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Interferon regulatory factors (IRFs) are a family of transcription factors that play a key role in viral defense. Apart from their function in the adaptive immune system recent work revealed that several IRFs contribute to antiviral response independent of secreted IFN. IRFs have been developed earlier in evolution than IFN and are regarded as precursor of today’s IFN system, acting only on an intrinsic level. IRF-1 by itself exhibits antiviral effects that are exerted by the induction of a set of genes that overlaps the set of IFN-induced genes (ISGs). This work shows that IRF-1 contributes decisively for the protection of mice from neurotropic vesicular stomatitis virus (VSV), a virus similar to rabies virus. Mice, deficient in IRF-1, are highly vulnerable to VSV infection and succumb with signs of encephalitis. Unlike the effects of the type I IFN which is essential in restricting VSV both in the periphery and the CNS, IRF-1 mediated antiviral effects are redundant in the periphery but highly crucial for restricting viral replication and spread in the neuronal tissues. Although type I IFN action is a prerequisite for survival from the infection, IRF-1 becomes increasingly crucial in neuronal tissue at a time point where clearance of the virus has not been achieved. The data highlight the importance of IRF-1 as an innate immune mediated antiviral agent that acts in combination with the IFN system. Moreover, our data suggests that IRF-1 responses protect against VSV infection through an IFN-independent program in the brain which could be crucial, in situations where viruses evade immunity by the inhibition of the IFN system., Die Interferon regulierenden Faktoren (IRFs) sind eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die eine wichtige Rolle bei der antiviralen Abwehr spielen. Abgesehen von ihrer Funktion innerhalb des adaptiven Immunsystems zeigen neuere Arbeiten einen Beitrag der IRFs zur antiviralen Antwort, die unabhängig von sekretiertem Interferon (IFN) ist. IRFs haben sich in der Evolution früher als IFNs entwickelt und werden als Vorläufer des heutigen Typ-I-IFN–System angesehen, die nur auf intrinsischem Niveau agieren. IRF-1 selbst besitzt eine antivirale Wirkung, die durch die Induktion einer Reihe von Genen ausgeübt wird, darunter auch die Gruppe der IFN-induzierten Gene (ISG). Diese Arbeit zeigt, dass IRF -1 entscheidend zum Schutz von Mäusen vor dem neurotropen vesikulären Stomatitis-Virus (VSV), einem Verwandten desRabiesvirus (Erreger der Tollwut), beiträgt. IRF-1 defiziente Mäuse sind hoch anfällig für eine VSV-Infektion und sterben nach dem sie Symptomen einer Enzephalitis zeigen. Im Gegensatz zum Typ-I-IFN, das essentiell für die Kontrolle von VSV in der Peripherie und im ZNS ist, bleiben IRF- 1-vermittelte antiviralen Effekte in der Peripherie redundant. IRF-1 ist allerdings sehr entscheidend bei der Kontrolle der viraler Replikation und Ausbreitung im zentralen Nervensystem (ZNS). Obwohl die Aktivierung von Typ–I-IFN für das Überleben der Infektion unerlässlich ist, übernimmt IRF-1 im späteren Verlauf der Infektion eine wichtige Rolle und ist für die Eliminierung der Virusinfektion im ZNS verantwortlich.Die Daten unterstreichen die Bedeutung von IRF-1 als einen antiviral agierenden Vertreter des angeborenen Immunsystems, der in Kombination mit dem IFN -System wirkt. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass die IRF-1-Antwort durch einen IFN-unabhängigen Mechanismus gegen VSV-Infektion im Gehirn schützt, was immer dann entscheidend ist, wenn sich das Virus der Kontrolle des IFN-Systems der Immunantwort entzieht.

For the present work the Indu-Rag1 mouse has been used to investigate the kinetics of B cell development in adult mice. In this mouse, Rag1 which is required for T and B cell development is inverted and flanked by inverted loxP sites. When crossed with a mouse that bears a Cre that is fused with a mutated estradiol receptor under the control of the B cell-specific mb1 promoter, expression can be induced by administration of Tamoxifen. This leads to one wave of B cell development. Uninduced mice contain a pool of c-kit+ proB cells. Such cells can differentiate upon Tamoxifen induction. Thus, the time that B cells and their precursors need for maturation can be determined. ProB cells need five days to differentiate into preB cells and it takes another two days to detect the first transitional B cells in different organs. This is in agreement with the development observed in fetal liver. Using the synchrony at the early time points after induction, it was possible to demonstrate that during heavy chain recombination in progenitor B cells the VH genes proximal to the DJ segments are used first and the distal VH segments are rearranged later during B cell ontogeny. Analysis of the mature B cell populations revealed an earlier appearance of B-2 cells compared to B-1 and MZ B cells. This could be simply due to the precursor frequency for such B cells which might be higher for B-2 cells. Importantly, no proliferation could be found neither for transitional nor for mature B cells. Apparently, expansion takes place only at the precursor level. Using BM chimera it could be shown that B-1a cells developing from adult progenitors contribute to some extend to the B-1a cell pool in adult mice. In addition the source of hexameric IgM was analysed. Peritoneal B-1a cells appear to secrete pentameric and hexameric IgM, while splenic B cells clearly do only secrete pentameric IgM., Um die B-Zellentwicklung in der adulten Maus zu untersuchen wurde in der vorliegenden Arbeit die Indu-Rag1 Maus verwendet. In dieser Maus liegt Rag1 invertiert und von loxP-Sites eingeschlossen vor, sodass weder B- noch T-Zellen entwickelt werden. Diese Maus wurde mit einer Maus, in der Cre mit einem mutierten Östrogen-Rezeptor fusioniert und unter der Kontrolle des B-Zellspezifischen Promotors mb-1 ist, gepaart. Durch Gabe von Tamoxifen wird die Expression von Rag1 exklusiv in c-kit+ proB Zellen angeschaltet was zu einer einmaligen Welle der B-Zellentwicklung führt. Da in uninduzierten Mäusen ein Pool an proB Zellen vorliegt, kann dessen Differenzierung durch Tamoxifen-Gabe induziert werden und die Zeitspanne, der Reifung berechnet werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass diese Zellen fünf Tage zur Differenzierung in preB-Zellen benötigen und weitere zwei Tage bis die ersten transitionalen B-Zellen identifiziert werden. Dies ist übereinstimmend mit der Entwicklung in der fötalen Leber. Die Synchronität der B-Zellentwicklung zu den frühen Zeitpunkten wurde genutzt um zu zeigen, dass währen der Rekombination der schweren Kette die VH-Gene, die proximal zu den DJ-Segmenten angeordnet sind zuerst rearrangiert werden. Außerdem konnten reife B-Zell-Subpopulationen zu unterschiedlichen Zeiten das erste Mal detektiert werden was an unterschiedlichen Mengen an Vorläufer-Zellen liegen könnte. Auszuschließen ist Proliferation in dem Zusammenhang, da diese offensichtlich nur in den Vorläuferzellen stattfindet. Es wurden keine stärker proliferierenden transitionalen oder reifen B-Zellen gefunden. Weiterhin konnte durch Etablierung einer Knochenmarks-Schimäre gezeigt werden, dass B-1a Zellen, die von adulten Vorläuferzellen abstammen, auch einen Teil zu dem adulten B-1a Zell-Pool in der adulten Maus beitragen. Des Weiteren sekretieren peritoneale B-1a Zellen scheinbar pentamerisches und hexamerisches IgM, wobei B-Zellen aus der Milz ausschließlich pentamerisches IgM sekretieren.

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) causes Johne’s disease (JD) a chronic inflammatory bowel disease in ruminants. An association between MAP and Crohn’s disease (CD) in humans has been postulated due to similar histopathological appearance of JD and CD. In the present work, we hypothesized that MAP might not be causative agent of CD but exacerbating an already existing disease. Secondly, due to long disease progression from sub-clinical phase to the clinical phase and ubiquitous exposure of animals to environmental MAP, it was further hypothesized that infected animals will reveal the clinical symptoms after secondary exposure to MAP. This might be also the case in CD. Based on both hypotheses, dextran sulfate sodium-induced colitis was combined with MAP infection. An increased size of liver and spleen was observed in DSS-treated MAP infected mice. In addition, higher number and larger liver granuloma were observed in that group. Furthermore, higher numbers of viable bacteria were found in the colon of DSS+MAP mice in comparison to untreated MAP infected mice. Interestingly, the tissue recovery was delayed in DSS+MAP in comparison to DSS-treated uninfected mice. Upon secondary infection, DSS+MAP mice came down with diarrhea and colitis which are the clinical symptoms of JD and CD. An increased frequency of CD4+ T cell in the colon and the prevention of colitis by depletion of CD4+ T cells demonstrate the importance of CD4+ T cells in the pathogenesis of MAP infection after secondary infection. Interestingly, specific activity of MAP was found when other mycobacteria were compared and failed to induce similar effects. Taken together, these results are consistent with the previous hypothesis that MAP exacerbates the existing colitis. Thus, the mouse model presented here reflects histopathological aspects of JD and might in the long run help to understand a possible association between MAP and CD in humans., Mykobakterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der Verursacher der Johne’schen Krankheit. Dabei handelt es sich um eine entzündliche Darmkrankheit von Wiederkäuern. Andererseits wurde auf Grund der Ähnlichkeit des histopathologischen Erscheinungsbildes postuliert, dass MAP auch als Verursacher der Morbus Crohn fungiert. In der gegenwärtigen Arbeit wurde angenommen , dass MAP nicht der Verursacher der Morbus Crohn ist, sondern dass das Bakterium nur eine bereits vorhandene entzündliche Krankheit verstärkt. Es wurde weiter postuliert, dass angesichts der langen Inkubationsphase auch infizierte Wiederkäuer wiederholt MAP aus der Umwelt ausgesetzt sind und dadurch die klinischen Symptome ausgelöst werden. Ähnliche Verhältnisse können auch bei der Morbus Crohn eine Rolle spielen. Deshalb wurden Mäuse mit Dextran Sulfat (DSS) behandelt um eine Kolitis auszulösen und anschließend mit MAP infiziert. In diesen Mäusen wurden stark vergrößerte Milzen und Lebern gefunden. Zusätzlich war in diesen Mäusen eine erhöhte Anzahl von Granulomen in der Leber vorhanden, die ebenfalls eine größere Fläche einnahmen. Schließlich wurde im entzündeten Kolon der Mäuse eine erhöhte Anzahl von MAP gemessen. Diese Bakterien sind vermutlich der Grund, warum die Erholung dieses Gewebes längere Zeit benötigte als das der DSS-behandelten nichtinfizierten Kontrollen. Nach sekundären Infektionen wiesen die DSS+MAP Mäuse Durchfall und Kolitis auf, die klassischen Symptome der Johne‘schen Krankheit und der Morbus Crohn. Die erhöhte Anzahl von CD4 T-Zellen sowie die Verhinderung der Symptome durch Depletion von CD4 T-Zellen zeigten die Rolle dieser Effektorzellen bei der Pathogenese nach sekundären Infektionen durch MAP. Schließlich konnte noch gezeigt werden, dass nur MAP und keines der anderen nahverwandten Mykobakterien diese Symptome auslöst. Zusammengefasst sind die erzielten Ergebnisse gut vereinbar mit der Ausgangshypothese, dass MAP eine vorhandene Entzündung verstärkt. Somit repräsentiert das vorliegende Mausmodell Aspekte der Morbus Crohn und der Johne’schen Krankheit. Langfristig sollte es deshalb helfen den Zusammenhang zwischen Morbus Crohn beim Menschen und dem Bakterium MAP zu verstehen.

Interferon (IFN)-regulierende Faktoren (IRFs) sind eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die an der Regulation vieler Mechanismen der Wirtsabwehr, wie der Induktion von IFN beteiligt sind. IRF5 induziert die Expression proinflammatorischer Zytokine. Mehrere Studien weißen außerdem darauf hin, dass IRF5 eine wichtige Rolle bei der antiviralen Wirtsabwehr spielt. In dieser Arbeit sollte die Rolle von IRF5 an der antiviralen Immunität näher untersucht werden. IRF5-/- Mäuse zeigen im Vergleich zu Wildtyp Mäusen (wt) eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber intranasaler Infektion mit dem Vesikuläre-Stomatitis-Virus (VSV). Der Vergleich der viralen Replikation in peripheren Organen (Lunge, Leber und Milz) und im Gehirn zeigte, dass in wt Mäusen das Virus nach 4 Tagen vollständig eliminiert werden kann. In IRF5-/- Mäusen kommt es hingegen zur ungehinderten Ausbreitung und Vermehrung von VSV im Gehirn. Im Vergleich zu wt Mäusen zeigten IRF5-/- Mäuse geringere Konzentration an IFNa im Serum. Dennoch waren sie eingeschränkt in der Lage sowohl in der Lunge, wie auch im Gehirn antivirale Gene zu exprimieren. Dies wies darauf hin, dass auch Mechanismen der adaptiven Immunität von IRF5 beeinflusst sein könnten. Naive IRF5-/- Tiere besaßen weniger B- und T-Zellen. Ein wichtiger Mechanismus bei der Bekämpfung einer VSV-Infektion ist die Produktion VSV-neutralisierender Antikörper. Es konnte gezeigt werden, dass IRF5-/- Tiere einen Defekt in der humoralen Immunabwehr haben. Trotz der Kompensation dieses Defekts durch den adaptiven Transfer von B-Zellen war die Infektion mit VSV letal. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IRF5 einen bedeutenden Einfluss auf die antivirale Wirtsabwehr besitzt. IRF5 ist ein wichtiger Faktor zur Induktion von IFN, der Entwicklung von B- und T-Zellen und ist an der Produktion neutralisierender Antikörper beteiligt. Die IRF5-abhängige Resistenz gegenüber VSV wird jedoch B-Zell-unabhängig, wahrscheinlich über Neuronen-intrinsische Effekte vermittelt., Interferon (IFN) Regulatory Factors (IRFs) are a group of transcription factors that are involved in the regulation of different mechanisms of the host response, like the induction of IFN. IRF5 has been shown to be involved in the induction of proinflammatory cytokines. Several studies suggest a role of IRF5 in the antiviral response. Hence, the overall aim of this study was to explore the IRF5-dependent innate and adaptive antiviral response. IRF5-/- mice are highly susceptible to intranasal infections with Vesicular Stomatitis Virus (VSV), whereas wild type mice (wt) survive. A comparison of viral replication in the peripheral organs (lung, liver and spleen) and the brain in IRF5-/- mice and wt mice demonstrated the clearance of the virus within 4 days in wt mice. In contrast, the virus replicates and spreads unlimited in IRF5-/- brains. In comparison to the wt mice, IRF5-/-mice showed decreased amounts of IFNa in the serum. Nevertheless these mice were able to express antiviral genes both in the lung and brain. This gave rise to the assumption that IRF5 could be involved in the adaptive immunity. Naive IRF5-/- mice had lesser B and T lymphocytes compared to their wt counterparts. An important mechanism to control VSV infections is the production of VSV-neutralizing antibodies. The data showed that IRF5-/- mice had a defective humoral immune response. Despite of the efforts to compensate for this defect by the adaptive transfer of B cells to IRF5-/- mice, the mice still succumbed to VSV infection. These results indicate that IRF5 has a strong impact on the antiviral host defense through different mechanisms. IRF5 is a crucial factor for type I IFN induction, adaptive immune responses such as B and T cell development and neutralizing antibody production. However, the IRF5-dependent resistance against VSV is mediated by B-cell independent mechanisms and most probably by neuron-intrinsic effects.

The Hepatitis-C virus is the leading cause of chronic hepatitis. The host immune system identifies specific viral patterns, and induces an Interferon (IFN) response. IFNs are known to suppress HCV replication in vitro, by the induction of antiviral responses mediated by Interferon stimulated genes (ISGs) and the current treatment regimen of IFN-α and Ribavirin has proven partly successful.However, HCV remains a poor inducer of interferon. This feature is attributed to the ability of the HCV proteins to cleave or successfully circumvent most proteins involved in the interferon pathway. IFN-independent antiviral mechanisms have been shown to exist as bypass mechanisms in the event of viral evasion of the IFN system. In this study, gene knock-out lines lacking key molecules involved in induction, reaction and amplification of type I IFNs as well as antiviral responses induced by alternative pathways was used to determine the role of the type I IFN system in the restriction of HCV replication. The data provided here indicate the novel antiviral functions of Interferon regulatory factors (IRFs) and interferon stimulated genes (ISGs) in limiting HCV replication in mouse cells. Mouse cells with a competent interferon signalling system did not permit replication of HCV whereas cells with individual defects in the type I interferon response, IRF-3, STAT-1 and the ISG PKR permitted detectable levels of replication. However, replication was observed in cells with defective IRF-5, IRF-7 and IRF-1 only in the absence of a type I interferon response. These results argue, that lesion of these genes weaken such IFN-independent defences to the extent that HCV replication is detectable upon neutralization of secreted IFN. Therefore, we conclude that in WT MEFs, IFN-dependent and independent mechanisms contribute to the control of HCV replication, and that IFN-independent defences are mediated through IRF-5,IRF-7, IRF-1 and PKR. This is compatible with the current view that these factors are essential for the IFN-mediated antiviral activity. Taken together, these data show that apart from the predominant type I IFN response, IFN-independent antiviral effects are involved in restricting HCV replication in mouse fibroblasts. Similarly, data from primary mouse hepatocytes indicate that in addition to the type I IFN responses; other interferons such as type III interferon may also exert antiviral effects., Das Hepatitis-C-Virus ist eine der häufigsten Ursachen chronischer Hepatitis. Bei viralen Infektionen erkennt das Immunsystem spezifische virale Strukturen und induziert daraufhin eine Interferon (IFN)-Antwort. IFNs sind dafür bekannt, die HCV-Replikation in vitro durch die Induktion Interferon stimulierter Gene (ISGs) mit antiviralem Effekt, zu unterdrücken. Deshalb besteht die verbreitete Therapie von Hepatitis C in der Behandlung mit pegylierten Interferon α in Kombination mit dem Nukleosidanalogon Ribavirin. Allerdings produzieren HCV-infizierte Zellen nur geringe Mengen IFN, da viele HCV-Proteine die Fähigkeit besitzen Proteine des IFN Signalweges zu blocken oder ihrer Wirkung zu entgehen. Es konnte gezeigt werden, dass es IFN-unabhängige antivirale Mechanismen gibt, welche die Aufgabe von IFN übernehmen, wenn deren Wirkung von Viren umgangen wird. In dieser Studie wurden murine embryonale Fibroblasten mit einem Defekt in der Induktion, Amplifikation und Reaktion vom Typ I IFNs sowie deren antiviralen Wirkung verwendet, um die Rolle des Typ I IFN-System in der Inhibition der HCV-Replikation zu bestimmen. Die hier dargestellten Daten zeigen eine neue antivirale Funktion Interferon regulierender Faktoren (IRF) und Interferon stimulierter Gene (ISGs) die Replikation von HCV in murinen Zellen zu hemmen. HCV ist nicht in der Lage in Mauszellen mit einem intakten Interferon-System zu replizieren. Zellen mit einem Defekt im IRF-3-, STAT-1- und PKR-Gen erlauben eine Replikation des Virus. Jedoch wurde Replikation in IRF-5-, IRF-7- und IRF-1 defizienten Zellen nur in Abwesenheit eines Typ I Interferon-Antwort beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Verlust dieser Gene die IFN-unabhängigen Abwehrmechanismen schwächen, was die Replikation von HCV ermöglicht. Daraus schließen wir, dass in WT MEFs, IFN-abhängige und -unabhängige Mechanismen zur Steuerung der HCV-Replikation beitragen und das IFN-unabhängigen Abwehrmechanismen durch IRF-5, IRF-7, IRF-1 und PKR vermittelt werden. Dies stützt die verbreitete Meinung, dass diese Faktoren essentiell für die IFN-vermittelten antiviralen Aktivität sind. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass abgesehen von der dominanten Wirkung von Typ I IFN, IFN-unabhängige antivirale Effekte an der Restriktion der HCV-Replikation in Mausfibroblasten beteiligt sind. Experimente in murinen Hepatozyten lassen weiterhin vermuten, dass neben Typ I IFN auch andere Interfone, wie Typ III IFN antiviralen Effekt vermitteln können.

Aussagekräftige endotheliale in vitro Testplattformen werden in der Wirkstoffentwicklung für kardiovaskuläre Erkrankungen benötigt. Während solcher Entwicklungsprozesse ist es wichtig, möglichst frühzeitig abzuschätzen, wie sich ein Produkt in Bezug auf Wirksamkeit, Gesundheit und Umwelt auswirkt. Es besteht eine immer stärkere Notwendigkeit zellbasierte in vitro Testverfahren als Alternative zu Tierversuchen einzusetzen. Zudem sind Endothelzellen in der Forschung, der regenerativen Medizin und Zelltherapie von hohem Interesse. Den Engpass stellt die Versorgung mit genügend Zellmaterial dar, dass die physiologischen Eigenschaften des nativen Zelltyps aufweist, um aussagekräftige reproduzierbare Erkenntnisse zu generieren, die möglichst nahe der in vivo Situation sind. Das hier vorgestellte Immortalisierungsverfahren ermöglicht die Etablierung einer neuen Kategorie von Zelllinien, die zum einen die Proliferation von klassischen Linien aufweisen, zum anderen den funktionalen Phänotyp des nativen Zelltyps konservieren. Der Hypothese folgend, dass man zur Etablierung einer funktionalen Zelllinie eine zelltypspezifische Kombination an Immortalisierungsgenen benötigt, wurde in dieser Arbeit eine innovative Screeningmethode entwickelt, die zum einen die Immortalisierung ermöglichen und zum anderen den physiologisch relevanten Phänotyp konservieren. Zur Selektion dieser Genkombinationen, wurden die generierten Endothelzelllinien einer Charakterisierung unterzogen und ihre Expression endothel-spezifischer Marker und Funktionen im Vergleich zu dem Verhalten der entsprechenden primären Zellen evaluiert. Im Vergleich zu etablierten Immortalisierungsansätzen, weisen die resultierenden Zelllinien eine physiologische Funktionalität und Phänotyp auf, ermöglichen eine unkomplizierte Handhabung und generieren valide Ergebnisse., Physiological relevant endothelial in vitro testplatforms are needed in support of drug development processes for cardiovascular diseases. It is important to evaluate the efficacy of a potential drug during early stages of the process using cell based in vitro models that closely represent the in vivo environment. They promise to reduce the need for laboratory animals while simultaneously increasing the success rate of new leads. Currently, either permanent cell lines or primary cells are employed for such purposes but limiting is the supply of cell material with properties comparable to the in vivo situation. In this study a system was developed enabling the efficient establishment of novel cell lines with physiological relevant characteristics. Our hypothesis is that each cell type requires a specific combination of genes for immortalization to result in a physiological relevant cell line. The approach developed in this work, is a powerful tool to screen for such gene subsets. Our data demonstrate that the established cell lines retain cell specificity, intracellular signaling pathways and cell functionality in vitro and in vivo. This approach enables the rapid creation of novel cell lines e.g. with correct pharmacologic properties, that are patient or disease specific. Therefore, cell lines established via this approach enable convenient maintenance and obtain valid results. The unique combination of availability and functionality of these cell systems will pave the way to a better understanding of diseases, a precise drug development process and in long term also offer novel treatment options.

Multipotente mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind eine heterogene Zellpopulation, welche in einer Vielzahl von Geweben vorkommt. MSCs sind durch mesodermale Differenzierung an der Gewebehomöostase beteiligt und besitzen trophische Eigenschaften. Aufgrund ihrer immunsuppressiven Aktivitäten sind sie vielversprechende Kandidaten für die Behandlung chronisch-entzündlicher Autoimmunerkrankungen wie der Rheumatoiden Arthritis. Es wurde die Hypothese entwickelt, dass eine Überexpression immunsuppressiver Faktoren durch MSCs eine geeignetere Therapie autoimmuner Erkrankungen darstellt, als konventionelle therapeutische Ansätze mit unbehandelten MSCs. Dies wurde in einem Mausmodell der Rheumatoiden Arthritis untersucht (Kollagen-induzierte Arthritis in DBA/1-Mäusen). Wurden lentiviral modifizierte MSCs, welche rekombinant immunsuppressive Faktoren hoch-exprimierten, nach dem Krankheitsausbruch appliziert (kurative Behandlung), konnte die Hypothese nicht bestätigt werden. Lediglich moderate Effekte von nativen und iNOS (induzierbare NO-Synthase)-überexprimierenden MSCs wurden beobachtet. Die Überexpression eines anderen Faktors, der Indoleamin-2,3-dioxygenase (IDO), verschlimmerte die Krankheit sogar. Erfolgte die Applikation der MSCs hingegen vor der Manifestation der Rheumatoiden Arthritis (präventiver Ansatz), so resultierte die Überexpression von iNOS, aber nicht von IL-10, in einem deutlichen therapeutischen Effekt. Diese Daten heben die Wichtigkeit der Administrationszeitpunkte der MSCs hervor. In vitro-Analysen der T-Zellproliferation und Mixed Lymphocytes Reactions (MLRs) belegten einen biphasischen Effekt der MSCs, wonach die Zellen zunächst immunstimulatorische Einflüsse besitzen und erst bei erhöhten Zellzahlen eine immunsuppressive Wirkungsweise entfalten. Zusammenfassend verdeutlicht diese Arbeit die Wichtigkeit der Applikationszeiten und eingesetzten MSC-Zahlen für deren immunsuppressives Potential in einer chronischen Erkrankung wie der Rheumatoiden Arthritis., Multipotent mesenchymal stem cells (MSCs) are a heterogeneous population of cells which reside in a variety of tissues. They contribute to the tissue-homeostasis by differentiating into several mesodermal lineages and they possess trophic activities. So, MSCs exert immunosuppressive activities and are, therefore, promising candidates for the treatment of chronic inflammatory autoimmune disorders such as rheumatoid arthritis. The notion was developed that overexpression of immunosuppressive factors in MSCs might be a promising tool for the therapy of autoimmune disorders improving conventional therapeutic approaches with unmodified MSC. This hypothesis was tested in a mouse model for rheumatoid arthritis (collagen-induced arthritis in DBA/1 mice). When lentivirally modified MSC expressing high levels of immunosuppressive factors were applied after onset of rheumatoid arthritis (curative treatment), the latter hypothesis could not be confirmed. Only moderate therapeutic effects were observed by native and by inducible nitric oxide synthase (iNOS) overexpressing mMSCs. Overexpression of another immunosuppressive factor, indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO), even aggravated the disease. In contrast, when immunosuppressive factors were applied before onset of rheumatoid arthritis (preventive treatment), overexpression of iNOS but not of IL-10 in MSCs resulted in a clear therapeutic effect. These data emphasize the importance of the time of MSC administration to exert their immunosuppressive potential. Analyses of T-cell proliferation and mixed lymphocytes reactions (MLRs) in vitro showed that MSCs exert a biphasic effect with an immune stimulating potential at moderate cell numbers and the desired immunosuppressive activities only with high cell numbers. In conclusion, this study emphasizes for MSCs the role of application time and of cell numbers to exert anti-inflammatory and immunosuppressive properties in a chronic inflammatory disorder such as rheumatoid arthritis.

Typ I IFN gehört zur ersten Abwehrlinie des Körpers nach Infektionen. Neben der direkten antiviralen Wirkung auf infizierte Zellen, wirkt es auf Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems. Die Wirkung von Typ I IFN auf CD8+ T-Zellen, die als Teil der adaptiven Immunantwort infizierte Zellen eliminieren, ist widersprüchlich. Zum einen kann Typ I IFN die Immunantwort unterstützen, zum anderen übt IFN negative Effekte auf CD8+ T Zellen aus. Wie diese vielfältigen Wirkungen zustande kommen ist bisher unklar. Sowohl die Bindung von Typ I IFN an den entsprechenden Rezeptor als auch eine Stimulation des T-Zell-Rezeptors induzieren Signalkaskaden. Es sollte daher untersucht werden, welchen Einfluss die Signalkaskaden aufeinander ausüben, ob es einen „Crosstalk“ zwischen den Signalkaskaden gibt und welche Konsequenzen dies für die Aktivierung, Differenzierung und Effektorfunktion von T-Zellen hat. Um dies näher zu untersuchen, wurden OT-I T-Zellen TZR-spezifisch stimuliert und der Einfluss einer IFN-ß-Stimulation untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Typ I IFN abhängig von Zeitpunkt und Dauer der Stimulation Proliferation und Effektorfunktion von Antigen-stimulierten T-Zellen inhibiert, während Aktivierung und Differenzierung der T-Zellen nicht beeinflusst werden. Typ I IFN inhibiert die Induktion von IL-2, was ursächlich für die verminderte Proliferation ist. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Typ I IFN Moleküle der T-Zell-Rezeptor-Signalkaskade beeinflusst. Der Kalzium-Signalweg, der Ras/MAPK-Signalweg sowie die Aktivierung von NF-kB werden durch Typ I IFN inhibiert, während die MAP-Kinasen JNK und p38 nicht beeinflusst werden. Geninduktionsanalysen zeigen, dass Typ I IFN zu einer verminderten Induktion einer Vielzahl T-Zell-Rezeptor-induzierter Gene führt, jedoch auch IFN-induzierte Gene durch eine T-Zell-Rezeptor-Stimulation vermindert induziert werden. Insgesamt zeigen die Daten, dass ein „Crosstalk“ zwischen T-Zell-Rezeptor- und Typ I IFN-induzierten Signalwegen existiert und in Folge dessen T-Zell-Funktionen beeinflusst werden., Type I IFN provides the first line of defense after infections. Apart from its direct antiviral effects on infected cells, Type I IFN can also modulate cells of the innate and adaptive immunity. CD8+ T cells, a part of the adaptive immunity, recognize and eliminate infected cells. Previously described effects of Type I IFN on CD8+ T cells are contradictory. CD8+ T cell-mediated responses can be supported or are negatively affected. The reason for these multifaceted outcomes has not been elucidated in detail. Binding of Type I IFN to its corresponding receptor as well as the stimulation of the T cell receptor induces subsequent downstream signaling cascades. This study aimed at identifying, how these signaling cascades interact with each other and what the consequences of these interactions are for T cell activation, differentiation and effector-function. For this purpose, the effect of IFN-ß stimulation on antigen-specific stimulated OT-I T cells was investigated. Type I IFN leads to a time-dependent inhibition of T cell-proliferation and effector-function, whereas activation and differentiation of T cells remain unaffected. Type I IFN reduces the induction of Interleukin-2, leading to the observed reduced proliferation. Furthermore, Type I IFN can influence certain TCR-induced signaling cascades. The TCR-induced Calcium pathway is inhibited, the activation of MAP-Kinase Erk1/2 as well as NF-kB is reduced, while the activation of the MAP-Kinases JNK and p38 is not altered. Microarray-analysis revealed a Type I IFN-mediated decrease in the induction of a multitude of TCR-stimulated genes, whereas a TCR-stimulation led to a diminished IFN-stimulated gene induction. These results indicate the existence of a “cross-talk” between TCR- and IFN-induced signaling cascades influencing T cell function.

Mutationen der humanen Mismatch-Reparaturgene stellen die Ursache der erblichen Darmkrebsform Lynch Syndrom/HNPCC dar. Mismatch-Reparatur (MMR) erkennt und korrigiert post-replikativ Fehler in der DNA-Sequenz, wobei die Proteinheterodimere MutSalpha und –beta sowie MutLalpha als essentiell für die Reparatur beschrieben sind. Den darüberhinaus bekannten Heterodimeren der MMR-Familie MutSgamma (MSH4/MSH5) und MutLgamma (MLH1/MLH3) werden in humanen Zellen dagegen Funktionen in der Meiose und in crossing-over-Ereignissen zugeschrieben. Arbeiten mit MMR-spezifischen Knockout-Mäusen lassen vermuten, dass diese gamma-Heterodimere einen Funktionsverlust der alpha/beta-Heterodimere kompensieren können und so ein Backup-System darstellen. In humanen Zellen konnte diese Redundanz bisher nicht gezeigt werden, obwohl hohe Sequenzhomologien bekannt sind. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals erfolgreich ein stabil exprimierendes Untersuchungssystem für MutSgamma und MutLgamma etabliert. Die Fusion mit Fluoreszenzproteinen ermöglichte eine Untersuchung der Funktion der gamma-Heterodimere in vivo in humanen Zellen. Nach Induktion von DNA-Schäden durch laservermittelte UVA-Strahlung, wurde eine Akkumulation von MLH3 mittels live cell imaging beobachtet. Eine Funktion von MutLgamma in MMR wurde anhand der Auslösung eines spezifischen Zellzyklusarrests, der aus aktiver Reparatur resultiert, untersucht. Dazu wurden Einzelklone der MMR-defizienten Zelllinie 293T, die durch rekombinante Expression von MutLalpha oder MutLgamma rekonstituiert wurden, vergleichend eingesetzt. Während über die Expression von MutLalpha die Reparaturfunktion und die Auslösung des Zellzyklusarrests wiederhergestellt werden konnte, konnte nach Expression von MutLgamma kein Einfluss auf den Zellzyklus detektiert werden. Im Gegensatz zu murinen Zellen sind daher eine Redundanz zwischen MutLgamma und MutLalpha sowie eine Backup-Funktion durch das gamma-Heterodimer in humanen Zellen nicht nachweisbar., Mutations in human mismatch repair genes are the hallmark of Lynch Syndrome/HNPCC. Mismatch repair (MMR) functions in detection and repair of DNA errors, resulting from incorrect replication. While the protein heterodimers MutSalpha and –beta as well as MutLalpha are well known key players of MMR, reported functions of the heterodimers MutSgamma (MSH4/MSH5) and MutLgamma (MLH1/MLH3) are limited to meiosis and crossing-over in human cells. Recent data from knockout-mice suggest that in murine cells these gamma-heterodimers may function as a backup-system for the alpha/beta-heterodimers. This function could not be shown in human cells so far, although wide sequence homologies have been reported. This work describes for the first time a model system of cells, stably expressing MutSgamma and MutLgamma in fusion with fluorescent markers. After induction of UVA-laser induced DNA damage, we observed accumulation of MutLgamma via live-cell-imaging. To investigate a function of MutLgamma in MMR, the ability to activate a MMR-specific cell cycle arrest was checked. Therefore, single clones of the MMR-deficient cell line 293T, reconstituted by recombinant expression of MutLalpha or MutLgamma were compared. While expression of MutLalpha restored repair function and activation of the cell cycle arrest, expression of MutLgamma had no effect on cell cycle. Contrary to murine cells, redundant functions of MutLalpha and –gamma as well as a backup-function by the gamma-heterodimer are not detectable in human cells.

Die rheumatoide Arthritis ist eine chronische Autoimmunerkrankung in deren Verlauf es zu es zu der Entzündung und Degradation mehrerer Gelenke kommt. Die Krankheit betrifft 1% der Bevölkerung und ist durch Invalidität und erhöhter Mortalität gekennzeichnet. Limitierungen derzeitiger Therapien, wie z.B. den TNF-alpha Blockern, machen die Suche nach neuen Therapiestrategien zu einem wichtigen Ziel in der Rheumaforschung. TAK1 (TGF-beta aktivierte Kinase 1) ist eine MAP3K, die die neben TGF-beta und BMP vermittelten Differenzierungsprozessen auch mit den inflammatorischen IL-1-, TNF-alpha- und Toll-like-Rezeptor vermittelten Signalwegen interferiert. Aktuelle Studien zeigen, dass TAK1 ein Schlüsselmolekül bei der Regulation von inflammatorischen Prozessen ist. In dieser Arbeit wurde davon ausgegangen, dass eine systemische anti-TAK1 Strategie einen neuen Weg für die therapeutische Behandlung der rheumatoiden Arthritis darstellen könnte. In dieser Doktorarbeit wurde erstmals der therapeutische Effekt einer systemischen siRNA vermittelten Inhibition von TAK1 in vivo in einem experimentellen und kurativen Modell der Kollagen-induzierten Arthritis in DBA/1-Mäusen untersucht. Dabei zeigte sich eine sehr gute therapeutische Wirkung der anti-TAK1 Strategie, die mit stark verminderten Pfotenschwellungen und Arthritiswerten einherging. Im Verlauf der Studien konnte außerdem gezeigt werden, dass der therapeutische Effekt maßgeblich auf die verminderte Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IFN-gamma IL-6 und TNF-alpha und der verstärkten Produktion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 zurückzuführen ist. Als maßgebliche Produzenten dieser Zytokine und Effektoren der anti-TAK1 Behandlung stellten sich nicht wie erwartet Makrophagen, sondern interessanterweise zytotoxische T-Zellen und T-Helferzellen der Milz und der Lymphknoten heraus. Insgesamt zeigt diese Arbeit erstmalig, dass über Signalmediatoren wie TAK1 die Möglichkeit besteht eine effiziente anti-inflammatorische Strategie zu entwickeln. Durch eine wichtige Rolle von TAK1 in Differenzierungsprozessen und der Gewebedegradation könnte die anti-TAK1 Strategie ebenfalls auf der Ebene der Gewebedegradation und –regeneration vorteilhaft sein. TAK1 bietet demnach ein potentielles neues Ziel in der Behandlung von rheumatoider Arthritis., Rheumatoid Arthritis is a chronic autoimmune disease characterized by articular inflammation that results in progressive degradation of cartilage and bone. It affects almost 1% of the world population and, up to now, therapeutic treatments do not entirely cure the disease calling for additional and novel therapies. TAK1 (TGF-beta activated kinase 1) is a MAP3K, that mediates IL-1, TNF-alpha and Toll-like receptor signaling in addition to the TGF-beta/BMP pathways. Therefore, TAK1 plays a crucial role not only in adaptive and innate immune responses, but also in inflammation. Therefore, the hypothesis was investigated that a systemic anti-TAK1 strategy might result in a novel modality for a rheumatoid arthritis therapy. The therapeutic effect of a systemic anti-TAK1 siRNA was assessed in an experimental and curative DBA/1 mouse model of collagen-induced rheumatoid arthritis. After intravenous injection in vivo, both incidence and severity of collagen-induced arthritis were significantly reduced at macroscopic levels in the group of mice treated with anti-TAK1 siRNA. This therapeutic effect was associated with a decreased secretion of pro-inflammatory cytokines IL-6, INF-gamma and TNF-alpha as well as the induction of the anti-inflammatory cytokine IL-10. Interestingly it turns out that cytotoxic T-cells as well as T-helper cells from draining lymph nodes and spleen are the main producers of these cytokines and not macrophages, as hypothesized. In conclusion, this study demonstrates that targeting of signaling molecules like TAK1 is a suitable approach for anti-inflammatory strategies. Since TAK1 also plays an important role in catabolic events, the anti-TAK1 strategy might also be beneficial for tissue regeneration and for the inhibition of tissue degradation, as well. TAK1 is, therefore, a potential new therapeutic target for the treatment of rheumatoid arthritis.

Präeklampsie (PE) ist eine Erkrankung die im letzten Trimester der Schwangerschaft auftritt und durch Schlüsselsymptome wie Hypertension und Proteinurie charakterisiert ist, wahrscheinlich als Folge eines dysfunktionalen Endothels. Ein Effekt der in vielen PE-Fällen beobachtet wird ist der starke Anstieg eines löslichen Rezeptors in der Zirkulation, dem sFlt-1/ sVEGFR-1. Im Gegensatz zur transmembranen Form fehlt der löslichen Variante die intrazelluläre Kinasedomäne, die für eine Signaltransduktion erforderlich ist. Folglich erreicht sFlt-1 die maternale Zirkulation und kann so den korrespondierenden Liganden mit hoher Affinität binden. Gleichzeitig wird so die Bioverfügbarkeit der Liganden VEGF-A und PlGF vermindert, sowohl in der Zirkulation als auch in endogenen parakrinen und autokrinen Zyklen. Als Folge kann ein Multiorganschaden auftreten, wie eine Nierenschädigung aufgrund einer gestörten Filtrationsbarriere, oder Ödeme in Leber und Hirn. Um den in PE auftretenden Überschuss an zirkulierendem sFlt-1 zu simulieren wurde ein Mausmodell mit adenoviraler sFlt-1 Überexpression entwickelt. Dafür wurde AdsFlt-1 adulten Balb/c Mäusen i.v. injiziert, und das Experiment nach 10d ausgewertet. Untersuchungen behandelter vs unbehandelter Tiere bestätigten einen starken Anstieg des sFlt-1 in Leberlysaten, und histologische Schnitte demonstrierten die Schädigung der Filtrationsbarriere im renalen Glomerulum. Des Weiteren wurde ein starker Anstieg des Albumins im 24h-Harn behandelter Tiere nachgewiesen. Die Analyse zirkulierender sFlt-1 Spiegel vor Adenovirusinjektion und 10d später zeigte ebenfalls einen signifikanten Anstieg. Der Einsatz von Telemetrie eröffnete gleichfalls eine deutliche Steigerung des Blutdrucks in behandelten Tieren. Die durch adenovirale sFlt-1 Überexpression induzierten Effekte konnten durch adenovirale Co-Expression des verwandten Liganden VEGF-A nahezu neutralisiert werden., Preeclampsia (PE) appears during the third trimester of pregnancy and is characterized by crucial symptoms like hypertension and proteinuria, probably as a consequence of a dysfunctional endothelium. One effect observed in most cases of PE is the strong increase of a soluble receptor molecule, sFlt-1/ sVEGFR-1 in the maternal circulation. In contrast to the transmembrane form, the soluble form lacks the intracellular kinase domain required for signalling. Hence sFlt-1 reaches the maternal circulation and can bind corresponding ligands with high affinity. It decreases thereby the bioavailability of the ligands VEGF- A and PlGF not only in the circulation but also in endogen autocrine and paracrine loops. That can cause multiorgan disease, like kidney damage due to a disrupted filtration barriere, or edema in liver and brain. A mouse model for simulation of excess sFlt-1 in the circulation, like observed in PE, was developed, using adenoviral overexpression. Therefore AdsFlt-1 was injected intravenously in adult female Balb/c mice and the experiment analyzed 10 days after. Investigations of treated vs untreated animals confirmed a strong increase of sFlt-1 in liver lysates, and histological sections demonstrated renal damage like a collapsed filtration barriere intraluminal (endothelial) as well as extraluminal (podocyte layer). As a consequence a strong albumin increase could be shown in 24h-urine samples of treated mice. Analysis of circulating sFlt-1 levels before injection of adenoviruses and 10 days after indicated also a significant rise in plasma sFlt-1 levels. Using telemetric blood pressure measurements an obvious pressure increase could be confirmed and therefore the PE-like impact of sFlt-1 overexpression in mice. The effects induced by sFlt-1 overexpression were nearly rescued by adenoviral co-expression of the cognate ligand VEGF-A.

Über die Entwicklung von Sehnen- und Bändern ist wenig bekannt. Untersuchungen ergaben, dass es bei Überexpression von Smad8ca und BMP2 in der mesenchymalen Vorläuferzelllinie C3H10T1/2 zu einer Differenzierung in Sehnenzellen kam. Zur Untersuchung der Differenzierung modifizierter muriner Stammzellen in vivo wurde ein ektopes Mausmodell zur Sehnenbildung entwickelt. Es zeigte sich, dass BMP2 und Smad8ca die Tendogenese ermöglichen. Es wurde auch das Differenzierungsverhalten von viral-modifizierten C3H10T1/2-Zellen untersucht. Ektope Implantationen mit adenoviral Smad8ca und BMP2 veränderten C3H10T1/2-Zellen zeigten, dass in vivo eine Differenzierung der Zellen sowohl in sehnen-ähnliches als auch in Knochengewebe stattfand. Des Weiteren kam es zur Generierung eines apophysären Knochen-Sehnen-Übergangs. Im Gegensatz dazu bildete sich in C3H10T1/2-Zellen die nur Smad8ca exprimierten, sehnen-ähnliches Gewebe ohne Knochenelemente. Dies zeigt, dass eine Smad8ca-abhängige Signalvermittlung für eine Sehnenzellbildung ausreichend ist. Es wurden auch lentiviral-infizierte humane MSCs ektopisch in Mausgewebe implantiert. Auch hier konnte eine Smad8ca/BMP2-abhängige Differenzierung in Knochen- und sehnen-ähnliches Gewebe beobachtet werden. Mit Hilfe eines Microarrays wurde nach sekretierten Faktoren gesucht. Es zeigte sich, dass das Gen Periostin im Smad8ca/BMP2-Hintergrund hoch reguliert wurde. Bei Implantation von Periostin- und caBMPR-IA-modifizierten murinen als auch humanen MSCs konnte beobachtet werden, dass in beiden Fällen eine stammzellabhängige Differenzierung in sehnen-ähnliches Gewebe stattfand. Bei den modifizierten huMSCs wurde die Bildung des neuen Gewebes allerdings außerhalb der implantierten Trägermatrix beobachtet. Es wird vermutet, dass die huMSCs Periostin in das umliegende Mausgewebe sekretieren und dieses dort die Organisation der extrazellulären Matrix in sehnen-ähnliches Gewebe einleiten kann., Little is known about the development of tendons and ligaments. Investigations have shown that by overexpression of Smad8ca and BMP2 in the mesenchymal progenitor cell line C3H10T1/2 cause a differentiation into tenocytes. An ectopic mouse model for the formation of tendon tissue was generated for the investigation of the differentiation of modified stem cells. It seems that Smad8ca and BMP2 allow tendogenesis. The differentiation potential of viral-modified C3H10T1/2 cells was investigated as well. Ectopic implantations with adenoviral-modified C3H10T1/2 cells containing Smad8ca and BMP2 differentiated into tendon-like tissue as well as in bony elements. Furthermore a bone-tendon junction was generated. In contrast, C3H10T1/2 cells, which only contained Smad8ca, differentiated into tendon-like tissue without bony elements. This means that the presence of Smad8ca is sufficient for the differentiation into tenocytes. Lentiviral-modified human mesenchymal stem cells (huMSCs) were implanted in mice as well. As before, a Smad8ca/BMP2-depending differentiation into bone- and tendon-like tissue could be observed. By the use of microarray analysis it was searched for secreted factors. It appeared that the gene Periostin was up-regulated in the presence of Smad8ca/BMP2. The implantation of modified murine and human MSCs with Periostin and caBMPR-IA resulted in a stem cell-depending differentiation into tendon-like tissue. In the case of modified huMSCs, however, the neotissue was located outside the implanted sponge. It is supposed that Periostin is secreted into the surrounding mouse tissue by huMSCs where it induces the organisation of extracellular matrix into tendon-like tissue.

Der Transkriptionsfaktor IRF-1 steuert Gene der Pathogenabwehr, Proliferation, Immunaktivierung und Entzündung. IRF-1 wirkt als Tumorsuppressor und vermittelt seine Wirkung sowohl über einen intrinsischen, wachstumsinhibierenden Effekt als auch über einen systemischen, das Immunsystem aktivierenden Effekt. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung der IRF-1 Effekte auf die Proliferation und Transformation sowie der Induktion einer tumorspezifischen Immunantwort im murinen CT26 Darmkarzinom-Modell. Dazu wurde die IRF-1 Expression konditional in diesen Tumorzellen etabliert. Die konditionale Expression von IRF-1 führt zur Inhibition der Proliferation und zur Reversion des onkogenen Phänotyps. Diese Effekte vermitteln jedoch keine aussreichende Protektion vor Tumoren, da IRF-1 in immundefizienten Nacktmäusen eine Reduktion aber keine vollständige Abstoßung bewirkt. Die Induktion von IRF-1 erhöht die MHC Klasse I Expression, führt zu einer verbesserten Eliminierung von Tumorzellen durch spezifische CTLs, induziert die Expression von Chemokinen und vermittelt eine erhöhte Attraktion von Lymphozyten. In immunkompetenten Mäusen vermittelt IRF-1 eine vollständige Abstoßung der Tumore und induziert eine tumorprotektive Immunantwort. Die Analyse der Milzzellen zeigt die Anwesenheit von tumorspezifischen CTLs. Bei einem Einsatz in der Therapie muß IRF-1 die Fähigkeit zeigen, das Wachstum bereits vorhandener Tumore zu verlangsamen oder zu stoppen. Die Expression von IRF-1 in etablierten Tumoren führt in der Mehrzahl der Mäuse zur Abstoßung des Tumors. Die Einbringung von IRF-1 in einen Tumor mittels Gentransfer würde nicht zur Expression in allen Tumorzellen führen, da die Transfermethoden nicht effizient genug sind. Die Expression von IRF-1 in einem Viertel der Tumorzellen erwies sich als ausreichend, um die Tumorabstoßung zu bewirken. Die Entwicklung einer Tumortherapie unter Mitwirkung von IRF-1 scheint daher möglich., The transcription factor IRF-1 was originally identified as a protein mediating the effects of the interferon system. Besides its regulatory functions of the cellular response in host defense, proliferation and immune activation, IRF-1 was found to be a tumor suppressor. Besides direct effects on tumor cells IRF-1 is capable of mediating its anti-tumor effects by inducing a tumor specific immune response in the host. To study the tumorsuppressive effects of IRF-1 in vitro and in vivo the colon carcinoma cell line CT26 was transduced by lentiviral vectors to conditionally express IRF-1. The tumor cells showed a significant growth arrest and a reversion of the transformed phenotype after induction of IRF-1. Upon expression of IRF-1 an increase of MHC class I expression was detected and these tumor cells showed a significantly higher recognition and elimination rate by specific cytotoxic T cells. In addition, the induction of chemokines was shown as well as an increased attraction of lymphocytes. Tumor cells were subcutaneously injected in mice to study tumor formation in vivo. Tumor growth was delayed in nude mice, but complete tumor rejection was observed in immunocompetent syngenic mice. Furthermore these mice were protected from new tumor burden and tumor specific cytotoxic T cells were detected in spleens. The rejection of established tumors is a prerequisite for IRF-1 being a potential therapy candidate. Further experiments revealed, that also established tumors were rejected upon IRF-1 expression. IRF-1 mediated tumor rejection was also achieved with only 25% of tumor cells expressing IRF-1. These results demonstrate that IRF-1 expression in tumor cells leads to an induction of a tumor specific immune response, which results in tumor rejection. The developmant of an IRF-1 based tumor therapy seems possible.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Frage wie der Transkriptionsfaktor IRF-1 in Zellen antivirale und antiproliferative/tumorsuppressive Aktivitäten auslöst. Die Effekte wurden in einem Zellkulturmodell untersucht, indem sowohl die onkogene Transformation als auch die IRF-1 Aktivität von außen gesteuert werden kann. Dies entspricht in idealisierter Form der natürlichen Situation, in der IRF-1 durch Pathogene und proinflammatorische Zytokine transkriptionell induziert wird. Simultan mit der tumorsuppressorischen Wirkung von IRF-1 konnte eine Reversion der Expression von 60 % aller Gene festgestellt werden, die beim Übergang vom normalen zum onkogen-transformierten Zustand dereguliert werden. Viele der indirekt durch IRF-1 regulierten Gene kodieren für Proteine, die an der Regulation des Zellzyklus beteiligt sind. Es wurde nachgewiesen, dass die IRF-1 vermittelte Reversion der Transformation fast uneingeschränkt auf eine Normalisierung der erhöhten Zyklin D1 Expression zurückzuführen ist. Unter den Genprodukten der direkten IRF-1 Zielgene sind vielen, von denen bekannt ist, dass sie bei der Abwehr von Pathogenen mitwirken. Darunter Viperin, das bisher als ein Interferon stimuliertes Gen (ISG) mit antiviraler Aktivität beschrieben wurde. Für die Klärung der Frage, welche Rolle IRF-1 bei der Induktion von Viperin spielt, wurden Infektionsversuche mit VSV (Vesikular Stomatitis Virus) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Viperin Gen IRF-1 abhängig von Viren induziert werden kann und sein Genprodukt die VSV Replikation effektiv hemmt. Weiterhin wurde gezeigt, dass IRF-1 einen eigenen IFN unabhängigen, antiviralen Schutz vermittelt. Diese Daten geben erste Hinweise darauf, dass IRF-1 für die Etablierung antiviraler Mechanismen essentiell ist, wenn das Interferon System durch die Virusinfektion inhibiert wird., Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) was originally identified as a protein mediating the effects of the interferon system. Beside its antiviral and pro-inflammatory activity IRF-1 antagonizes the growth of tumour cells in vitro and in vivo by counteracting the uncontrolled growth of tumour cells. In addition, the activation of IRF-1 in different tumour models leads to a reversion of the tumorigenic phenotype. All of these effects are mediated through the transcriptional activation of IRF-1 target genes. A cell line which allows the regulation of IRF-1 as well as the oncogenic transformation by c-myc and c-Ha-ras was used to uncover the molecular alterations initiated by IRF-1. This equals an idealised form of the natural situation where the induction of IRF-1 is triggered by interferons, viruses, dsRNA and inflammatory cytokines. Gene expression profile analyses showed that more than 60% of the genes whose expression changed during transformation have an expression pattern as in the non-transformed state after IRF-1 activation. Many of the indirect regulated IRF-1 target genes act on proliferation and cell cycle control. Continuative analyses demonstrated that IRF-1 mediates its tumour-suppressive effects mainly by inhibiting oncogene-induced cyclin D1 expression. The biggest portion of the primary IRF-1 targets is associated with pathogen defence. Among them Viperin, an interferon stimulated gene, that exhibits antiviral activity. To clarify the function of IRF-1 in virus mediated Viperin induction, infection studies were performed. Finally, it was shown that IRF-1 is essential for the VSV mediated Viperin induction and that enforced expression of Viperin limits VSV replication. Furthermore, it was shown that IRF-1 mediates interferon independent antiviral mechanisms. Since IRF-1 induces several other important antiviral factors it is postulated that IRF-1 serves as a feedback mechanism when the interferon system is blocked by viruses.

Distinkte Mutationen in der Rezeptor-Tyrosinkinase Ror2 (Regeneron orphan receptor 2) resultieren u.a. in schweren skelettalen Fehlbildungen wie der dominanten Brachydaktylie Typ B. Trotz des Wissens über die Funktion von Ror2 und die Auswirkungen von Mutationen auf die Embryonalentwicklung in vielen Organismen ist nur sehr wenig über die Signalwege bekannt, in die Ror2 involviert ist. In dieser Arbeit konnten neue Interaktionspartner von Ror2 identifiziert und funktionell charakterisiert werden, was einen besseren Einblick in Aufbau und Funktion von Ror2-abhängigen Signalwegen ermöglicht. Sowohl TAK1 (TGF-beta-aktivierte Kinase 1), ein bedeutender Regulator der Wnt-Signalwege, als auch Bprp (Basic proline-rich protein) interagieren mit den C-terminalen Domänen von Ror2. Die TAK1/Ror2-Interaktion führt dabei zur Phosphorylierung eines TGY-Motivs innerhalb der distalen Serin-/Threonin-reichen Domäne von Ror2. Diese intrazelluläre Ror2-Interaktion mit TAK1 wird durch die extrazelluläre Bindung von Wnt-1, nicht jedoch Wnt-5a, unterdrückt. Parallel konnte in einem Wnt-abhängigen Reporter-System gezeigt werden, dass die Bindung von Wnt-1 an Ror2 zu einer Stimulierung des kanonischen Wnt-Signalweges führt. Die Deletion der C-terminalen Serin-/Threonin- und Prolin-reichen Sequenzen führt zu einer erheblichen Steigerung dieses Effektes und erlaubt daher die Rolle von Ror2 bei verschieden schweren Ausprägungen der Brachydaktylie Typ B auf eine Steigerung des kanonischen Wnt-Signalweges zurückzuführen., Distinct mutations within the receptor tyrosine kinase Ror2 (Regeneron orphan receptor 2) result, amongst others, in brachydactyly type B, a severe autosomal dominant skeletal disorder. Considerable knowledge about Ror2 and its mutations in embryonic development exist but only little is known about the signalling pathways Ror2 is involved in. In this thesis new interacting partners of Ror2 were identified and functionally characterized allowing a deeper insight into the composition and function of Ror2-dependent signalling pathways. Both TAK1 (TGF-beta-activated kinase 1), a crucial regulator of Wnt signaling pathways, and Bprp (basic proline-rich protein) interact with the C-terminal domains of Ror2. TAK1/Ror2 interaction leads to the phosphorylation of a TGY-motif within the distal serine-/threonine-rich domain of Ror2. This intracellular Ror2 interaction with TAK1 is suppressed by extracellular Wnt-1- but not by Wnt-5a-binding. A Wnt-dependent reporter system showed that the association of Wnt-1 with Ror2 leads to the stimulation of the canonical Wnt signaling pathway. Deletion of the C-terminal serine-/threonine- and proline-rich sequences entails a significant increase in canonical Wnt signalling and allows, therefore, the hypothesis that the Ror2-dependent level of canonical Wnt signaling may be responsible for the marked variability of brachydactyly type B phenotypes.

VEGF ist einer der Hauptfaktoren der physiologischen und pathophysiologischen Angiogenese. VEGF bindet an die Rezeptoren VEGFR-1 (Flt-1), die lösliche Variante sVEGFR-1 (sFlt-1) und VEGFR-2 (KDR), welche nahezu ausschließlich auf Endothelzellen exprimiert werden. Die Verfügbarkeit von VEGF kann unter anderem durch Expression des sVEGFR-1 moduliert werden. Das weibliche Reproduktionssystem ist eines der wenigen Systeme im adulten Organismus, in dem eine physiologische Angiogenese stattfindet. In der vorliegenden Arbeit wurden Endothelzellen mit Granulosazellen aus dem Corpus luteum (Gelbkörper) unter verschiedenen Kokultivierungsbedingungen analysiert. Es wurde die Regulation der VEGF-Rezeptoren auf RNA- sowie auf Proteinebene untersucht. Die Granulosazellen inhibieren die Expression des löslichen VEGFR-1s durch Sekretion eines löslichen Faktors und modulieren so möglicherweise die Verfügbarkeit des VEGFs., VEGF is a keyplayer in physiological and pathophysiological angiogenesis. VEGF and its receptors VEGFR-1 (Flt-1) and VEGFR-2 (KDR) are a tightly regulated system. Also the naturally occurring soluble form of VEGFR-1 (sVEGFR-1 or sFlt-1) - consisting of only 6 Ig-like domains - can modulate the bioavailability of VEGF by sequestering the ligand. The female reproductive tract is one of the few organs with active angiogenesis in the adult. Especially the corpus luteum and its rapid vascularization is necessary to ensure fertility. In this work a coculture system with endothelial and granulosa cells was established to study the VEGF receptor expression on endothelial cells. Granulosa cells reduce the expression of the soluble VEGFR-1 by secretion of an unknown factor.This may regulate the bioavailability of VEGF in a cell culture system.

Die rekombinante Expression von Bone Morphogenetic Protein-2 in der murinen mesenchymalen Vorläuferzellinie C3H10T½ führt zur Ausprägung distinkter chondrogener und osteogener Zellpopulationen. Zur Klärung der spezifischen Rolle der Bone Morphogenetic Protein Typ IA und Typ IB Rezeptoren (BMPR-IA/BMPR-IB) in der BMP-2 abhängigen chondro-/osteogenen Differenzierung wurden funktionelle und dominant-negative BMP Typ I Rezeptoren, denen die carboxyterminale Ser/Thr Kinasedomäne fehlt, in parentalen und BMP-2 exprimierenden C3H10T½-Zellen exprimiert. Nach histochemischen und genetischen Analysen von spezifischen chondrogenen und osteogenen Markergenen blockieren dominant-negative BMPR-IA die BMP-2 abhängige chondro-/osteogene Differenzierung, während die Expression funktioneller BMPR-IA zu einer Erhöhung des chondro-/osteogenen Potentials der mesenchymalen Vorläuferzellen C3H10T½ führt. Demgegenüber weisen dominant-negative BMPR-IB nur einen marginalen Einfluß auf die frühe BMP-2 abhängige chondro-/osteogene Entwicklung in vitro auf, wohingegen in vivo die BMP-2 abhängige Ossifikation unterbunden wird. Auch führt die Expression funktioneller BMPR-IB zu einer Erhöhung des BMP-2 abhängigen osteogenen Potentials. Diese Ergebnisse zeigen die prädominante Rolle des Bone Morphogenetic Protein Typ IA und nicht des Typ IB Rezeptors in der frühen BMP-2 abhängigen chondro-/osteogenen Entwicklung der mesenchymalen Vorläuferzellen C3H10T½ auf., The permanent recombinant expression of BMP-2 (Bone Morphogenetic Protein) in murine mesenchymal progenitors C3H10T½ results in the differentiation along the chondrogenic and osteogenic lineage. In order to investigate the specific roles of BMPR-IA and -IB during the BMP-2 mediated chondro-/osteogenic development, full-length or dominant-negative BMP-type I receptors lacking the carboxyterminal Ser/Thr-kinase domain were permanently expressed in C3H10T½ with or without a background of recombinant BMP-2 expression. The dominant negative BMPR-IA blocked BMP-2 mediated chondro-/osteogenic differentiation in C3H10T½ mesenchymal progenitors. This strongly reduced chondro-/osteogenic differentiation potential was substantiated by histochemical and genetic analysis of marker genes typical for chondrogenesis and osteogenesis. Concomitantly, the recombinant expression of the full-length BMPR-IA receptor led to considerable increase of the chondro-/osteogenic differentiation potential. In contrast, overexpression of dominant negative BMPR-IB had only a minor influence on the early onset of BMP-2 mediated chondro-/osteogenic development in vitro and blocks the BMP2-dependent ossification in vivo. Also, the overexpression of the full length BMPR-IB increased moderately the osteogenic differentiation potential in C3H10T½ progenitors. These results suggest a decisive role for BMPR-IA and not for BMPR-IB in BMP-2 mediated chondro-/osteogenic differentiation of mesenchymal progenitor cells C3H10T½.

The aim of this research was to elucidate the functions of the three domains of the BMP2 signaling mediator-Smad1: the N-terminal domain, the C-terminal domain and the proline-rich linker domain, especially the function of the less conserved proline-rich linker region, in the mesenchymal differentiation processes, particularly in regard to osteo-/chondrogenic development was investigated by histological staining and also by RT-PCR analyses of the expression of several marker genes, which are specific or typical for osteogenic-, chondrogenic-, and adipogenic development. Smad1 and its biological active C domain initiated osteogenic development in the C3H10T1/2 cells and stimulated in C3H10T1/2BMP2 cells differentiation into osteogenic lineages. The N domain was sufficient to initiate transcription of some osteogenic marker genes in parental C3H10T1/2 cells. However, this domain blocked osteogenic development when recombinantly expressed in C3H10T1/2BMP2 cells. The P domain dominant-negatively inhibited the BMP2-dependent osteogenesis in C3H10T1/2 cells. The P domain of Smad1 inhibited Smad1 C domain dependent osteogenesis in a dose dependent manner. And the inhibitory effect of P domain on osteogenesis is not a common property of all Smads, but seems specific for Smad1. Smad1 and its domains do obviously not participate in the BMP2-dependent chondrogenic development. The trancriptional assays of promoter luciferase constructs for some BMP-responsive genes, substantiated the histological and genetic analyses of Smad1 by showing stimulation of the promoter luciferase activities by the Smad1 C domain. The analysis of effects of the Smad1 domains has important value in understanding the process of BMP2-dependent osteo-/chondrogenic development in mesenchymal progenitors (C3H10T1/2)., Die vorliegende Forschung zielt darauf ab, die Funktionen der drei Domänen des BMP2-Signalmediators Smad1, insbesondere die Funktion der weniger konservierten Linkerdomäne in dem mesenchymalen Differentierungsprozeß zu ermitteln. Vor allem werden ihre Funktionen in bezug auf die osteo-/chondrogene Entwicklung mittels histologischer Färbung und genetischer Anaylse der Expression mehrerer Markergene, die spezifisch oder typisch für die osteogene, chondrogene und adipogene Entwicklung sind, untersucht. Smad1 und sein biologisch aktive C-Domäne führen osteogene Entwicklung in C3H10T1/2 -Zellen ein und stimulieren die Differenterung von C3H10T1/2BMP2-Zellen zur osteogenetischen Zellinie. Die N-Domäne ist in der Lage, die Transkription von manchen osteogenetischen Markergenen in der C3H10T1/2-Zellen zu induzieren, während sie die osteogenetische Entwicklung der rekombinanten C3H10T1/2BMP hindert. Die Linkerdomäne inhibiert die BMP2-abhängige Osteogenese auf dominant negative Weise. Die von Smad1 C-Domäne abhänige Osteogenese wird je nach der Dosis der Smad1 P-Domäne mehr oder weniger gehindert. Die Inhibierung der Osteogenese durch die P-Domäne ist aber nur auf Smad1 beschränkt. Smad1 und ihre Domäne zeigen keine Auswirkung auf die BMP2-abhänige chondrogene Entwicklung. Die Transkriptionsanalyse der Promotor-Luciferase-Konstrukte der BMP-reagierten Gene bestätigt die Ergebnisse der histologischen Färbung und genetischen Analyse. Die Analyse der Auswirkung der Smad1-Domäne hat eine große Bedeutung für das Verständnis des Prozesses der BMP-abhängigen osteog-/chondrogene Entwicklung in den mesenchymalen Vorläuferzellen (C3H10T1/2).