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The present study evaluated the cryoprotectant efficacy of dimethylacetamide (DMA) and ethylene glycol in a one-step protocol to freeze boar sperm. The sperm-rich portion of the ejaculates from two boars were collected once a week, for 10 weeks. After collection, the ejaculates were diluted (1:1; v/v) in the cooling extender. After determining their spermatozoa concentration, the ejaculates were pooled with the same number of spermatozoa from each boar and stabilized at 20°C for 120 min. Distinct cryoprotectants were added to the cooling extender at 20 °C, at different concentrations, composing six treatments: 1.25% and 2.5% glycerol (control); 1.25% and 2.5% ethylene glycol; 2.5% and 5.0% DMA. The samples were stored in 0.25 mL straws, containing 35 × 106 spermatozoa. After 90 min at 20 °C, the straws were submitted to a cooling curve until 5 °C (0.3 to 0.5 °C/min) and kept at 5°C for 60 min. Freezing was conducted by placing the straws horizontally 5 cm above the liquid nitrogen for 10 min, followed by immersion on liquid nitrogen. After thawing at 37 °C for 30 seconds, sperm quality was evaluated through a computer-assisted semen analysis system and flow cytometry. Sperm motility was greater (P< 0.05) in treatments with 5.0% and 2.5% DMA (22.2 ± 2.6% and 20.0 ± 2.8%, respectively) than in treatment with 2.5% ethylene glycol (8.2 ± 1.0%). The integrity of the plasma membrane (P = 0.08) and mitochondrial membrane potential (P = 0.27) was similar among the treatments. The treatment with 2.5% ethylene glycol was the least efficient to maintain intact acrosome membrane (P< 0.01). Some kinetics parameters (DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL e ALH) were positively affected by 5.0% DMA. The one-step freezing protocol resulted in unsatisfactory boar sperm motility after thawing, regardless of the cryoprotectant. RESUMO: O presente estudo objetivou avaliar a eficácia de um protocolo one-step de congelamento do sêmen suíno utilizando dimetilacetamida (DMA) e etilenoglicol como crioprotetores. Durante 10 semanas, a fração rica dos ejaculados de dois machos suínos foram coletados, uma vez por semana. Após a coleta, os ejaculados foram diluídos (1:1; v/v) no diluidor de resfriamento. Após a avaliação da concentração espermática, os ejaculados foram agrupados em um pool com o mesmo número de espermatozoides de cada macho e estabilizados a 20 °C por 120 min. Os criopropetores foram adicionados ao diluidor de congelamento a 20 °C, em diferentes concentrações, compondo seis tratamentos: glicerol (controle), 1,25% e 2,5%; etilenoglicol, 1,5% e 2,5%; e DMA, 2,5% e 5,0%. As amostras foram armazendadas em palhetas de 0,25 mL contendo 35 x 106 espermatozoides. Após 90 min a 20 °C as palhetas foram submetidas a uma curva de resfriamento até 5 °C (0,3 a 0,5 °C/mim) e mantidas a 5 °C por 60 min. O congelamento foi realizado a partir da colocação das palhetas horizontalmente a 5 cm acima do nitrogênio líquido por 10 min, com sua posterior imersão no nitrogênio líquido. Após o descongelamento a 37 °C por 30 segundos a qualidade espermática foi avaliada através de um sistema computadorizado e por citometria de fluxo. A motilidade espermática foi maior (P < 0,05) nos tratamentos com 5,0% e 2,5% DMA (22,2 ± 2,6% e 20,0 ± 2,8%, respectivamente) do que no tratamento com 2,5% etilenoglicol (8,2 ± 1,0%). A integridade da membrana plasmática (P = 0,08) e potencial de membrana mitocondrial (P = 0,27) foi similar entre os tratamentos. O tratamento com 2,5% de etilenoglicol foi menos eficiente em manter membrana acrossomal intacta (P< 0,01). Alguns parâmetros de cinética espermática (DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL e ALH) foram afetados positivamente pelo uso de DMA a 5.0%. O protocolo simplificado para congelamento de sêmen suíno resultou em motilidade espermática insatifatória após o descongelamento, independente do crioprotetor utilizado.

Degradation of bovine small intestine and respective effects on biomechanics have not been described to date. Biomechanical testing of intestinal tissues is often carried out within a few hours of donor death and tissue deterioration is not accounted for. Freezing is efficient for the preservation of several tissues; however, it may cause cellular damage. This study investigated the morphologic and biomechanical changes of bovine jejunum at different postmortem moments. Effects of freezing and thawing on morphology and biomechanical behavior were also examined. Macroscopic changes were first noted within eight hours of death. At this time, histologic changes also started to set in, and biomechanical tests revealed lower bursting pressure (203.10±46.14mmHg). At 12 hours, tissue rearrangement was noted, and bursting pressure increased (238.43±31.04mmHg). A second drop in pressure was detected at 18 hours (235.20±38.21mmHg), followed by a progressive drop until the end of the experimental period. Histologic changes revealed progressive deterioration. Mechanical resistance did not differ between thawed and fresh specimens. It was concluded that bovine jejunal specimens retain biomechanical resistance up to 6 hours after death. Freezing and thawing did not affect the mechanical resistance of the intestinal wall in this experimental model. RESUMO A degradação do intestino delgado de bovinos e seu efeito biomecânico não são descritos na literatura. Trabalhos que envolvem a biomecânica intestinal realizam os ensaios em poucas horas após o óbito dos doadores, sem avaliação de seu estado de deterioração. O congelamento é eficiente na conservação de vários tecidos, porém pode provocar danos em nível celular. Este estudo teve por objetivo avaliar a degradação morfológica e biomecânica do jejuno de bovinos em diferentes tempos post mortem. O efeito do congelamento e do descongelamento sobre essas características também foi avaliado. As primeiras alterações macroscópicas foram observadas oito horas após o óbito. No mesmo momento, se iniciaram as alterações histológicas e a menor pressão suportada ao teste biomecânico (203,10±46,14mmHg). A partir de 12 horas, o tecido sofreu um rearranjo, suportando maior pressão (238,43±31,04mmHg). Uma segunda queda foi detectada após 18 horas (235,20±38,21mmHg), seguida de redução progressiva até o término do experimento. As lesões histológicas foram progressivas e graduais. As amostras testadas após descongelamento não apresentaram diferença estatística quanto à resistência mecânica em comparação com os espécimes frescos. Concluiu-se que as amostras mantêm sua resistência biomecânica até 6 horas após o óbito. Também se mostrou que o congelamento e o descongelamento, nas condições testadas, não alteraram a resistência mecânica da parede intestinal.

Toxoplasma gondii can be eliminated in bovine semen. Cryopreserved semen is often used due to the fact that artificial insemination in dairy and beef cattle provides benefits in terms of production. However, little is known regarding the viability and infectivity of T. gondii tachyzoites in cryopreserved bovine semen. In the present study, cattle semen negative for T. gondii were contaminated with 1 x 106 tachyzoites (RH strain) and cryopreserved with and without different cryoprotectants, such as DMSO (concentrations of 2.5%, 5.0%, 7.5%, 8.0% and 10.0%) and glycerol (2.25%, 2.5%, 3.0%, 5.0%, 7.5% and 10.0%), followed by freezing in liquid nitrogen (-196°C). After 24 hours, the samples were thawed and inoculated in 10 mice per cryoprotectant concentration. The mice were evaluated for clinical signs of toxoplasmosis (rough coat, diarrhea, hypoactivity and sudden death) as well as serum titers of IgM and IgG and the presence of tachyzoites in the peritoneal lavage. The results revealed that T. gondii remained infective in all samples. Clinical signs of toxoplasmosis were observed in the mice beginning with the 6th day post-inoculation (DPI) and 100% lethality was found between the 7th and 9th DPI. Viable tachyzoites were recovered from peritoneal exudate of dead mice (except for the control group), with higher mean of tachyzoite counts in the intraperitoneal lavage for 5% DMSO (±3.32 x 106), 8% DMSO (±3.53 x 106), 3% glycerol (±4.75 x 106), 7.5% glycerol (±6.26 x 106) and the absence of cryoprotectant (±3.11 x 106). Seroconversion occurred in the treated groups, with titers of IgG from 1:16 to 1:128 and IgM from 1:16 to 1:512. T. gondii viability and infectivity were maintained in cattle semen during 24 hours of cryopreservation at -196°C with and without cryoprotectant. However, further studies are necessary to determine whether cryopreserved semen contributes to the spread of toxoplasmosis through artificial insemination. RESUMO: Sabe-se que Toxoplasma gondii pode ser eliminado no sêmen bovino. A inseminação artificial em bovinos leiteiros e de corte proporcionou avanços e benefícios nas produções e para isso o sêmen criopreservado é frequentemente utilizado. No entanto, pouco se sabe sobre a viabilidade e infectividade dos taquizoítos de T. gondii em sêmen bovino criopreservado. Para isso o sêmen bovino, negativo para T. gondii, foi contaminado com 1x106 taquizoítos (cepa RH), criopreservados com ou sem diferentes crioprotetores como DMSO (2.5%, 5.0%, 7.5%, 8.0% e 10.0%) e Glicerol (2.25%, 2.5%, 3.0%, 5.0%, 7.5% e 10.0%) e congelados em nitrogênio líquido (-196°C). Após 24 horas, essas amostras foram descongeladas e inoculadas em 10 camundongos por diluente de concentração de crioprotetor. Os camundongos foram avaliados quanto a sinais clínicos de toxoplasmose (pele áspera, diarreia, hipoatividade e morte súbita), títulos séricos de IgM e IgG e presença de taquizoítos no lavado peritoneal. Os resultados mostraram que T. gondii se manteve infectante em todas as amostras, inclusive naquelas sem crioprotetor. Sinais clínicos de toxoplasmose foram observados nos camundongos a partir do 6º dia pós-inoculação (DPI) e 100% de letalidade foi verificada entre o 7º ao 9º DPI. Nos camundongos mortos, exceto no grupo controle, taquizoítos viáveis foram recuperados do exsudato peritoneal, com maior média de taquizoítos quantificados na lavagem intraperitoneal para DMSO a 5% (±3.32x106), 8% (±3.53x106) e glicerol 3% (±4.75x106), 7,5% (±6.26x106) e livre de crioprotetor (±3.11x106). A soroconversão ocorreu nos grupos tratados com títulos de IgG (1:16 a 1:128) e IgM (1:16 a 1:512). A viabilidade e infectividade do T. gondii no sêmen bovino durante as 24 horas de criopreservação a -196°C foram mantidas com ou sem crioprotetor. No entanto, mais estudos são necessários para verificar se o sêmen criopreservado contribui para a disseminação da toxoplasmose na inseminação artificial.

The quality of post-thawing goat sperm is critical to the success of artificial insemination protocols and may be influenced by extenders, cryoprotectants, and antioxidant substances. Therefore, the objective of this study was to evaluate the effects of the antioxidant anethole on goat sperm diluted in preservation medium based on powdered coconut water (ACP-101c) and frozen. For that, each ejaculate was submitted to the following treatments: ACP-101c (control); control plus supplementation with 30, 300, or 2000 µg/mL anethole. The samples were thawed and evaluated for morphology, kinetics, membrane integrity, and reactive oxygen species (ROS). The addition of anethole increased morphological abnormalities (P < 0.05), however, it did not affect sperm kinetics. Flow cytometry analysis showed that sperm cells cryopreserved with 300 µg/mL anethole had lower acrosome integrity than those cryopreserved in other treatments. Evaluation of oxidative stress revealed that cells stored in the presence of 2000 µg/mL anethole had small amounts of ROS when compared to those preserved in the control medium alone or supplemented with 300 µg/mL anethole (P < 0.05). After cryopreservation of sperm with 2000 µg/mL anethole, the highest percentage of viable sperm without ROS was observed (P < 0.05). In conclusion, despite reducing ROS levels, the supplementation of anethole in ACP-101c did not affect sperm kinetics or membrane integrity post-thawing, however, it did cause morphological damage to sperm. A qualidade do espermatozoide caprino pós-descongelação é crítica para o sucesso dos protocolos de inseminação artificial e pode ser influenciada por extensores, crioprotetores e substâncias antioxidantes. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do antioxidante anetole sobre espermatozoides caprinos diluídos em meio de conservação à base de água de coco em pó (ACP-101c) e congelados. Para tanto, cada ejaculado foi submetido aos seguintes tratamentos: ACP-101c (controle); controle mais suplementação com 30, 300 ou 2000 ug / mL de anetole. As amostras foram descongeladas e avaliadas quanto à morfologia, cinética, integridade de membranas e espécies reativas de oxigênio. A adição de anetole aumentou as anormalidades morfológicas (P < 0,05), no entanto, não afetou a cinética dos espermatozoides. A análise da citometria de fluxo mostrou que as células de esperma criopreservadas com 300 ug / mL anethole tinham integridade acrosma menor do que aquelas criopreservadas em outros tratamentos. A avaliação do estresse oxidativo revelou que as células armazenadas na presença de 2000 ug / mL anethole apresentaram pequenas quantidades de ROS quando comparadas às preservadas em meio de controle isoladamente ou suplementadas com 300 ug / mL anethole (P < 0,05). Após a criopreservação de espermatozoides com 2000 ug / mL anethole, observou-se a maior porcentagem de espermatozoides viáveis sem ROS (P < 0,05). A população com espermatozoides viáveis sem ROS foi maior quando utilizado 2.000 ug / mL (P < 0,05). Em conclusão, apesar de reduzir os níveis de ROS, a suplementação de anetole em ACP-101c não afetou a cinética espermática e a integridade da membrana pós-descongelação, entretanto, causou danos morfológicos nos espermatozoides.

Several snake species are under some degree of extinction threat, generated mainly by human poaching, based on mystical-religious fear, and habitat loss. However, it is possible to avoid extinction processes by using reproductive biotechnologies with the purpose of producing offsprings in order to reinsert these species in their natural environment. In this regard, the objective of this study is to conduct a scientometric survey about assisted reproduction in snakes in the last 50 years, without a geographical cut-off. Web of Science, Scopus, Science Direct, Pub Med, Scielo and Google Academic databases were used with the term: snake sperm and snake artificial insemination. In total, 22 papers related to the theme were selected, 21 of them published in 16 different journals, and one book chapter. The Google Scholar database presented 100% of the selected materials, being the most complete platform among those evaluated. Regarding the authorship of these studies, 19 research institutions from five countries actively participated in their production. An average productivity of 0.53 studies per year was found, starting from the first publication in 1980. The species Elaphe gutatta was the most commonly used model, participating in 4 (19.04%) surveys. We conclude that reproduction biotechnologies applied to snakes has a good adherence in scientific journals, and has a high potential to be used as a conservationist tool in the taxon, however, new studies, with more solid methodologies, are necessary to validate this technological resource, especially in relation to artificial insemination, which is the major target of this field. Muchas especies de serpientes se encuentran en algún grado de amenaza de extinción, generada principalmente por la caza depredadora humana, basada en el miedo místico-religioso y la pérdida de hábitat. Sin embargo, es posible evitar los procesos de extinción mediante el uso de biotecnologías reproductivas con el fin de producir descendencia para la reinserción al medio natural de estas especies. En este sentido, el objetivo de este trabajo es realizar un relevamiento cienciométrico sobre la reproducción asistida en serpientes, en los últimos 50 años sin corte geográfico. Las búsquedas se realizaron en las siguientes bases de datos: Web of Science, Scopus, Science Direct, Pub Med, Scielo y Google Scholar, utilizando los términos: espermatozoide de serpiente y inseminación artificial de serpiente. En total se seleccionaron 22 artículos relacionados con el tema, de los cuales 21 fueron publicados en 16 revistas diferentes y un capítulo de libro. La base de datos de Google Scholar presentó el 100% de los materiales seleccionados, siendo la plataforma más completa entre las evaluadas. En cuanto a la autoría de estos estudios, 19 instituciones de investigación de cinco países participaron activamente en esta producción. Calculamos una productividad promedio de 0,53 estudios por año, desde la primera publicación de 1980. La especie Elaphe gutatta fue el modelo más utilizado, participando en 04 (19,04%) estudios. Concluimos que las biotecnologías reproductivas aplicadas al grupo de serpientes tienen una buena adhesión en revistas científicas, y tienen alto potencial para ser utilizadas como herramienta conservacionista en el taxón, sin embargo, se necesitan más estudios, con metodologías más sólidas, para validar este recurso tecnológico, principalmente en relación con la inseminación artificial, que es el principal objetivo en este ámbito. Diversas espécies de serpentes encontram-se com algum grau de ameaça de extinção, gerados principalmente pela caça predatória humana, fundamentada no medo místico-religioso, e perda de habitat. Contudo, é possível evitar processos de extinção a partir da utilização de biotecnologias reprodutivas com a finalidade de produção de prole para reinserção no ambiente de ocorrência natural dessas espécies. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho é realizar um levantamento cienciométrico sobre a reprodução assistida em serpentes, nos últimos 50 anos sem recorte geográfico. Foram realizadas buscas nas bases de dados: Web of Science, Scopus, Science Direct, Pub Med, Scielo e Google Acadêmico, utilizando os termos: snake sperm e snake artificial insemination. No total, foram selecionados 22 trabalhos relacionados à temática, sendo 21 deles publicados em 16 periódicos distintos, e um capítulo de livro. A base de dados Google Acadêmico apresentou 100% dos materiais selecionados, sendo a plataforma mais completa dentre as avaliadas. Em relação a autoria desses estudos, 19 instituições de pesquisa de cinco países participaram ativamente dessa produção. Calculamos uma média de produtividade de 0,53 estudos por ano, a partir da primeira publicação que data de 1980. A espécie Elaphe gutatta foi o modelo mais utilizado, participando de 04 (19,04%) pesquisas. Concluímos que as biotecnologias da reprodução aplicada no grupo das serpentes têm uma boa aderência em periódicos científicos, e possui elevado potencial para ser utilizado como ferramenta conservacionista no táxon, contudo, novos estudos, com metodologias mais sólidas, são necessários para validar esse recurso tecnológico, sobretudo em relação à inseminação artificial, que é o grande alvo dessa área.

Submitted by Jeferson Carlos da Veiga Rodrigues (jveigar@unisinos.br) on 2022-12-12T11:54:41Z No. of bitstreams: 1 Guilherme Dahmer Steffenon_PROTEGIDO.pdf: 3672437 bytes, checksum: 066c0abe17264dc0e4753aeaa2eacd7f (MD5) Made available in DSpace on 2022-12-12T11:54:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guilherme Dahmer Steffenon_PROTEGIDO.pdf: 3672437 bytes, checksum: 066c0abe17264dc0e4753aeaa2eacd7f (MD5) Previous issue date: 2022-09-29 Nenhuma A criopreservação celular é um ramo da ciência que descreve metodologias para conservar células vivas através do congelamento e conservação em temperaturas negativas. Tendo isso em vista, algumas pesquisas estudam o processo de congelamento celular das mais diferentes maneiras, podendo ele ser classificado entre congelamento lento e rápido (vitrificação). Com isto, o presente trabalho visa estudar experimentalmente o método de vitrificação por evaporação de filme fino de nitrogênio para criopreservação celular. Este estudo conta com uma comparação experimental entre o método de evaporação de filme fino e o método de imersão, utilizando nitrogênio líquido como refrigerante e água como amostra em ambos os casos. O estudo experimental utilizou diferentes seções de testes, com diferentes dimensões e composições, visando identificar o melhor layout para otimizar a taxa de resfriamento. Além do estudo experimental, o trabalho também desenvolveu uma metodologia numérica para descrever o processo estudado por meio de simulações computacionais em CFD utilizando o software Ansys Fluent ®. A simulação numérica estudada considerou uma geometria em 2D, utilizando método de turbulência k-ω e solidificação para simular todos os processos que ocorrem na evaporação de filme fino. Os resultados experimentais encontrados apresentaram uma maior taxa de congelamento nos métodos de imersão, apresentando valores de aproximadamente 900°C/min. Já o método de evaporação de filme fino, no melhor caso estudado encontrou cerca de 500 °C/min. Por fim, a simulação numérica também conseguiu prever o início do processo de congelamento, demonstrando os perfis de escoamento de nitrogênio, variação de temperatura e o processo de solidificação da amostra. Cell cryopreservation is a branch of science that describes methodologies to preserve living cells through freezing and conservation at negative temperatures. With this in mind, some researchers study the process of cellular freezing in the most different ways, and it can be classified between slow and fast freezing (vitrification). So the present work aims to experimentally study the method of vitrification by thin film evaporation of nitrogen for cellular cryopreservation. This study has an experimental comparison between the thin film evaporation method and the immersion method, using liquid nitrogen as coolant and water as a sample in both cases. The experimental study used different test sections, with different dimensions and compositions, in order to identify the best layout to optimize the cooling rate. In addition to the experimental study, the work also developed a numerical methodology to describe the process studied through computer simulations in CFD using Ansys Fluent ® software. The numerical simulation studied considered a 2D geometry, using k-ω turbulence method and solidification method to simulate all the processes that occur in thin film evaporation. The experimental results showed a higher freezing rate in the immersion methods, presenting values of approximately 900°C/min. The thin film evaporation method, in the best case studied, found a freezing rate of 500 °C/min. Finally, the numerical simulation was also able to predict the beginning of the freezing process, demonstrating the nitrogen flow profiles, temperature variation and the solidification process of the sample.

Campylobacter is considered a fragile microorganism ans sensitive to environmental conditions, but demostrate strategies to survive in unfavorable environmental conditions. This study evaluated the viability and production of transcipts of the genes sodB, p19 ciaB and dnaJ in strains ATCC 33291, NCTC 11351 and IAL 2383 stored in UHT milk and neopeptona + 12% glycerol,whether or not subject to the pre-treatment temperature of 4°C or 10°C for 30 minutes.Analyses were performed immediately after freezing in liquid nitrogen (day 0) and after maintenance for 30, 60 and 90 days at -20°C.The viability was evaluated by traditional method of cultivation and production of transcripts by RT-PCR technique. The quantification was only possible on the first day of analysis (day 0) and had a mean of 3.0x107UFC and in the remaining periods of storage strains showed confluent growth not allowing their enumeration. The set of results has shown that the UHT milk was the most appropriate for cryopreservation than the use of neopeptona +12% glycerol. The pretreatment at 4°C for 30 minutes favored the production of transcripts for ciaB and dnaJ genes. For the strains ATCC 33291 and NCTC 11351 was verified a possible interconnection of sodB genes and p19, however, this link was not observed for the strain IAL 2383, which also showed different behavior from other strains for viability in both cryoprotectants and production of transcripts. The results of this study show that when the maintenance of viability of the strains is essential, it is necessary to use different combinations of cryoprotectants / treatments to increase the chances of recovery and, when the primary purpose is the production of transcripts, the option to maintain the reliability of the results is the immediate extraction of DNA of isolated strains. Campylobacter é considerado um microrganismo frágil e sensível às condições ambientais, mas que demonstram possuir estratégias para sobreviver em condições ambientais desfavoráveis. Este estudo avaliou a viabilidade e produção de transcritos dos genes sodB, p19, ciaB e dnaJ em cepas ATCC 33291, NCTC 11351 e IAL 2383 armazenadas em leite UHT integral e neopeptona + glicerol 12%, submetidas ou não a pré-tratamentos à temperatura de 4°C ou 10°C por 30 minutos. As análises foram realizadas imediatamente após o congelamento em nitrogênio líquido (dia 0) e após manutenção por 30, 60 e 90 dias a -20ºC. A viabilidade foi avaliada pelo método tradicional de cultivo e a produção de transcritos pela técnica do RTPCR. A quantificação só foi possível no primeiro dia de análise (dia 0) e apresentaram média de 3,0 x 107 UFC, sendo que nos demais períodos de armazenamento as cepas apresentaram crescimento confluente não permitindo sua enumeração. O conjunto de resultados permitiu verificar que o leite UHT integral foi mais adequado para a criopreservação que o uso da neopeptona + glicerol 12%. O pré-tratamento a 4ºC por 30 minutos favoreceu a produção de transcritos para os genes ciaB e dnaJ. Para as cepas ATCC 33291 e NCTC 11351 foi verificada uma possível interligação dos genes sodB e p19, entretanto, esta ligação não foi observada para a cepa IAL 2383, que também mostrou comportamento diferente das outras cepas quanto à viabilidade nos dois crioprotetores e produção de transcritos. Os resultados obtidos neste estudo permitem concluir que quando a manutenção da viabilidade das cepas é essencial, faz-se necessário o uso das diferentes combinações crioprotetor/tratamentos para aumentar as chances de recuperação e, quando o objetivo principal é a produção de transcritos, a opção para manter a fidedignidade dos resultados é a extração imediata do DNA das estirpes isoladas. Mestre em Ciências Veterinárias

This study aimed to evaluate different antioxidants in embryo culture after vitrification, with or without the previous use of hydrostatic pressure (PH). Considering this, three experiments were designed to evaluate the interaction between PH and antioxidants (β-mercaptoethanol - BME, cysteamine - CYST and BME + CYST) in fresh and vitrified in vitro produced embryos. In experiment 1 hatching and degeneration rates were evaluated with 24 and 48 hours after passing through the PH and in experiment 2, the same parameters were evaluates at 12, 24, 48 and 72 hours after heating. The last step of the study evaluated the pregnancy rate of vitrified embryos, cultured for 12 hours with / without antioxidant. The first experiment showed no difference between treatments the differences, independent of the treatment, were obtained between expanded blastocyst (BX) and blastocyst (BL). The second experiment found similar results for all parameters evaluated in embryos BX. Note that the BME + cyst treatment got better hatching rate in the BL with 48 and 72 hours (76.04%) than the control group (45.83%). The same behavior was observed in degeneration 24 hours, where the BME + CYST group was 7.29 % against 32.29% in the control group. However, the pregnancy rates (55 embryo transfers) were not different between groups control fresh, control vitrified and BME (38.9%, 16.7% and 31.6%, respectively). This study showed that the use of hydrostatic pressure and antioxidant had no effect in the evaluated parameters. However. there is a significant improvement to BL embryos when combining BME + CYST in the culture medium after vitrification. Objetivou-se com o presente trabalho avaliar o efeito de dois antioxidantes no cultivo de embriões pós desvitrificação, associados ou não à pressão hidrostática (PH). Três distintos e complementares experimentos foram delineados. O primeiro consistiu em avaliar uma possível interação entre PH e antioxidante (β-mercaptoetanol - BME, cisteamina CYST e BME + CYST). O segundo foi similar ao primeiro, entretanto, os embriões foram vitrificados uma hora após passarem ou não pela PH. Os parâmetros avaliados foram taxas de eclosão e degeneração com 24 e 48 horas após passar pela PH (exp. 1) e 12, 24, 48 e 72 horas pós desvitrificação (exp.2) A última etapa do trabalho avaliou a taxa de prenhez de embriões cultivados por 12 horas com/sem antioxidante (exp.3). O primeiro experimento não demonstrou qualquer tipo de interação entre os tratamentos quando o estágio embrionário foi desconsiderado. Houve significância para todos os parâmetros ao confrontar blastocisto expandido (BX) e blastocisto (BL). No segundo experimento os resultados foram similares para todos os parâmetros avaliados em embriões BX. O tratamento BME + CYST obteve melhor taxa de eclosão dos BL com 48 e 72 horas (76,04%) do que o grupo controle (45,83%). O mesmo comportamento ocorreu para a taxa de degeneração às 24 horas (grupo BME + CYST = 7,29% contra 32,29% do grupo controle). Entretanto, ao transferir os embriões (n= 55), percebeu-se uma similaridade nas taxas de prenhez do grupo controle fresco, controle vitrificado e BME (38,9%; 16,7% e 31,6%, respectivamente). O presente trabalho mostrou que o uso da pressão hidrostática e de BME e CYST não influencia, a partir dos parâmetros avaliados, as taxas de eclosão e degeneração de embriões vitrificados. Contudo, há uma melhoria significativa para embriões BL quando se associa BME + CYST no meio de cultivo pós desvitrificação. Mestre em Ciências Veterinárias

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia A infertilidade masculina é um problema que pode ser consequência de problemas oncológicos, bem como dos tratamentos sobre os mesmos, uma vez que podem atacar diretamente ou os testículos ou o eixo HPG – que são essenciais para o bom funcionamento da espermatogénese e, consequentemente, para a produção dos espermatozoides. Isto, associado a um crescente aumento da taxa de sobrevivência ao cancro, faz com que seja crucial informar os utentes de modo a não haver dúvidas sobre as diversas estratégias de preservação da fertilidade, bem como das técnicas disponíveis para a procriação medicamente assistida. Posto isto, este estudo foi realizado com o objetivo de perceber quais as informações que são passadas aos utentes, em que altura e de que forma. Foram realizadas entrevistas a um grupo de 53 homens (entre os 18 até aos 45 anos), que criopreservaram em momentos diferentes, uns entre 2012 e 2017 e outros entre janeiro e maio de 2022. Foi possível perceber que, efetivamente existem questões a serem melhoradas, nomeadamente na forma como as informações são dadas, o formato das mesmas e também o momento a serem dadas. Verificou-se que os utentes não retêm as informações dadas oralmente, percebendo-se que existe a necessidade de complementar as mesmas com suporte escrito. Como resultado destas entrevistas, foi possível criar um panfleto informativo, baseado na literatura e nos questionários realizados, que será posteriormente entregue a futuros doentes oncológicos que irão criopreservar no serviço. Além do panfleto informativo, é importante que seja atualizado o website oficial, de modo que os utentes tenham mais facilidade em procurar as diferentes informações acerca da preservação da fertilidade. Male infertility is a problem that can be a consequence of oncological diseases, as well as their treatment, since they can directly attack either the testes or the HPG axis – that are essential for the proper functioning of spermatogenesis and, consequently, to sperm production. This, associated with an increasing cancer survival rate, makes it crucial to inform patients in a way that leaves no doubts about the different fertility preservation strategies, as well as the techniques available for medically assisted procreation. This way, this study was carried out in order to understand what information is passed to patients, when and how. Interviews were conducted with a group of 53 men (18 years to 45 years old) who cryopreserved at different times: some between 2012 and 2017 and others between january and may 2022. It was possible to perceive that, indeed, there are issues to be improved, namely in the way the information is given, its format and also the timing. It was verified that patients do not retain the information given orally, and that there is a need to complement it with written support. As a result of these interviews, it was possible to create an informative pamphlet, based on science and the results of questionnaires, which will later be delivered to future cancer patients who will cryopreserve at the service. In addition to the information leaflet, it is important that the official website suffers some updates, so that patients have an easier access to different information about the fertility preservation.

The aim this paper was investigate the biology of incorporation of autologous and allogeneic onlay grafts to mandible of rabbits in association or not with Platelet Rich Plama (PRP). Forty animals composed this experiment. Bones were harvested from the wing of ilium and onlay grafted bilaterally to mandible cortex. Half of the animals received fresh autologous bone and the others received allogeneic bone previously frozen under -70ºC for 120 days. On the right side of the mandible, PRP was added. Euthanasia of the animals took place after 3, 7, 14, 28 and 56 days. Histological sections were stained with hematoxilin and, eosin, toluidin blue, picro-sirius and TRAP. For immunohistochemical study, anti-CD79αcγ, anti-CD3 and anti-RAM11 antibodies were considered. At all variables studied, a superiority on the behavior of allogeneic grafts, especially in the latest periods of grafting was observed. The largest amount of macrophages was detected around allogeneic bones, despite it being the less absorbed. The presence of PRP did not modify the behavior of those variables in a statistically significant way. The frozen allogeneic bone represented a good material for the thickening of the jaw and did not induce immunological reaction. PRP was not effective in improving the healing of onlay bone grafts. El objetivo de este trabajo fue investigar la biología de la incorporación de injertos onlay autólogos y alogénicos a la mandíbula de conejos en asociación o no con Plaqueta Rica en Plaquetas (PRP). Cuarenta animales compusieron este experimento. Los huesos se extrajeron del ala del ilion y se injertaron de manera bilateral en la corteza mandibular. La mitad de los animales recibieron hueso autólogo fresco y el resto hueso alogénico previamente congelado a -70ºC durante 120 días. En el lado derecho de la mandíbula, se agregó PRP. La eutanasia de los animales tuvo lugar después de 3, 7, 14, 28 y 56 días. Las secciones histológicas se tiñeron con hematoxilina y eosina, azul de toluidina, picro-sirius y TRAP. Para el estudio inmunohistoquímico se consideraron anticuerpos anti-CD79αcγ, anti-CD3 y anti-RAM11. En todas las variables estudiadas se observó una superioridad sobre el comportamiento de los injertos alogénicos, especialmente en los últimos periodos de injerto. La mayor cantidad de macrófagos se detectó alrededor de los huesos alogénicos, a pesar de ser los menos absorbidos. La presencia de PRP no modificó el comportamiento de dichas variables de forma estadísticamente significativa. El hueso alogénico congelado representó un buen material para el engrosamiento de la mandíbula y no indujo reacción inmunológica. El PRP no fue eficaz para mejorar la cicatrización de los injertos óseos onlay. O objetivo deste trabalho foi investigar a biologia da incorporação de enxertos onlay autólogos e alogênicos em mandíbula de coelhos em associação ou não com Plama Rico em Plaquetas (PRP). Quarenta animais compuseram este experimento. Os ossos foram colhidos da asa do ílio e onlay enxertados bilateralmente no córtex da mandíbula. Metade dos animais recebeu osso autólogo fresco e os demais receberam osso alogênico previamente congelado a -70ºC por 120 dias. No lado direito da mandíbula, foi adicionado PRP. A eutanásia dos animais ocorreu após 3, 7, 14, 28 e 56 dias. Os cortes histológicos foram corados com hematoxilina e, eosina, azul de toluidina, picro-sirius e TRAP. Para o estudo imuno-histoquímico, foram considerados os anticorpos anti-CD79αcγ, anti-CD3 e anti-RAM11. Em todas as variáveis ​​estudadas, observou-se superioridade no comportamento dos enxertos alogênicos, principalmente nos períodos mais tardios de enxertia. A maior quantidade de macrófagos foi detectada ao redor dos ossos alogênicos, apesar de ser o menos absorvido. A presença do PRP não modificou o comportamento dessas variáveis de forma estatisticamente significativa. O osso alogênico congelado representou um bom material para o espessamento da mandíbula e não induziu reação imunológica. O PRP não foi eficaz em melhorar a cicatrização de enxertos ósseos onlay.

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A criopreservação induz uma série de modificações físicas e bioquímicas nos espermatozoides que levam a alterações na célula espermática. Estas alterações estão associadas à perda da motilidade, ruptura da membrana plasmática e acrossomal, estresse oxidativo, entre outras, promovendo danos irreversíveis ao espermatozoide. Além de fatores relacionados a cadela, como momento da ovulação, oócitos imaturos, e local de inseminação, a utilização de sêmen canino criopreservado é prejudicada pela viabilidade espermática pós-descongelação, que em muitas vezes pode ser baixa em decorrência de danos tanto na estrutura quanto na função dos espermatozoides e podem ser atribuídos ao choque térmico durante a congelação. Esses danos podem ser diminuídos com o uso de diluentes adequados para a criopreservação. Assim, o objetivo deste estudo é avaliar a eficácia de três diluentes comerciais para congelação de sêmen canino, sendo 2 a base de gema de ovo (Gema1 e Gema2) e 1 a base de lecitina de soja (Lecitina), sobre a qualidade espermática pós-descongelação. O estudo foi dividido em 2 experimentos, no experimento 1 foram 10 animais utilizados. Após a colheita, cada ejaculado foi dividido em 3 alíquotas iguais, diluídos nos respectivos meios de congelação na concentração de 100x106 espermatozoides/mL, envazados em palhetas de 0,5mL, submetidos à congelação obedecendo os critérios de estabilização de acordo com os fabricantes, e armazenadas em nitrogênio líquido. No experimento 2, foram selecionados os dois melhores diluentes do experimento 1 para nova avaliação e comparação, aumentando o número de amostras diminuindo assim o erro amostral, então foram adicionados mais 5 animais aumentando o número de amostras em 50%. A descongelação foi realizada a 37ºC por 30 segundos. As amostras foram submetidas a análise computadorizada da cinética espermática pelo CASA e integridade das membranas e potencial mitocondrial por citometria de fluxo após descongelação. No experimento 1 os diluentes a base de gema de ovo apresentaram resultado significativamente superior em comparação ao meio a base de lecitina de soja, para os parâmetros de motilidade total, motilidade progressiva, espermatozoides com movimento rápido, integridade de membrana plasmática e acrossomal, estabilidade de membrana plasmática, e alto potencial mitocondrial. No experimento 2, os 2 melhores diluentes do experimento 1 foram os dois a base de gema de ovo, e houve diferença significativa entre os meios que apresentaram motilidade total de 59,9%±3,3 e 52,3%±2,2 para Gema1 e Gema2 respectivamente, na avaliação da membrana por citometria o meio Gema1 também apresentou melhores resultados que o meio Gema2, 54,5%±3,3 e 45,0%±4,0 para integridade de membrana plasmática e acrossomal, e 47,6%±4,5 e 37,3%±3,5 para estabilidade de membrana plasmática respectivamente. Em conclusão pode-se afirmar que a lecitina de soja não atingiu resultados satisfatórios para os parâmetros espermáticos avaliados comparados a gema de ovo, e entre os meios a base de gema de ovo o meio Gema1 apresentou resultados superiores para os parâmetros avaliados pós-descongelação para espécie canina. The use of frozen semen depends on maintaining some sperm attributes for successful fertilization of the oocyte, and the addition of cryoprotective substances promotes protection to the sperm during freezing. Cryopreservation induces a series of physical and biochemical changes in sperm that lead to changes in the sperm cell. These changes are associated with loss of motility, rupture of the plasma and acrosomal membrane, oxidative stress, among others, promoting irreversible damage to the sperm. In addition to factors related to the bitch, such as time of ovulation, immature oocytes, and site of insemination, the use of cryopreserved canine semen is impaired by post-thawing sperm viability, which can often be low due to damage to both structure and structure. in sperm function and can be attributed to heat shock during freezing. These damages can be reduced with the use of diluents suitable for cryopreservation. Thus, the objective of this study is to evaluate the effectiveness of three commercial extenders for canine semen freezing, 2 of which are egg yolk based (Gema1 and Gem2) and 1 are soy lecithin (Lecithin) on sperm quality post-thawing. The study was divided into 2 experiments, in experiment 1 10 animals were used. After collection, each ejaculate was divided into 3 equal aliquots, diluted in the respective freezing media at a concentration of 100x106 spermatozoa/mL, poured into 0.5mL straws, subjected to freezing according to the stabilization criteria according to the manufacturers, and stored in liquid nitrogen. In experiment 2, the two best diluents from experiment 1 were selected for further evaluation and comparison, increasing the number of samples, thus decreasing the sampling error, then 5 more animals were added, increasing the number of samples by 50%. Thawing was performed at 37°C for 30 seconds. The samples were submitted to computerized analysis of sperm kinetics by CASA and membrane integrity and mitochondrial potential by flow cytometry post-thawing. In experiment 1, the egg yolk-based extenders presented a significantly superior result compared to the soy lecithin-based medium, for the parameters of total motility, progressive motility, fast moving spermatozoa, plasma and acrosomal membrane integrity, stability of plasma membrane, and high mitochondrial potential. In experiment 2, the 2 best extenders of experiment 1 were both egg yolk-based, and there was a significant difference between the media that showed total motility of 59.9%±3.3 and 52.3%±2.2 for Gema1 and Gema2 respectively, in the evaluation of the membrane by cytometry, the Gema1 medium also presented better results than the Gema2 medium, 54.5%±3.3 and 45.0%±4.0 for plasma and acrosomal membrane integrity, and 47.6%±4.5 and 37.3%±3.5 for plasma membrane stability respectively. In conclusion, it can be stated that soy lecithin did not achieve satisfactory results for the evaluated sperm parameters compared to egg yolk, and among the egg yolk-based medium, the Gema1 medium showed superior results for the parameters evaluated after thawing for canine species.