHIP, have implicated in cytosolic degradation pathways,xxiiputting molecular chaperones at the center of the decision process between folding and degradation of non-native polypeptides. The ubiquitin/proteasome system, the interaction partner of BAG-1, degrades misfolded or unfolded proteins.Investigating the effect of BAG-1 on the estrogen receptor has found that BAG-1L promotes estrogen-dependent transcription but BAG-1M or BAG-1S do not increase transcription of ER. BAG-1L interacts with estrogen receptors and enhances receptors activity. Studies on proteasome have shown that toxic effects of proteasome inhibition in cancer cells are more sensitive than normal cells. Although the mechanism behind the higher susceptibility of cancer cells is not known, there is a high probability of using the proteasome to regulate proliferation and anti-apoptotic pathways. BAG-1, an adaptor protein in the ubiquitin/proteasome system, can be used as a drug target in cancer due to cell survival effect. Here, we adopted a proteome-based strategy comprising isolation of BAG-1L associated complexes from breast cancer and epithelial cell lines as well as breast tissues. Identification of the proteins involved in BAG-1L associated complexes to ultimately delineate the adaptor role of BAG-1L in breast cancer. Proteins involved in BAG-1L associated complexes were identified via LC-MS/MS analysis with an BAG-1L isoform-specific manner. Further analyses with bioinformatics tools hinted the involvement of BAG-1L isoform in protein quality control system, which includes the action of endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) mechanism to maintain intracellular homeostasis of cellular proteins. Interaction of BAG-1L isoform with the proteasome were poorly characterized, detailed understanding of the involvement of BAG-1L isoforms in the ubiquitin mediated proteasomal degradation is lacking. Determined interactions which includes specifically VCP/p97 and Rad23, components of proteasome machinery, set a critical role for BAG-1 in the ubiquitin-dependent proteasomal degradation. 90

Kanser, yirmi birinci yüzyılın dünyasında önemli bir sorundur ve refah seviyesi fark etmeksizin tüm ülkeleri etkiler. GLOBOCAN verilerine göre, 2012 yılında tüm dünyada 14.1 milyon yeni kanser vakası ve 8.2 milyon kanser kaynaklı ölüm meydana gelmiştir. İlerleyen yıllarda ise kanser insidansının ve kansere bağlı ölümlerin artış göstermesi beklenmektedir. Meme kanseri dünyada ikinci en sık görülen ve kadınlarda en sık görülen kanser türüdür. Meme kanseri her yıl 1.15 milyon yeni vakaya ve 411,000 ölüme sebep olmaktadır. Kolorektal kanseri ise dünyada üçüncü en sık saptanan malignite ve dördüncü kansere bağlı ölüm sebebidir. GLOBOCAN veri tabanına göre kolorektal kanserde, 2012 yılında 1.4 milyon yeni vaka ve yaklaşık olarak 700,000 ölüme sebep olmuştur.Hücre döngüsü, hücre büyümesini ve DNA'nın çoğalmasını düzenlemek için sıralı fazları ve kontrol noktalarını içeren bir işlemler bütünüdür. Tümör baskılayıcı genlerin ve onkogenlerin ürünleri olan ve hücre döngüsünde görev alan bazı proteinler vardır. Tümör baskılayıcı genlerdeki anormalliklerden dolayı, hasar görmüş tümör baskılayıcı proteinler hücre döngüsünü kısıtlama olan görevlerini doğru şekilde yerine getiremezler. Bunun yanı sıra, mutasyonlar sonucu aktive hale gelen onkogenler, kontrol mekanizmasının etkin olmadığı bir hücre döngüsüne sebep olur. Bozulmuş bir hücre döngüsü sonucu biriken hataların sonucunda hücreler, hücre büyümesini ve ölümünü kontrol eden sinyallere daha fazla cevap veremezler. Bu sıralı olaylar kanser hücrelerinin oluşumuna neden olurlar. Tümör baskılayıcı genler hücre döngüsünü prosesinin ve replikasyonun devamlılığyla birlikte kontrolünü sağlar. BRCA1 ve BRCA2 gibi genler ise DNA kırıklarının hatasız tamiri için kardeş kromatidi kullanan homolog rekombinasyon tamir mekanizmasında görev alan ana genlerdir. Öte yandan, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 ve EPCAM'dan oluşan mismatch tamir mekanizması yanlış nükleotid eşleşmelerini ve küçük insersiyonlarla delesyonların düzeltilmesinde görev alır. Mismach tamir mekanizmasındaki bozukluklar kanser gelişiminde önemli bir yer tutmaktadır ve herediter non-polyposis kolorektal kanser sendromu –diğer adıyla Lynch sendromu ile ilişkilendirilmektedir. Bu mekanizmadaki bozukluklar özellikle kolorektal kanser riskini arttırmakla beraber gastrik, endometriyal ve over kanserlerine de sebep olmaktadır. Ek olarak, kanser dokularında mikrosatellit instabilitenin (MSI) de görülmesinde etkilidir. MSI, birçok kanser türünde oluşabilmektedir ancak Lynch sendromu ilişkili kolorektal kanserin karakteristik özelliğidir. Kanserlerin vakalarının çoğunluğu kişilerin hayatı boyunca oluşabilecek patojenik varyantlardan kaynaklanmaktadır ama nesiller boyunca aktarılmış genetik değişimlerden dolayı oluşan kanserler kalıtsal tür olarak adlandırılmıştır. Yaklaşık olarak tüm kanser vakalarının yüzde beş ila onu kalıtsal kanser kategorisinde bulunmaktadır.Meme ve kolorektal kanserlerin insidans ve ölüm oranları göz önünde bulundurulduğunda, klinik özelliklerin ve nadir varyantların karakterize edilmesi için kalıtsal risk grubundaki hastaların germline DNA'ları çoklu gen panelleri ile yeni nesil dizileme (NGS) teknolojisi kullanılarak dizilendi.Hasta grubu 273 meme kanseri hastası ve 123 kolorektal kanseri hastasından oluşmaktadır. Kontrol grubu içinse 65 yaşından büyük ve kişisel kanser öyküsü bulunmayan 338 kişi çalışmaya dâhil edilmiştir. Kalıtsallık riskine sahip olan hastaları belirlemek için NCCN'ye ait olan kalıtsal meme ve kalıtsal kolorektal kanser kılavuzlarından faydalanıldı. Yeni nesil dizileme için üç farklı ticari kit kullanıldı. . Varyant çağırma için Sophia DDM yazılımı ile GATK analizleri kullanıldı. Analizler sonucu açığa çıkarılan varyantlar üç ticari kitte bulunan ortak 20 gene göre filtrelendi. Bu genler kalıtsal meme ve over kanser, kalıtsal non-polipozis kolorektal kanser ve bağırsak polipozis sendromlarıyla ilişkilidir. 20 genin sıralanışı şu şekildedir: APC, ATM, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, EPCAM, MLH1, MSH2, MUTYH, NBN, PALB2, PMS2, PTEN, RAD51C, RAD51D, STK11 ve TP53. 1000 Genom populasyon veri tabanında alel frekansı %1'in altındaki ekzonik ve splice bölgelerinde bulunan varyantlar seçilmiştir. Hastaların raporlandırılması esnasında monoallelik MUTYH patojenik varyantlar değerlendirme dışı bırakılmıştır. Patojenik/muhtemel patojenik varyantları bulunduran ve pozitif olarak değerlendirilen hastalarla sağlıklıların oranları şu şekildedir: Meme kanseri hastaları için %13.55 (n=37), kolorektal kanseri hastaları için %11.90 (n=15) ve kontroller için %4.45 (n=15). Meme kanseri hastalarının %24.18'i (n=66), kolorektal kanser hastalarının %30.95'i (n=39) ve kontrollerin %21.96'sında önemi belirsiz (VUS) varyant bulunmuştur.Hastalarda yapılan kalıtsallık riskinin tahmini sonucu meme kanseri hastalarının %72'si (n=197) yüksek risk sınıfında bulunmuştur. Kalan hastaların %28'inde ise (n=76) kalıtsallık riski daha az olarak bulunmuştur. Yüksek risk ve yüksek olmayan risk gruplarının yaş ortalamaları sırasıyla 44.9 ve 59.6 olarak tespit edilmiştir. Tüm meme kanseri hastalarında (n=273), toplamda 43 patojenik varyant bulunmuştur. Patojenik varyantların %4.76'sı BRCA1 ve BRCA2 genlerinde gözlenmiştir. Orta dereceli penetransa sahip genler (ATM, CHEK2, PALB2, NBN) %5.10 ile en fazla patojenik varyant içeren genler olarak bulunmuştur. Vaka control karşılaştırması sonucunda CHEK2 geninde bulunan patojenik varyantların anlamlı odds oranına sahip olduğu bulunmuştur (OR=3.51). Ayrıca, CHEK2 geninde bulunan bir patojenik varyantın, NM_007194(CHEK2):c.1427C>T (p.Thr476Met), meme kanseri hastalarında (n=4) ve kontrollerde (n=3) bulunduğu tespit edilmiştir. Meme kanseri hastalarında 83 (n=75) tane önemi belirsiz varyant tespit edilmiştir. Bu varyantların 72'si ise farklı varyantlar olarak tanımlanmıştır. Tüm ve farklı önemi belirsiz varyantların içinde, ATM ve BRCA2 diğer genlerden daha yüksek oranlara sahip olduğu bulunmuştur. Gen ürünü büyüklüğünün bulunan varyant sayısı üzerindeki etkisini kaldırmak için tüm ve farklı önemi belirsiz varyantlara standardizasyon uygulandı. Standardizasyon sonucunda CHEK2, MSH2, RAD51C ve MSH6 genleri amino asit başına bulunan VUS sayısı bakımından diğer genlere göre daha yüksek oranlar gösterdi. Aynı sonuçlar yüksek ve daha az kalıtsal riske sahip olan hastalarda da gözlenmiştir. RAD51C ise bir tane önemi belirsiz varyanta sahip olduğundan, CHEK2, MSH2 ve MSH6, yapılacak ileri analizlerde meme kanseri ile ilişkili genlerin belirlenmesinde gelecek vaat eden genlerdir.Kolorektal kanser grubunun %35'i (n=43) yüksek kalıtsal riske sahip olarak tanımlanmışken %65'i (n=80) daha az kalıtsal riske sahip olarak tanımlandı. Tüm kolorektal kanser hastalarında 19 patojenik variant tanımlandı. 17 tane farklı patojenik variant ve bunlardan üç tanesi ise daha önce literatürde ve veri tabanlarında gözlenmedi. Tüm patojenik varyantların %5.69'u MLH1 ve MSH2 genlerinde bulundu. Mismatch tamir genlerinden olan MLH1 (OR=19.45, p=0.0499) ve MSH2 (OR=25.11, p=0.0308) anlamlı odds oranları gösterdi. Orta dereceli penetransa sahip genlerden ATM ve CHEK2 genleri kolorektal kanserle anlamlı ilişki göstermediği bulundu. Düşük penetransa sahip genlerde patojenik varyanta saptanmamıştır. Tüm ve farklı önemi belirsiz varyantlarda ATM geninin tüm 20 genin içinde en yüksek varyant oranına sahip olduğu görüldü. Standardize edilmiş ve edilmemiş VUS sayılarının karşılaştırılması sonucunda, CHEK2 geninin birim amino asit başına en fazla VUS'a sahip olduğu bulundu.Tek nükleotid değişimlerine ve küçük insersiyon/delesyonlara ek olarak Sophia DDM yazılımı kullanılarak in silico yöntemle meme kanseri hastalarında 22, kolorektal kanseri hastalarındaysa 4 tane kopya sayısı varyantı bulunmuştur. Yine de bulunan sonuçların fonksiyonel çalışmalarla valide edilmesi gerekmektedir.Sonuç olarak bu çalışma, Türkiye'de bulunan meme ve kolorektal kanseri hastalarının incelenmesi açısından öncüdür. Elde edilen verilerle ilerleyen dönemlerde yapılacak çalışmalar Türk toplumunu daha uygun şekilde temsil edecektir. Cancer is a global burden in the twenty-first century, affects all countries regardless of income levels. According to the GLOBOCAN data, 14.1 million new cancer cases and 8.2 million cancer-related deaths occurred in 2012. In addition, increase of the cancer incidence and cancer-related deaths are expected in coming years. Breast cancer represents the second most common in the world and the most common cancer among women, accounts for 1.15 million new cases and 411,000 cancer deaths each year. Colorectal cancer is the third most commonly diagnosed malignancy and the fourth leading cause of cancer-related death in the world. The GLOBOCAN database showed that it accounted for 1.4 million new cases and approximately 700,000 deaths in 2012.The cell cycle is a process, which includes sequential phases and checkpoints in order to regulate cell growth and replication of DNA. There are some set of proteins involved in the cell division events, which are the products of tumor suppressor genes and oncogenes. Due to the abnormalities in tumor suppressor genes, defective tumor suppressor proteins malfunction to restrict cell cycle. On the other hand, activated oncogenes leads to uncontrolled cell cycle, which drives the cell cycle forward without controlling. The accumulation of mistakes during the malfunctioned cycle, the cells no longer respond to the signals that control cellular growth and death. These sequence of events cause to formation of cancer cells, which is also called carcinogenesis. Tumor suppressor genes manage fidelity of cell cycle replication process and controls. The tumor suppressor genes such as BRCA1 and BRCA2 are the major part of homologous recombination repair, which is an important mechanism using sister chromatid in order to process error-free repair of DNA double breaks. On the other hand, the mismatch repair mechanism (MMR), which consists of MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 and EPCAM, is responsible for correcting single base mismatches as well as small insertion/deletion loops of unpaired bases. Alterations in the MMR system stands in a significant place in carcinogenesis, associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome, which is also known as Lynch syndrome. The MMR defects increases the risk of colorectal, gastric, endometrial and ovarian cancer, but mostly are associated with colorectal cancer. Besides, pathogenic variants in the MMR genes cause to microsatellite instability (MSI) in tumor tissues. MSI may occur in many cancer types but it is a significant marker for colorectal cancer patients with Lynch syndrome. The majority of cancer arise from pathogenic variants sustained over a lifelong but the cancer results from genetic alterations that are transmitted through generations considered as hereditary case. Approximately 5-10% of all cancer cases appear in this category.Considering that the incidence and mortality rates of colorectal and breast cancer, hereditary patients were sequenced using multigene panel testing in order to characterize clinical features and rare variants found in those patients. Apart from that, it is aimed to reveal recurrent pathogenic variants, candidate for founder pathogenic variants, by comparing the patient and control groups.Study subjects consists of 273 breast cancer patients, 123 colorectal cancer patients as well as 338 controls older than 65 years without personal cancer history. All the patients and controls were given informed consent form. The patients were grouped whether they have increased risk of breast or colorectal cancer according to NCCN guidelines for hereditary breast and hereditary colorectal cancer. For sequencing, three different commercial kits were used. Both Sophia DDM and GATK Variant Calling pipeline were used in order to call variants, and the found variants were filtered 20 cancer predisposing genes relevant with hereditary breast and ovarian cancer, HNPCC and intestinal polyposis syndrome. The 20 cancer predisposing genes are as follows: APC, ATM, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, EPCAM, MLH1, MSH2, MUTYH, NBN, PALB2, PMS2, PTEN, RAD51C, RAD51D, STK11 and TP53. The exonic and splice variants, which have allele frequency equal or smaller than 1% as well as no data in 1000 Genome population database were selected. Interpretation of the selected variants was done according to the ACMG guideline. During interpretation of patients, monoallelic MUTYH pathogenic variants were excluded. Positive rates for patients and controls with a pathogenic/likely pathogenic mutation(s) were as follows: 13.55% (n=37) for breast cancer group, 11.90% (n=15) for colorectal cancer group and 4.45% (n=15) for controls. Inconclusive results were found in 24.18% (n=66) for breast cancer patients, 30.95% (n=39) for colorectal cancer patients and 21.96% (n=74) for controls.The estimation of hereditary breast cancer showed that 72% (n=197) of breast cancer patients are in high risk group, whereas 28% (n=76) of the patients falls in non-high risk group. The average ages of high and non-high risk groups are 44.9 and 59.6, respectively. In all breast cancer patients (n=273), 43 (7.56%) pathogenic variants were found. 4.76% of pathogenic variants were found in BRCA1 and BRCA2. Pathogenic variants in moderate penetrance genes (ATM, CHEK2, PALB2, NBN) had the highest rate in breast cancer patients (5.10%). Case-control comparison revealed that pathogenic variants in CHEK2 have significant OR of 3.51 in breast cancer patients. Also, a recurrent pathogenic variant, NM_007194(CHEK2):c.1427C>T (p.Thr476Met), was found in both breast cancer patients (n=4) and controls (n=3). 83 VUS (n=75) were identified in breast cancer patients, and 72 of the VUS were unique. In both all and unique rare VUS, ATM (%all = 6.2, %unique = 5.1) and BRCA2 (%all = 4.4, %unique = 3.3) had higher rates than other genes in 273 breast cancer patients. To overcome with the size of gene products and their effects on variant numbers, standardization applied for both all rare and unique rare VUS numbers identified in breast cancer patients. It is found that CHEK2, MSH2, RAD51C and MSH6 had more VUS per amino acid than other genes. The same result was obtained in comparison between high risk and non-high risk patients. Since RAD51C had only one VUS, CHEK2, MSH2 and MSH6 are promising candidates for further studies associated with breast cancer.In colorectal cancer, 35% (n=43) of the patients were classified as high risk patients, whereas 65% (n=80) were non-high risk patients. In all colorectal cancer patients, 19 pathogenic variants were identified. 17 pathogenic variants were unique, and 3 of unique pathogenic variants were identified as novel. 5.69% of pathogenic variants were found in MLH1 and MSH2. Mismatch repair genes, MLH1 and MSH2 showed significant OR of 19.45 (p = 0.0499) and 25.11 (p = 0.0308), and associated with colorectal cancer. Pathogenic variants in moderate penetrance genes, ATM and CHEK2 did not show significant associations with colorectal cancer. No pathogenic variants were found in low penetrance genes. In both all and unique rare VUS, ATM (8,9%, n=11) had the highest rate among all 20 genes. Comparison of standardized and non-standardized VUS between all and unique rare VUS revealed that standardized CHEK2 had the highest number of VUS in colorectal cancer patients.In additionally, using Sophia DDM software, 22 and 4 copy number variants were identified in breast and colorectal cancer patients, respectively. Still, these variants need to be validated with functional studies.After all, this study is a pioneer to examine the hereditary breast and colorectal cancer patients in the Turkish population. With the gathered data, the future cancer studies will represent the Turkish population more precisely. 105

BAG-1 (Bcl-2 ilişkili athanogen-1) bir çok organizmada evrimsel süreçte korunmuş olan BAG ailesine ait anti-apoptotik bir proteindir. Hücre içerisinde önemli mekanizmada görev alan BAG-1, çok fonksiyonlu adaptör protein olarak bilinir. HSP70/HSC70 ısı şoku proteinleri, E3 ubikuitin protein ligazlar, nükleer hormon reseptörleri, Raf-1 serin/treonin kinaz ailesi ve Bcl-2 proteini gibi çeşitli moleküllerle olan etkileşimler ile BAG-1 transkripsiyon, hormon aktivitesi, hücre büyümesi, hücre hareketliliği ve proliferasyonu, tümörigenez, apoptoz mekanizması ve hücre içindeki önemli sinyal yolaklarını düzenlemektedir. BAG-1'in hücrenin yaşamını sürdürmesini sağlamakta olduğu düşünülmektedir. Yapılan çalışmalar meme kanseri, kolon kanseri ve prostat kanseri başta olmak üzere çeşitli kanser türlerinde BAG-1'in yüksek oranda ifade edildiğini göstermektedir. Hücre içerisindeki fonksiyonları göz önünde bulundurulduğu zaman BAG-1'in özellikle meme kanserinin oluşum ve gelişim sürecinde BAG-1'in önemli rolü olduğu düşünülmektedir.BAG-1 proteini aynı mRNA üzerindeki farklı başlangıç bölgelerinden translasyon sonucu oluşan üç ana izoformdan oluşmaktadır. BAG-1'ın üç izoformu da C-ucunda BAG domaini ve ubikuitin benzer domaini bulundurmaktadır. İzoformlar arasındaki fark N-ucu bölgesinden kaynaklanmaktadır. En büyük izoform olan BAG-1L, N-ucunda nükleer lokalizasyon sinyaline sahiptir ve nükleusta bulunur. BAG-1S hücre içerisinde en baskın olarak bulunan ve sitoplazmada lokalize olmuş en küçük BAG-1 izoformudur. BAG-1M ise ekspresyon seviyesi BAG-1L ve BAG-1S'ye kıyasla daha az olan ve nükleer lokalizasyon sinyali bulunmamasına karşın çeşitli aracı proteinler ile hem sitoplazma hem de nükleusta lokalize olabilen BAG-1 izoformudur. İzoformların bulundukları doku ve hücreye göre özelleşebildiği bilinmekte ancak izoform spesifik çalışmalar ile her bir BAG-1 izoformun etkileştiği proteinler ve görev aldığı mekanizmalar ile ilgili detaylı bilgi bulunmamaktadır.BAG-1M'nin hem sitoplazma hem de çekirdekte bulunabilmesi, bu izoformun hem DNA hem de sitoplazmik proteinler ile etkileşerek kanser sürecinde görev alabileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmada BAG-1M izoformunun öncelikle BAG-1'in bilinen etkileşim partnerleri ile olan etkileşiminin incelenmesi ve hücre sağkalımı üzerindeki etkisinin gösterilmesi, sonrasında ise etkileşim partnerlerinin meme kanseri ve meme epitel hücrelerinde tespit edilmesi amaçlanmıştır. Yapılan bu çalışmanın BAG-1M'nin kanserli ve meme epitel hücrelerindeki farklı etkileşimleri göstererek bu izoformun meme kanseri oluşum ve gelişim sürecindeki rolünün aydınlatılmasına katkıda bulunması hedeflenmiştir.BAG-1M'nin etkileşim partnerlerinin tespit edilebilmesi için öncelikle N-ucu TAP etiketi içeren BAG-1M dizisini içeren vektör plazmid hücrelere transfekte edilmiş, ardından TAP etiketi pürifikasyonu ile transfekte edilen hücrelerden elde edilen total protein içerisinden BAG-1M saflaştırılmıştır.xxivBAG-1M'nin hücre sağkalımındaki etkisi transfekte edilmemiş hücrelerle karşılaştırmalı olarak gösterilmiş, BAG-1M izoformunun yüksek ifadesinin hücre proliferasyonunu ve hücrelerin koloni oluşturma yatkınlığını arttırdığı hücre canlılığı testleri ile gösterilmiştir.BAG-1'in bilinen etkileşim partnerleri olan HSP-70, Bcl-2, Raf-1, Akt, Raf-1 ve Akt'ın sırasi ile 338. ve 473'üncü serinlerinden fosforillenmiş formları ile BAG-1M etkileşiminin olduğu saflaştırılan BAG-1M örneklerinde immün blotlama ile gösterilmiştir.Bilinen etkileşim partnerleri dışındaki etkileşen proteinlerin tespit edilmesi amacıyla saflaştırılan BAG-1M proteini tripsin ile peptitlerine parçalanmış ve peptit haritalama yöntemi için sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ile analiz edilmiştir. Tespit edilen peptitler PLGS (Protein Lynx Global Server) kullanılarak UNIPROT veritabanı ile eşleştirilerek kimliklendirilmiş, iki biyolojik tekrarın ikişer teknik tekrarı yapılarak ortak bulunan proteinler BAG-1M etkileşim partnerleri olarak kabul edilmiştir.Sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizleri sonucunda tespit edilen BAG-1M etkileşim partnerlerinin hücre içerisinde dahil oldukları mekanizmalar ve protein-protein etkişim ağları sırası ile KEGG ve STRING internet ağ sunucuları kullanılarak analiz edilmiş, proteinler GO Enrichment analizi kullanılarak moleküler fonksiyonlarına göre karbon metabolizması, hücre iskeleti organizasyonu, stres yanıtı ve endoplazmik retikulumdaki protein işlenmesi olmak üzere dört kategori altında incelenmiştir. BAG-1'in endoplazmik retikulum ilişkili degradasyonda görev alabileceğinin düşünülmesinden dolayı bu çalışmada endoplazmik retikulumda protein işlenmesi kategorisine odaklanılmış, etkileşimlerin kanserli ve epitel meme hücreleri arasındaki farkları incelenmiştir.LC-MS/MS analizleri sonucunda kimliklendirilen proteinlerin doğrulanması amacı ile iki boyutlu jel elektroforezi (2-DE) yöntemi kullanılarak proteinler izoelektrik noktaları ve moleküler ağırlıklarına göre ayrılmış, jelden kesilen protein spotları MALDI-TOF analizleri ile kimliklendirilmiştir. Kütle spektrometresi ve iki boyutlu jel elektroforezi sonuçlarında ortak gelen proteinlerin BAG-1M izoformu ile etkileşimi meme kanseri ve meme epitel hücrelerinden saflaştırılan örneklerin immün blotlama analizleri ile de doğrulanmıştır.BAG-1M izoformunun etkileştiği proteinlerle oluşturduğu komplekslerin görev aldığı hücresel mekanizmaları aydınlatması amacıyla doğal formları korunarak transfekte edilen hücrelerden izole edilen ve saflaştırılan proteinlerin oluşturduğu kompleksler mavi poliakrilamid jel elektroforezi ile moleküler ağırlıklarına göre ayrılmıştır. Her bir kompleksin jelden kesilmesi, peptitlerine parçalanması ve LC-MS/MS peptit haritalaması ile kompleksteki proteinler tespit edilmiştir. Komplekslerin incelenmesi ile tespit edilen proteinlerin proteazom alt birimlerini, ubikuitinasyonda görev alan proteinleri, endoplazmik retikulumda yerleşik olan proteinleri içerdiği görülmüş, bu proteinlerin aynı komplekslerde bulunması da BAG-1M'nin endoplazmik retikulum ilişkili degradasyonda görev alabileceği düşüncesini desteklemiştir.Bu çalışmada yapılmış olan tüm deneysel çalışmalarda elde edilen sonuçlar, ısı şok proteini 90 (HSP-90), ısı şoku proteini 70 ailesi üyesi BiP (HSPA5), protein disülfid izomeraz A3 (PDIA3), geçişli endoplazmik retikulum ATPaz (VCP) ve UV eksizyon tamir proteini RAD23 homoloğu (RAD23B) gibi katlanma/yeniden katlanma mekanizmasında görevli ve ubikuitin ile ilişkili proteazomal bozunmada işlevi olan proteinlerle BAG-1M izoformunun etkileştiğini göstermiştir. Meme kanseri ve memexxvepitel hücrelerinde BAG-1M ile VCP ve BAG-1M ile RAD23B etkileşimlerinin farklılık gösterdiği immün blotlama yöntemi ile gösterilmiştir. BAG-1M izoformunun VCP ve RAD23B ile kurduğu etkileşimin sadece meme kanseri hücrelerinde görülmesi bu etkileşimlerin kanser sürecinde önemli rolü olabileceğini düşündümüştür.Yeni tespit edilen etkileşim partnerlerinin PDB veritabanında bulunan yapıları BAG-1'in BAG domaini ve ubikitin benzeri domaini ile PRIŞM web sunucusu kullanılarak incelenmiş, kurulabilecek olası kompleksler yapıları ve iki protein arasındaki enerji seviyesine göre değerlendirilmiştir. Yapısal analizler, RAD23B, VCP ve PDIA3'ün BAG-1 ile etkileşime geçebileceklerini, ancak HSP-90 ve BiP ile BAG-1 etkileşiminin BAG-1'in her iki domaininden de pek olası bulunmadığını göstermiştir.Mavi-nativ jel elektroforezi ile kimliklendirilen kompleksler incelendiğinde, HSP-70 ile HSP-90 ve BiP'in bilinen etkileşimleri, BAG-1 ile HSP70 etkileşiminin biliniyor olması ve yapısal analizlerde BAG-1M ile HSP-90 ve BAG-1M ile BiP'in etkileşiminin olası bulunmaması, bu iki protein ile BAG-1M'nin birlikteliğine HSP-70 veya başka aracı proteinlerin sebebiyet verebileceğini düşündürmüştür.Bu çalışma ile BAG-1M izoformunun doğrudan (fiziksel) veya dolaylı (fonksiyonel) olarak etkileştiği proteinler kimliklendirilmiştir. BAG-1'in rol aldığı mekanizmalar, bilinen etkileşim partnerleri ve yeni tanımlanan etkileşen proteinler göz önünde bulundurulduğunda, endoplazmik retikulumdaki yerleşik proteinlerle, ubikuitinasyon mekanizmasında görev alan proteinlerle, proteazom alt üniteleri ve şaperonlarla olan etkileşimleri BAG-1M izoformunun endoplazmik retikulum ilişkili degradasyon (ERAD) mekanizmasında fonksiyonu olabileceğini önerisini desteklemektedir.Elde edilen deneysel bulgular ve gerçekleştirilen yapısal analizler ışığında gelecekte yapılacak olan bölgesel yönlendirilmiş mutasyonlar ile tespit edilen protein etkileşimlerinin bozulmasının hücre üzerindeki etkilerinin incelenmesi, degradasyon mekanizmasında hedef alınan substratların fonksiyonel analizler ile tespit edilmesi ve in vitro yüzey analizi çalışmaları ile etkileşimlerin analiz edilmesi gibi daha detaylı çalışmaların meme kanserinde bir biyobelirteç olarak görülen BAG-1'in BAG-1M izoformuna özgü fonksiyonlarının aydınlatılmasına, yeni tespit edilen etkileşimlerin kristal yapı çalışmalarına ve kanser tedavisinde kullanılabilecek küçük molekül sentezlenmesi ile yeni terapötik ajanlar geliştirilmesine katkıda bulunabileceği düşünülmektedir. BAG-1 (Bcl-2 associated athanogene-1) is an anti-apoptotic protein which is a member of BAG family that has been evolutionary conserved in many organisms. BAG-1 is involved in important mechanisms within the cell, as a multifunctional and an adapter protein. BAG-1 functions on the regulation of transcription, hormone activity, cell proliferation, cell motility, tumorigenesis, apoptosis and various cellular signaling pathways via its interactions with heat shock proteins, E3 ligases, nuclear hormone receptors, Raf-1 serine/threonine kinase family, and Bcl-2. When the functions in the cell are taken into account, BAG-1 allows the cell to survive and is overexpressed in many types of cancer. It is thought that BAG-1 has an important role in the development of breast cancer in particular.There are three major isoforms of BAG-1 originated from alternative translation initiation sites on the same mRNA. Both of the three isoforms contain the BAG domain and ULD (ubiquitin like domain) at the C-terminus regions, the difference between the isoforms arise from the N-terminus sites. BAG-1L is the largest isoform, has the nuclear localization signal at the N-terminus and is found in the nucleus, the smallest isoform is the BAG-1S which is known as the most abundant isoform in cell and localized in the cytoplasm. BAG-1M can be found in both cytoplasm and nucleus with a variety of mediator proteins. It is known that BAG-1 isoforms can be specialized to the tissues and cells they are present in, but there is no detailed information in the literature on isoform-specific studies that lighten the proteins that each isoform interacts with and the mechanisms in which it is involved.In this study, it was aimed to detect the interaction partners of BAG-1M isoform in breast cancer and breast epithelial cells.In order to detect the interaction partners of BAG-1M, the vector plasmid that contains the N-terminus TAP-Tagged sequence of BAG-1M was used transfect cells and then BAG-1M was purified from the total protein isolated from the cells transfected. Proteins interacting with BAG-1M were first identified via LC-MS/MS (liquid chromatography-mass spectrometry) analyses for peptide mapping of the digested purified proteins. For verification of identified proteins, 2-DE performed on purified BAG-1M samples and spots of 2-dimensional gel were analyed on MALDI-TOF. For further confirmation, immunoblotting assays were applied on purified samples to check the existance of identified proteins.Pathway analysis and protein-protein interaction networks of the detected proteins were analyzed using KEGG and STRING web servers. For the classification of the identified proteins, GO Enrichment assays were used.In order to illuminate the cellular mechanisms of the complexes formed by BAG-1M and its interacting proteins, native forms of proteins were purified and complexes werexxiiseparated according to their size by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Each complex was cut from the gel, digested to peptides and analyzed on LC-MS/MS for peptide mapping to detect containing proteins.The results obtained in all experimental studies showed that the interacting proteins of BAG-1M as heat shock protein 90 (HSP-90) , heat shock protein family member BiP (HSPA5), protein disulfide isomerase family member A3 (PDIA3), transitional endoplasmic reticulum ATPase (VCP) and UV excision repair protein RAD23 homolog B (RAD23B) which function in folding/refoldig of proteins and the ubiquitin-related proteasomal degradation.Considering of the mechanisms that BAG-1 is involved, known partners and newly identified interacting proteins suggested that interacting with the proteins localized in endoplasmic reticulum, proteins functions in ubiquitination mechanism, proteasome subunits, and chaperons may be related to role of BAG-1M in endoplasmic reticulum associated degradation (ERAD).Prediction of interaction surfaces of the identified proteins with the BAG domain and ubiquitin-like domain of BAG-1 were performed using the PRISM web server and evaluated according to the energy level between two proteins. Structural analyses showed that RAD23B, VCP and PDIA3 are capable to interact with BAG-1, while HSP-90 and HSPA5 interactions were not found as have possible physical interactions.This study identified proteins that interacting with BAG-1M isoform in direct or indirect manner. More detailed studies that will be performed in the light of the experimental findings and structural analyses can contribute to the elucidation of isoform-specific functions of BAG-1, which is seen as a biomarker in breast cancer, and to the development of new therapeutic agents. 99

Karaciğerde fibroz kronik hasara cevap olarak meydana gelen yara iyileşme sürecine bağlı gelişerek karaciğerde aşırı ekstrasellüler matriks ve hasarlı doku birikimine sebep olur. Karaciğerde oluşan bu hasarlı doku birikimi, organın kasılma hareketlerine bağlı olarak kan akışını engeller. Bu durum da, progresif karaciğer hasarına ve fibrozun son aşaması olan sirozu takiben karaciğer yetmezliği, portal hipertansiyon ve hepatoselüler karsinoma (HCC) gibi daha vahim sonuçlara yol açabilir. Fibroz, kronik karaciğer hastalıklarının (viral hepatit, alkole bağlı ya da alkolden bağımsız steatohepatit, toksik karaciğer hasarı, otoimmün hastalıklar ve bazı genetik hastalıklar) en belirgin sonucudur. Karaciğer fibrozu genellikle progresif lineer bir olay olarak değerlendirilse de klinik çalışmalar fibroz gelişiminin her zaman sabit bir hızla ve doğrusal bir patern ile meydana gelmediğini göstermektedir. Karaciğer fibrozunun etiyolojisine bakılmaksızın kimi insanlarda hızlı bir şekilde siroz gelişimi gözlenirken kimilerinde fibroz oluşumu çok yavaş gerçekleşmekte ya da hiç gerçekleşmemektedir. Bu durumu sadece çevresel koşullara bağlamak mümkün değildir. Özellikle Hepatit B enfeksiyonunda klinik sonuç (kronik aktif hepatit, inaktif hepatit, fibroz gelişimi, siroz oluşumu vb.) virüsün replikasyon durumuna ve konağın virüse verdiği immün yanıta göre değişkenlik göstermektedir. Kronik hepatit B hastalarının hangisinde hızlı bir şekilde fibroz veya siroz gelişiminin meydana geleceğinin tahmin edilmesi son derece önem teşkil etmekte olup fibroz gelişiminde rol alan hücresel yolakların iyi bir şekilde tanımlanmasını gerektirmektedir. Bu tez çalışması, Hepatit B virüsü (HBV) ile enfekte hastalarda fibroz gelişimine odaklanarak kronik hepatit B'nin nedenlerini ve sonuçlarını kapsayan, birbirleriyle bağlantılı iki bölümden oluşmaktadır. Tezin ilk bölümü HBV enfeksiyonunda karaciğer fibrozu gelişimi ile ilişkili yolakların proteomik yöntemler aracığıyla belirlenmesini içermektedir. Tezin ikinci bölümü ise konağın immün profili ve kronik hepatit B'de görülen farklı klinik sonuçlar (aktif ya da inaktif hastalık seyri, siroz, virolojik alevlenme vb.) arasındaki ilişkiyi araştırmaktadır. Tezin ilk bölümünde, HBV ile enfekte 47 hastanın (F1: n = 7, F2: n = 20, F3: n = 12, F4: n = 3, F5: n = 2, F6: n = 3) doku örneklerinin iki boyutlu diferans jel elektroforezi (2D-DIGE) yöntemi kullanılarak proteomik taraması gerçekleştirilmiştir. Bu yöntem, tek bir jelde birçok protein örneğinin analizini sağlayarak daha doğru ve hassas proteomik kantitasyon sağlamaktadır. İki boyutlu jel elektroforezi (2-DE) binlerce proteini 2 boyutta öncelikle izoelektrik noktalarına, ardından kütlelerine göre ayrıştırabilen oldukça yüksek çözünürlüğe sahip bir yöntemdir. 2D-DIGE ise bu yöntemin daha gelişmiş bir versiyonu olup tek bir jelde birden çok örneğin incelenmesine izin vermektedir. Bunu sağlayan, her bir protein örneğinin yapısal olarak aynı fakat spektral özellikleri farklı olan floroforlarla (Cy2, Cy3, Cy5) kovalentxxivmodifikasyonunun gerçekleşmesidir. Her bir jelde Cy3 ve Cy5 floroforlarıyla etiketlenmiş 2 örnek ve çalışmadaki tüm örneklerden eşit miktarda barındıran Cy2 ile etiketlenmiş bir dahili standart incelenir. Böylece hem yapılacak olan jel sayısı azaltılır, hem de dahili kontrol sayesinde jeller arası varyasyonlar azaltılarak daha doğru ve hassas proteomik kantitasyon yapılabilir. 2D-DIGE deneyleri sonucunda tespit edilen farklı fibrotik düzeylerin proteomik profili student's T-test (tek değişkenli analiz) ile analiz edilerek anlamlı bulunan protein spotları (p < 0.05) jelden kesilerek kütle spektrometresi ile bu spotların ait olduğu protein sekansları tespit edilmiş ve belirlenen proteinler immün-blotlama ile de doğrulanmıştır. Belirlenen proteinlerin fonksiyonel ilişkileri ve ekspresyon profilleri EnrichNet uygulamaları ve String veribankası kullanılarak belirlenmiştir. Doku örneklerinde, farklı fibrotik düzeylerde değişim gösteren proteinler şunlardır: keratin 5 (KRT5), aneksin A4 (ANX A4), apolipoprotein A1 (APOA1), immünoglobin kappa zinciri C bölgesi (IGKC), aldehit dehidrojenaz 2 (ALDH2), alkol dehidrojenaz 1 (ADH1A1), fenazin biyosentez-benzeri domen içeren protein (PBLD), transferrin (TRFE), glutamat dehidrojenaz 1 (DHE3), piruvat kinaz PKM (KPYM), peroksiredoksin 3 (PRDX3), gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH). EnrichNet uygulaması üzerinden yapılan Reactome ve KEGG veribankası analizleri ile String analizleri çalışmaları sonucunda platelet atılımı, glikoliz ve HDL bağımlı lipid transport yolaklarının HBV kaynaklı karaciğer fibrozunda etkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, literatür araştırmalarının da etkisiyle HBx proteinin bir etkileşim partneri olan hipoksiya ile tetiklenen HIF-1α proteinin glikoliz yolağındaki değişimlerden ve fibrozda görülen mitokondriyal hasardan sorumlu olabileceği kanısına varılmıştır.Tezin ikinci bölümü, konağın HBV enfeksiyonuna immün cevabının incelenmesini içermektedir. Bu amaç doğrultusunda insan lökosit antijenleri (HLA) DQB1 ile DRB1 allellerinin kronik hepatit B enfeksiyonu ile ilişkisi araştırılmış ve HLA-DQB1 allellerinin genetik olarak düşük bariyerli ilaçlarla HBV tedavisinde virolojik alevlenmeye etkisi incelenmiştir. Oral yollu antiviral ilaçlarla kronik hepatit B tedavisi oldukça uzun bir süreçtir. Bu tedavi sürecinde, özellikle de virüsün tek bir nükleotid mutasyonu ile direnç kazanabileceği düşük bariyerli ilaçlar kullanılıyorsa, antiviral direnç çok önemli bir husustur. Konak immünitesinin de bu antiviral direnç kazanma mekanizmasında önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bahsi geçen bu ilaç direncinin ilk klinik işareti ise tıp terminolojisinde `virologic breakthrough` olarak geçen viral alevlenmedir. Konak immünitesinin çok önemli bir parçası olan İnsan lökosit antijenleri (Human Leukocyte Antigens = HLA) kompleksi, 6. kromozom üzerinde, kısa kolda (6 p23.1) 6 Megabaz (Mb) yer işgal eden bir gen grubudur. HLA gen ürünleri, bağışıklık sistemi yanıtının özgüllüğünü, organ naklinde doku uyumunu ve bazı otoimmün hastalıklara yakalanma riskini belirlerler. En çok bilinen genler HLA sınıf I ve HLA sınıf II gen kompleksleridir ve insan genomunda en polimorfik olan bölgedendirler. HLA sınıf II genlerinden sentezlenen majör MHC sınıf II molekülleri olan HLA-DP, HLA-DQ ve HLA-DR'de peptid bağlayan bölgede, hem alfa hem de beta alt ünitesinde değişkenlik gözlenir. HLA-DP alfa zinciri HLA-DPA lokusundan, HLA-DP beta zinciri HLA-DPB lokusundan, HLA-DQ alfa zinciri HLA-DQA lokusundan, HLA-DQ beta zinciri HLA-DQB lokusundan, HLA-DR alfa zinciri HLA-DRA lokusundan, HLA-DR'nin 4 farklı beta zinciri HLA-DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 lokuslarından kodlanır. HLA sınıf I moleküllerleri tümör immünolojisinde, hücre-içi patojenlere karşı yanıtta rol alırken HLA sınıf II molekülleri çoğunlukla antijen sunan hücreler tarafından eksprese edilirler ve antijen sunan hücrelerin, hücre dışına saçılmış peptitleri fagosite ederek ya da dendritik hücrelerde olduğu gibi, stres altındaki hücrelerin prezente ettiği hücre içi peptitleri CD+ T lenfositlere sunarak,xxvkazanılmış bağışıklık yanıtının başlamasına sebep olurlar. Bu bölümde de ilk olarak HLA-DQB1 allellerinin virolojik alevlenme olaylarına etkisini incelenmiştir. Bu doğrultuda 198 kronik hepatit B hastasının HLA-DQB1 alleleri sekans-spesifik primer-polimeraz zincir reaksiyonu (SSP-PCR) yöntemi ile genotiplendirilerek DQB1 allelerinin virolojik alevlenme gösteren ve göstermeyen gruplar arası dağılımı analiz edilmiştir. Sonuç olarak, DQB1*05:03 allelinin virolojik alevlenme göstermeyen grupta daha sık görüldüğü (28.4% vs 12.4%, p = 0.006) tespit edilmiştir. Tek değişkenli analizler sonucunda da HBeAg seropozitivitesi (p < 0.001), siroz gözlenmeme durumu (p = 0.007), genç yaş (p = 0.002) ve tedavi öncesi yüksek logDNA miktarlarının (p < 0.001) virolojik alevlenme olayları ile ilişkili olduğu gözlenmiştir. Fakat çok değişkenli analizler sonucunda sadece logDNA (p < 0.001) ve DQB1*05:03 allelinin (p = 0.02) virolojik alevlenme olayları ile anlamlı ilişkisi olduğu gösterilmiştir. Son olarak da konak immün profilinin kronik hepatit B enfeksiyonun klinik sonuçlarına etkisi incelenmiştir. Bu doğrultuda, 355 kronik hepatit B hastasının HLA-DQB1 ve DRB1 alleleri SSP-PCR yöntemi ile genotiplendirilerek sirozlu hasta grubu ile kronik aktif hepatit B hasta grubu arasında allellerin dağılımı analiz edilmiştir. Çalışma sonucunda 355 hastada en sık rastlanan HLA DQB1 alleli olarak DQB1*03:01 (48.2%) ve en sık rastlanan HLA DRB1 alleli olarak HLA DRB1*13/14 (51.8%) tesptit edilmiştir. HLA-DQB1*05:01 alleli kronik aktif hepatit B hastalrında inaktif hastalara nazaran daha sık gözlenmektedir (27% vs 9.1%, p = 0.002, pc = 0.026). HLA-DRB1*07 alleli ise sirozlu hastalarda sirozsuz hastalara nazaran daha nadir gözlenmektedir (3.4% vs 16%, p = 0.002, pc = 0.022). Bunun dışında ileri yaş (p < 0.001) ve erkek cinsiyeti (p = 0.008) siroz varlığını etkileyen diğer etmenler olarak gözlenmiştir. Çok değişkenli lojistik analizler sonucunda, DRB1*07 halen sirozun negatif yönlü bir prediktörü olarak görülmektedir (p = 0.015). Biyoinformatik analizler de DRB1*07 allelindeki aminoasit değişimlerinin T-hücresi tanıma bölgesinde değişimlere yol açarak hipoimmün bir profile yol açabileceğini göstermektedir.Sonuç olarak, tezin proteomik kısmındaki çalışmalar platelet atılımı, glikoliz ve HDL-bağımlı lipid transportu yolaklarının HBV ile enfekte hastalarda fibroz gelişimi ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tezin genomik bölümündeki çalışmalar da HLA alleleri düzeyinde incelenen konak immünitesinin hem oral antiviral ilaçlarla tedavi sırasında meydana gelebilecek virolojik alevlenme olaylarına etkisi olduğunu hem de hepatit B enfeksiyonu sonucundaki klinik tabloya (hastalığın gelişimi, siroz gözlenmesi vb) etki ettiğini göstermektedir. Bu sonuçlar doğrultusunda, tez çalışması bir bütün olarak platelet atılımı, glikoliz ve HDL-bağımlı lipid transportu yolaklarında meydana gelen proteomik değişimlerin ve hastaların HLA profillerinin HBV ile enfekte hastalarda siroz oluşumunda etkili olduğunu göstermektedir. Bu bağlamda yapılan tez çalışması, farklı fibroz düzeylerini doku örnekleri düzeyinde inceleyen ilk çalışma olarak bu alanda yapılacak olan diğer çalışmalara ışık tutacaktır. Bu öncü çalışma sonucunda belirlenen yolaklar, daha ileri çalışmalarla incelenerek HBV hastalarında fibrozun önlenmesi için tasarlanacak yeni tedaviler için ve de fibroz düzeylerinin invasif olmayan yöntemlerle teşhis edilebilmesi için tespit edilecek biyobelirteçler için önemli bir hedef teşkil edecektir. Liver fibrosis is a common outcome of chronic Hepatitis B virus infection, which will progress into cirrhosis, the major cause of morbidity and mortality in chronic HBV, and eventually hepatocellular carcinoma (HCC) if not treated at earlier stages. To estimate which patient with chronic hepatitis B will develop rapidly fibrosis or cirrhosis is yet a thorny issue and requires a vast recognition of cellular pathways involved in fibrosis. This thesis consists of two related chapters about causes and consequences of Chronic Hepatitis B (CHB) and especially focuses liver fibrogenesis in HBV infected patients. The first chapter of the thesis includes proteomic approaches for investigating cellular pathways associated with liver fibrosis in HBV infection. The second chapter of this thesis involves genomic approaches for investigating the association between host's immune profile and outcomes of CHB such as active or inactive disease, cirrhosis, viral breakthrough. In the first chapter of the thesis, tissue samples from 47 HBV infected patients (F1: n = 7, F2: n = 20, F3: n = 12, F4: n = 3, F5: n = 2, F6: n = 3) were enrolled for two dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) proteomic screening. Proteomic profiles were analyzed between different fibrotic stages by univariate analysis (p

Çok fonksiyonlu apoptoz karşıtı Bag-1 proteini (Bcl-2 assosiye gen) hücre içerisinde önemli fonksiyonları olan nuclearhormone reseptörleri, Bcl-2 proteini, Hsp70/ Hsc70 ısı şok proten ailesi, büyüme hormone reseptörleri, Raf-1 serin/treoninkinaz ailesi gibi birçok molekül ile etkileşimde bulunmaktadır. Bu nedenle, Bag-1 hücre büyümesini ve proliferasyonunu, hücre sinyal yolaklarını ve apoptoz mekanizmasını düzenlemede rol almaktadır. Bag-1 proteinin hücre içerisinde farklı yerlede lokalize olan 3 izoformu bulunmaktadır. Bag-1L izoformu 50 kDa olup, nüklear lokalizasyon sinyali (NLS) sayesinde nukleusta konumlanmaktadır. Bag-1M izoformu 46 kDa olup nukleus ve sitoplazma arasında konumlanmaktadır. Bag-1S ise 36 kDa olup sitoplazmada lokalize olmuştur.Birçok kanser çeşidinde Bag-1?ın ekspresyon seviyesinde artış görülmektedir. Bu artış, Bag-1?ın etkileşimde bulunduğu moleküller ile gerçekleşmekte ve en önemli etkileşimini Bcl-2 ve Hsp70 ile göstermektedir. Bu sayede Bag-1 çeşitli stres faktörleri karşısında hücrelerin sağ kalımını arttırıcı etki göstermektedir. Kanser tedavilerinde klasik kemoterapötik ilaç uygulamaları uzun süredir kullanılmaktadır ancak kanser gelişiminde rol oynayan bazı genlerin geçici olarak susturulması ve protein ekspresyon seviyelerinin azaltılması ile hücreleri ölüme götürmeyi hedeflemek yeni uygulamalardan biridir. Bu yöntem ile hem ilaçların yan etkilerini azaltılmakta hem de hücrelerin ilaçlara karşı oluşturduğu resistans mekanizması ortadan kaldırılmaktadır. Bu nedenle çalışmamızda, Bag-1?ın geçici olarak susturulmasının MCF-7 hücrelerinde sisplatin ya da paklitaksel ile tetiklenenapoptotik mekanizmadaki rolü araştırılmıştır.Öncelikle zamana bağlı sisplatin ya da paklitaksel uygulamasının MCF-7 hücrelerinin sağ kalımını azalttığı MTT Hücre canlılığı testi ile gösterilmiştir. Her iki ilacın da Bag-1 ekspresyonunu azalttığı immünoblotlama ile gösterilmiştir. Bag-1?ın geçici olarak susturulmasının tüm izoformlar üzerinde etkili olduğu ve susturulmayı takiben uygulanan sisplatin ya da paklitakselin Bag-1 ekspresyonunu oldukça azalttığı immunoblotlama ile gösterilmiştir. Bunun yanında, Bag-1 siRNA uygulaması ile birlikte sisplatin ya da paklitakselin tetiklediği apoptozda, hücrelerin morfolojik olarak gösterdiği değişiklikler gösterilmiştir. Apoptozun önemli göstergelerinden olan DNA kırıklarının oluşumu, nüklear kondensasyon, mitokondri membran permeabilitesindeki azalma ya da apoptotik ve lizozomik vesiküllerin oluşumu PI, DiOC6, AO/EB ve DAPI boyaması ile gösterilmiştir. Pro-apoptotik ve anti-apoptotik Bcl-2 ailesi proteinlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişiklik sisplatin ya da paklitaksel uygulanan MCF-7 normal ve Bag-1 susturulmuş hücrelerde immünoblotlama ile gösterilmiş ve pro-apoptotik Bcl-2 ailesi proteinlerinin ekspresyon seviyelerinde artış gözlenirken, anti-apoptotik Bcl-2 ailesi proteinlerinin ekspresyon seviyelerinde azalma gözlenmiştir. Çoğu kanser tipinde mutasyona sahip olan tümör supressör p53 proteininin ve p53?ün hedef genlerinin ürünleri olan Puma ve Noxa proteinlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişiklik Bag-1?ın susturulduğu hücrelerde cisplatin ya da paclitaxel varlığında çalışılmıştır. Bunun yanında akım sitometrisi ile Bag-1?ın hücre siklusu üzerindeki etkisi araştırılmış ve Bag-1 susturulmasını takiben uygulanan ilaçların apoptoz göstergesi olan sub-G1 fazında artışa neden olduğu gösterilmiştir. Hücre siklusunda önemli görevleri olan siklinler ve sikline bağlı kinaz proteinlerinin ekspresyon seviyelerindeki değişiklik incelenmiştir. Kullanılan cisplatin ya da paclitakselin, çeşitli kanser tiplerinde G2/M fazında hücre döngüsünde tutuklanmaya sebep oldukları bilinmektedir ancak Bag-1 siRNA hücre döngüsünde meydana gelen değişiklikler daha önce araştırılmadığı için, bu çalışmanın amaçlarından birisi olmuştur. Apoptoz yolağının en önemli parametrelerinden birisi olan kaspazların aktif hale gelmesi ve kaspaz yolağını aktive etmeleri cisplatin ya da paclitaksel uygulanan Bag-1 susturulmuş ve doğal tip hücrelerde zamana bağlı olarak araştırılmıştır. Zamana bağlı ilaç uygulamaları ile kaspazların kesilmiş formlarında artış gözlemlenmiş ve Bag-1 siRNA varlığında bu kesilmiş formların ekspresyon seviyelerinde artış gözlemlenmiştir. Bag-1?ın ekspresyon seviyesindeki değişimin hücrelerin büyümesi, canlılığı, proliferasyonu ve apoptoz mekanizması üzerinde farklı etkilere sahip olduğunun doğrulanması amacı ile Bag-1?ın geçici olarak susturulmasının yanında Bag-1L genine sahip plazmid vektör transfeksiyonu ile MCF-7 hücrelerinde Bag-1?ın stabil olarak ekspresyonu arttırılmıştır. Bag-1ın ekspresyon seviyesindeki artışın hücrelerin sağ kalımında ve proliferasyonunda artışa neden olduğu belirlenmiş ve ekspresyon seviyesindeki bu artışın sisplatinya dapaklitaksel uygulamalarına karşı koruma meydana immünoblotlama ile gösterilmiştir.Bag-1 proteinin sisplatin ya da paklitaksel ile tetiklenen apoptoz mekanizmasındaki rolü Polyamin metabolizması ile ilişkilendirilerek araştırılmıştır. Hücrelerin canlılığının korunma, çoğalma ve büyüme mekanizmalarında rol oynayan poliaminleramin türevli organik bileşiklerdir. Birçok farklı kanser tipinde hücre içi poliamin miktarlarında artış gözlemlenmiştir. Putresin, spermidin ve spermin bu mekanizmalarda görev alan önemli poliaminlerdendir ve biyosentezleriOrnitinDekarboksilaz (ODC) enzimi ile kontrol edilirken, katabolik yolakları Poliaminoksidaz (PAO) ve Spermidin/spermin-N1-asetiltransferaz (SSAT) enzimi ile kontrol edilmektedir. Bag-1 aşırı ekspresyonuna sahip hücrelerde normal hücrelere kıyasla ODC ekspresyonu artış gösterirken, Bag-1?ın susturulmasının da katabolik enzimlerden PAO ve SSAT ekspresyonunda artışa sebep olduğu immunoblotlama ile belirlenmiştir. Poliamin yolağının yan ürünleri olarak açığa çıkan Reaktif Oksijen Türleri (ROS), Bag-1?ın susturulması ile artış göstermektedir. Özetle, bu çalışmanın en önemli amacı Bag-1?ın susturulmasını takiben uygulanan ilaçlar varlığında tetiklenen apoptotik mekanizmasının farklı parametreler ile gösterilmesidir. Bunun için kullanılan parametler, apoptozun hangi yoldan ilerlediği, bunun için hangi protein ya da protein ailelerine bağlı kaldığını açığa çıkarmaktadır. Kanser hücrelerinin apoptoza yönelmesinde ilaç uygulamalarının yan etkilerini ortadan kaldırmaya yönelik olarak geliştirilen yeni çalışmalarda Bag-1 siRNA? nın potansiyel kullanımını arttırmak amaçlanmaktadır. The multifunctional anti-apoptotic Bag-1 (Bcl-2 athanogene) protein has several interaction partners, such as nuclear hormone receptors, anti-apoptotic Bcl-2 protein, Hsp70/Hsc70 heat shock protein family, growth hormone receptors, Raf-1 serine threonine kinase family, that have important roles in cell involving the regulation of cell survival, cell proliferation, cell signalling and apoptosis. Bag-1 protein consists of three different isoforms produced by alternative translation from the same mRNA. Bag-1L (50 kDa) is the least expressed isoform of Bag-1 and localized in the nucleus due to its Nuclear Localization Signal (NLS). Bag-1M (46 kDa) partitions betweenthe nucleus and the cytoplasm.Bag-1S (36 kDa) is the most expressed isoform of Bag-1 localized in the cytoplasm. Elevated levels of Bag-1 expression were observed in various cancer cells, thereby, linking the overexpression of Bag-1 with the development of cancer. The most striking interactions of Bag-1 are with Bcl-2 and Hsp 70. These interactions of Bag-1 can enhance the survival potential of cancer cells against stress conditions. Classical chemotherapeutic drugs has been used for many years for the treatment of various cancer types, but the downregulation of some genes that have roles in cancer development represents a new approach to enhance the cell death mechanism. By this way, the side effects of drugs or resistance to drugs can be minimized. With this motivation, we decided to examine the effects of Bag-1 silencing in cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 cells.We determined that cisplatin and paclitaxel decreased the cell viability of MCF-7 cells in a time and dose dependent manner, as confirmed with the MTT cell viability assay. Therefore, both drugs were used to induce apoptosis in MCF-7 cells. We showed that silencing of Bag-1 was effective to downregulate all Bag-1 isoforms, and cisplatin or paclitaxel treatment following Bag-1 silencing abolished the Bag-1 expression whichwas investigated by immunoblotting analysis. We determined the effect of cisplatin or paclitaxel and/or Bag-1 silencing in cell proliferation or cell death mechnanisms of MCF-7 cells by trypan blue dye exclusion assay and apoptotic cell death Elisa assay. The most important features of apoptosis are DNA fragmentation, nuclear condensation, cell shrinkage, mitochondrial membrane permeabilization loss andmembrane blebbing. We observed these signs of apoptosis in cisplatin or paclitaxel and/or Bag-1 siRNA treated MCF-7 cells by propidium iodide (PI), DiOC6, acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) and DAPI staining. The role of Bag-1 silencing in cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis was investigated by comparing the expression levels of anti-apoptotic and pro-apoptotic Bcl-2 family members usingimmnublotting assay. It was observed that each drug was effective to downregulate the anti-apoptotic Bcl-2 family members (Bcl-2 and Bcl-xL) and upregulate the pro-apoptotic Bax, Bak, Bid, Bad, Noxa and Puma expression, and silencing of Bag-1 enhanced these effects. Cell cycle machinery was analyzed by flow cytometer to observe the apoptotic functions of drugs and/or Bag-1 siRNA and it was found that Bag-1 silencing caused the accumulation of sub-G1 phase which is indicative of apoptosis.To confirm that Bag-1 expression level was important for cell proliferation, cell survival or apoptotic mechanism, MCF-7 cells were transfected with human specific Bag-1L plasmid and stable colonies were selected. We examined that Bag-1L overexpression upregulated Bag-1 isoforms, enhanced the cell proliferation potential and decreased the apoptotic potential of both drugs was investigated by immunoblotting and cell death Elisa assay. The functional role of Bag-1 in cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis in association with polyamine signaling pathway was investigated in polyamine (PA) metabolism. Elevated intracellular polyamines are generally proposed as a final consequence of deregulated polyamine metabolism in cancer cells. Polyamines; putrescine, spermidine and spermine, are regulated by the biosyntheticornithine decarboxylase (ODC) enzyme and catabolic polyamine oxidase (PAO) and Spermidine/spermine-N1-acetyltransferase (SSAT) enzymes. However, overexpression of Bag-1 led to upregulation of ODC levels, silencing of Bag-1 caused the upregulation of PAO and SSAT levels. In addition, silencing of Bag-1 increased the generation of byproducts of PA metabolism, Reactive Oxygen Species (ROS), on during cisplatin or paclitaxel-induced apoptosis. 130

Arkeadan ökaryotlara kadar bütün organizmalar kendi içsel dengelerini korumak için pH, sıcaklık değişimleri, oksidatif ve kimyasal stresler gibi çevresel durumlara cevap verirler. Bu tür durumlarda, belli bir grup proteinin ifadesi artarak bu içsel dengeyi sağlar. Bu proteinlere moleküler şaperon adı verilmektedir. Moleküler şaperonların hücre içerisinde vazgeçilmez görevleri vardır; yeni sentezlenen proteinlerin işlenmesi, proteinlerin organel membranlarından geçirilmesi, oligomerik proteinlerin alt birimlerine ayrılması, proteozom sisteminin asiste edilmesi ve bazı transkripsiyon faktörlerinin aktivitesinin düzenlenmesi gibi.Hsp70 proteinleri en yaygın bulunan proteinlerden olup bütün organizmaların sitoplazmasında ve ökaryotların neredeyse bütün organellerinde (endoplazmik retikulum, mitokondri, kloroplast vb...) bulunur. Hsp70 proteinleri görevlerini gerçekleştirirlerken ATP?yi döngüler halinde kullanırlar ve substrat bağlama bölgeleri ile substrata bağlanırlar. Burada substrat olarak belirtilen amino asit sekanslarındaki kısa hidrofobik bölgelerdir. Hsp70?ler diğer moleküler şaperonlar ile birlikte doğru katlanmamış, bozulmuş veya sentezlenmekte olan proteinlerin doğru katlanma yollarına yönlenmesini sağlarlar. Enzimlerde olduğu gibi doğru katlanma reaksiyonunu hızlandırmazlar. Yaptıkları tek şey bu hidrofobik bölgelerin istenmeyen bir şekilde birbirleri ile ilişki kurmasını engellemektir.Hsp70 proteinleri 44 kDa?lık N-terminal nükleotid bağlama domeni (NBD), 25 kDa?lık C-terminal substrat bağlama domeni (SBD) ve bu domenleri birbirine bağlayan oldukça korunmuş, kısmen hidrofobik bir bağlaçtan oluşur. SBD substrat moleküllerine afinite gösterirken; NBD, SBD?nin substrata olan ilgisini bağlaç aracılığıyla kontrol eder. Oluşturulan farklı nükleotit bağlı konformasyonlar farklı substrat afinitesine sahip olmaktadır. NBD?ye ATP bağlandığında bağlaç bölgesi NBD?nin lobları arasındaki hidrofobik yarığa girer ve iki domenin yapışık olmasını sağlar. Bu durumda SBD?nin kapağı açılır ve substrat afinitesi düşer. Diğer bir deyişle substrat bağlanma/ayrılma (kon/off) kinetiği artar. ATP?nin ADP?ye hidrolizi ise hidrofobik yarığın kapanmasına ve iki domenin ayrılmasına neden olur. SBD?nin kapağı kapanır ve substrat afinitesi artar. Yani substrat bağlanma/ayrılma kinetiği azalır. NBD?nin farklı nükleotit durumlarıyla SBD?yi kontrol etmesinin yanı sıra; SBD?ye substrat bağlanması da NBD?nin ATPaz hızını arttırmaktadır. Domenler arası kurulan bu karşılıklı, allosterik kominikasyonda, evrimsel olarak oldukça korunmuş 388VLLL392 bağlaç sekansının önemli bir rol aldığı bilinmektedir. Kesilmiş DnaK proteinleri, 389VLLL392 sekansını içeren [DnaK(1-392)] ve içermeyen [DnaK(1-388)], ile yapılan ATPaz ölçümleri bu rolün önemini açıkça göstermiştir. 389VLLL392 sekansını içermeyen NBD, tam dizilim DnaK?nın [DnaK(1-638)] ortamda susbtrat bulunmadığında gösterdiği aktiviteye benzer bir eğriye sahip olurken; 389VLLL392 sekansını içeren NBD, tam dizilim DnaK?nın substrat ile stimüle olmuş pH bağımlı aktivitesine benzer bir aktivite sergilemektedir. NBD de kendi içerisinde I ve II olmak üzere iki loba ve her lob da A ve B olmak üzere iki altdomene ayrılır. Lob-I ve lob-II arasında nükleotit bağlama bölgesini sararken, IA ve IIA altdomenleri arasında hidrofobik bağlaç bağlanma yarığı oluşur. Nükleotit bağlanma bölgesinde ADP bağlı durumda: E267, K270 ve S274 nükleotitin adenozin kısmıyla; G442?nin amid grubu ?-fosfat ile; ve T11, T12 ve N15?in omurga ve yan zinciri ß-fosfat ile ilişki halindedir. Ayrıca D8, D194 ve E171 magnezyum iyonunun ilk koordinasyon kabuğundaki sular ile ilişkilidir. Bu ilişkiler proteinin ADP?ye olan ilgisini büyük ölçüde belirlemektedir ve katalitik aktivitede önemli olabilirler. Bir önceki paragrafta da belirtildiği gibi farklı nükleotit bağlı durumlar farklı NBD konformasyonlarına neden olmaktadır. ATP bağlı NBD?de loblar arası etkileşimler daha fazladır ve nükleotit bağlanma bölgesi kapalıdır. İki lob birbirine ATP?nin yarattığı köprü ile bağlıdır. ATP hidrolizi gerçekleştiğinde ise bu köprü kırılır ve IIB altdomeni 200?lik bir açı ile döner. Böylece açık NBD konformasyonu oluşturulmuş olur. NBD açık konformasyona sahip olduğunda (Nükleotitsiz ve ADP bağlı konformasyon) IA ve IIA altdomeni arasında bulunan hidrofobik bağlaç bağlanma bölgesi kapalıdır. NBD kapalı konformasyona sahip olduğunda (ATP bağlı konformasyon) ise bu bölge açıktır ve domenler arası etkileşime izin verir. Sonuç olarak NBD?ye bağlanan nükleotit NBD?nin içsel konformasyonunu belirleyerek DnaK?nın substrat bağlama döngülerini gerçekleştirmesini sağlar. NBD?de gerçekleşen ATP hidroliz reaksiyonunun ise tam olarak nasıl gerçekleştiği bilinmemektedir. Bu konuda ATP hidroliz mekanizması bilinen proteinlere dayanarak çeşitli hipotezler ortaya atılmıştır ama henüz hiçbiri kesin olarak ispatlanamamıştır.SBD ise ß altdomeni ve ? altdomeni olmak üzere iki parçadan oluşur. ß altdomeni substratın bağlanmasına yataklık ederken (L1,2 ve L3,4 bölgelerinin arası), ? altdomeni bir kapak görevi görerek hidrofobik substratın üzerine kapanır (heliks A ve B) ve substratın hidrofilik ortamdan uzaklaştırılmasını sağlar. Heliks B ile ß altdomeni arasındaki bağlantı bir tuz köprüsü ve L3,4 ve L5,6 bölgeleri ile yapılan iki hidrojen bağı sayesinde kurulur. Heliks A ve B?nin aksine ? altdomenini oluşturan diğer helikslerin (C-terminal ucundaki C, D ve E heliksleri) rolü net bir şekilde anlaşılamasa da, yüksek sıcaklıklarda bu helikslerin ? altdomenini stabilize ettiği bulunmuştur.Bütün bu verilere rağmen Hsp70?lerin çalışma mekanizması şu ana kadar kesin bir biçimde ortaya koyulamasa da, allosterik ilişkiyi gösteren sonuçlar açıktır. Bunlara ek olarak yukarıda da belirtildiği gibi NBD?de gerçekleşen ATP hidrolizi reaksiyonunun da tam olarak nasıl gerçekleştiği bilinmemektedir. Daha önce yapılan çalışmalarda hidrolizde önemli olabilecek bazı amino asitlere dikkat çekilmiştir. Fakat yine de tatmin edici sonuçlar elde edilememiştir. Bu çalışmalardan biri T199?u bir otofosrilasyon bölgesi olarak belirtmekte ve T199?u olmazsa olmaz bir amino asit olarak tanımlamaktadır. Fakat daha sonra kesilmiş NBD ile yapılan deneylerde bu amino asitin ATP hidrolizi için vazgeçilmez olmadığı ortaya koyulmuştur. Başka bir çalışma proton kabul edicisi olarak aktif bölgede bulunan bazı asidik amino asitlere dikkat çekmiştir. E171, D201, D8 ve D194?ün mutasyonunun yapıldığı bu çalışmada ise ATP hidrolizinde sadece tek bir amino asitin proton kabul edicisi olarak görev almayabileceği ihtimali ortaya atılmıştır. Yine başka bir çalışmada K70 üzerine dikkatler çekilerek, bu amino asitin saldıracak nükleofil için bir pozisyonlandırıcı olabileceği ihtimali üzerinde durulmuştur.Biz de bu çalışmada yukarıda sözü edilen kesilmiş DnaK parçalarını kullandık. Bu projede aktivitenin pH bağımlılığından sorumlu olan amino asitleri araştırmak için, şüphelendiğimiz amino asitleri (D194 ve D201) site-directed mutagenez yöntemi ile alanin amino asitine çevirdik. Yaptığımız ATPaz aktivite, ADP-çıkış hızı ve stabilite deneyleri ile bu amino asitlerin aktivitede nasıl etkilere sahip olduğuna dair güçlü veriler elde etmiş bulunmaktayız. Deneysel çalışmalarımıza ek olarak yaptığımız hesapsal çalışmalar da elde ettiğimiz deneysel verileri desteklemektedir. Daha önceki çalışmalar ve bulunan kristal yapılar, D194?ün Mg2+?iyonunun ilk koordinasyon kabuğundaki sular ile etkileşerek, proteinin ATP afinitesini belirlediğini göstermiştir. Bizim çalışmalarımızda da, bu çalışmalarla tutarlı olarak, sözü edilen etkileşimlerin kaybolması sonucu nükleotit afinitesinin oldukça kaybolduğu bulunmuştur. Ayrıca hesapsal olarak bulunan pKa değerleri ile de D194?ün protonasyon durumunun proteinin aktivitesi için önemli olabileceği sonucu ortaya çıkmaktadır. Çalışmalarımızla D201 amino asitinin de bağlaç ile tetiklenen aktivitede sinyalizasyon yolağı üzerinde önemli bir role sahip olabileceği bulunmuştur. pH bağımlı deney sonuçlarımızla birlikte, stabilite ölçümlerimiz de bu sonucu desteklemektedir. Hsp70 proteins have essential roles in cells such as de novo folding of newly synthesized proteins, refolding or ubiquitination of denatured proteins, protein trafficking and translocation through membranes. In this project, we analyzed Escherichia coli DnaK which is the most investigated Hsp70 homolog. DnaK is comprised of an N-terminal nucleotide binding domain (NBD), a C-terminal substrate-binding domain (SBD) and a partially conserved hydrophobic linker that connects the domains. NBD is composed of two lobes (I and II) harboring the bound nucleotide and the lobes are also divided into two subdomains A and B. SBD is composed of an ?-helical lid and a ß-sandwich domain. It is clearly known that SBD has affinity to bind hydrophobic amino acid stretches in de novo or partially unfolded protein sequences. Its activity prevents the formation of unwanted inter and intra molecular hydrophobic interactions of proteins. NBD in the meantime can hydrolyze ATP molecules in order to control the activity of SBD. ATP binding to NBD causes the two domains to be docked, leading to the opening of the ?-helical lid. In this state, the affinity for substrate is low and the kon/off rate is high. On the other hand, in the ADP bound state two domains become separated and act like irrelevant beads bound with a flexible string. In this state, affinity for the substrate is high and kon/off rate is low as a result of the closure of the lid. Not only the nucleotide states of NBD controls the activity of SBD, but also binding of substrate enhances the ATPase rate indicating a reciprocal communication between the domains. Several studies showed that the communication is provided via the partially hydrophobic linker containing 389VLLL392 sequence. Investigations done with truncated DnaK constructs showed that presence or absence of this sequence as in the case of [DnaK(1-392)] and [DnaK(1-388)], respectively has specific features compared to that of the full-length protein [DnaK(1-638)]. It is proposed that the shorter construct has similar activity profile with the activity of the full-length protein in the absence of substrate which is at basal levels while the linker containing construct mimics the pH dependent activity of the substrate stimulated full-length protein. In this project we also used these constructs to investigate the allosteric signaling pathway in NBD. Here, we investigated residues D194 and D201 for the pH dependence of NBD and mutated them to alanine to see the effects of these residues. In addition to ATPase, ADP-dissociation and stability measurements, we also made molecular dynamic simulations to investigate the importance of D194 and D201. Our experimental data provide us strong evidence showing a relation of these residues with pH dependence, also pKa calculations using thermodynamic integration method supported our experimental data. 74

Et, içerdiği amino asitler, vitaminler, yağ ve özellikle hayvansal protein ile insan sağlığı için vazgeçilmez bir besin kaynağıdır. Türkiye İstatistik Kurumu?nun (TUIK) 2012 verilerine göre; Türkiye?de yıllık kişi başına tüketilen et miktarı 12 kg?dır. Yine TUIK?in sonuçlarına göre, Avrupa ülkelerinde kişi başına tüketilen et miktarı 30 kg iken Amerika Birleşik Devletlerinde bu sayı 60 kg?a kadar çıkmaktadır. Bu veriler, Türkiye?de et tüketiminin son derece az olduğunu göstermektedir.Artan insan popülasyonu ve et ürünlerinin maliyetlerinin yüksek olması et tüketim oranını her yıl azaltmaktadır. Bu yüzden et üreticileri, fiyatları düşürmek için farklı et türlerini (at, esek, domuz, hindi, ve tavuk) karıştırmaya başlamıştır. Benzer pigmentasyona sahip et türleri (dana ve at, tavuk ve domuz gibi) dondurulduktan sonra veya işlenmiş et ürünlerinde kullanıldıklarında tüketici tarafından algılanması neredeyse imkansız hale gelir. Bu nedenle, köfte, salam, sosis, sucuk gibi ürünlerde sahteciliklerin yapılması oldukça kolaydır.2013 yılından önceki Türk Gıda Kodeksi?ne göre, et üreticilerinin karıştırdığı hayvan türlerini, ürünlerin etiketlerinde bildirmesi koşuluyla karma et uygulamasına izin verilmekteydi. Ancak, Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı yaptığı çalışmalar sonucunda, piyasada bulunan bir çok ürünün etiketinde, içerdiği hayvan türünün belirtilmediğini tespit etmiştir. Bu durum, 2013 yılında revize edilen Türk Gıda Kodeksi?nde karma et uygulamasının tamamen yasaklanmasına neden olmuştur.Et tür tayini analizlerinde en sık kullanılan yöntemler, protein ve nükleik asit tabanlıdır. Fakat, ısıl işleme maruz kalan ürünlerin protein yapıları bozulduğundan, protein tabanlı yöntemlerin et tür tayini için yetersiz kaldığı bildirilmiştir.DNA tabanlı yöntemlerin, protein tabanlı yöntemlere göre daha avantajlı olduğu düşünülmektedir. DNA molekülü sıcaklığa dayanıklı bir moleküldür, tüm hücrelerde aynı özelligi gösterir ve ayrıca tür hakkında daha fazla bilgi sağlar. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) tabanlı metotlar, belli bir hayvan türüne ait özgü DNA sekansını çoğaltma gücüne sahiptir. Diğer taraftan, konvensiyonel PZR ile kantitatif sonuçlar elde edilemez ve jel elektroforezi gibi PZR sonrası adımlar gerektirdiği için zaman alıcı bir yöntemdir.Kantitatif eş zamanlı PZR (quantitative Real Time PCR- qPCR), hem kalitatif hem de kantitatif sonuçlar sağlar. Bu teknikte, hedef genin çoğalması, floresans işaretleyiciler kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Et tür tayini çalışmalarında, Sybr Green ve oligonükleotit problar en çok kullanılan işaretleyicilerdir. Sybr Green belli bir konsantrasyonun üstünde kullanıldığında PZR reaksiyonunu inhibe edebilir ve ayrıca çoklu hedefleri tespit etmek için uygun değildir. Bu yüzden, yüksek maliyetli olmalarına rağmen oligonükleotit problar en çok tercih edilen işaretleyicilerdir. Alternatif olarak, Yüksek Çözünürlükte Erime(HRM) boyaları, erime eğrisi analizlerinde, DNA denatürasyonu ile birlikte çok daha ayırt edilebilir sinyal değişimlerine neden oldukları için tercih edilmektedirler. HRM boyaları sadece çift zincirli DNAya bağlanır, bu da boya molekülünü erime sırasında tek zincirli DNAya yeniden bağlanmasını önler ve üstün erime eğrisi çözünürlüğü sağlar. SYBR Green boyalarının aksine, HRM boyaları yüksek konsantrasyonlarda kullanılabilir, çünkü HRM boyaları DNA polimerazı ve PZR reaksiyonunu inhibe etmezler. Ayrıca HRM boyaları Sybr Green ile karşılaştırıldığında hidrojen bağlarına 4 kat daha fazla bağlanır.Bu tezin amacı; et ürünlerinin içerisine karıştırılan farklı et türlerinin (sığır, tavuk, hindi,at, eşek ve domuz) kalitatif olarak varlığını hızlı, güvenilir ve ekonomik bir biçimde tespit edilebilmesi için qPCR tabanlı bir sistem geliştirmektir. Bu çalışmada ilk olarak, 20 dakikadan az bir sürede tamamlanabilen, enzim içermeyen bir DNA izolasyon metodolojisi geliştirilmiştir. Geliştirilen metodoloji, boncuk ile parçalama ve silika kolon yöntemine dayalıdır. Bu metodolojide, hekzadesiltrimetilamonyum bromür (CTAB), guanidin tiyosiyanat ve boncuk ile parçalama uygulaması kullanılmıştır. Guanidin tiyosiyanat ve boncuk ile parçalama uygulaması hücreleri parçalamak için kullanılmıştır. Ayrıca guanidin tiyosiyanat DNA bağlanmasında ve PZR inhibitorlerinin uzaklaştırmasında rol oynar.DNA izolasyon sonuçlarına göre, geliştirilen DNA izolasyon metodolojisi kullanılarak elde edilen DNAların saflıkları ve konsantrasyonları ulaşılmak istenen aralıklarda elde edilmiştir: sırasıyla 1.6-2 ve 50-1000 ng/?l. Elde edilen DNAların kalitesi, qPCR?da bu DNAların 200 nanogramının kalıp DNA olarak kullanılmasıyla sınanmıştır. Elde edilen eşik döngü sayılarının 20?nin altında elde edilmesi, elde edilen DNAların PZR çoğalması için uygun olduğunu kanıtlamıştır. Piyasada mevcut ticari DNA izolasyon kitleri, zaman alıcı reaksiyonlara dayalıdır ve DNA izolasyon işlemi en az 1.5 saat sürmektedir. Bu çalışmada, enzimatik adımlar içermeyen bir DNA izolasyon protokolü geliştirilmiştir. DNA izolatları, sadece fiziksel ve kimyasal hücre parçalamasıyla elde edilmiştir. Bu da, toplam analiz süresinin (20 dakikadan az) ve DNA izolasyonun maliyetini önemli ölçüde azaltmıştır.Bu zamana kadar yapılan çalışmalarda, genellikle 12S rRNA, sitokrom b geni ve 16S rRNA gibi evrensel mitokondriyal genler, et türüne özgü prop dizaynı için hedef olarak seçilmişlerdir. Bu durum, özgüllük problemlerine neden olabilmektedir. Mitokondriyal genler son derece korunmuş genlerdir, bu yüzden at ve eşek gibi aynı cinse ait türler arasında ayrım yapmak zordur. Daha özgül sonuçlar elde etmek için, bu çalışmada her bir hayvan türü için yüksek derecede değişken gen bölgelerin çoğaltılmasına odaklanılmıştır. Bu yaklaşım sayesinde, özgül olmayan çoğalmalar önlenmiş ve validasyon çalışmaları için iş akışı kolaylaştırılmıştır.Bu çalışmada geliştirilen qPCR metodolojisi, tekli ve çoklu DNA tiplerini hedef alacak şekilde dizayn edilmiştir. Bu metodoloji sayesinde, tek bir HRM boyası (EvaGreen) kullanılarak, farklı PZR ürünlerinin, erime sıcaklığı (Tm) farklılıklarına göre çoklu tespit yapılmıştır. Referans et örneklerinin qPCR sonuçlarına göre; hedefe özgü erime sıcaklıkları at için 82.02 ± 0.29?C, domuz için 84.3?C ± 0.32?C, eşek için 78.80 ± 0.38?C, hindi için 84.86 ± 0.29?C, tavuk için 81.91 ± 0.34?C ve sığır için 86.96 ± 0.31?C olarak belirlenmiştir. Hindi/sığır, tavuk/sığır, tavuk/hindi, domuz/eşek, eşek/at, domuz/at ikili karışımlarının qPCR denemelerinde ve hindi/tavuk/sığır, domuz/eşek/at üçlü qPCR denemelerinde, istenilen hedeflere özgü olan birden fazla erime sıcaklığı tespit edilmiştir.Tespit limitini (Limit of Detection ?LOD) belirlemek için; 10 gramlık et karışımları hazırlanmıştır. Sırasıyla hedeflenenler hayvan eti, sığır eti ile karıştırılmıştır. Sığır etiyle karıştırılan her hayvan türü , karışımda 1 ? 100 kopya gen sayısı bulunduracak şekilde karışımlar yapılmıştır. Sığır etinin 1 gramında tespit limiti; tavuk için 4 gen kopya sayısı; hindi için 3 gen kopya sayısı; at , eşek ve domuz için ise 1 kopya gen sayısı olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, standart et karışımları akredite referans laboratuvarlar tarafından hazırlanmadığı için, gerçek LOD?nin kabaca tahmini yapabilmek için bu çalışmalar yürütülmüştür.Türkiye gıda piyasasına sunulması planlanan çiğ ve işlenmiş et ürünleri geliştirilen yöntemle başarıyla analiz edilmiştir. Numuneler akredite gıda kontrol laboratuvarları tarafından sağlanmıştır. Analiz edilen numune tipleri köfte, döner, sucuk, salam ve sosis gibi işlenmiş ürünler ve bir et üretim tesisinin üretim tezgahlarından alınan sürüntü numuneleridir. Analiz edilen toplam 83 örnekten; 24 tanesinin tavuk eti, 9 tanesinin hindi eti ve 1 tanesin domuz eti içerdiği tespit edilmiştir. Sonuçların doğruluğu, DNA sekanslama yöntemi kullanılarak onaylanmıştır. Geliştirilmiş olan bu yöntemin, mevcut PZR tabanlı yöntemlere göre en az iki kat daha hızlı olduğu ve 75 dakika içinde hassas sonuçlar verebildiği kanıtlanmıştır.Et türü tayini için kullanılan mevcut qPCR tabanlı yöntemler yüksek zaman ve maliyet gerektirmektedir. Bunun temel nedeni DNA ekstraksiyonu ve qPCR adımlarındaki uzun inkübasyon süreleri ve yüksek sarf maliyetleridir. Bu çalışmada bu sorunlara çözüm getirmek için yeni bir sistem geliştirilmiştir. Bu sistemin başarısının altında enzim içermeyen DNA protokolü ve tek HRM boyası ile yapılan çoklu hedef tespiti yatmaktadır. Bu çalışmada ilk defa, farklı hayvan türlerinden çoğaltılmış üç farklı hedef DNA qPCR?da tek bir boya kullanılarak, Tm?lerindeki farktan faydalanılarak ayırt ve tespit edilebilmiştir. Elde edilen sonuçlar geliştirilen yöntemin 75 dakikadan kısa bir sürede hassas sonuçlar verebileceğini göstermiştir. Böylelikle mevcut PCR tabanlı et türü tayin yöntemlerine nazaran en az 2 kat daha hızlı sonuç elde edilebilmiştir.Bu çalışmada geliştirilen qPCR?a dayalı metodoloji, ısıl işlem görmüş et karışımlarında at, eşek, domuz, tavuk ve hindi etlerinin hızlı ve rutin tespitleri için potansiyel bir moleküler araç olarak kullanılabilir. Türe özgü primerlerin kullanılması, bu metodu çiğ ve işlenmiş etlerin tespitinde son derece hassas kılmaktadır. Diğer taraftan, geliştirilen bu metodolojinin, akredite gıda kontrol labaratuvarları tarafından Meat contains amino acids, vitamins, fat and especially animal proteins, which are extremely important for human health. According to data from Turkish Statistical Institute (TUIK) meat consumption per capita in Turkey was 12 kg in 2012. The meat consumption per capita in United States of America (U.S.A.) and European Union (EU) are approximately 60 kg and 30 kg, respectively. These data show that; meat consumption in Turkey is lower than EU and U.S.A. Increasing human population and the cost of meat products have resulted in gradual decreases in meat consumption over the years. So that, the manufacturers started to mix different meat types (horse, donkey, pig, turkey and chicken) to reduce the costs. If the food is frozen and processed, it becomes impossible for consumer to differentiate the meat type which has similar pigmentation (beef- horse, chicken-pork, etc.). Therefore, forgery is commonly encountered within the production of meatball, sausage and salami.According to the Turkish Food Regulations before 2013, mixed meat application is permitted as long as the producers state the mixed meat types on the label. On the other hand, the Ministry of Food, Agriculture and Livestock has determined undeclared mixed meat applications in the Turkish Food Market. This has led to the new regulations in 2013, which strictly prohibited the mixed meat application.Protein and nucleic acid-based methods have been commonly used for meat species identification. The protein-based methods have been reported to be inadequate for the meat species identification since the protein structures deformed in thermally processed foods.DNA based methods have been considered to be more advantageous than the protein based methods. DNA is thermo-stable, shows the same features in all cells and provides more information about the species. Polymerase chain reaction (PCR) based methods have a power of amplifying a specific DNA molecule that belongs to a certain animal species. On the other hand, the conventional PCR cannot provide quantitative results and the post PCR steps such as gel electrophoresis make it time consuming.Quantitative Real Time PCR (qPCR) can provide both qualitative and quantitative results for meat type identification. In this technique, amplification of the target gene can be monitored online by the use of fluorescent reporters. The most commonly used reporters in meat type detection are Sybr Green dye and the oligonucleotide probes. Sybr Green can inhibit PCR reactions if used above a certain concentration and it cannot be used for detection of the multiple targets. This is why the oligonucleotide probes are the most frequently used reporters despite of their high costs. As an alternative, High Resolution Melting (HRM) dyes are preferred for use with melting curve assays due to the more discrete signal change occurring upon DNA denaturation. HRM dyes only bind to double stranded DNA that prevents the dye molecule from redistribution during melting and provides superior melt curve resolution. Unlike SYBR Green dye, HRM dyes can be used at high concentrations because they do not inhibit DNA polymerases and PCR reaction. HRM dyes great ability to bind the hydrogen bond almost 4 times more than SYBR Green.The aim of this study, develop a quick, reliable and low-cost qPCR based methodology to qualitatively detect different meat species (cattle, chicken, turkey, horse, donkey and pig) in food products. Firstly in this study, an enzyme free DNA extraction methodology which can be completed in less than 20 minutes was developed. The developed methodology was based on bead beating treatment and silica column method. In this methodology, hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), Guanidinium thiocyanate and bead beating were used to disrupt the cells. Guanidinium thiocyanate also acted in PCR inhibitor removal and DNA binding.The results showed that the purities and concentrations of the DNA extracts obtained using the developed DNA extraction methodology were in the desirable ranges: 1.6-2 and 50-1000 ng/?l, respectively. The obtained DNA qualities were also assessed by using 200 ng of the template DNAs in qPCR. The obtained threshold cycle numbers were less than 20, which implied that the obtained DNAs were suitable for PCR amplification. The current commercially available DNA extraction kits are based on time-consuming reactions that are completed in at least 1.5 hours. In this study, we have developed a DNA extraction protocol, which does not include enzymatic steps. The DNA extracts were obtained via only the physical and the chemical cell disruption. This has significantly decreased the total time (less than 20 minutes) and the cost of the DNA extraction.Universal mitochondrial DNA sequences such as; 12S rRNA, cytochrome b and 16S rRNA genes have generally been chosen as the target for meat type specific probe design. This has led to specifity problems in the detections. Mitochondrial genes are highly conserved so that differentiation is difficult between the species that belongs to the same genus such as; horse and donkey. To obtain more specific results, we concentrated on the amplification of highly variable gene regions for the each animal type. This approach prevented the non-specific amplifications and led to easier workflow for the validation studies.The qPCR methodology was designed to target both single and multiple DNA types. The multiple detection was based on melting temperature (Tm) differences of the different PCR amplification products with a single HRM dye (EvaGreen). The qPCR trials on the reference meat samples showed that the target specific melting peaks can be obtained at 82.02 ± 0.29?C for horse, 84.3?C ± 0.32?C for pig, 78.80 ± 0.38?C for donkey, 84.86 ± 0.29?C for turkey, 81.91 ± 0.34?C for chicken and 86.96 ± 0.31?C for cattle. Q-PCR trials on the binary mixtures of turkey/cattle, chicken/cattle, turkey/chicken, pig/donkey, donkey/horse and horse/pig and triple mixtures of turkey/chicken/cattle and pig/donkey/horse resulted in multiple melting peaks that are specific to the intended targets.To obtain the limit of detection (LOD), 10 g standard meat mixtures that contain 1-100 copies of the additive meat type DNA were prepared. The LODs were 4 chicken copies/gr cattle sample, 3 turkey gene copies/gr cattle sample, 1 horse gene copy/gr cattle sample, 1 donkey gene copy/gr cattle sample and 1 pig gene copy/gr cattle sample.On the other hand, since the standard meat mixtures were not obtained from an acredited reference laboratory, the detected LODs were rough estimations of the real LODs.Commercial samples which are intended to be introduced to the Turkish food market were screened. The commercial samples were obtained from acredited food laboratories. The sample types were sucuk, doner kebap, beef sausage, beef salami and the swab samples from meat production benches. 24 chicken, 9 turkey and 1 pig meat positive samples were detected among the 83 screened samples. The results were also confirmed via the DNA sequencing of PCR products.The currently available qPCR based meat type identification methodologies are time and money consuming. The main reasons behind these are the long incubation times and high costs of the available DNA extraction and the multiplex qPCR methodologies. In this study, a new system was developed to overcome these problems. This was achieved via an enzyme free DNA extraction methodology and a multiplex qPCR using a single HRM dye. For the first time, this study introduced discrimination of three different qPCR amplicons from various animal specific gene products based on the differences in Tms. The overall results proved that the developed method could give sensitive results in less than 75 minutes, which is at least two times faster than the currently available PCR-based methods for meat type detection.The qPCR based methodology developed in this study is a potential molecular tool that can be used in rapid and routine detection of horse, donkey, pig, chicken and turkey meats present in heat treated meat mixtures. The use of species-specific primers makes the method very sensitive for determination in raw and processed meats. On the other hand, the methodology must be validated using the reference samples prepared by reference accredited food control laboratories. 99

Bu çalışmada, Hsp70'in iki bölge arasındaki sinyal iletim mekanizmasının moleküler temellerinin aydınlanmasını sağlamaya yönelik derin bir bakış açısı kazanılması amaç edinilmiştir. Bu bakımdan, DnaK(1-388) kullanılarak ATPaz allosterik mekanizmasında kritik öneme sahip olduğu düşünülen birçok amino asit ile mutasyon analizleri yapılmıştır. Bu mutasyon analizleri için seçilen residüler, ATPaz bölgesinin nükleotid bağlanma bölgesine yakın His226, Thr225, Asp85, Arg71 ve bu bölgeden biraz uzak olan His295'dir. Deneysel sonuçlarda, D85A ve R71A mutantlarının ATPaz aktivitelerinde yabanıl tip DnaK(1-388)'e kıyasla yüksek oranda artışa sebep oldukları gözlenmiştir. Bu sonuçlar, Asp85 ve Arg71 residülerinin ATPaz aktivitesinin düzenlenmesinde baskılayıcı etkilerinin olduğunu göstermektedir. Bunun yanında, H226A, H226F ve T225A mutantlarınınn pH aktivite profillerinin yabanıl tip DnaK(1-388)'e benzer olması bu mutasyonların ATPaz mekanizmasında bir etkilerinin olmadığını düşündürtmüştür. Bunların dışında, D85E ve H295D mutantları yabanıl tipten farklı bir pH aktivite profili sergilemiş ve DnaK(1-392)'ye benzer olarak pH 7.5 civarında bir aktivite artışı göstermişlerdir. Bu sonuçlar, bu mutantların DnaK(1-392)'ye benzer bir konformasyon gösterip, DnaK(1-392)'den kıyasla daha az da olsa ATPaz aktivitesinin stimülasyonunda etkilerinin olduğunu düşündürtmüştür. ATPaz aktivite deneyleri dışında mutasyonların neden olduğu ikincil yapısal değişiklikleri gözlemlemek için yapılan denatüre edici olmayan jellerde D85E ve H295D mutantlarının ATP varlığında benzer oligomerizasyon göstermeleri DnaK(1-388)'de bağlaç olmamasından dolayı IA ve IIA alt bölgeler arasındaki hidrofobik bölgesinin ATP-bağlı haldeyken açık olması sayesinde eksi yüklü residüler ile etkileşime girerek oligomerizasyona yol açtığını düşündürtmüştür. In this study, we aimed to understand allosteric mechanism underlying the linkerbinding effects to the ATPase domain by pinpointing the critical residues that arepresent in DnaK(1-388). In this regard, mutagenesis was performed on these residuesand pH-dependent ATPase assays were done to understand the roles of these residues inthe pH-dependent ATPase activity. When pH-activity profiles of Thr225 and His226replacements were compared to that of the ATPase constructs, we found that mutationsof these sites did not alter the ATPase mechanism and we revealed that the activitymechanism of the ATPase domain is different for linkerless version, DnaK(1-388),compared to DnaK(1-392). On the other hand, we found that replacement of Asp85 andArg71 cause 16 fold increase in the ATPase rate indicating these residues haverepressive effects on the modulation of ATPase activity in the linkerless version,DnaK(1-388). In this study, His295 was also investigated for its possible effect on the pH-dependent ATPase activity. We observed similar shift in the pH activity profiles ofH295D and D85E mutantsas observed in the DnaK(1-392) may indicating thesemutations can stimulate ATPase to a lesser extend than DnaK(1-392). In addition, tounderstand the structural effects of mutations we also did native gel electrophoresis andobserved similar oligomerizations for D85E and H295D suggesting that linker bindingcleft is exposed in the DnaK(1-388) in ATP-bound state and interact with negativeresidues. 87

Özellikle son on yılda yapılan çalışmalar, adipoz dokunun inert bir doku olmaktan çok, aktif bir endokrin organ olduğunu göstermektedir. Bu gelişmeler ise bilimcileri adipoz hücreleri olan adipositlerin kökenlerini araştırmaya yöneltmiştir. Bu bağlamda yapılan en önemli keşif, adipoz dokuda yerleşik olarak bulunan mezenkimal kök hücrelerin bulunmasıdır. Ancak bu hücrelerin kısıtlı çoğalma kapasiteleri sonradan anlaşılmıştır, dolayısıyla adipoz dokuyu dışarıdan besleyen, adipoz dokuda yerleşik olmayan ata hücrelerin bulunduğu hücresel kaynaklar fikri ortaya çıkmıştır.Belirtilen açıklamaya göre bu yüksek lisans tezinin birincil önceliği, kemik iliğinden (BM72 & BM78) ve adipoz dokudan (LA47) elde edilen mezenkimal kök hücrelerin ve dermal fibroblast (DF24) hücrelerinin adipojenik farklılaşma kapasitelerinin anlaşılmasıdır. Bu amaç için 3 tane marker gen (proliferator-activated receptor-? (PPAR-?), perilipin, and adiponectin (ADPQ)) ekspresyon dereceleri açısından karşılaştırmalı qRT-PCR tekniği ile analiz edilmişlerdir. Adipojenik uyarıma bağlı olarak mezenkimal kök hücrelerde, marker genlerin ekspresyonları yüksek oranda artmış, fibroblastlarda ise tam etkinleşmemiştir. Şaşırtıcı olan sonuç ise mezenkimal kök hücrelerin gen ekspresyon kinetiklerinin karşılaştırılmalarıyla bulunmuştur. Buna göre, ekspresyondaki değişiklikler bu hücre soylarının yeni çevrelere adaptasyon geliştirdikleri veya doğalarında farklı özellikler taşıdıklarını göstermektedir. Bu yüzden, yapılan buluş bu kök hücrelerin farklı adanmışlık seviyelerine sahip oldukları anlamına gelebilir ki, bu ise adipositlere farklılaşan hücrelerin ve onların atalarının ayırımı açısından anlamlı olabilir.Fibroblast hücreler, adipojenik farklılaşma kapasitelerinin daha iyi anlaşılması için, gen ekspresyon çalışmalarına ek olarak immünofloresans boyama ile analiz edilmişlerdir. Bu hücrelerin yağ parçacık yapılarına ve hücre şekillerine dair anlamlı bulgular elde edilmiş olsa da, fibroblastların bu farklılaşma türüne başlayıp devam ettiklerini net olarak söylememize olanak sağlayacak bulgulara rastlanılamıştır.Diğer bağ doku üyeleri gibi, adipoz dokuda da ekstrasellüler matriks yapısal bir iskele görevi görür. Bu ise dokudaki sinyalizasyon olayları açısından gereklidir. Tezin bu son aşamasında, farklı türdeki ekstrasellüler matriks proteinleri, adipojenik farklılaşma üzerindeki etkileri açısından analiz edilmişlerdir. Bu bağlamda, kollajen tip I'in ve fibronektinin adipojenik farklılaşmayı arttırıcı ve koruyucu etkilerine rastlanılırken, kollajen tip IV ve laminin nötral bir etki göstermişlerdir. Research of especially the past decade has pointed adipose tissue as a highly active endocrine organ rather than being an inert tissue. This also promoted investigations on the origins of adipocytes. In this context, the most important finding was the discovery of the adipose tissue-resident mesenchymal stem cells. However, it has been lately understood that these cells have a limited proliferative capacity, thus the idea occured that there should be other sources, feeding the tissue from non-adipose tissue resident progenitor cells.According to this statement, the principal aim of this master?s thesis was to understand the adipogenic differentiation potentials of two bone marrow (BM72 & BM78) and one adipose tissue (LA47) -derived mesenchymal stem cell strains and a dermal fibroblast cell strain (DF24). For this purpose the relative expression levels of the adipogenic marker genes proliferator-activated receptor-? (PPAR-?), perilipin, and adiponectin (ADPQ) were analyzed with qRT-PCR. Upon adipogenic induction, the expression profiles of marker genes were largely intensified in all MSCs from bone marrow or fat tissue, while expression was only rudimentary in dermal fibroblasts. The surprising finding at this part was gained by the comparison of the gene expression kinetics of the MSCs. Accordingly, the differences in expression between these cell strains mirrored an initial adaptation to the different environments or distinct inherent traits. This may point to a difference in the commitment stages of MSCs from bone marrow and adipose tissue, also allowing the discrimination of early progenitors and their progeny, the pre-adipocytes.For better understanding of the adipogenic differentiation potential of DF24 cells, they were analyzed by immunofluorescence staining in parallel to gene expression assays. Although the observed oil droplet formation or cell shape changes were indicative of adipogenesis, there was no definite proof to say that dermal fibroblasts initiate and proceed in true adipogenic differentiation.As other connective tissues, adipose tissue is structured by a sscaffold of extracellular matrix (ECM) which exerts signalling functions, too. At the last part of the thesis, different types of ECM proteins were examined for their influences on adipogenesis. Herein, promoting and mainteaning effects on adipogenic differentiation were found for collagen type I and fibronectin whereas collagen type IV and laminin proteins did not reveal any measurable effect. 137

Kronik hepatit B virüs enfeksiyonu dünyada yaklaşık 350 milyon kişiyi enfekte eden, en yaygın bulaşıcı hastalıklardan birisi olarak global bir sağlık sorunu teşkil etmektedir. Yapılan çalışmalar, hepatit B virüs enfeksiyonun'un progresyonunda sadece viral genotip ve vireminin değil, aynı zamanda konak genetik faktorlerinin de oldukça önemli rol oynadığını vurgulamaktadır. Aynı zamanda, hem hücresel hem de humoral immün yanıtın virüsün eredike edilmesi için gerekli olduğu birçok deneysel çalışmada gösterilmektedir.Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, Türk toplumunda HLA-DRB1 allelleri ve viral hepatit B klinik seyri arasındaki ilişkiyi araştırmaktır. Bu çalışmaya, 324 hasta dahil edildi; 63.4% erkek (n=204), 36.4% kadın (n=120) ve 23.5% (n=76) HBe antigeni pozitif hastalar ile 23.8% (n=77) siroz olan hastalar. Ortalama yaş 44 yıl (39-49 yaş ) arası, ortalama takip süresi ise 86.5 ay idi. Kontrol grubunda ise 150 sağlıklı kişi dahil edildi (DRB1*07). Kronik hepatit B olan 324 hastada ve 150 sağlıklı kişide HLA-DRB1 allelleri polimeraz zincir reaksiyonu/sekans spesifik primer (PCR/SSP) tekniği kullanılarak analiz edildi.Bu çalışmada, aktif ya da inaktif hastalık veya interferon tedavisine yanıt veya nükleozid analog tedavisi sırasında gözlenen virolojik kırılma (breakthrough) olayları ile DRB1 allellerinin arasında anlamlı ilişki gözlemlenmemiştir. Diğer taraftan vaka-kontrol grubumuzda DRB1*07 alleli için istatistiksel olaraka anlmalı değerler elde edildi (p=0.003). Dahası, elde dilen veriler sonucunda, DRB1*07 alleli saptanan hastalarda siroz anlamlı olarak daha nadir gözlemlenmiştir (likelihood ratio chi square:4.17, p=0.04).Bu durumda, DRB1*07 alleli HBV immun yanıtını etkileyen önemli konak faktörlerden biri olabilir. Ayrıca, kronik HBV ana komplikasyonlar'dan biri olan sirozun kendi kendini sınırlamasında oldukça önemli rol oynadığı düsünülmektedir. Bu çalışma, kronik HBV ve HLA DRB1 polimorfizmi arasındaki ilişkinin ortaya konmasında yardımcı bilgiler sunmaktadır. HBV'nin genetik patogenezinin anlaşılması ve bu çalışmadaki bulguların doğrulanması için daha büyük hasta gruplarında HLA polimorfizmi araştırılmalıdır. Chronic hepatitis B virus (HBV) infection is a global health problem with an estimated 350 million people chronically infected worldwide. Considerable evidence suggests that the progression of hepatitis B virus infection is influenced not only by the viral genotype and the level of viremia but also host genetic factors play a significant role in the pathogenesis and clinical outcome of chronic HBV infection in several ethnic groups. It is mentioned that both cellular and humoral responses are required for viral clearance. Hence, the aim of this study is to investigate the association between the polymorphisms of HLA-DRB1 alleles and viral hepatitis B in Turkish population.In this study 324 patients were included; 63.4% male (n=204), 36.6% female (n=120) and, where 23.5% (n=76) of patients being HBe antigen positive, 23.8% (n=77) having cirrhosis. The median age was 44 years (age between 39-49), median follow up time was 86.5 months. In the control group 150 healthy cases were included (for DRB1*07 allele). HLA-DRB1 alleles in 324 patients with chronic hepatitis B and 150 controls were analyzed using the polymerase chain reaction/sequence specific primer (PCR/SSP) technique.In our group of patients, DRB1 alleles were not related to active or inactive disease, or interferon treatment response or virologic breakthroughs observed during nucleoside analog treatments. On the other hand we have found statistically significant frequency of DRB1*07 allele (p=0.003) in our case-control study. Moreover, our data showed that, patients who had DRB1*07 allele had lower probability to have cirrhosis (likelihood ratio chi square: 4.17, p=0.04), suggesting that DRB1*07 might be associated with low risk of cirrhosis development.In this case, DRB1*07 allele may be one of the host factors, which influences immune response to HBV, by self-limiting cirrhosis, one of the main complications of chronic HBV. Findings from this thesis are expected to acknowledge the relationship between chronic HBV infection and HLA DRB1 polymorphisms. Additional study is needed to validate these findings and to further explore the genetic pathogenesis of HBV infection. 87