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A síndrome de Coffin-Siris é uma condição genética causada por mutações em genes que são responsáveis pela codificação de componentes do complexo BAF, causando hipoplasia ou aplasia da falange do quinto dedo, aparência facial grosseira, atraso de desenvolvimento, retardo intelectual, cabelos esparsos, hipotonia, anormalidades cardíacas e cerebrais, entre outras características. Nesse sentido, objetiva-se neste artigo trazer um relato de caso sobre a progressão do diagnóstico da Síndrome de Coffin-Siris (CSS), onde os sinais e sintomas iniciais podem ser imprecisos para realizar o diagnóstico, sendo necessário recorrer a exames genéticos para a confirmação da síndrome. Coffin-Siris syndrome is a genetic condition caused by mutations in genes that are responsible for encoding components of the BAF complex, causing hypoplasia or aplasia of the fifth finger phalanx, coarse facial appearance, developmental delay, intellectual retardation, sparse hair, hypotonia, cardiac and brain abnormalities, among other characteristics. In this sense, the objective of this article is to present a case report on the progression of the diagnosis of Coffin-Siris Syndrome (CSS), where the initial signs and symptoms can be imprecise to make the diagnosis, being necessary to resort to genetic tests for the diagnosis. confirmation of the syndrome. El síndrome de Coffin-Siris es una condición genética causada por mutaciones en genes que son responsables de codificar componentes del complejo BAF, causando hipoplasia a aplasia de la falange del quinto dedo, apariencia facial tosca, retraso en el desarrollo, retraso intelectual, cabello escaso, hipotonía, problemas cardíacos, y anomalías cerebrales, entre otras características. En este sentido, el objetivo de este artículo es presentar un caso clínico sobre la evolución del diagnóstico del Síndrome de Coffin-Siris (SCS), donde los signos y síntomas iniciales pueden ser imprecisos para realizar el diagnóstico, siendo necesario recurrir a la genética. Pruebas para el diagnóstico Confirmación del síndrome.

La deficiencia de hormonas hipofisarias o hipopituitarismo congénito (HC) suele presentarse con fenotipos altamente variables y usualmente se ve asociada a otros defectos congénitos. Numerosos genes han sido descritos en la etiología de HC, sin embargo, se estima que solo el 16% de los pacientes recibe un diagnóstico genético certero, dejando a la mayoría de los casos familiares y esporádicos inconclusos. En este trabajo de tesis implementamos un panel de testeo de genes, utilizando secuenciación de single-molecule molecular inversión probes. Este panel consta de un conjunto de 104 genes, los cuales incluyen genes previamente reportados y genes candidatos a causar HC. Capturamos ADN genómico de 265 pacientes argentinos pediátricos con HC, ya sea aislado o con otras anomalías. Encontramos variantes candidatas patogénicas, posiblemente patogénicas y de significado incierto (VUS) en el 56% de los casos. Con el fin de validar los efectos de variantes VUS en los genes ya descritos como causantes de la patología, LHX3, LHX4, y GLI2, realizamos ensayos funcionales in-vitro, utilizando líneas celulares humanas. Para evaluar las variantes en LHX3/4 se co-transfectaron células HEK293T con plásmidos de expresión conteniendo los cDNAs de LHX3/4 wild type (WT) ó mutados, junto con plásmidos reporteros. Estos últimos, contienen el gen de la luciferasa río abajo de los promotores de ɑGSU ó GH-1, para LHX3 y 4, respectivamente. Para el análisis funcional de GLI2 utilizamos la línea celular NIH/3T3-CG, la cual fue transfectada establemente para expresar GFP ante la presencia de la forma activa de GLI2. El gen Gli2 endógeno fue knockeado por CRISPR-Cas9. Utilizamos entonces esta nueva línea reportera para evaluar la capacidad de GLI2 WT ó mutado de restaurar la expresión de GFP. Mediante estos distintos experimentos funcionales, concluímos que las variantes LHX3:p.Pro187Ser LHX4:p.Arg84His, p.Gln100His y p.Trp204Leu y GLI2:p.Ser1404Lfs afectan a la activación del gen reportero, mientras que las variantes LHX3:p.Leu220Met, GLI2:p.Ala203Thr y p.Leu761Pro tiene actividad equivalente a las proteínas WT en sus respectivos ensayos. Por otro lado, evaluamos una variante sinónima en POU1F1 y una variante intrónica en PNPLA6, ambas identificadas por secuenciación completa de exoma y genoma respectivamente y predichas como disruptores del splicing. Análisis del ARN de los pacientes confirmaron que ambas variantes afectan la longitud del ARN mensajero, probablemente afectando la función de la proteína o su presencia. Por último, proponemos la creación de un catálogo funcional para variantes en los genes POU1F1 y GLI2. Para ello, construímos todas las posibles variantes de nucleótido único en el exón 2 de POU1F1, región involucrada en splicing, por mutagénesis de saturación. Luego de transfectar células COS7 con los plásmidos conteniendo todas las variantes, se secuenció el ARN transcripto y se evaluó la proporción de las distintas isoformas de POU1F1 ó la pérdida completa del exón. Asimismo, desarrollamos los primeros pasos para evaluar de manera equivalente múltiples variantes en el dominio de transactivación de GLI2. Creemos que el análisis funcional de variantes potencialmente patogénicas se vuelve crítico a la hora de definir un diagnóstico molecular preciso. En este trabajo queda plasmada esta necesidad, y se muestra que la identificación de variantes causantes de HC es una tarea complicada debido a la variación fenotípica y penetrancia incompleta. Se debe seguir trabajando en la creación de un catálogo entero de efectos de variantes en genes causantes de la patología, disponible para los/as médicos/as, de forma de simplificar la interpretación de variantes nóveles encontradas y reducir así la odisea de diagnóstico. Congenital hypopituitarism (CH) presents with highly variable phenotypes and is often associated with other birth defects. Several genes have been described in CH etiology, however only an estimated 16% of patients receive a genetic diagnosis, thus the majority of familial and sporadic cases have unknown genetic origin. We implemented a target panel genetic screening using single-molecule molecular inversion probes sequencing to identify causative mutations in a set of 104 previously reported and candidate associated genes. We captured genomic DNA from 265 argentinean pediatric patients with CH, either alone or with other abnormalities. We found candidate pathogenic, likely pathogenic and uncertain significance variants (VUS) in 56% of the cases. In order to validate the effects of VUS in known causative genes LHX3, LHX4, and GLI2, we performed in-vitro functional assays to study the activity of the mutated proteins. To test LHX3/4 variants we co-transfected HEK293T cells with wild type (WT) or mutated LHX3/4 variant plasmids and the luciferase reporter gene downstream of ɑGSU promoter or GH1 promoter respectively, and the luciferase assay was performed. For GLI2 functional analysis, we used the cell line NIH/3T3-CG, which was stably transfected to express GFP under the presence of GLI2 activated form. Endogenous Gli2 was knocked out by CRISPR-Cas9 and clones were selected for absence of GFP expression upon activation of the sonic hedgehog pathway. We tested the ability of transfected WT or mutated GLI2 expression plasmids to restore GFP fluorescence. We concluded that variants LHX3:p.Pro187Ser LHX4:p.Arg84His, p.Gln100His and p.Trp204Leu and GLI2:p.1404Lfs impair activation of the reporter gene, while the LHX3:p.Leu220Met and GLI2:p.L761P have WT activity on their respective assays. We also tested a synonymous variant in POU1F1 and an intronic variant in PNPLA6, both found in whole exome and whole genome sequencing respectively, that splicing predictors assessed as splicing disruptive. Minigen experiments confirmed that both variants affect the length of the resulting ARN, possibly affecting protein function or availability. Finally, we proposed to create a catalog of functional testing of variants for POU1F1 and GLI2. We created all possible SNV in exon 2 of POU1F1 by saturation mutagenesis in a minigen plasmid, transfected cells and then extracted and sequenced ARN transcribed from the plasmid. That allowed us to test whether each variant affected the proportion of alpha, beta isoforms of POU1F1, or promoted exon skipping. Finally, we developed the first steps to test in a similar fashion multiple variants of GLI2. Identification of disease causing variants in CH is complicated by phenotypic variation and incomplete penetrance. Functional testing of potential pathogenic variants becomes critical to arrive at a definitive molecular diagnosis. Further work needs to be done to have a full catalog of variant effects in known causative genes available to clinicians in order to simplify the interpretation of novel found variants and reduce diagnostic odyssey. Fil: Vishnopolska, Sebastián Alexis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A síndrome da apneia obstrutiva do sono (SAOS) é caracterizada pela obstrução completa ou parcial das vias aéreas superiores, resultando em períodos de apneia associada ao sono. A SAOS aumenta o risco de morbidade e mortalidade por doenças cardiovasculares e cerebrovasculares. Embora a herdabilidade da SAOS seja estimada em ~40%, os genes subjacentes precisos permanecem indefinidos. O objetivo do presente estudo é definir a base genética da SAOS aparentemente monogênica em duas famílias brasileiras. Essas famílias seguem um padrão sugestivo de herança autossômica dominante. O sequenciamento completo do exoma do DNA da linhagem germinativa e os dados gerados foram analisados usando o software Mendel,MD. As variantes selecionadas foram analisadas usando Varstation®, com análises subsequentes que incluíram validação por sequenciamento de Sanger, avaliação de pontuação patogênica pelos critérios ACMG, análises de cosegregação (quando possível), frequência alélica, padrões de expressão tecidual, análises de vias, efeito na modelagem de dobramento de proteínas usando SwissModelo e RaptorX. Duas famílias (seis casos de SAOS afetados e três controles não afetados) foram analisadas. Uma análise abrangente de várias etapas apontou variantes em COX20 (rs946982087) (família A), PTPDC1 (rs61743388) e TMOD4 (rs141507115) (família B) que parecem ser genes fortes candidatos a serem associados à OSAS nessas famílias. Em conclusão, as variantes encontradas em COX20, PTPDC1 e TMOD4 aparentemente estão correlacionadas ao fenótipo da SAOS nessas famílias. Mais estudos em famílias etnicamente diversas e casos de SAOS não familiares são necessários para melhor definir o papel dessas variantes como contribuintes para o fenótipo da SAOS. Obstructive sleep apnea syndrome (OSAS) is characterized by complete or partial obstruction of the upper airways, resulting in periods of sleep associated apnea. OSAS increases morbidity and mortality risk from cardiovascular and cerebrovascular diseases. While heritability of OSAS is estimated at ~40%, the precise underlying genes remain elusive. The aim of present study is define the genetic basis of seemingly monogenic OSAS in two Brazilian families. Brazilian families with OSAS that follows as seemingly autosomal dominant inheritance pattern were recruited. Whole exome sequencing of germline DNA and the generated data were analyzed using Mendel,MD software. Variants selected were analyzed using Varstation® with subsequent analyses that included validation by Sanger sequencing, pathogenic score assessment by ACMG criteria, cosegregation analyses (when possible) allele frequency, tissue expression patterns, pathway analyses, effect on protein folding modeling using SwissModel and RaptorX. Two families (six affected OSAS cases and three unaffected controls) were analyzed. A comprehensive multistep analyses yielded variants in COX20 (rs946982087) (family A), PTPDC1 (rs61743388) and TMOD4 (rs141507115) (family B) that seemed to be strong candidate genes for being OSAS associated genes in these families. In conclusion, sequence variants in COX20, PTPDC1 and TMOD4 seemingly are associated with OSAS phenotype in these families. Further studies in more, ethnically diverse families and nonfamilial OSAS cases are needed to better define the role of these variants as contributors to OSAS phenotype.

Tese (Doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Da Saúde, 2022. As doenças cardíacas congênitas (DCCs) são definidas como alterações estruturais no coração e nos grandes vasos presentes ao nascimento. Acometem em todo o mundo de 1 a 5% de todos os nascidos vivos, sendo, portanto, o defeito congênito mais comum. Com o objetivo de investigar a etiologia genética foram selecionados 120 pacientes com DCCs e fenótipos extracardíacos, e suas amostras foram submetidas a exames de Cariótipo, MLPA (do inglês, Multiplex Ligationdependent Probe Amplification), análise cromossômica por microarray (CMA) (do inglês Chromosomal Microarray Analysis) e/ou sequenciamento de exoma, conforme orientação clínica. Com aplicação do fluxograma proposto foram realizados 115 exames de Cariótipo, 43 exames de MLPA, 42 CMAs e nove sequenciamentos de exoma, que permitiram a identificação de alterações patogênicas ou provavelmente patogênicas em 71,7% dos pacientes (86 de 120), superando a expectativa de diagnóstico apresentada na literatura e reforçando a capacidade diagnóstica disponível e aplicável no Brasil. Os achados genômicos desse grupo de pacientes reforçam a importância da fenotipagem adequada para classificação de variantes genômicas, e do entendimento das vias metabólicas envolvidas na cardiogênese. Contribui-se ainda para ponderação sobre regras vigentes de classificação de CNVs e variantes genômicas em doenças complexas, apresentando alterações com potencial para o estabelecimento ou ampliação de associações genótipo-fenótipo em pacientes com DCCs. Congenital heart diseases (CHD) are structural alterations in the heart and/or great vessels present at birth. Affecting between 1 and 5% of all live births worldwide, they constitute the most common congenital defect. To investigate the genetic etiology of CHD, 120 patients with CHD and extracardiac phenotypes were selected and their samples submitted to karyotyping, MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), Chromosomal Microarrays (CMA) and exome sequencing techniques, after clinical guidance. 115 karyotype tests, 43 MLPA tests, 42 CMAs, and nine exome Sequencing were performed. The screening resulted in the identification of pathogenic or potentially pathogenic alterations in 74.1% of the patients (89 of 120). This result exceed the diagnostic expectation presented in the literature and reinforce the diagnostic capacity applicable in Brazil. The genomic findings for this patient group highlight the importance of adequate phenotyping to allow the classification of genomic variants and reinforce the importance of screening the metabolic pathways involved in cardiogenesis. Furthermore, these findings contribute to discussions regarding the classification standards for copy number variations (CNVs) and genomic variants in complex diseases, presenting variants with the potential to establish or expand genotype-phenotype associations in patients with CHD.

Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2022. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF). A Deficiência Intelectual (DI) é classificada como transtorno do neurodesenvolvimento, tipicamente se manifestando no começo do desenvolvimento, antes mesmo da criança iniciar os estudos, interferindo em todo o seu desenvolvimento pessoal, social, no meio acadêmico e profissional. A Deficiência intelectual atinge 1-3% da população mundial e sua etiologia é heterogênea e, na maioria das vezes tem causa genética. Usualmente as variantes genéticas que causam a DI são divididas em anormalidades cromossômicas numéricas, deleções/duplicações também conhecidas como variantes de número de cópias, variantes monogênicas, ou ainda ter causa multifatorial. O presente trabalho teve como objetivo buscar a causa genética da deficiência intelectual em 6 pacientes com DI sindrômica utilizando métodos citogenéticos e moleculares. Foram realizadas a análise do cariótipo, pesquisa da mutação da síndrome do X-frágil, análise cromossômica por microarray e Exoma. Em três dos seis casos avaliados as variantes responsáveis pela deficiência intelectual foram identificadas, sendo elas: ZDHHC9:c.777+1G>T (relacionada à síndrome de Raymond, forma de DI ligada ao X), HNRNPU:c.16delG (relacionado à encefalopatia, atraso do desenvolvimento e epilepsia), e uma deleção de 61 kb (ChrX, del: AVPR2, L1CAM, CEP290, ARHGAP4), sendo o gene AVPR2 relacionado ao Diabetes insipidus nefrogênico, ligado ao X e o gene L1CAM relacionado à síndrome L1. Em um dos casos não foi identificada uma variante causadora da DI, porém um achado incidental de variante patogênica no gene COL4A3:c4421T>C relacionada a síndrome de Alport. Em dois casos não foram identificadas variantes patogênicas ou candidatas para explicar a DI. Nesses casos, a reanálise futura ou análise de outros familiares pode permitir a identificação da etiologia da DI. Conclusão: Os resultados deste trabalho sugerem que o Sequenciamento de Exoma é uma técnica essencial para a determinação da etiologia da DI, pois contribuiu para o aumento do aproveitamento diagnóstico, por ser capaz de identificar variantes raras, variantes presentes em mais de um gene e por possibilitar a reanalise futura dos dados resultantes dessa técnica para identificação da etiologia. Intellectual Disability (ID) is classified as a neurodevelopmental disorder, typically manifesting itself at the beginning of development, even before the child begins their studies, interfering with all their personal, social, academic and professional development. Intellectual disability affects 1-3% of the world population and its etiology is heterogeneous and most often has a genetic cause. Usually, the genetic variants that cause ID are divided into numerical chromosomal abnormalities, deletions/duplications, also known as copy number variants, monogenic variants, or even having a multifactorial cause. The present study aimed to search for the genetic cause of intellectual disability in 6 patients with syndromic ID using cytogenetic and molecular methods. Karyotype analysis, fragile X syndrome mutation research, chromosomal analysis by microarray and Exome were performed. In three of the six cases evaluated, the variants responsible for the intellectual disability were identified, namely: ZDHHC9:c.777+1G>T (related to Raymond syndrome, X-linked form of DI), HNRNPU:c.16delG (related to encephalopathy, developmental delay and epilepsy), and a 61 kb deletion (ChrX, del: AVPR2, L1CAM, CEP290, ARHGAP4), with the AVPR2 gene related to nephrogenic, X-linked Diabetes insipidus and the L1CAM gene related to the L1 syndrome . In one of the cases, a variant causing ID was not identified, but an incidental finding of a pathogenic variant in the COL4A3:c4421T>C gene related to Alport's syndrome. In two cases, no pathogenic variants or candidates to explain ID were identified. In these cases, future reanalysis or analysis of other family members may allow the identification of the ID etiology. Conclusion: The results of this work suggest that Exome Sequencing is an essential technique for determining the etiology of ID, as it has contributed to the increase in diagnostic use, as it is able to identify rare variants, variants present in more than one gene, and for to enable the future reanalysis of the data resulting from this technique to identify the etiology.

Els trastorns genètics de la substància blanca cerebral (Genetic White Matter Disorders; GWMDs) afecten predominantment a la producció i manteniment de la mielina del sistema nerviós central. L'abordatge diagnòstic "clàssic", basat en estudis genètics dirigits a partir de la sospita clínica, permet el diagnòstic molecular en només la meitat dels pacients. L'estudi de seqüenciació de l'exoma i del genoma complets (WES i WGS respectivament), ha demostrat un alt rendiment diagnòstic en estudis realitzats en diverses patologies de base genètica, principalment en trios (analitzant conjuntament les dades genòmiques del pacient i els seus progenitors). Aquest treball pretén establir la utilitat clínica dels estudis WES/WGS mitjançant l'anàlisi únicament de casos índex (no trio) amb GWMDs, identificar nous gens associats a aquests trastorns i descriure nous fenotips clínics. Al laboratori de Malalties Neurometabòliques de l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) vam estudiar mitjançant WES/WGS pacients amb GMWDs no diagnosticats després d'un abordatge "clàssic". Els casos van ser remesos des de serveis de neurologia d'hospitals terciaris d'arreu d'Espanya des de gener de 2015 fins a desembre de 2019. Els estudis WES/WGS van ser analitzats mitjançant un algoritme computacional que prioritza les variants genètiques segons la informació clínica codificada en termes HPO (Human Phenotype Ontology) i informació de les interaccions físiques i funcionals de les proteïnes de l'organisme. Vam incloure 126 famílies i vam poder establir el diagnòstic molecular en 91 d'elles (72% dels casos). A més, vam identificar 7 gens candidats, fenotips nous i cinc famílies amb diagnòstic dual. Es va evidenciar la gran heterogeneïtat genètica d'aquest grup de trastorns (57 gens identificats entre els 91 casos diagnosticats), sent els més freqüents EIF2B5, POLR3A, RNASEH2B i PLP1. Vam identificar un nou GWMD, produït per variants bial·lèliques en el gen PI4KA i vam fer la validació funcional. Vam descriure deu pacients amb un espectre fenotípic que comprenia des d'una malaltia hipomielinitzant greu associada a alteracions estructurals del cervell (hipoplàsia del tronc de l'encèfal i del cerebel o polimicrogíria), fins a una paraparèsia espàstica pura. Alguns pacients presentaven trastorns immunològics, gastrointestinals o anomalies genitourinàries. A més, vam poder participar en la descripció del fenotip clínic associat a variants bial·lèliques en el gen PRORP, que es caracteritzava per una sordesa neurosensorial, insuficiència ovàrica primària, retard del desenvolupament i canvis de la substància blanca cerebral. També en la descripció d'un nou fenotip associat a POLR3A, amb predomini de clínica extrapiramidal i afectació estriatal, i en la caracterització fenotípica de variants en el gen HNRNPH1. Finalment, vam coordinar l'estudi de 53 pacients amb variants en heterozigosi el gen DLG4, que codifica per la proteïna postsinàptica PSD-95. El quadre clínic es caracteritzava per una discapacitat intel·lectual, un trastorn de l'espectre autista, epilèpsia i trastorns del moviment. Cal destacar que alguns d'aquests pacients presentaven anomalies de la substància blanca cerebral, en forma d'atròfia, retard de la mielinització o hiperintensitats periventriculars, i d'altres, una paraparèsia espàstica. Per tant, aquest treball mostra com els trastorns sinàptics també poden tenir una forma de presentació compatible amb l'espectre fenotípic de GWMD-paraparèsia espàstica hereditària. Aquesta tesi mostra la utilitat clínica dels estudis de WES/WGS realitzats en casos índex (no trio) amb GWMDs, i com possibiliten la identificació de nous gens candidats i nous fenotips clínics. Reforça a més la necessitat d'implantar-los en estadis inicials del procés diagnòstic, per poder oferir un assessorament genètic adequat i tractaments específics abans que l'afectació neurològica estigui ja massa avançada. Finalment, posa de manifest la importància de la col·laboració entre centres assistencials i d'investigació, i de la participació dels clínics en el procés diagnòstic basat en la NGS. Los trastornos genéticos de la sustancia blanca cerebral (Genetic White Matter Disorders; GWMDs) afectan predominantemente a la producción y mantenimiento de la mielina del sistema nervioso central. El abordaje diagnóstico "clásico", basado en estudios genéticos dirigidos a partir de la sospecha clínica, permite el diagnóstico molecular en la mitad de los pacientes. El estudio de secuenciación del exoma y del genoma completos (WES y WGS respectivamente), ha demostrado un alto rendimiento diagnóstico en estudios realizados en diversas patologías de base genética, principalmente en tríos (analizando conjuntamente los datos genómicos del paciente y sus progenitores). Este trabajo pretende establecer la utilidad clínica de los estudios WES/WGS mediante el análisis únicamente de casos índice (no trío) con GWMDs, identificar nuevos genes asociados a estos trastornos y describir nuevos fenotipos clínicos. En el laboratorio de Enfermedades Neurometabólicas del Instituto de Investigación Biomédica de Bellvitge (IDIBELL) estudiamos mediante WES/WGS a pacientes con GMWDs no filiados después de un abordaje diagnóstico "clásico". Estos pacientes fueron remitidos desde servicios de neurología de hospitales terciarios de toda España desde enero de 2015 hasta diciembre de 2019. Los estudios WES/WGS fueron analizados mediante un algoritmo computacional que priorizaba las variantes genéticas según la información clínica codificada en términos HPO (Human Phenotype Ontology) e información de las interacciones físicas y funcionales de las proteínas del organismo. Incluimos 126 familias y pudimos establecer el diagnóstico molecular en 91 de ellas (72% de los casos). Además, identificamos 7 genes candidatos, nuevos fenotipos y cinco familias con diagnóstico dual. Se evidenció la gran heterogeneidad genética de este grupo de trastornos (57 genes identificados entre los 91 casos diagnosticados), siendo los más frecuentes EIF2B5, POLR3A, RNASEH2B y PLP1. Identificamos un nuevo GWMD, producido por variantes bialélicas en el gen PI4KA y realizamos la validación funcional. Describimos diez pacientes que presentaban un espectro fenotípico que comprendía desde una enfermedad hipomielinizante grave con alteraciones estructurales del cerebro (hipoplasia del tronco del encéfalo y del cerebelo o polimicrogiria), hasta una paraparesia espástica pura. Algunos pacientes presentaban trastornos inmunológicos, gastrointestinales o anomalías genitourinarias. Además, pudimos participar en la descripción del fenotipo clínico asociado a variantes bialélicas en el gen PRORP, que se caracterizaba por una sordera neurosensorial, insuficiencia ovárica primaria, retraso del desarrollo y cambios de la sustancia blanca cerebral. También en la descripción de un nuevo fenotipo asociado a POLR3A, con predominio de clínica extrapiramidal y afectación estriatal, y en la caracterización fenotípica de variantes en el gen HNRNPH1. Finalmente, coordinamos el estudio de 53 pacientes con variantes en heterozigosis el gen DLG4, que codifica por la proteína postsináptica PSD-95. El cuadro clínico se caracterizaba por una discapacidad intelectual, un trastorno del espectro autista, epilepsia y trastornos del movimiento. Cabe destacar que algunos de estos pacientes presentaban anomalías de la sustancia blanca cerebral, en forma de atrofia, retraso de la mielinización o hiperintensidades periventriculares, y otros, una paraparesia espástica. Por tanto, este trabajo muestra cómo los trastornos sinápticos también pueden tener un modo de presentación compatible con el espectro fenotípico de GWMD-paraparesia espástica hereditaria. Esta tesis muestra la utilidad clínica de los estudios de WES/WGS realizados en casos índice (no trío) con GWMDs, y cómo posibilitan la identificación de nuevos genes candidatos y nuevos fenotipos clínicos. Refuerza además la necesidad de implantarlos en estadios iniciales del proceso diagnóstico, para poder ofrecer un asesoramiento genético adecuado y tratamientos específicos antes de que la afectación neurológica esté ya demasiado avanzada. Por último, pone de manifiesto la importancia de la colaboración entre centros asistenciales y de investigación, y de la participación de los clínicos en el proceso diagnóstico basado en la NGS. Genetic White Matter Disorders (GWMDs) predominantly affect the production or maintenance of myelin in the central nervous system. The "classic" diagnostic approach, based on targeted genetic studies, allows molecular diagnosis in only half of patients. The study of Whole-Exome and Whole-Genome Sequencing (WES and WGS respectively) showed a high diagnostic performance in hereditary neurological diseases in studies performed mainly in trios (analysing together the genomic data of the patient and his parents). This work aims to establish the clinical utility of WES/WGS studies by analysing only index cases (not trio) with GWMDs, while identifying new genes associated with these disorders, and describing new clinical phenotypes. In the Neurometabolic Diseases Laboratory of the Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), we ran singleton WES/WGS to study patients with undiagnosed GMWDs after a "classic" diagnostic approach. These patients were referred from neurology services of tertiary Spanish hospitals from January 2015 to December 2019. The WES/WGS studies were analysed using a computational algorithm that prioritized genetic variants according to the clinical information encoded in HPO terms (Human Phenotype Ontology) and information on the physical and functional interactions of the body's proteins. We included 126 families and were able to establish the molecular diagnosis in 91 of them (72% of cases). In addition, we identified 7 candidate genes, new phenotypes, and five families with dual diagnosis. A high genetic heterogeneity was evidenced (57 genes identified among the 91 diagnosed cases), with the most frequent being EIF2B5, POLR3A, RNASEH2B and PLP1. We identified a new GWMD, produced by biallelic variants in the PI4KA gene, and we made a functional validation. We described ten patients with a phenotypic spectrum ranging from severe hypomyelinating disease, associated with structural brain abnormalities (brainstem and cerebellum hypoplasia or polymicrogyria), to a pure spastic paraparesis. In addition, some patients had immune disorders, gastrointestinal manifestations or genitourinary abnormalities. We were also able to participate in the description of the clinical phenotype associated with biallelic variants in the PRORP gene, which was characterized by sensorineural hearing loss, primary ovarian failure, developmental delay and cerebral white matter abnormalities. We also collaborated in the description of a new phenotype associated with POLR3A, with a predominance of extrapyramidal manifestations and striatal involvement on neuroimaging, and in the phenotypic characterization of variants in the HNRNPH1 gene. Finally, we coordinated the study of 53 patients with heterozygous variants in the DLG4 gene, which encodes the PSD-95 postsynaptic protein. The clinical picture was characterized by intellectual disability, autism spectrum disorder, epilepsy, and movement disorders. It should be noted that some of these patients had cerebral white matter atrophy, delayed myelination or periventricular hyperintensities on MRI, while others had spastic paraparesis. Therefore, this work shows how synaptic disorders can also have a clinical presentation compatible with GWMD-hereditary spastic paraparesis spectrum. This thesis shows the clinical utility of WES/WGS studies performed in index cases (not trio) with GWMDs, and how they enable the identification of new candidate genes and new clinical phenotypes. It also reinforces the need to introduce them in the initial stages of the diagnostic process, to offer adequate genetic counselling and specific treatments before the advancement of neurological involvement. Finally, it highlights the importance of collaboration between healthcare and research centres, and the participation of clinicians in the diagnostic process based on NGS.

Purpose: Pathogenic variants in ARID1B are one of the most frequent causes of intellectual disability (ID) as determined by large-scale exome sequencing studies. Most studies published thus far describe clinically diagnosed Coffin-Siris patients (ARID1BCSS) and it is unclear whether these data are representative for patients identified through sequencing of unbiased ID cohorts (ARID1B-ID). We therefore sought to determine genotypic and phenotypic differences between ARID1B-ID and ARID1B-CSS. In parallel, we investigated the effect of different methods of phenotype reporting. Methods: Clinicians entered clinical data in an extensive webbased survey. Results: 79 ARID1B-CSS and 64 ARID1B-ID patients were included. CSS-associated dysmorphic features, such as thick eyebrows, long eyelashes, thick alae nasi, long and/or broad philtrum, small nails and small or absent fifth distal phalanx and hypertrichosis, were observed significantly more often (p < 0.001) in ARID1B-CSS patients. No other significant differences were identified. Conclusion: There are only minor differences between ARID1BID and ARID1B-CSS patients. ARID1B-related disorders seem to consist of a spectrum, and patients should be managed similarly. We demonstrated that data collection methods without an explicit option to report the absence of a feature (such as most Human Phenotype Ontology-based methods) tended to underestimate gene-related features., We are grateful for the assistance of Pepijn Cox in setting up the website www.arid1bgene.com. This study has made use of data generated by the Human Disease Genes website series, www.humandiseasegenes.com. This work was financially supported by grants from the Netherlands Organisation for Health Research and Development (917-86-319 to B.B.A.d.V., 912-12-109 to B.B.A.d.V.)

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Até recentemente, as alterações genéticas relacionadas à patogênese das síndromes mielodisplásicas, neoplasias mieloproliferativas e leucemia mieloide aguda eram em grande parte desconhecidas. A introdução das tecnologias de sequenciamento de nova geração na investigação dessas doenças tem fornecido valiosas contribuições na identificação de novos biomarcadores moleculares, no estabelecimento de classificações de risco mais precisas, acompanhamento da evolução clonal das células neoplásicas e seleção de intervenções terapêuticas mais específicas. Este trabalho teve como objetivo identificar, por meio de sequenciamento do exoma, variantes genéticas específicas em casos de neoplasias mieloides com apresentação atípica ou com mais de uma ocorrência na mesma família. Pacientes de três diferentes famílias foram selecionados para o estudo: no caso 1, duas irmãs com mielofibrose primária e histórico de exposição de longa data a agrotóxicos do tipo DDT; no caso 2, uma paciente diagnosticada aos 21 anos de idade com síndrome mielodisplásica (SMD ¿ CRMD), doença esta com idade média de apresentação aos 70 anos de idade; e no caso 3, um pai com SMD de alto risco prognóstico e dois filhos com trombocitopenia periférica e atipias celulares na medula óssea. Para a pesquisa de variantes nesses pacientes, procedeu-se ao sequenciamento completo do exoma na modalidade estrito, em plataforma HiSeq 2500 (Illumina, Inc.), de amostras de DNA provenientes de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea (CD34+) e células de linhagem germinativa do sangue periférico (linfócitos T CD3+). As análises em bioinformática dos dados do sequenciamento foram conduzidas segundo protocolo estabelecido pelo LaCTAD ¿ Unicamp, com o auxílio das seguintes feramentas: NGSQCToolkit, BWA, SAMtools, GATK e ANNOVAR. Tais programas foram aplicados, respectivamente, na filtragem das leituras por qualidade, alinhamento das leituras, remoção de duplicatas dos resultados de alinhamento, identificação e anotação de variantes. As variantes anotadas em conjuntos de genes implicados direta ou indiretamente na patogênese das doenças neoplásicas mieloides foram filtradas de acordo com a sua localização no genoma e com os valores de cobertura atingidos. Após as filtragens, as variantes remanescentes foram avaliadas quanto ao potencial deletério por meio do programa SIFT e quanto à patogenicidade pelo software PolyPhen2 e selecionadas para investigação futura de acordo com critérios de patogenicidade e baixa frequência em todas as populações combinadas (global minor allele frequency < 1%). No caso 1, filtragens em genes implicados na patogênese das neoplasias mieloides identificaram as variantes GATA1 Thr263Met na medula óssea (MO) e no sangue periférico (SP) de ambas as pacientes (III-2 e III-3) e JAK3 Val718Leu na medula óssea da irmã mais jovem (III-3). Foram identificadas ainda três variantes em genes que codificam enzimas metabolizadoras de drogas: CYP3A5 Gly31fs, CYP2A6 Ser467Stop e CYP2B6 Thr67Met. A alteração em GATA1, particularmente, não contém registro em bancos de dados de variantes até o momento. Por isso, predições moleculares da proteína GATA1 foram conduzidas e demonstraram que a treonina (T263) afetada pela inserção da variante está localizada no domínio dedo de zinco C-terminal e, portanto, em região funcional e altamente conservada dessa proteína. No caso 2, três variantes obedeceram aos critérios de seleção para investigação futura: ATM Pro1054Arg, RAD51C Thr287Ala e FANCB Gly335Glu (neste último, GMAF = 3,66%), todas presentes na MO e SP da paciente II-1, o que sugere que estas alterações tenham sido herdadas. Essas três variantes foram detectadas em três genes distintos que têm em comum função de reparo de danos ao DNA, de modo que mutações neles localizadas podem estar relacionadas a um risco aumentado para SMD e outros distúrbios mieloides. No caso 3, apenas duas variantes foram selecionadas para validação: ATM Ser333Phe, presente na MO e SP dos três pacientes sequenciados e PAPD5 Val572insSer (ou Val525insSer), na MO do pai (I-2) e do filho mais jovem (II-3) e no SP do pai. Tais resultados apontam que apenas a ATM Ser333Phe foi herdada nos pacientes avaliados do caso 3. Todas as variantes selecionadas serão validadas por meio de testes como sequenciamento de Sanger e estudos funcionais. Estudos de ligação familiar (linkage) nos demais indivíduos das famílias contempladas por este estudo também serão conduzidos Abstract: Until recently, the genetic changes related to the pathogenesis of myelodysplastic syndromes, myeloproliferative neoplasms and acute myeloid leukemia were largely unknown. The introduction of next generation sequencing technologies in research of these diseases has provided valuable contributions on the identification of new molecular biomarkers, establishing more accurate risk ratings, the monitoring clonal evolution of cancer cells and selection of more specific therapeutic interventions. This study aimed to identify, through exome sequencing, specific genetic variants in cases of myeloid neoplasms with atypical or with more than one occurrence in the same family. Patients from three different families were selected for the study: in the case one, two sisters with primary myelofibrosis and history of longtime exposure to pesticides DDT type; in the case 2, one patient diagnosed at 21 years old with myelodysplastic syndrome (MDS - RCMD), a disease whose average age of presentation is 70 years old; and in case 3, a father with SMD high risk prognosis and two brothers with peripheral trombicitopenia and atypical cells in the bone marrow. To investigate the variations in these patients, we proceeded to complete sequencing of the exome in strict mode at HiSeq 2500 platform (Illumina, Inc.) from DNA samples of hematopoietic stem cells from bone marrow (CD34 +) and germline cells from peripheral blood (CD3 + lymphocytes). The bioinformatics analysis of sequence data were conducted according to the protocol established by LaCTAD - Unicamp, with the help of the following tools: NGSQCToolkit, BWA, SAMtools, GATK and ANNOVAR. Such programs were applied, respectively, for the filtering of reads by quality, alignment of the reads, removal of duplicates from alignment results, identification and annotation of variants. The variants annotated in groups of genes involved directly or indirectly in the pathogenesis of myeloid neoplasms were filtered according to their location in the genome and the achieved coverage values. After filtering, the remaining variants were evaluated as to their deleterious potential by SIFT and to the pathogenicity by PolyPhen2 software and selected for further investigation in accordance with pathogenicity criteria and low frequency in all the combined populations (global minor allele frequency

Orientador: Edi Lúcia Sartorato Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A síndrome de Usher (USH) é a forma mais comum de surdez e cegueira hereditária, apresentando uma prevalência de 1 para 6.000 - 25.000 pessoas e uma taxa de portadores de 1 a cada 100 pessoas. Clinicamente podem-se distinguir três subtipos de acordo com a gravidade da perda auditiva, presença ou ausência de disfunção vestibular e a idade do início da retinose pigmentosa. Os mecanismos moleculares envolvendo a síndrome de Usher ainda não são completamente conhecidos e a ausência de estudos moleculares na população brasileira apontam para a importância da investigação dessa condição que acomete os indivíduos com muitos prejuízos em sua qualidade de vida. Por outro lado, considerando a alta heterogeneidade genética da doença, um estudo molecular aprofundado pode revelar genes causais adicionais ainda não identificados. Dessa forma, o projeto teve como objetivo buscar variantes causadoras da síndrome de Usher. Entre as técnicas usadas para o rastreamento foram realizados o sequenciamento de exoma e painel de captura de genes. Dessa forma, estudou-se 11 famílias com pelo menos um indivíduo com manifestação clínica da síndrome de Usher: oito pela técnica de sequenciamento de exoma, uma por meio de painel de captura e duas foram apenas rastreadas variantes em alguns exons do gene USH2A. Se encontraram 13 variantes, 11 no gene USH2A (p.Y1123H; p.C3267R; p.N405Ifs*3; p.S1369L; p.E4034*; p.N443Mfs*18; p.F1732S; p.S2981=fs*61; p.L4406P; p.C638*; p.M3271Sfs*30) e duas no gene CDH23 (p.A2637P; p.E2520K). Entre as alterações encontradas, a p.N443Mfs*18 foi a mais frequente. A pesquisa de alterações moleculares em uma amostra de pacientes brasileiros, com diagnóstico clínico de Síndrome de Usher, permitiu a elucidação da causa genética em oito das 11 famílias estudadas, contribuindo dessa forma, para um diagnóstico mais preciso e aconselhamento genético adequado. Além disso, os resultados obtidos no presente estudo podem indicar as mutações mais frequentes presentes na nossa população, permitindo otimizar testes de diagnóstico molecular para a triagem da perda auditiva em indivíduos com suspeita de Usher para melhor prognóstico, tratamento e aconselhamento genético. O diagnóstico genético de forma precoce possibilita reabilitação no caso da perda auditiva e o preparo para o impacto físico e emocional decorrente da perda visual Abstract: Usher syndrome (USH) is the most common form of deafness and hereditary blindness, with a prevalence of 1 to 6,000 - 25,000 people and a carrier rate of 1 in 100 people. Clinically, three subtypes can be distinguished according to severity of hearing loss, presence or absence of vestibular dysfunction, and age of onset of retinitis pigmentosa. The molecular mechanisms involving Usher syndrome are still not fully understood and the absence of molecular studies in the Brazilian population points to the importance of investigating this condition that affects individuals with many impairments in their quality of life. Therefore, considering the high genetic heterogeneity of the disease, an in-depth molecular study may reveal additional unidentified causal genes. Thus, the purpose of the project was to search for variants that caused Usher syndrome. Among the approaches used for the screening were the whole exome sequencing and the gene capture panel. Thus, 11 families were studied with at least one individual with clinical manifestation of Usher syndrome: eight by the whole exome sequencing, one by capture panel and two were only screened variants in some exons of the USH2A gene. We found 13 variants, 11 in USH2A gene (p.Y1123H; p.C3267R; p.N405Ifs*3; p.S1369L; p.E4034*; p.N443Mfs*18; p.F1732S; p.S2981=fs*61; p.L4406P; p.C638*; p.M3271Sfs*30) and two into CDH23 gene (p.A2637P; p.E2520K). Among the alterations found, the most frequent was p.N443Mfs*18. The investigation of molecular alterations in a sample of Brazilian patients with a clinical diagnosis of Usher Syndrome allowed the elucidation of the genetic cause in seven of the 11 families studied, thus contributing to a more accurate diagnosis and adequate genetic counseling. In addition, the results obtained in the present study may indicate the most frequent mutations present in our population, allowing the optimization of molecular diagnostic tests for hearing loss screening in individuals with suspected Usher for better prognosis, treatment and genetic counseling. Early genetic diagnosis enables rehabilitation in cases of hearing loss and preparation for physical and emotional impact resulting from visual loss Mestrado Genética Médica Mestre em Ciências Médicas CNPQ 158980/2015-8 FAPESP

Orientadores Íscia Teresinha Lopes Cendes, Jorgen Kjems, Rodrigo Secolin Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, e Aarhus University. Interdisciplinary Nanoscience Center Resumo: O Acidente Vascular Cerebral (AVC) é uma das doenças que mais acomete a população mundial, sendo uma das principais causas de morte e incapacitação. O subtipo isquêmico é o mais frequente, atingindo em torno de 80% dos pacientes com AVC. Apesar de fatores de risco de exposição ambiental terem sido estabelecidos para o AVC, esses contribuem com aproximadamente 60% da probabilidade de desenvolvimento do quadro, mostrando que fatores genéticos também influenciam a ocorrência da doença. Alguns estudos identificaram variantes genéticas comuns putativamente associadas ao fenótipo em pacientes com AVC, porém, a maioria não se classifica como uma variante causal. Além disso, é possível que variantes raras sejam responsáveis por parte da herdabilidade do AVC, contribuindo com uma porcentagem do risco para o seu desenvolvimento. Outro ponto a se considerar é a natureza multifatorial do AVC, onde espera-se uma interação de fatores genéticos e ambientais determinando as alterações biológicas que levam a doença. Essas interações podem gerar biomarcadores moleculares que por sua vez podem ser utilizados na prática clínica auxiliando o diagnóstico ou no estabelecimento do prognóstico para a doença. Desse modo, fatores de risco distintos podem convergir na determinação de mecanismos moleculares comuns, afetando a regulação da expressão gênica em pacientes com AVC. Isso posto, os objetivos desse estudo são: i) avaliar a contribuição de variantes genômicas raras presentes nas regiões codificantes do genoma humano em pacientes com AVC isquêmico. ii) determinar o padrão de expressão de microRNAs circulantes em pacientes com AVC isquêmico, nas fases aguda e crônica da doença, e iii) determinar o padrão metabolômico em plasma de pacientes com AVC isquêmico, nas fases aguda e crônica da doença. Utilizando o sequenciamento de nova geração avaliamos o exoma de 130 pacientes com AVC isquêmico, o padrão de expressão de microRNAs em 154 indivíduos, incluindo 53 controles, e o padrão metabolômico do plasma em 52 indivíduos, incluindo 14 controles. A análise de exoma permitiu a identificação de 523 variantes raras em 53 genes de interesse para o AVC isquêmico, entre eles destacamos COL4A3, COL6A3, FGFR2, FVIII, HLA-B. Esses genes fazem parte prioritariamente das vias de biossíntese de colágeno, coagulação sanguínea, inflamação, angiogênese e integridade vascular. Além disso, identificamos microRNAs circulantes com expressão diferencial em pacientes nas diferentes fases do AVC, sendo que os microRNAs let-7, mir-182 e mir-324 estavam diferencialmente expressos na fase aguda do AVC, enquanto o mir-34c está diferencialmente expresso na fase crônica da doença. Comparando o padrão de expressão dos microRNAs na fase aguda e crônica, observamos alterações nos níveis de expressão dos microRNAs mir-142, mir-16, mir-206 e mir-30a. Também observamos similaridade entre os microRNAs identificados na análise do plasma total e aqueles associados a vesículas extracelulares. Utilizando técnicas de RMN, identificamos metabólitos associados com a fase aguda do AVC como formato, piruvato e GlycA. Por sua vez, na fase crônica, os níveis do glutamato eram diferentes em paciente, quando comparado aos controles. Interessante mencionar que os metabólitos identificados em níveis diferentes nos pacientes possuem relação com os mesmos processos fisiológicos identificados na análise de microRNAs. Em conclusão, identificamos variantes raras em genes de interesse para o AVC, como o USP7, não descrito na literatura para a doença. Estas podem contribuir para os riscos de ocorrência e para a gravidade do AVC isquêmico. Além disso, identificamos microRNAs e metabólitos circulantes específicos para diferentes fases do AVC isquêmico, incluindo algumas moléculas inéditas para o AVC isquêmico, porém, com mecanismos relevantes para a doença. Nossos resultados, indicam potenciais biomarcadores para o AVC isquêmico que após passar por etapas adicionais de validação, possam ser usados no desenvolvimento de estratégias de prevenção, diagnóstico e tratamento para pacientes com AVC isquêmico. Abstract: Stroke is one of the most frequent diseases worldwide and one of the leading causes of death and disability. Ischemic stroke is the most common subtype, affecting around 80% of the patients. Although environmental risk factors have been established to increase the risk of stroke, they contribute only with approximately 60% of the probability of developing the disease. Thus, genetic factors also play a role in the predisposition to stroke. Some studies identified common genetic variants putatively associated with stroke. However, it is also possible that rare variants may contribute to the heritability of the disorder. Furthermore, stroke is a multifactorial disorder, where it is expected an interaction of different genetic and environmental factors to determine the biological alterations leading to disease. These interactions can create molecular biomarkers that, in turn, may be used in clinical practice to assist in the diagnose or to establish disease prognosis. In this way, distinct risk factors might converge to determine common molecular mechanisms, which may affect gene expression regulation in patients with stroke. Therefore, the aims of this study are: i) to evaluate the contribution of rare genetic variants to the risk of developing ischemic stroke; ii) to determine the circulating microRNAs expression pattern in patients with ischemic stroke, in both the acute and chronic stage of the disease; and iii) to determine the metabolomic pattern on plasma samples from patients with ischemic stroke, in both the acute and chronic stage of the disease. Using next-generation sequencing, we evaluated the exome of 130 patients with ischemic stroke, the plasma microRNA expression pattern of 154 individuals, including 53 controls, and the metabolomic pattern from the plasma of 52 individuals, including 14 controls. The exome analysis allowed us to identify 523 rare variants in 53 genes of interest to ischemic stroke, from which we highlight COL4A3, COL6A3, FGFR2, FVIII, HLA-B. These genes are primarily part of the following biological pathways: collagen biosynthesis, blood coagulation, inflammation, angiogenesis, and vascular integrity. Furthermore, we identified circulating microRNAs with a differential expression in different phases of ischemic stroke. The microRNAs let-7, mir-182, and mir-324 were differentially expressed in the acute phase of stroke. In contrast, mir-34c was differentially expressed in the chronic phase of ischemic stroke. Comparing the microRNAs expression pattern on acute and chronic phases, we observed changes in expression levels of microRNAs mir-142, mir-16, mir-206, and mir-30a. We also observed similarities between microRNAs identified in plasma and those associated exclusively with extracellular vesicles. We identified metabolites associated with acute stroke in plasma of patients by NMR techniques, such as formate, pyruvate, and GlycA. During the chronic phase, the level of glutamate was altered in patients when compared to controls. Interestingly, the metabolites identified as differentially abundant in patients are related to similar biological pathways as the microRNAs found to be differentially expressed in patients. In conclusion, we identified rare variants in candidate genes, as USP7, which were not previously identified to ischemic stroke, that may predict the risk of occurrence and the severity of ischemic stroke. Also, we identified circulating microRNAs and metabolites specific for the different stages of ischemic stroke, and that have not been observed in ischemic stroke patients, that should be validated in broader clinical studies. These molecules are potential disease biomarkers and might help, in the future, the development of new strategies to prevent, diagnose and treat patients with ischemic stroke. Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências CAPES 88887.468872/2019-00 FAPESP 2015/25607-0

Orientador: Íscia Teresinha Lopes Cendes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Os gastos crescentes dos sistemas de saúde ao redor do mundo têm sido alvo de preocupação de gestores, profissionais de saúde e usuários. A incorporação de novas tecnologias aos exames complementares é um dos fatores responsáveis por este fenômeno e a oneração dos sistemas de saúde per se não necessariamente representa melhorias diagnósticas ou terapêuticas. Diante deste impasse e na tentativa de promover o uso racional dos recursos disponíveis surgiram os estudos de avaliação de tecnologias em saúde, dentre eles as análises de custo-efetividade. Na área da genômica, o advento do sequenciamento de nova geração propiciou a redução dos custos de sequenciamento e por conseguinte viabilizou a ampliação de abordagens genômicas com finalidades diagnósticas - antes utilizadas apenas como ferramentas de pesquisa, neste cenário destaca-se a aplicação clínica do sequenciamento do exoma. A proposta deste trabalho é avaliar a aplicabilidade, o rendimento diagnóstico e a custo-efetividade do sequenciamento do exoma na investigação diagnóstica de diferentes condições determinadas geneticamente, no âmbito do sistema público de saúde e em conformidade com a Política Nacional de Gestão de Tecnologias em Saúde, além de conhecer a opinião de pacientes, familiares, estudantes e profissionais de saúde a respeito de questões relacionadas à aplicação da genômica na prática clínica. Frente a esta perspectiva, após aconselhamento genético pré-teste, foi sequenciado o exoma de 71 indivíduos sem diagnóstico etiológico estabelecido, com rendimento diagnóstico variando entre 35% e 55,1%, na dependência do quadro clínico apresentado pelo grupo de pacientes. Foram reportados achados incidentais relacionados a risco cardiovascular aumentado em 2 casos (4,08%). O inquérito composto pela opinião de 57 profissionais e estudantes de saúde revelou que a maioria deles acredita que a busca por achados secundários passíveis de uma intervenção médica deve ser oferecida aos pacientes, além de concordar em partilhar os resultados de teste genômicos em bancos de dados públicos. Foi elaborado parecer técnico-científico contendo estudo de custo-efetividade que comparou o uso do exoma como teste diagnóstico de primeira linha para investigação diagnóstica de déficit intelectual sem causa determinada versus a hibridização genômica em arrays como primeiro exame, a comparação mostra uma economia de R$ 130,04 por caso diagnosticado com o uso inicial do exoma, considerando um modelo de árvore de decisão simples com dois braços (exoma + array X array + exoma), as análises de sensibilidade que variam o custo dos exames e o rendimento diagnóstico dos mesmos confirmam que nenhuma das duas tecnologias isoladamente é dominante sobre a outra. O parecer técnico-científico foi submetido à CONITEC, com recomendação favorável ao uso diagnóstico do exoma para deficiência intelectual de causa indeterminada, que culminou com a incorporação da tecnologia no SUS Abstract: Increasing health care spending worldwide has been a concern of health-care officials, health professionals, and patients. The incorporation of new technologies for diagnostic tests is only one of the causal factors of this phenomenon, leading to a significant increase in health care spending. However, this increased budget for health care systems alone does not necessarily represent diagnostic or therapeutic improvements. Thus, health technology assessment studies, including cost-effectiveness analysis, have emerged to promote the rational use of available resources. In genomic medicine, next-generation sequencing reduced sequencing costs and expanded genomic approaches for diagnostic purposes, especially the clinical applications of whole-exome sequencing, which was previously used only as a research tool. This study aims to evaluate exome sequencing as diagnostic testing for different genetically determined conditions in the context of the Brazilian public healthcare system and under the National Policy on Health Technology Management, in addition to know the opinion of patients, family members, students and health professionals regarding issues related to the application of genomics in clinical practice. Whole-exome sequencing was performed in 71 individuals without established etiological diagnosis resulting in an overall diagnostic yield ranging from 35% to 55.1%, depending on the clinical presentation of patients. There were also incidental findings related to increased cardiovascular risk found in 2 patients (4.08%). Furthermore, a survey of the opinion of 57 health professionals and students revealed that most of them agree with the search and the report of incidental findings in medically actionable genes in the context of molecular testing applied to the clinical practice. They also agree with genomic data sharing in public databases. Finally, a technical-scientific report was prepared, containing a cost-effectiveness study that compared the use of whole-exome sequencing as a first-line diagnostic test to investigate intellectual disability versus chromosomal microarray as the first testing. The comparison shows an economy of R$ 130.04 per diagnosed patient when whole-exome sequencing is used first. However, sensitivity analyses, evaluating genetic testing costs and diagnostic yield of these tests indicate that both technologies are comparable. The technical-scientific report, with a favorable recommendation for the diagnostic use of exome sequencing for intellectual disability, culminated in the incorporation of the new technology into the Brazilian public health system – SUS Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2013/07559-3

Orientadores: Andréa Trevas Maciel Guerra, Mara Sanches Guaragna Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: O distúrbio da diferenciação sexual ovariotesticular (DDS-OT) é uma afecção rara definida pela presença de tecido ovariano e testicular no mesmo indivíduo. Nos pacientes com DDS-OT 46,XX e ausência do gene SRY acredita-se que a diferenciação de tecido testicular ocorra por mutação em um dos genes envolvidos na diferenciação gonadal, como descrito recentemente em relação ao gene NR5A1. Com o avanço das tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, tal como a abordagem de sequenciamento de exoma, é possível a investigação do genoma humano em busca de variantes patogênicas e/ou genes candidatos, o que auxilia no estudo de condições geneticamente heterogêneas e com etiologia indefinida, como é o caso dos DDS-OT 46,XX. Objetivos: Investigar a origem do DDS-OT 46,XX SRY-negativo em pacientes de um único serviço com essa condição, em busca de variantes patogênicas do gene NR5A1 ou de variantes raras que permitam identificar novos genes envolvidos na origem dessa afecção. Método: Foi realizado sequenciamento do gene NR5A1 em sete pacientes com DDS-OT 46,XX SRY-negativo e, posteriormente, sequenciamento de exoma em dois pacientes que apresentam recorrência familiar de DDS 46,XX (famílias 1 e 2). Resultados e Discussão: O sequenciamento do NR5A1 não detectou variantes patogênicas nem potencialmente patogênicas. O estudo do exoma também não detectou variantes patogênicas ou provavelmente patogênicas. Na família 1 foram encontradas variantes de significado incerto em HHAT e USP44; na família 2, foram encontradas variantes de significado incerto em CBX2, CCN2, POU6F2 e INSRR. Desses, destacam-se HHAT, pelo resultado de estudos em animais, e principalmente CBX2, que tem papel bem estabelecido no processo de diferenciação gonadal e já foi associado a casos de DDS. Conclusões: Variantes patogênicas no NR5A1 não são causa de DDS-OT 46,XX SRY-negativo em nossa amostra, e o estudo do exoma não permitiu que se chegasse a um diagnóstico etiológico. Apesar disso, as variantes encontradas podem ter contribuído para o fenótipo de forma oligogênica. A etiologia dessa condição permanece indefinida, exigindo reanálise futura dos dados obtidos e o emprego de novas abordagens genômicas Abstract: Introduction: Ovotesticular Disorder of Sex Development (OT-DSD) is a rare condition defined by the presence of ovarian and testicular tissue in the same individual. In patients with 46,XX OT-DSD and absence of the SRY gene, it is believed that testicular tissue differentiation occurs by variants in one of the genes involved in gonadal differentiation, such as NR5A1. With the advancement of high-throughput sequencing technologies, such as the exome sequencing approach, it is possible to investigate the human genome in search for pathogenic variants and/or candidate genes, which aids in the study of genetically heterogeneous conditions and those with undefined etiology, such as 46,XX OT-DSD. Objectives: To investigate the origin of SRY-negative 46,XX OT-DSD in patients from a single service, searching for pathogenic variants in NR5A1 or rare variants that allow the identification of new genes involved in the origin of this condition. Methods: NR5A1 gene sequencing was performed in seven patients with SRY-negative 46,XX OT-DSD, followed by exome sequencing of two patients that presented familial recurrence of 46,XX DSD (families 1 and 2). Results and Discussion: NR5A1 sequencing did not detect pathogenic or probably pathogenic variants. The study of the exome also did not detect pathogenic or probably pathogenic variants. In family 1, variants of uncertain significance were found in HHAT and USP44,; in family 2, variants of uncertain significance were found in CBX2, CCN2, POU6F2 and INSRR. Of these, HHAT stands out, due to the results of studies in animals, and especially CBX2, which has a well-established role in the process of gonadal differentiation and has already been associated with cases of DSD. Conclusion: Pathogenic variants in NR5A1 are not the cause of SRY-negative 46,XX OT-DSD in our sample, and the study of the exome did not allow us to reach an etiological diagnosis. Nevertheless, the variants found may have contributed to the phenotype in an oligogenic way. The etiology of this condition remains undefined, requiring future reanalysis of the data obtained and the use of new genomic approaches Doutorado Saúde da Criança e do Adolescente Doutora em Ciências CAPES 001 FAPESP 2019/26382-3

Traballo Fin de Grao en Medicina. Curso 2019-2020 Antecedentes: Los trastornos del espectro autista, TEA (en inglés ASD, “Autism Spectrum Disorders”) son trastornos del neurodesarrollo (TND) caracterizados por déficits en la comunicación social, intereses restringidos y comportamientos repetitivos. Los TEA son TND complejos, en los que el ambiente y la genética son claves en su patogénesis. El componente genético de los TEA se estima en torno a un 80%. Aunque la variación común es la que juega un papel más relevante, la variación rara (MAF

A José Antonio López Escamez, por la revisión crítica de este ma- nuscrito. Este Trabajo forma parte del Trabajo fin de Master de Ingeniería Titular y Terapias Avanzadas de Iván Morales Esquina., Introducción: La hipoacusia es una de las alteraciones sensoriales más frecuentes, afectando aproximadamente a uno de cada 500 nacimientos, y pudiendo producirse a cualquier edad en individuos sanos. Gracias a las técnicas de secuenciación masiva, como el análisis del exoma completo, y al uso de estrictos protocolos de filtrado de variantes, se han identificado más de 100 loci relacionados con la hipoacusia no sindrómica. El objetivo de este estudio es diseñar un protocolo para la identificación de las secuencias nucleotídicas de baja cobertura a partir de datos de secuenciación de exoma, particularmente en los genes causales de hipoacusia no sindrómica autosómica dominante. Materiales y métodos: Cincuenta y cinco individuos (15 pacientes con enfermedad de Meniere y 40 controles) fueron seleccionados para llevar a cabo un análisis genómico mediante secuenciación de exoma completo. Los exones de los genes asociados a hipoacusia no sindrómica autosómica dominante de estas 55 muestras fueron analizados mediante el software Integrati ve Genome Viewer. Los datos de cobertura se contrastaron con las bases de datos de secuencias de exoma y genoma actuales. Finalmente, se simularon las estructuras primaria y secundaria de las secuencias implicadas con la herramienta bioinformática "mfold". Resultados: Trece de los 34 genes de hipoacusia no sindrómica autosómica dominante presentaron una baja cobertura. Veinte de las 24 secuencias exónicas con baja cobertura presentaban un contenido de GC más elevado del considerado como óptimo, y todas ellas contenían, al menos, una estructura secundaria. Los genes con un mayor número de exones con baja cobertura son MYH14, WFS1 y P2RX2. Conclusiones: 1. La secuenciación del exoma humano muestra que muchos de los genes de hipoacusia autosómica no sindrómica dominante presentan baja cobertura en algunos de sus exones. 2. El análisis del contenido de guaninas y citosinas, y la presencia de estructuras secundarias determinan secuencias específicas con problemas de lectura. 3. Es necesario validar los resultados obtenidos por la Secuenciación de Nueva Generación para evitar posibles falsos positivos., Introduction: Hearing loss is one of the most frequent sensory alterations, affecting approximately one in 500 births, and it may occur de novo at any age in healthy individuals. Thanks to massive sequencing techniques, such as whole exome sequencing, and the use of strict variant filtering protocols, more than 100 loci related to non-syndromic hearing loss have been identified. The aim of this study is to design a protocol for the identification of low coverage nucleoti de sequences from exome sequencing data, particularly in the genes responsible for non-syndromic autosomal dominant hearing loss. Materials y methods: Fifty-five individuals (15 cases with Meniere’s disease and 40 controls) were selected to perform a genomic analysis by whole exome sequencing. The exons of the genes related to non-syndromic autosomal dominant hearing loss of the whole sample were analyzed with Integrative Genome Viewer. The coverage was evaluated with the current genomic and exomic databases. Finally, we simulated the primary and secondary structures of the sequences involved with the "mfold" bioinformatic tool. Results: Thirteen from the 34 genes involved in no syndromic autosomal dominant hearing loss had low coverage. Twenty from the 24 exonic sequences with low coverage had higher percentage of GC content than the optimal and all of them had one or more secondary structures. Genes with more exons with low coverage were: MYH14, WFS1 and P2RX2. Conclusions: 1. Whole Exome Sequencing shows that most of the non-syndromic autosomal dominant hearing loss genes had low coverage in some exons. 2. The analysis of the guanines and cytosines content, and the presence of secondary structures have determined specific sequences with read problems. 3. The results of Next Generation Sequencing must be validated to avoid possible false positives.

Situs inversus totalis is a rare recessive autosomal congenital abnormality in which the mediastinal and abdominal organs are in a mirrored position when compared to the usual topography. The literature reports some cases of situs inversus totalis and concomitant conditions: spinal abnormalities, cardiac malformations and hematological diseases, such as idiopathic thrombocytopenic purpura, which is an autoimmune disease that causes thrombocytopenia due to platelet destruction or suppression of its production. This article aimed to report the coexistence of situs inversus totalis and idiopathic thrombocytopenic purpura. RESUMO Situs inversus totalis é uma anormalidade congênita autossômica recessiva rara em que os órgãos mediastinais e abdominais encontram-se em posição espelhada em relação à topografia habitual. A literatura relata alguns casos de concomitância do situs inversus totalis com outras condições: anomalias espinhais, malformações cardíacas e doenças hematológicas, como púrpura trombocitopênica idiopática, que é uma doença autoimune com plaquetopenia, devido à destruição dos trombócitos ou supressão da sua produção. Esse artigo teve o objetivo de relatar coexistência de situs inversus totalis e púrpura trombocitopênica idiopática.

Introducción: La enfermedad de Meniere (EM) es una enfermedad rara del oído interno caracterizada por hipoacusia neurosensorial, vértigo episódico, y tinnitus. Aunque la mayoría de los casos de esta enfermedad son esporádicos, en el 6 al 9% de estos pacientes presentan agregación familiar, lo que sugiere una contribución genética en la EM. La EM es una enfermedad compleja, con una gran variabilidad en el fenotipo que se ve acompañada de heterogeneidad genética. Hasta la fecha, solo se han descrito variantes en familias individuales, no encontrándose replicación entre familias no relacionadas. Objetivos: Identificar los principales genes implicados en la EM familiar mediante secuenciación de exoma completo, así como demostrar un efecto agregado de variantes en determinados genes. Así mismo, se identificarán las principales rutas metabólicas implicadas y los resultados serán comparados con una serie de pacientes con EM esporádica. Métodos: Un total de 138 casos con EM (94 pacientes con EM familiar y 44 con EM esporádica) diagnosticados de acuerdo con los criterios definido por la Barany Society fueron seleccionados y secuenciados con el objetivo de buscar variantes raras. Las frecuencias alélicas de las variantes identificadas fueron anotadas para llevar a cabo análisis uni y multivariante. Las frecuencias alélicas en nuestro grupo de pacientes fueron comparadas con las frecuencias encontradas en bases de datos de referencia europeas y españolas. Se llevaron a cabo análisis de sobrerrepresentación para obtener las principales rutas y procesos biológicos afectados. Resultados: En un primer abordaje del trasfondo genético de la EM, se pudo observar que el 40% de los casos familiares y el 68% de los casos esporádicos portaban una variante nueva o ultrarara en un gen ya relacionado con hipoacusia neurosensorial. Analizando estos genes, identificamos un enriquecimiento de variantes en algunos de ellos, destacando sobre los demás el gen que codifica la proteína otogelina, OTOG. Se encontraron un total de 10 variantes en 15 familias no relacionadas. Estudiando la clínica de estos pacientes, se observó que podrían conformar un endofenotipo, caracterizado por hipoacusia pantonal con poca progresión. Finalmente, se llevó a cabo un análisis más general, incluyendo todos los genes codificantes. Los resultados de este análisis sugieren que existe una contribución poligénica y/o polialélica en la EM, siendo diferentes los genes involucrados en la forma familiar y esporádica. Basados en los resultados de estos análisis, se pudo determinar mediante un análisis de sobrerrepresentación que rutas como la guía de señalización axonal podría ser importantes en el desarrollo de la enfermedad. Conclusiones: En esta tesis doctoral se han definido los posibles principales genes y rutas candidatas para la EM familiar, encontrando a su vez una estructura genética diferente a la EM esporádica. Estos resultados podrían ser la base para futuros estudios genéticos y funcionales en la EM. Introduction: Meniere’s disease (MD) is a rare inner ear disorder characterized by sensorineural hearing loss, episodic vertigo and tinnitus. Although most of MD patients are sporadic, familial aggregation is observed in 6-9% of these patients, suggesting a genetic contribution in MD. MD is a complex disease, showing phenotypic heterogeneity as well as genetic heterogeneity. To date, only variants in single families have been associated to familial MD, finding no replication in non-related families. Objectives: To identify the main genes involved in familial MD by whole exome sequencing, and to demonstrate an aggregate effect of variants in certain genes. Furthermore, the main biological processes and pathways will be analyzed, and the results will be compared with sporadic MD patients. Methods: A total of 138 MD patients (94 familial MD patients and 44 sporadic MD patients) diagnosed according to the criteria defined by the Barany Society were recruited and sequenced to look for rare variants. Minor allelic frequencies of identified variants were annotated to undertake a single rare variant and a gene burden analyses. Allelic frequencies were compared with the frequencies from European and Spanish reference datasets. Over-representation analyses were done to identify the main biological processes and pathways. Results: In a first approach of the genetic MD background, we identified that 40% of familial MD patients and 68% of sporadic MD patients carried, at least, a novel or ultrarare variant in a gene linked to sensorineural hearing loss. Analyzing these genes, enrichment of rare variants were identified in some of them, standing out the gene which encodes otogelin, OTOG. Ten variants were found in 15 nonrelated families. Studying the clinical information of these patients, an endophenotype characterized by flat hearing loss with no progression was observed. Finally, we analyzed all the genes within the human genome. The results obtained from this analysis suggest a polygenic and/or a polyallelic contributions in MD, being different the genes involved in familial and sporadic MD. Based on these results, pathways such as axon guidance were identified throughout an over-representation analysis as key pathways in MD. Conclusions: In this doctorate thesis, the main potential genes and pathways for familial MD have been defined, finding a differential genetic background between sporadic and familial MD. These results could be the basis for future genetic and functional studies on MD. Tesis Univ. Granada. Funded by the Luxembourg National Research Fund INTER/Mobility/17/11772209 Grant Supported by ASMES (Asociación Sindrome de Meniere España)

Las técnicas de Secuenciación de nueva generación (NGS) y la hibridación genómica comparativa con microarrays (a-CGH) permiten el estudio de las anomalías cromosómicas. Su utilidad en la aproximación diagnóstica de los pacientes con retraso global del desarrollo, alteraciones dismorfólogicas, alteraciones en talla, peso y neoplasias es importante. Sin embargo, no han sido estudiadas en poblaciones colombianas en centros de salud periféricos. Por lo anterior, se realizó un estudio observacional descriptivo y retrospectivo transversal de serie de casos, con 208 pacientes que asistieron a la consulta médica de genética del Hospital Universitario Hernando Moncaleano Perdomo de la ciudad de Neiva (Huila), el cual tuvo como objetivo principal evaluar el rendimiento diagnóstico de las NGS y la aCGH; el uso de estas técnicas permitió la identificación de patologías que no fueron detectadas mediante ejercicio clínico, u otro tipo de exámenes de apoyo, incluyendo técnicas de citogenética clásica, arrojando en conjunto un rendimiento diagnóstico del 44% en la población estudiada. De esta manera, se evidencio que estos exámenes moleculares son efectivos en la aproximación diagnóstica etiológica de pacientes con enfermedades de base genética y deben ser utilizados como técnicas de primera línea en los casos indicados. New generation sequencing techniques (NGS) and comparative genomic hybridization with microarrays (a-CGH) allow the study of chromosomal abnormalities. Its utility in the diagnostic approach of patients with global developmental delay, dysmorphological alterations, alterations in height, weight, and malignancies is important. However, we have not been studied in Colombian populations in peripheral health centers. Therefore, an observational descriptive and retrospective cross-sectional study of case series was carried out was carried out with 208 patients who attended the genetic consultation at the Hernando Moncaleano Perdomo University Hospital in the city of Neiva (Huila), whose main objective was to evaluate the diagnostic performance of the NGS and the a-CGH; The use of these techniques allowed the identification of pathologies that were not detected through clinical exercise, or other types of support exams, including classical cytogenetic techniques, together yielding a diagnostic yield of 44% in the study population. In this way, it is evident that these molecular exams are effective in the etiological diagnostic approach of patients with genetically based diseases and should be used as first-line techniques in the indicated cases.

Introducción: La enfermedad de Meniere (EM) es una enfermedad rara del oído interno caracterizada por hipoacusia neurosensorial, vértigo episódico, y tinnitus. Aunque la mayoría de los casos de esta enfermedad son esporádicos, en el 6 al 9% de estos pacientes presentan agregación familiar, lo que sugiere una contribución genética en la EM. La EM es una enfermedad compleja, con una gran variabilidad en el fenotipo que se ve acompañada de heterogeneidad genética. Hasta la fecha, solo se han descrito variantes en familias individuales, no encontrándose replicación entre familias no relacionadas. Objetivos: Identificar los principales genes implicados en la EM familiar mediante secuenciación de exoma completo, así como demostrar un efecto agregado de variantes en determinados genes. Así mismo, se identificarán las principales rutas metabólicas implicadas y los resultados serán comparados con una serie de pacientes con EM esporádica. Métodos: Un total de 138 casos con EM (94 pacientes con EM familiar y 44 con EM esporádica) diagnosticados de acuerdo con los criterios definido por la Barany Society fueron seleccionados y secuenciados con el objetivo de buscar variantes raras. Las frecuencias alélicas de las variantes identificadas fueron anotadas para llevar a cabo análisis uni y multivariante. Las frecuencias alélicas en nuestro grupo de pacientes fueron comparadas con las frecuencias encontradas en bases de datos de referencia europeas y españolas. Se llevaron a cabo análisis de sobrerrepresentación para obtener las principales rutas y procesos biológicos afectados. Resultados: En un primer abordaje del trasfondo genético de la EM, se pudo observar que el 40% de los casos familiares y el 68% de los casos esporádicos portaban una variante nueva o ultrarara en un gen ya relacionado con hipoacusia neurosensorial. Analizando estos genes, identificamos un enriquecimiento de variantes en algunos de ellos, destacando sobre los demás el gen que codifica la proteína otogelina, OTOG. Se encontraron un total de 10 variantes en 15 familias no relacionadas. Estudiando la clínica de estos pacientes, se observó que podrían conformar un endofenotipo, caracterizado por hipoacusia pantonal con poca progresión. Finalmente, se llevó a cabo un análisis más general, incluyendo todos los genes codificantes. Los resultados de este análisis sugieren que existe una contribución poligénica y/o polialélica en la EM, siendo diferentes los genes involucrados en la forma familiar y esporádica. Basados en los resultados de estos análisis, se pudo determinar mediante un análisis de sobrerrepresentación que rutas como la guía de señalización axonal podría ser importantes en el desarrollo de la enfermedad. Conclusiones: En esta tesis doctoral se han definido los posibles principales genes y rutas candidatas para la EM familiar, encontrando a su vez una estructura genética diferente a la EM esporádica. Estos resultados podrían ser la base para futuros estudios genéticos y funcionales en la EM., Introduction: Meniere’s disease (MD) is a rare inner ear disorder characterized by sensorineural hearing loss, episodic vertigo and tinnitus. Although most of MD patients are sporadic, familial aggregation is observed in 6-9% of these patients, suggesting a genetic contribution in MD. MD is a complex disease, showing phenotypic heterogeneity as well as genetic heterogeneity. To date, only variants in single families have been associated to familial MD, finding no replication in non-related families. Objectives: To identify the main genes involved in familial MD by whole exome sequencing, and to demonstrate an aggregate effect of variants in certain genes. Furthermore, the main biological processes and pathways will be analyzed, and the results will be compared with sporadic MD patients. Methods: A total of 138 MD patients (94 familial MD patients and 44 sporadic MD patients) diagnosed according to the criteria defined by the Barany Society were recruited and sequenced to look for rare variants. Minor allelic frequencies of identified variants were annotated to undertake a single rare variant and a gene burden analyses. Allelic frequencies were compared with the frequencies from European and Spanish reference datasets. Over-representation analyses were done to identify the main biological processes and pathways. Results: In a first approach of the genetic MD background, we identified that 40% of familial MD patients and 68% of sporadic MD patients carried, at least, a novel or ultrarare variant in a gene linked to sensorineural hearing loss. Analyzing these genes, enrichment of rare variants were identified in some of them, standing out the gene which encodes otogelin, OTOG. Ten variants were found in 15 nonrelated families. Studying the clinical information of these patients, an endophenotype characterized by flat hearing loss with no progression was observed. Finally, we analyzed all the genes within the human genome. The results obtained from this analysis suggest a polygenic and/or a polyallelic contributions in MD, being different the genes involved in familial and sporadic MD. Based on these results, pathways such as axon guidance were identified throughout an over-representation analysis as key pathways in MD. Conclusions: In this doctorate thesis, the main potential genes and pathways for familial MD have been defined, finding a differential genetic background between sporadic and familial MD. These results could be the basis for future genetic and functional studies on MD., Tesis Univ. Granada., Funded by the Luxembourg National Research Fund INTER/Mobility/17/11772209 Grant, Supported by ASMES (Asociación Sindrome de Meniere España)

Situs inversus totalis is a rare recessive autosomal congenital abnormality in which the mediastinal and abdominal organs are in a mirrored position when compared to the usual topography. The literature reports some cases of situs inversus totalis and concomitant conditions: spinal abnormalities, cardiac malformations and hematological diseases, such as idiopathic thrombocytopenic purpura, which is an autoimmune disease that causes thrombocytopenia due to platelet destruction or suppression of its production. This article aimed to report the coexistence of situs inversus totalis and idiopathic thrombocytopenic purpura.

[ES] Las ENACH o NBIA (Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation) comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades hereditarias que suelen presentar depósitos de hierro en el cerebro, principalmente en los ganglios basales. Se trata de enfermedades raras con una prevalencia de 1/1.000.000. Hasta la fecha se conocen 12 genes NBIA, aunque un número relevante de pacientes permanece sin diagnóstico genético. Alrededor del 35-50% de pacientes NBIA padecen PKAN (Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration, gen PANK2). La segunda forma más frecuente es PLAN (PhosphoLipase A2 Associated Neurodegeneration, gen PLA2G6) que responde a aproximadamente el 20% de los pacientes NBIA. El resto de formas son poco frecuentes. El avance de estas enfermedades es devastador e incluye dificultades progresivas en el habla, disfagia, distonía, espasticidad, parkinsonismo, acinesia pura, disfunción oculomotora, pérdida de visión y síntomas neuropsiquiátricos. Los pacientes precisan de la atención de un equipo multidisciplinario y reciben un tratamiento paliativo que se centra principalmente en reducir la distonía y la espasticidad que son altamente discapacitantes. En 2015 iniciamos un proyecto financiado por la Fundació La Marató de la TV3 coordinado por la Dra. B. Pérez-Dueñas (H.U. Vall d'Hebron) para la elaboración de una escala clínica para pacientes PKAN y el diagnóstico genético de la población española NBIA con la colaboración de más de 20 hospitales españoles. Algunos de los clínicos que forman parte de esta red, forman parte del equipo de investigación del presente proyecto. La escala clínica PKAN-DSR (PKAN Disease Rating Scale) ha sido ya validada con éxito en la evaluación clínica de nuestra serie16. Actualmente tenemos censados 134 casos NBIA o NBIA-mimic, que refiere a aquellas formas que no cursan estrictamente con el cuadro clínico característico de estos pacientes. El análisis genético de PANK2 y PLA2G6 mediante secuenciación Sanger y MLPA nos ha permitido diagnosticar el 54% de los casos. Los pacientes que resultan negativos para estos análisis son analizados mediante un panel diseñado con tecnología SureSelectXT (Agilent) para MiSeq (Illumina), que comprende 498 genes implicados en NBIA y otros trastornos del movimiento (MovDisord-498). Hemos analizado con esta metodología 38 pacientes y de momento, hemos logrado el diagnóstico genético en 19 de ellos. Los resultados genéticos han revelado que el espectro clínico es más amplio del conocido hasta ahora. Un ejemplo de todo ello es la paciente NBIA-18. Se trata de una niña de padres consanguíneos en quien hemos detectado dos cambios en homozigosis en dos genes: DLD y FBXO7. Hemos llevado a cabo estudios de expresión (western-blot), de Nonsense Mediated Decay (NMD) y de localización sub-celular en fibroblastos. Éstos han revelado que la mutación FBXO7 c.368C>G (p.S123X) conduce a la activación del mecanismo NMD y el mRNA es degradado; y que la mutación DLD c.100A>G (p.T34A) impide que la proteína alcance su localización correcta en la mitocondria. Los casos que son negativos tras su estudio mediante el panel MovDisord-498 son estudiados mediante secuenciación de exoma (WES, Whole Exome Sequencing). Está descrito que aproximadamente el 85% de las mutaciones patológicas se localizan en los exones. Por ello, pese a que la WES sólo supone la secuenciación de alrededor del 2% del genoma humano, se ha demostrado que es una herramienta coste-efectiva interesante para el diagnóstico genético. En el caso de enfermedades pediátricas del neurodesarrollo, estudios comparativos has mostrado que cuando sólo se aplica WES a la muestra del probando, la tasa de éxito ronda el 28%, mientras que si se amplía el estudio a los padres (trío) ésta aumenta un 38%. Es importante recalcar que la mayoría de casos son esporádicos y por tanto, es de esperar mutaciones de novo o bien, mutaciones con una herencia autosómica r, [EN] The disorders with NBIA (Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation) comprise a heterogeneous group of hereditary diseases which are characterized by the presence of iron deposits in the brain, mainly in the basal ganglia. These diseases are rare, with a prevalence of 1/1.000.000. So far, 12 genes causing NBIA diseases have been described, but there is a relevant number of patients lacking a genetic diagnostic. Around 35-50% of NBIA patients suffer from PKAN (Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration, PANK2 gene). The second most frequent form is PLAN (PhosphoLipase A2 Associated Neurodegeneration, PLA2G6 gene), present in approximately 20% of the NBIA patients. The rest of the forms are rare. The progress of these diseases is devastating and includes progressive difficulties in speaking, dysphagia, dystonia, spasticity, parkinsonism, pure akinesia, oculomotor dysfunction, loss of vision and neuropsychiatric symptoms. Patients require the attention of a multidisciplinary team and they receive palliative treatment that is primarily focused on reducing dystonia and spasticity, which are highly disabling. In 2015, we initiated a project funded by Foundation La Marató of TV3, which is coordinated by Dr. B. Pérez-Dueñas (HU Vall d'Hebron). The aim of the project is to develop a clinical scale for PKAN patients, and to genetically diagnose the Spanish NBIA population with the collaboration of more than 20 Spanish hospitals. Some of the clinicians who are part of this network are part of the research team of this project. The PKAN-DSR clinical scale (PKAN Disease Rating Scale) has been successfully validated in the clinical evaluation of our series. Currently, we have registered 134 NBIA or NBIA-mimic cases, which refer to those forms of the disease that do not strictly show the clinical picture characteristic of these patients. The genetic analysis of PANK2 and PLA2G6 by Sanger sequencing and MLPA allowed us to diagnose 54% of the cases. Patients, who are negative for these analyses, are studied by means of a panel designed with the technology SureSelectXT (Agilent) for MiSeq (Illumina), which comprises 498 genes involved in NBIA and other movement disorders (MovDisord-498). 38 patients have been analysed with this methodology and so far, 19 of them have been genetically diagnosed. An example of this is the patient NBIA-18, a girl with consanguineous parents. Two homozygotic changes have been detected in two genes: DLD and FBXO7. We carried out studies of expression (western-blot), nonsense mediated decay (NMD) and subcellular localization in fibroblasts. These revealed that the FBXO7 c.368C>G mutation (p.S123X) leads to the activation of the NMD mechanism and mRNA is degraded; and that the DLD c.100A>G mutation (p.T34A) prevents the protein from reaching its correct location in the mitochondria. Negative cases after their study using the MovDisord-498 panel are studied by whole exome sequencing (WES). Approximately 85% of the pathological mutations are located in the exons. Therefore, although WES comprises approximately 2% of the human genome, it is an interesting cost-effective tool for genetic diagnosis. In pediatric neurodevelopmental diseases, comparative studies have shown that when WES is applied only to the proband sample, the success rate is around 28%, while if the study is extended to the parents (trio) the yield increases to 38%. It is important to emphasize that most cases are sporadic and, therefore, de novo mutations or mutations with an autosomal recessive inheritance are expected. We have studied two NBIA families (in both cases trios) with WES, and we have identified a novel gene not associated with any human pathology to date, and the second case of PLEKHG2 involved in leukodystrophy and acquired microcephaly with or without dystonia (MIM 616763). Undoubtedly, WES allows the characterization of new genes and new mutations in known genes, which permits a better characterization of the cl

Trabajo de fin de máster en Bioinformática y Biología Computacional, Desde la secuenciación del primer genoma humano, el desarrollo de nuevas técnicas de secuenciación ha crecido exponencialmente, bajando los costes de esta por debajo de los mil dólares. Actualmente, en el ámbito del diagnóstico clínico se utilizan tecnologías de segunda generación para secuenciar regiones determinadas del genoma, ya sea la totalidad de los genes (exoma) o un conjunto de ellos (panel de genes). La secuenciación de regiones concretas del genoma se conoce como secuenciación masiva dirigida. Esta técnica incluye, entre otras, una etapa de captura y enriquecimiento de las regiones a secuenciar, cuya efi ciencia condicionará el resultado final de la secuenciación. Por ello, son necesarias herramientas de software que evalúen la efi ciencia y la ausencia de sesgo en el proceso de enriquecimiento, actuando como control de calidad antes de continuar con el análisis de los datos obtenidos. Hoy en día existen varias herramientas que permiten realizar este control de calidad, entre las que destaca ngsCAT (Next Generation Sequencing data Capture Assessment Tool). A pesar de ser una herramienta muy extendida en la comunidad científica), presenta limitaciones en cuanto a su arquitectura, tecnología usada, instalación y representación de los datos. Por tanto, en este trabajo se ha desarrollado una versión llamada ngsCAT2, la cual suple las carencias que presentaba su predecesora. Esto se ha conseguido gracias a una nueva arquitectura, al uso de Python3, el empleo de gr a cas interactivas, la adici on de nuevas funcionalidades y la publicaci on en plataformas colaborativas. Con ello, se ha conseguido una herramienta más completa, exible y sencilla de desarrollar, facilitando su utilización por parte de usuarios inexpertos que deseen evaluar el proceso de captura de sus experimentos de secuenciación dirigida, y a desarrolladores que deseen ampliar la herramienta. Todas estas nuevas características permiten un aumento del soporte del software, ampliando su uso y permanencia en la comunidad científi ca.

IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES GENÉTICAS RELACIONADAS CON DIABETES MELLITUS TIPO 2 EN POBLACIÓN ESPAÑOLA. INTRODUCCIÓN: La DM2 es una enfermedad metabólica multifactorial compleja en la que participan tanto factores ambientales como genéticos. Numerosos estudios han demostrado que la influencia de la genética en el riesgo de padecer DM2 es significativa. La heredabilidad estimada puede variar entre un 25% al 80% dependiendo de la población de estudio y de la herencia familiar. Sin embargo, las variantes encontradas hasta el momento, que tienen valores de Frecuencia del Alelo Minoritario (MAF) > 0.05, solo explican una pequeña parte del riesgo de padecer DM2, sobre un 15%, el resto aún está por identificar. La búsqueda de variantes poco comunes o con valores de MAF < 0.05 pueden tener un efecto funcional relevante y afectar al desarrollo de la enfermedad. Actualmente, gracias al rápido desarrollo de la tecnología, se pueden realizar estudios y análisis de secuenciación de exoma completo que permiten encontrar variantes poco frecuentes con mayor fiabilidad. OBJETIVOS: Identificar variantes genéticas en genes seleccionados de estudios previos, así como en muestras de exoma que puedan estar asociadas a DM2 en población española. Idear un flujo de análisis bioinformático fiable y automático para poder utilizar analizar los datos y que pueda ser utilizado en futuros proyectos. METODOLOGÍA: Parte 1: Estudio de 19 genes en una población compuesta por 588 casos de entre 30 y 65 años y 832 controles de los 50 y los 75 años de edad. Secuenciación de multiplexes de amplicones por técnicas NGS, Desarrollo de un flujo de análisis bioinformático y análisis estadístico de asociación posterior. Parte 2: Preparación de 119 genotecas de exoma caso/control, secuenciación por NGS y análisis bioinformático conjunto con 369 exomas caso/control extra disponibles, análisis descriptivo y estadístico de las variantes encontradas. RESULTADOS: Parte 1: En total se han encontrado 539 variantes en los 19 genes analizados de las cuales 11 de ellas, han sido estadísticamente significativas en la asociación con la DM2 en el estudio caso/control realizado. Parte 2: Se han encontrado en conjunto 12708 variantes genéticas en los 488 exomas analizados. De entre ellas, 49 variantes han resultado significativas en la asociación con DM2 dentro de la comparación caso/control analizada. CONCLUSIONES: En este trabajo se ha llevado a cabo la identificación de variantes genéticas relacionadas con la DM2 mediante estudios de exoma y validación de genes previamente identificados. Se ha diseñado y automatizado un flujo de análisis bioinformático para ser utilizado en futuros proyectos. Aun así, son necesarios otros estudios que puedan replicar estos u otros resultados en poblaciones de mayor tamaño, así como estudios funcionales.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2019. Os distúrbios do desenvolvimento são um grupo de doenças heterogêneas que incluem predominantemente deficiência intelectual e/ou distúrbios do espectro autista, afetando cerca de 2 a 3% da população mundial. A deficiência intelectual é caracterizada como uma doença do neurodesenvolvimento, que afeta diretamente duas habilidades do funcionamento adaptativo e pode estar associada ou não a outras alterações congênitas, sendo uma das razões mais frequentes para a procura de aconselhamento genético. Por muitos anos, o exame de cariótipo, a triagem de doenças metabólicas e o teste do X-frágil foram as técnicas recomendadas para a identificação de distúrbios do desenvolvimento neurológico, elucidando cerca de 40% dos casos. Mais recentemente, o sequenciamento total de exoma (WES) surge como a principal técnica para o diagnóstico e elucidação das causas genéticas de distúrbios do neurodesenvolvimento, permitindo a detecção de variantes raras em doenças mendelianas com heterogeneidade genética. O WES se tornou um dos recursos mais preciosos disponíveis para esclarecer uma desordem do neurodesenvolvimento que recorre em uma família, incluindo a identificação de genes até então desconhecidos para a desordem. De 2010 a 2018, diferentes abordagens da análise genética combinadas com o WES, além de possibilitar a identificação de novas mutações em genes já conhecidos de deficiência intelectual, levaram a descoberta de mais de 1000 novos genes relacionados à condição. O presente trabalho teve como objetivo investigar a causa de distúrbios do desenvolvimento em cinco famílias com casos recorrentes de deficiência intelectual, utilizando WES. Obtivemos um resultado conclusivo apenas para duas das famílias analisadas. Em uma destas famílias, com ao menos nove indivíduos afetados, identificamos uma mutação já descrita no gene MYCN, confirmando essa família como o primeiro caso da Síndrome de Feingold Tipo 1 (FGLDS1) no Brasil. Apresentamos aqui o detalhamento fenotípico incluindo aspectos cognitivos e comportamentais de familiares afetados por essa síndrome subdiagnosticada. Na outra família, onde cinco irmãos apresentam a síndrome de Bardet-Biedl (BBS), identificamos uma mutação que também havia sido encontrada anteriormente, no gene BBS9. Nesta família registramos o primeiro relato de um recém-nascido afetado por BBS e hidrocefalia congênita grave. Durante a investigação desta família, verificamos que as principais deleções e duplicações no gene BBS9, apresentadas como frequentes no banco de dados curado de uma coleção de variantes estruturais no genoma, o DGV, são artefatos, provavelmente devido à abordagem do uso do mapeamento de extremidades emparelhadas (paired-end mapping) para identificar variações estruturais em dados de sequenciamento de genoma completo que, ao que tudo indica, pode não fornecer resultados confiáveis quando envolve regiões flanqueadas por duplicações segmentares. Nas outras três famílias com dois ou mais indivíduos afetados por deficiência intelectual não sindrômica, ou cujas características fenotípicas eram pouco específicas, não foi possível identificar um gene causal, embora mais de um indivíduo de cada família tenha sido sequenciado pelo WES. É possível que as mutações causais tenham sido excluídas em nossos procedimentos de filtragem ou que os membros afetados destas famílias não tenham a mesma etiologia genética entre si, porém também é possível que as mutações causais não residam no exoma, mas em outras sequências do genoma como íntrons, regiões promotoras ou sequências reguladoras. Este trabalho revela as dificuldades de descobrir a mutação causal em desordens sem um fenótipo claramente definido, mesmo com a abordagem do uso de WES em casos familiares, principalmente se não envolver um gene já relacionado à condição. Abstract: Developmental disorders are a group of heterogeneous diseases that predominantly include intellectual disability and/or autism spectrum disorder, affecting around 2 to 3% of the world population. Intellectual disability is characterized as a neurodevelopmental disease which directly affects two skills of adaptive functioning and can be associated or not with other congenital alterations, being one of the most frequent reasons for seeking genetic counselling. For many years the karyotyping, the screening for metabolic diseases and fragile X-testing were the recommended techniques for the identification of intellectual disability, elucidating about 40% of the cases. More recently, whole exome sequencing (WES) emerges as the main technique for the diagnosis and elucidation of the genetic causes of neurodevelopmental disorders, allowing the detection of rare variants in mendelian diseases with genetic heterogeneity. WES is one of the most precious resources available for clarifying a recurrent mendelian neurodevelopmental disorder in a family, often leading to the identification of a hitherto unknown causal gene. From 2010 to 2018 different approaches to genetic analysis combined with WES helped researchers to discover new mutations in known intellectual disability genes and to uncover more than 1000 new genes related to the condition. The present work aimed to investigate the cause of developmental disorders in five families with recurring cases of intellectual disability, with the use of WES. We obtained a conclusive result for the two families with defined syndromic features. In one of these families, with at least nine affected individuals, we identified a previously described mutation in the gene MYCN, confirming this family as the first case of Feingold Syndrome Type 1 (FGLDS1) in Brazil. We describe the phenotype, including cognitive and behavioural aspects of family members affected by this underdiagnosed syndrome. In the other family, where five siblings present Bardet-Biedl syndrome (BBS), we identified a mutation that had also been registered previously in the BBS9 gene. In this family we record the first report of a newborn affected by BBS and severe congenital hydrocephalus. During the investigation of this family, we verified that major deletions and duplications in the BBS9 gene, presented as frequent in the Database of Genomic Variants (DGV), a curated collection of structural variation in the human genome, are artifacts, probably due to the approach of using paired-end mapping to identify structural variation in whole genome sequencing data which, as it seems, may not deliver reliable results for regions that are flanked by segmental duplications. In the other three families, which had non-syndromic or not less specific syndromic features, we could not identify the causal gene for their neurodevelopmental disorder, although more than one individual of each family was sequenced by WES. It is possible that the causal mutations have been excluded in our filtering procedures or that the members of these families do not have the same genetic etiology, but it is also possible that the causal mutations do not reside in the exome, but in other sequences of the genome like introns, promoter regions or regulatory sequences. This work reveals the difficulties of uncovering a causal mutation in disorders without a clearly defined phenotype, even with the approach of the use of WES in family cases, especially if it does not involve a gene already known to be related to the condition.

CAPÍTULO 1: “De la clínica a la mutación: Bases genéticas de neuropatías periféricas hereditarias” Las neuropatías periféricas hereditarias comprenden un grupo heterogéneo de enfermedades monogénicas degenerativas que afectan al sistema nervioso periférico y están producidas por mutaciones en más de 100 genes. El descubrimiento de nuevos genes y/o mutaciones es de vital importancia para comprender el mecanismo de enfermedad y con ello, lograr el desarrollo de estrategias terapéuticas. Mediante secuenciación de exoma, se han investigado las bases genéticas en cinco familias y hemos establecido la mutación causal en dos de ellas, atribuyendo un nuevo fenotipo clínico al gen KCNA1 y asociando por primera vez el gen CADM4 con enfermedad humana. En línea con esto, el desarrollo de ensayos experimentales es indispensable para confirmar o descartar el posible papel patológico de nuevas mutaciones. Hemos demostrado mediante estudios in vitro de fibroblastos de paciente, que la mutación novel c.629C>T (p.F210S) en el gen AIFM1, se asocia por primera vez a un fenotipo clínico de neuropatía herediataria motora distal con inicio en la infancia, concluyendo que las células presentan una expresión disminuida de la proteína AIF, una morfología celular anómala y una red mitocondrial fragmentada. Adicionalmente, el estudio del impacto patológico causado por la sobreexpresión de mutaciones clínicas del gen MME, ha demostrado que la localización subcelular y la actividad enzimática son procesos dañados en la fisiopatología de la forma CMT2T. CAPÍTULO 2: “De las bases moleculares al fenotipo celular y bioquímico: Fisiopatología de CMT2Z” Mutaciones en el gen MORC2 con herencia autosómica dominante causan una de las formas más comunes de CMT axonal, CMT2Z. A pesar de que las bases genéticas están claramente establecidas, el papel de MORC2 en nervio periférico así como el efecto de las mutaciones clínicas, se desconoce. Respecto a la funcionalidad de MORC2 en sistema nervioso periférico, hemos establecido cuál es la isoforma canónica en tejido nervioso humano; hemos indagado sobre la expresión diferencial de la proteína y el mRNA en tejidos murinos durante el desarrollo, observando una expresión regulada espacio-temporalmente; y hemos determinado su expresión en axón, células de Schwann y regiones ab-axonales en cortes de nervio ciático. En cultivo de neuronas sensoriales de rata, hemos detectado que la presencia de axonal swellings para p.R252W, la mutación más frecuente, era similar al control, cuando para p.S87L era anormalmente elevada, lo que podría explicar la clínica más grave asociada a esta última mutación. En células HeLa, p.R252W muestra una disminución no significativa de la actividad ATPasa, mientras p.S87L presenta una pérdida drástica de actividad enzimática. Mediante estudios transcriptómicos en fibroblastos derivados de pacientes CMT2Z y en modelos neuronales murinos, hemos detectado la expresión alterada de genes ZNF y genes homeobox. Además, en el modelo murino, también la expresión de receptores de neurotransmisores estaba alterada. En su conjunto, el análisis de estos resultados, para las mutaciones p.R252W y p.S87L en particular y para la fisiopatología de CMT2Z en general, conduce por primera vez a la propuesta de dos vías de afectación neuronal: el transporte intracelular y la comunicación interneuronal.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico O câncer de tireoide é o tumor maligno mais comum do sistema endócrino e representa 2,1% dos diagnósticos de câncer em todo o mundo. O carcinoma papilífero da tireoide (PTC) corresponde a mais de 80% dos casos desse tumor e é predominantemente esporádico. Casos de PTC hereditários consistem em 5%, tendem a ter início mais precoce, além de maiores riscos de metástase e de recorrência. O PTC familiar é uma doença geneticamente heterogênea, cuja patogênese não está associada às variantes observadas no carcinoma papilífero de tireoide esporádico. Assim, ainda permanecem desconhecidas as alterações moleculares associadas à carcinogênese da tireoide na maioria das famílias acometidas pelo PTC. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar a base genética de PTC em três famílias brasileiras (Famílias A, B e C) compostas por dois ou mais parentes de primeiro grau com o fenótipo do tumor de tireoide. Mutações germinativas foram pesquisadas em pelo menos um integrante de cada família utilizando-se o sequenciamento completo do exoma, enquanto o sequenciamento de Sanger foi utilizado para validação das mutações encontradas nos exomas e para genotipagem dos genes candidatos nos outros indivíduos de cada família. Foram identificadas sete variantes que podem estar associadas à suscetibilidade para PTC familiar. Dentre as variantes candidatas, foram observadas duas na Família A (p.D283N no gene ANXA3 e p.Y157S no gene NTN4), uma na Família B (p.G172W no gene SERPINA1), quatro na Família C (p.G188S no gene FKBP10, p.R937C no gene PLEKHG5, p.L32Q no gene P2RX5, e p.Q76* no gene SAPCD1). Essas mutações foram validadas pelo Sequenciamento de Sanger e também estavam presentes nos demais membros das respectivas famílias. Não foram validadas variantes candidatas comuns a todas as famílias. Mais estudos são necessários para a compreensão do papel exato dessas variantes, bem como a avaliação da presença destas mutações em outras famílias com PTC.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T19:37:36Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Renata_Lyrio_Rafael_Baptista.pdf: 1736690 bytes, checksum: da6823e80401b6785071617f6aab06f2 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T19:37:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Renata_Lyrio_Rafael_Baptista.pdf: 1736690 bytes, checksum: da6823e80401b6785071617f6aab06f2 (MD5) Previous issue date: 2018-03-12 Introduction: Although most cases of AML are sporadic, a small subgroup is associated with the presence of germ mutations. The 2016 review of the WHO Classification of 2008 included these cases in a session of myeloid neoplasia with presence of germ mutations. These patients should have a different management since the indication of related allogeneic HSCT makes it mandatory to exclude mutation in the donor sibling. In addition, family members should receive genetic counseling. Objectives: a) To establish the mutational status of the CEBPA, RUNX1, GATA2, TERT, TERC genes in patients with AML undergoing allo-HSCT in CEMO-INCA. During this work, a pair of twins discordant for the diagnosis of AML was identified. The rarity of this fact and the potential use of the model to try to understand the pathogenesis of AML lead to another goal to be developed; b) To evaluate the exome of identical twin siblings discordant for the diagnosis of AML identified in the studied cohort. Methods: The detection of mutations in the genes RUNX1, CEBPA, GATA2, TERT and TERC at 58 patients with the diagnosis of AML was performed with the implementation of the MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). The evaluation of exomes was performed through bioinformatic analysis. Results: The evaluation of the mutational status of the CEBPA, RUNX1, GATA2, TERT, TERC genes did not identify any mutation. Comparison of the exomes of the identical twin discordant to AML identified 9 genes mutated in the patient and 2 genes mutated in the healthy sibling with possible clinical relevance. Genes HJURP, ABCE1, PCDHA11, AJM1, TAS2R19, AMER2, FNDC3A, SIN3A and L1CAM are mutated in the patient. RBM5 and ATXN3 are mutated in the health twin. Conclusion: At the exome analysis of the discordant twins pair in AML the mutations found in here could be the result of genetic instability lead by malignance. More experiments are needed to confirm the role of each mutation found in discordance between the pair of twins in this initial genetic screening. Introdução: Apesar da maioria dos casos de LMA serem esporádicos, um pequeno subgrupo está associado à presença de mutações germinativas. Na revisão de 2016 da Classificação da OMS de 2008 foram incluídas as neoplasias mieloides com presença de mutações germinativas. Esses pacientes devem ser submetidos a uma abordagem terapêutica diferenciada, uma vez que a indicação de TCTH alogênico aparentado torna obrigatória a exclusão da mutação no irmão doador. Além disso, os familiares devem receber aconselhamento genético. Objetivos: a) Estabelecer o status mutacional dos genes CEBPA, RUNX1, GATA2, TERT, TERC em pacientes com LMA submetidos à TCTH alogênico no CEMO-INCA. No decorrer desse estudo foi identificado um par de gêmeos discordantes para o diagnóstico de LMA. A raridade desse fato e o potencial uso do modelo para tentar entender a patogênese da LMA fez com que um outro objetivo fosse desenvolvido; b) Avaliar os exomas de irmãos gêmeos idênticos discordantes para o diagnóstico de LMA identificados na coorte estudada. Métodos: A detecção de mutações nos genes CEBPA, RUNX1, GATA2, TERT e TERC em 58 pacientes com diagnóstico de LMA foi realizada pela técnica de MPLA (Amplificação de primer por ligação dependente multiplex). A avaliação dos exomas foi realizada por meio de análise bioinformática. Resultados: Na avaliação do status mutacional dos genes CEBPA, RUNX1, GATA2, TERT, TERC através da técnica de MPLA não foi identificada nenhuma mutação. A comparação do exoma dos gêmeos idênticos discordantes para LMA identificou 116 variantes, dessas foram selecionadas mutações em nove genes no paciente e em dois genes no irmão saudável. A categoria funcional desses genes (HJURP, ABCE1, PCDHA11, AJM1, TAS2R19, AMER2, FNDC3A, SIN3A e L1CAM) e sua possível relevância no processo de transformação é discutida. RBM5 e ATXN3 sã mutados no gêmeo saudável. Conclusão: Na análise de exoma em par de gêmeos discordantes para LMA, as mutações encontradas podem ser o resultado da instabilidade genética gerada por malignidades. Mais estudos são necessários para conformar o papel de cada mutação encontrada na discordância entre o par de gêmeos neste rastreamento genético inicial.

[ES] La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) o neuropatía sensitivo-motora here-ditaria (NSMH), es la neuropatía periférica hereditaria más común. Engloba un grupo de patologías clínica y genéticamente heterogéneas caracterizado por atrofia mus-cular, debilidad, y pérdida de la sensibilidad principalmente distal. El perfil genético y bioquímico de CMT solapa con el de otras neuropatías, complicando su diagnós-tico. Este Trabajo Final de Grado (TFG) tiene como objetivos: (i) lograr el diagnóstico molecular de una cohorte de pacientes con CMT en quienes previamente se han descartado mutaciones en genes implicados en CMT y otras neuropatías relaciona-das mediante panel de genes. Para ello, se secuenciará el exoma de estos pacientes y sus familiares con el propósito de identificar variantes genéticas candidatas a ser mutación causal. (ii) Investigar el posible efecto patológico de una mutación novel localizada en el gen MPZ (Myelin Protein Zero) mediante ensayos de localización subcelular., [EN] Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease, also known as hereditary motor and sensory neuropathy (HMSN), is the most common hereditary peripheral neuropathy. It en-compasses a clinically and genetically heterogeneous group of disorders character-ized by muscle wasting, weakness, and sensory loss usually most severe distally. The genetic and biochemical profile of CMT overlaps with that of other neuropathies, complicating diagnosis. This dissertation aims: (i) to obtain a molecular diagnosis for a cohort of CMT patients who have already undergone gene panel screening to rule out mutations related to CMT and other related neuropathies. The sequenced ex-ome data of patients and their relatives is studied in the search for gene variants with pathogenic potential. (ii) To study the possible pathogenic effect of a novel mu-tation on the gene MPZ (Myelin Protein Zero) via in vitro protein subcellular locali-zation assays.

ResumenEl diagnóstico etiológico es un objetivo primordial para el manejo clínico de cada paciente. Algunos niños con cuadros clínicos complejos son objeto de una lista interminable de exámenes, lo que se ha denominado “odisea diagnóstica”, y que, sin embargo, muchas veces no deja resultados concluyentes. En los últimos años, estamos siendo testigos de una verdadera revolución de la medicina genómica con la incorporación al ámbito clínico de tecnologías que prometen aumentar la capacidad de hacer diagnóstico y disminuir los tiempos. Con énfasis en pediatría, se actualizan conceptos sobre las principales ventajas y limitaciones del diagnóstico genómico, en contraposición con las metodologías usuales.AbstractEtiological diagnosis is essential in the clinical management of individual patients. Some children with complex medical conditions are subjected to numerous testing, known as “diagnostic odyssey”, which often gives no conclusive results. In recent years, a revolution in genomic medicine is underway with the use of technologies that promise to increase the ability to make a diagnosis and reduce the time involved. The main advantages and limitations of genomic diagnosis, as opposed to usual methodologies are reviewed with an emphasis on Pediatrics.

Las enfermedades mitocondriales son un grupo de trastornos hereditarios de metabolismo caracterizados por la alteración de la función mitocondrial, que en la mayor parte de los casos derivan en una disfunción en el sistema de fosforilación oxidativa. Este grupo de enfermedades es muy heterogéneo tanto clínica como genéticamente, debido a su implicación multiorgánica y a su origen genético dual. Debido a que por lo general no hay correlación entre fenotipo y genotipo en los pacientes con sospecha de enfermedad mitocondrial, en la mayor parte de los casos es difícil realizar un diagnóstico molecular definitivo. La integración de las técnicas de secuenciación masiva en este diagnóstico permite mejorar su eficacia, así como asociar nuevos fenotipos a genes ya descritos como implicados en estas enfermedades o incluso asociar nuevos genes a fenotipos clínicos. Durante el desarrollo de este trabajo, se ha integrado la secuenciación masiva en el diagnóstico de pacientes con fenotipo clínico de enfermedad mitocondrial. En primer lugar, se ha puesto a punto la secuenciación del ADNmt completo, así como se ha diseñado y validado un panel de genes a la carta incluyendo aquellos genes implicados en el mantenimiento del ADNmt, para su posterior uso en el diagnóstico; además, junto a dos aproximaciones, se ha aplicado el exoma clínico y el exoma completo a este diagnóstico. Finalmente, se han caracterizado variantes potencialmente patogénicas no descritas anteriormente, y se han estudiado posibles variables modificadoras del fenotipo en pacientes con sordera neurosensorial no sindrómica portadores de la variante homoplasmica m.1555A>G. Se ha obtenido un alto rendimiento diagnostico incluyendo diferentes técnicas de secuenciación masiva en la rutina diagnóstica de pacientes con enfermedad mitocondrial, sobretodo en pacientes bien caracterizados clínicamente. La secuenciación del ADNmt ha permitido la detección de variantes patogénicas en muy bajo porcentaje de heteroplasmia, así como el diagnóstico de pacientes con variantes no asociadas comúnmente a sus fenotipos. La aplicación del panel de genes a la carta ha permitido realizar el diagnóstico genético de pacientes con deleciones múltiples en el ADNmt. Con la aplicación del exoma clínico y el exoma completo, hemos identificado variantes potencialmente patogénicas asociadas a pacientes con síndrome de Leigh y defectos en la actividad enzimática de los complejos OXPHOS; además, una de las variantes se ha encontrado en un gen donde no se han asociado mutaciones previamente a un fenotipo clínico, abriendo nuevas líneas de investigación. Además, se ha podido caracterizar la patogenicidad de las variantes patogénicas estudiadas, asociándolas a los fenotipos clínicos de los pacientes., The mitochondrial disorders (MD) are a group of inherited metabolic diseases characterized by an alteration in the correct function of the mitochondria, mainly due to deficiencies of the oxidative phosphorylation system. These diseases are genetically and clinical heterogenic, due to their dual genetic origin (they can be caused due to mutations in the nuclear and in the mitochondrial genome) and their great phenotypic variability (the disease can affect only one organ or it can be multisystemic). Many times this group of disorders lacks of a genotype-phenotype correlation, since the same mutation can generate different phenotypes, and one specific phenotype can be caused by mutations in different genes, and this fact hampers the genetic diagnose of these disorders. The hypothesis of this thesis proposes that the use of the next generation sequencing (NGS) technologies in the genetic diagnostic of the MD will improve its performance. The use of the NGS in the diagnostic of these diseases will allow the detection of new point mutations in genes already described. Furthermore, the diagnostic through NGS also will allow to associate genes related with a specific MD to new phenotypes, or even to discover new genes causing MD, thus expanding the genetic and phenotypic spectrum of MD and improving the performance of the genetic diagnostic. In the present work we have integrated massive sequencing analysis of mitochondrial and nuclear genes to the diagnostic of patients with MD. We have set up and validated the complete mitochondrial DNA (mtDNA) sequencing that has enabled us to detect low levels of mtDNA heteroplasmy. Furthermore, the covering homogeneity of the complete mtDNA molecule has been optimized. This methodology has allowed us to precisely determine the concrete deleted sequences in single mtDNA deletions. Additionally, we have designed à la carte and validated a panel of genes directly related to mtDNA maintenance for diagnostic purposes. In patients with MD the clinic (n=8) and complete (n=9) exomes have been studied and analyzed. In this regard, new potentially mutagenic variants in both nuclear and mitochondrial DNA genes have been completely characterized, as well as potential phenotypic modulator variants in Non-Syndromic Sensoryneural Hearing Loss patients carrying the homoplasmic m.1555A>G mutation in the MTRNR1 gene. The application of the massive sequencing analysis technique in the diagnosis of these MD has represented an increase in the diagnosis efficiency, specially in those patients that had been well characterized clinically. MtDNA sequencing has allowed the detection in peripheric blood samples of pathogenic variants with a very low degree of heteroplasmy that were not previously detected by the classic Sanger sequencing, reducing the necessity of performing a muscle biopsy. In the complete mtDNA sequencing study, we have detected pathogenic variants that had not been previously associated to the phenotype of the patients. Additionally, the application of the genes panel related with mtDNA maintenance has proven to be very efficient, specially in those patients with multiple mtDNA deletions, being the POLG and TK2 the most representative in those patients. The clinic exome study in patients with Leigh syndrome has allowed us to genetically diagnose 2 out of 6 patients studied. Finally, in two patients with multi-enzymatic deficit of the oxidative phosphorylation system, we have found new potentially pathogenic variants, one in a gene previously associated with the YARS2 clinical phenotype, while the other in a mitochondrial gene previously not associated to any MD.

Submitted by GUILHERME LUÍS PEREIRA null (guipicoia@hotmail.com) on 2017-05-22T14:29:57Z No. of bitstreams: 1 Tese_Guilherme_Luis_Pereira.pdf: 2598868 bytes, checksum: aeb7dc177e4d5e4c0f7a8c7a59a11697 (MD5) Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-23T17:26:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_gl_dr_jabo.pdf: 2598868 bytes, checksum: aeb7dc177e4d5e4c0f7a8c7a59a11697 (MD5) Made available in DSpace on 2017-05-23T17:26:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_gl_dr_jabo.pdf: 2598868 bytes, checksum: aeb7dc177e4d5e4c0f7a8c7a59a11697 (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Dentre os equinos selecionados para velocidade, a linhagem de corrida da raça Quarto de Milha se destaca pelo alto desempenho em provas de curtas distâncias, sendo considerados os mais velozes do mundo. Apesar de, no Brasil, o efetivo de animais ser relativamente menor na linhagem de corrida do que nas demais, sua importância econômica é substancial. Tendo em vista o interesse econômico e científico relacionado a esta característica atlética, poucos esforços têm sido realizados para a maior compreensão de seus mecanismos genéticos e fisiológicos. Este trabalho teve como objetivos: 1) realizar a imputação de genótipos em duas vias entre indivíduos de uma amostra populacional relativamente pequena de cavalos de corrida da raça Quarto de Milha genotipados com painéis de 54k ou de 65k, bem como avaliar a acurácia de imputação por meio de simulações; 2) realizar estudo de associação ampla do genoma (GWAS) em cavalos da linhagem de corrida da raça Quarto de Milha por meio da utilização de chips equinos de genotipagem de SNPs, visando a prospecção de regiões cromossômicas, genes e polimorfismos relacionados ao desempenho; 3) analisar exomas de equinos de corrida da raça Quarto de Milha contrastantes para Índice de Velocidade máximo (IV max) em regiões previamente associadas à característica por meio de GWAS, visando a prospecção de polimorfismos gênicos causais, ligados ou em forte desequilíbrio de ligação com o desempenho em corridas. A imputação foi realizada utilizando 116 cavalos genotipados com o arranjo de SNPs de 54k e 233 genotipados com arranjo de 65k. Nas simulações foram escolhidas amostras aleatórias para constituírem as populações imputadas e referências em dois cenários. O cenário A simulou a imputação genótipos na primeira via (65k para 54k) e o cenário B na segunda (54k para 65k). No cenário A foram considerados 113 indivíduos para a população referência e 236 para a imputada, dos quais 116 e 120 foram genotipados com os arranjos de 54k e 65k, respectivamente. No cenário B foram considerados 50 indivíduos para a população referência e 299 para a imputada, dos quais 66 e 233 foram genotipados com os arranjos de 54k e 65k, respectivamente. Com isso, após o controle de qualidade, os painéis de 54k e de 65k contaram com 7.048 e 16.940 marcadores exclusivos, respectivamente. As médias de taxa de concordância para os cenários A e B foram 0,9815 e 0,9751 e para r2 alélico foram 0,9791 e 0,9740, respectivamente. O GWAS foi realizado com base no método single step GBLUP por meio de duas abordagens: ssGWAS1, em que somente efeitos de SNPs são reestimados a cada iteração, e ssGWAS2, em que a cada iteração são reestimados efeitos de SNPs a partir de valores genético genômico (GEBVs) reestimados. Vinte e uma regiões foram encontradas explicando mais que 1% da variância genética total (gVar) da característica índice de velocidade máximo (IV max) para ssGWAS1 e doze parassGWAS2. No total mais de 40% da gVar foi explicada por estas regiões para ssGWAS1 e cerca de 30% para ssGWAS2. Entre os cromossomos que explicaram mais de 1% da variância genética, cinco foram comuns aos dois métodos (ECA 3, 10, 15, 22, 25). Foram identificados 108 genes na primeira abordagem e 59 na segunda. A partir de informações de GEBVs de cada cavalo foram formados dois grupos de animais contrastantes para desempenho em corridas (20 animais de IV max superior e 20 IV max inferior), para ser sequenciados. Foram observadas leituras de boa qualidade para toda extensão das reads sequenciadas (até 100pb) e cobertura média de 43x. Foram identificadas 1.203 variantes (1.105 SNPs e 93 InDels) em 33 regiões de interesse obtidas, anteriormente, por meio de estudo de GWAS, das quais 61,3% não estavam registradas/depositadas no banco de dados de variantes equino. Do total de polimorfismos, 29 (24 SNPs e 5 InDels) foram considerados de importância com base em três abordagens distintas e independentes: escores SIFT classificado como deletério (

Purpose: To determine the feasibility of mRNAs (C-MYC, BCL-XL, BCL-6, NF-κβ, PTEN and AKT) in exosomes of plasma as a liquid biopsy method for monitoring and prognostic evolution in B-cell lymphomas. Patients and Methods: Exosomes were isolated from 98 patients with B-cell Lymphoma and 68 healthy controls. mRNAs were analyzed by quantitative PCR. An additional 31 post-treatment samples were also studied. Results: In the general and follicular lymphoma series, the presence of AKT mRNA was associated with poor response to rituximab-based treatment. Patients with first relapse or disease progression showed a lower percentage of PTEN and BCL-XL mRNA. The presence of BCL-6 mRNA was associated with a high death rate. The absence of PTEN mRNA in the general series, and presence of C-MYC mRNA in follicular lymphomas, were associated with short progression-free survival. BCL-6 and C-MYC mRNA were independent prognostic variables of overall survival. C-MYC mRNA may provide prognostic information with respect to overall survival. BCL-XL mRNA and increase of BCL-6 mRNA in post-treatment samples could serve as molecular monitoring markers. Conclusions: This is the first large study to evaluate the prognostic and predictive values of pretreatment tumor-associated mRNA in exosomes. BCL-6 and C-MYC mRNA positivity in pretreatment samples were predictors of worse PFS compared to patients with mRNA negativity. C-MYC mRNA positivity was also a statistically significant predictor of inability to obtain complete response with first-line therapy, This study was supported by grants FIS-PI08/0862, and SAF2010-20750. During this study, V. García received Fundación AECC and RTICC-RD2012/0036/0006 fellowships

Introducción y objetivos: Las nuevas técnicas de secuenciación genómica masiva han revolucionado el diagnóstico de las enfermedades neurológicas. Nuestro objetivo general es ilustrar, mediante la presentación de 3 casos clínicos, el abordaje diagnóstico de la patología neurológica desde la genómica. Para ello nos proponemos: explorar herramientas bioinformáticas de anotación e interpretación funcional de variantes, describir un algoritmo de análisis para los datos obtenidos del exoma y con estos resultados correlacionar en nuestros pacientes fenotipo-genotipo-vía funcional. Material y métodos: Fueron incluidos 3 pacientes que concurrieron a la consulta con síntomas neurológicos crónicos y progresivos. Secuenciamos el exoma en los 3. Mediante el uso de herramientas bioinformáticas, utilizando un algoritmo de selección, se filtraron las variantes por frecuencia poblacional, patogenicidad y modelo de herencia. Se estableció la correlación funcional con el fenotipo en cada caso y finalmente se validaron las variantes candidatas por Sanger en los afectados y se buscó su segregación en familiares. Resultados: Se elaboraron algoritmos de aproximación diagnóstica genómica para cada caso. En el caso 1 se llegó al diagnóstico de leucodistrofia asociada a POLR3A con las siguientes mutaciones c.G3781A:p.E1261K y c.G3014A:p.R1005H. En el caso 2 el diagnóstico probable fue de retraso mental sindromático secundario a la mutación p.Arg198* en homocigosis para GRIK2. Y, finalmente, en el caso 3 la causa de paraparesia espástica hereditaria fue el haplotipo patogénico en heterocigosis compuesta c.6763insA y c.6726A>T, p.Gln2242His en SPG11. Conclusiones: La aproximación diagnóstica genómica en conjunto con una completa evaluación clínica resulta útil para el abordaje de la patología neurológica, permitiendo una correlación fenotipo genotipo y vía funcional afectada, arribando a un diagnóstico molecular sólido. Introduction and objectives: The new techniques of mass genome sequencing have revolutionized the diagnosis of neurological diseases. Our overall objective is to illustrate the genomic diagnostic approach of neurological pathology by presenting three cases. To do this we will: explore bioinformatic annotation tools and functional interpretation of variants, describe an algorithm for exome data analysis and to correlate these results with our phenotype-genotype -functional pathway. Material and methods: We included 3 patients who attended the talks with chronic and progressive neurological symptoms. We sequenced the exome in all three. We performed the analysis through annotation and functional bioinformatic tools Results: Algorithms genomic diagnostic approach were developed for each case. In case 1 the diagnosis was reached Leukodystrophy associated with the following mutations POLR3A c.G3781A: p.E1261K and c.G3014A: p.R1005H. In case 2 the diagnosis was probable syndromic mental retardation secondary to homozygous mutation p.Arg198* for GRIK2. And finally in case 3 the cause of hereditary spastic paraparesis was compound heterozygous pathogenic haplotype c.6763insA and c.6726A > T, p.Gln2242His in SPG11. Conclusions: The genomic diagnostic approach along with a complete clinical evaluation is useful for addressing neurological pathology allowing genotype and phenotype correlation with functional pathways arriving to a solid molecular diagnosis. Fil: Córdoba, Marta. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital General de Agudos "Ramos Mejía"; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; Argentina Fil: Gonzalez Moron, Dolores. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital General de Agudos "Ramos Mejía"; Argentina. Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Rodríguez Quiroga, Sergio Alejandro. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital General de Agudos "Ramos Mejía"; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; Argentina Fil: Kauffman, Marcelo Andres. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital General de Agudos "Ramos Mejía"; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia ; Argentina

Orientador: Mônica Barbosa de Melo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível no mundo, acometendo cerca de 70 milhões de indivíduos, com pelo menos 6,8 milhões de pessoas apresentando cegueira bilateral. As formas mais comuns são o glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), seguido pelo glaucoma primário de ângulo fechado (GPAF). O GPAF é caracterizado por uma alteração anatômica na íris periférica, a qual leva ao bloqueio do fluxo do humor aquoso com consequente elevação da pressão intraocular (PIO). Suas formas clínicas incluem a crise aguda, processo tipicamente unilateral, mais agressivo e sintomático, levando a fortes dores oculares, dores de cabeça, visão borrada, náuseas e vômitos, e fechamento angular crônico, processo geralmente indolor e assintomático. Existe uma série de fatores predisponentes que foram extensivamente estudados na tentativa de explicar as variações populacionais e raciais na prevalência do GPAF. Além de fatores como sexo, idade e etnia, fatores anatômicos como 1) posição basal da íris, 2) medida da pressão diferencial e 3) resistência do canal íris-lente podem também contribuir para o desenvolvimento da doença. As predisposições étnicas e gênero-específicas e também o histórico familiar sugerem uma base genética para o desenvolvimento do GPAF. Dois Genome Wide Association Studies (GWAS) confirmaram a associação entre os loci rs11024102, rs3753841 e rs1015213 e o desenvolvimento do GPAF. O presente estudo propôs o estudo de características genéticas do GPAF em uma amostra de nossa população por meio da replicação dos loci previamente associados ao desenvolvimento da doença e o sequenciamento de exomas em duas famílias informativas para o GPAF. O estudo dos SNPs rs11024102, rs3753841 e rs1015213 não evidenciou associação entre os SNPs e o desenvolvimento do GPAF ou suas formas clínicas em nossa população. O estudo de exomas não evidenciou qual gene poderia estar causando a doença em ambas as famílias Abstract: Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide, affecting approximately 70 million individuals, with at least 6.8 million people presenting bilateral blindness. The most common forms are primary open-angle glaucoma (POAG), followed by primary angle-closure glaucoma (PACG). Primary angle-closure glaucoma is characterized by an anatomical alteration in the peripheral iris, which leads to blockage of the aqueous humor outflow and consequent elevation of intraocular pressure (IOP). Its clinical forms include acute attacks, typically unilateral, more aggressive and symptomatic process, leading to severe eye pain, headaches, blurred vision, nausea and vomiting, and chronic angle closure, a process that is painless and asymptomatic. A number of predisposing factors are extensively studied in an attempt to explain geographic and racial variations in the prevalence of PACG. In addition to factors such as sex, age and ethnicity, anatomical factors such as 1) basal iris position, 2) differential pressure measurement, and 3) iris-lens resistance may also contribute to the development of the disease. Ethnical and gender-specific predispositions as well as family history suggest a genetic basis for the development of PACG. In an attempt to better comprehend the genetic aspects of PACG in a sample of the Brazilian population, two strategies have been used. A replication study was conducted in order to verify the frequency of rs11024102, rs3753841 and rs1015213 in PACG cases and controls as well as to determine their association with the disease and its clinical characteristics. These loci have been associated with the disease in two previous studies. Simultaneously, the evaluation of two informative families harboring PACG has been performed through exome sequencing. Our results showed no association between rs11024102, rs3753841 and rs1015213 with PACG development, as well as with its clinical forms. The exome study could not detect which gene might be responsible for the development of the disease in both studied families Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular CNPQ 157539/2013-0

Con el objetivo principal de establecer la utilidad clínica de la secuenciación del exoma en términos de rendimiento diagnóstico, en pacientes menores de 18 años con dismorfias (con o sin discapacidad intelectual) se ha elaborado este informe de evaluación de tecnologías sanitarias, en el que, a través de una revisión estructurada de la literatura siguiendo las recomendaciones de la declaración PRISMA, los autores concluyen que debido al bajo nivel de evidencia al respecto se desconoce el rendimiento diagnóstico exacto de la secuenciación de exomas oscilando en torno al 30% descendiendo al 21% en los estudios que presentaron mejor calidad. Yes

Recurrent pregnancy loss is a frequently occurring human infertility-related disease affecting ~1% of women. It has been estimated that the cause remains unexplained in >50% cases which strongly suggests that genetic factors may contribute towards the phenotype. Concerning its molecular aetiology numerous studies have had limited success in identifying the disease’s genetic causes. This might have been due to the fact that hundreds of genes are involved in each physiological step necessary for guaranteeing reproductive success in mammals. In such scenario, next generation sequencing provides a potentially interesting tool for research into recurrent pregnancy loss causative mutations. The present study involved whole-exome sequencing and an innovative bioinformatics analysis, for the first time, in 49 unrelated women affected by recurrent pregnancy loss. We identified 27 coding variants (22 genes) potentially related to the phenotype (41% of patients). The affected genes, which were enriched by potentially deleterious sequence variants, belonged to distinct molecular cascades playing key roles in implantation/pregnancy biology. Using a quantum chemical approach method we established that mutations in MMP-10 and FGA proteins led to substantial energetic modifications suggesting an impact on their functions and/or stability. The next generation sequencing and bioinformatics approaches presented here represent an efficient way to find mutations, having potentially moderate/strong functional effects, associated with recurrent pregnancy loss aetiology. We consider that some of these variants (and genes) represent probable future biomarkers for recurrent pregnancy loss. © 2017 Quintero-Ronderos et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Introdução: A doença músculo-olho-cérebro (MEB) [MIM: 253280], forma rara de distrofia muscular congênita, possui padrão de herança autossômico re- cessivo com associação à mutações no gene POMGnT1 e quadro clínico com grande heterogeneidade genética. Objetivo: Relatar o caso de uma paciente com diagnóstico de MEB por meio do exoma; Métodos: As informações foram obtidas por meio de entrevista com o paciente, registro fotográfico de exames e revisão da literatura; Relato: Lactente de 1 ano e 6 meses encaminhada para avaliação genética por hipotonia muscular e achados de malformação do sistema nervoso desde a ultrassonografia de 38 semanas de gestação, que exibiu dilatação dos ventrículos cerebrais. Parto cesáreo sem intercorrrências com APGAR 7 e 8 de 1’ e 5’ respectivamente, sucção eficiente, mas tônus diminuído. TC de crânio, evidenciou ectasia do sistema ventricular com dilatação do terceiro ventrículo e sinais de permeação liquórica transependimária. RM de encéfalo, mostrou displasia cortical cerebelar e/ou hipoplasia ponto cerebelar. Apresentava miopia e, no mapeamento de retina, rarefação pigmentar difusa e implantação oblíqua do disco óptico com atrofia papilar. Ao exame físico: cílios longos, nistagmo, palato alto e hipotonia generalizada. Possuía atraso do desenvolvimento neuropsicomotor. Nos exames subsidiários: elevação de CPK, CPKMb e LDH; sorologia STORCH com IgG positivo para rubéola e citomegalovírus; cariótipo 46,XX [20]; teste de triagem neonatal normal. O exoma, escolhido em vez de biópsia muscular, identificou duas variantes do gene POMGNT1, c.1268C>T e c.880-1G>A, ambas deletérias, permitindo diagnóstico da doença. Conclusão: Diante do quadro clínico heterogêneo, ressalta-se a relevância do exoma abreviando o tempo de diagnóstico e reduzindo o estresse dos múltiplos exames subsidiários realizados por pacientes com esse fim.

[EN] The use of NGS technologies for the genetic diagnosis of hereditary diseases is becoming increasingly common. During the variant calling process, the values of Depth and Var/Depth for each sequenced position are obtained. These values indicate the number of reads obtained for that position, and the ratio between the number of reads for the alternative allele and the total number of reads obtained for that position. In theory, a heterozygous variant (1 copy of the reference allele and 1 copy of the alternative allele) should have a V/D close to 0.5. However, factors such as the Depth or the complexity of the sequence analyzed (homopolymer, GC rich regions, homology regions, etc.) can alter the V/D value (moving it away from the theoretical ratio of 0.5) and can raise doubts about the presence of these variations in the sample. Currently, the presence of a variant with probable clinical relevance must be confirmed by Sanger sequencing, the Gold Standard for sequencing in most laboratories. This confirmation represents an extra cost, and can represent a significant expense depending on the number of variants detected by NGS. This expense increases exponentially when a large number of genes are analyzed as in exome analysis. In this context, the aim of this study is to empirically determine a V/D threshold value that will allow us to discriminate a priori between a false positive and a false negative, avoiding performing the additional Sanger sequencing confirmation. To do this, we will select and confirm by Sanger sequencing a large number of variants identified by means of exome analysis and that have a V/D value far from the theoretical value of a heterozygous variant (0.5). The data obtained will be subjected to a statistical analysis in order to establish this V/D threshold value. The determination of the cut-off point is helpful since it allows increasing the benefit-efficiency ratio of the genetic diagnosis using NGS., [ES] El uso de las tecnologías de secuenciación masiva (NGS) para el diagnóstico de enfermedades de origen genético es cada vez más frecuente. En el proceso de identificación de variantes mediante NGS, para cada posición secuenciada se obtienen unos valores de Depth (D) y Var/Depht (V/D), que indican el número de lecturas obtenidas para esa posición, y el ratio entre el número de veces que se detecta el alelo alternativo con respecto a las lecturas totales para esa posición. Teóricamente, una variante en heterocigosis (1 copia del alelo de referencia y 1 copia del alelo alternativo) debería tener un V/D en torno al 0.5. No obstante, factores como el Depth o la complejidad de la secuencia analizada (zonas de homopolímeros, zonas ricas en GC, zonas de homología etc.) pueden alterar el ratio V/D (alejándolo del ratio teórico de 0.5) y creando, por tanto, dudas acerca de la verdadera presencia de la variante en la muestra analizada. Actualmente la presencia de una variante con posible relevancia clínica ha de ser confirmada mediante secuenciación Sanger, ya que se trata de la metodología Gold Standard de secuenciación en la mayoría de laboratorios. Esta confirmación representa un coste adicional para estos estudios, pudiendo llegar a suponer un gasto relevante en función del número de variantes detectadas mediante NGS. Este gasto se incrementa de forma exponencial con un mayor número de genes analizados, como es el caso del exoma diagnóstico. En este contexto, el objetivo del presente trabajo consiste en determinar el valor umbral de V/D, que permita esclarecer a priori la presencia o ausencia de una variante detectada por NGS, sin necesidad de realizar su confirmación por secuenciación Sanger. Para ello se llevará a cabo la selección y confirmación mediante secuenciación Sanger, de un elevado número de variantes con un V/D discrepante del teórico 0.5, identificadas en muestras de exoma. Estos datos serán sometidos a un análisis estadístico para el establecimiento del valor umbral de V/D que nos permita discriminar entre la presencia de un falso positivo frente a un verdadero positivo. La determinación de dicho punto de corte es de gran ayuda ya que permite aumentar el beneficio coste-eficiencia del diagnóstico genético mediante NGS.

La Parálisis Cerebral (PC) es un desorden del control motor de origen central, de presentación heterogénea, a la cual se le atribuye múltiples factores de riesgo pero en realidad de su etiología es poco lo que se conoce. Los nuevos avances en genética como la secuenciación exómica de nueva generación han permitido un mayor acercamiento a las asociaciones genéticas con la PC. En el presente estudio tiene como objetivo encontrar factores genéticos asociados a PC, en pacientes con PC de causa desconocida, con estudios imagenológicos normales y sin factores de riesgo neurológico, ya que estos pacientes se les atribuye mayor probabilidad de asociaciones genéticas. Luego de revisar 303 historias clínicas en un centro de referencia de atención medica pediátrica, se encontró un caso índice que cumple con estas características. Por medio de la secuenciación exómica se encontró una doble mutación para un gen asociado a ataxia espinocerebral congénita. Lo que concluye que es posible encontrar factores genéticos asociados a la PC idiopática y que el diagnóstico clínico de la PC puede ser genéticamente investigado en especial cuando se desconoce su etiología. Abstract. Cerebral Palsy (CP) is a disorder of motor control, with an heterogeneous presentation, which is attributed multiple risk factors but actually its etiology is little known. New advances in genetics like exome sequencing have allowed to be closer to genetic associations with the PC. In the present study has as an object to find genetic factors associated with PC, in patients with unknown cause, with normal imaging studies, without neurological risk factors; because these patients are more likely attributed to genetic associations. After reviewing 303 medical histories from a referral center for pediatric care, an index case that meets these characteristics it was found. Through exome sequencing, a double mutation in gene for spinocerebellar ataxia associated with congenital presentation was found. We can conclude that it is possible to find genetic factor asociated in idiopathic PC and the clinical diagnosis of the PC can be genetically investigated especially when the etiology is unknown. Otra