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Orientador: Marciane Milanski Ferreira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas Resumo: O hipotálamo mediobasal é conhecido como o local primário que coordena o balanço entre a ingestão alimentar e o gasto energético. Nesse contexto, dietas com alto conteúdo de ácidos graxos saturados são apontadas como fatores dietéticos importantes responsáveis pelo desenvolvimento da obesidade. Dados recentes demonstraram que a autofagia, um processo que regula a homeostase celular por degradar organelas e proteínas disfuncionais, é crucial para a manutenção da funcionalidade de neurônios hipotalâmicos AgRP e POMC, que por sua vez, são responsáveis por coordenar o balanço energético corporal. Nesse trabalho, avaliamos a distribuição e o conteúdo de proteínas da maquinaria da autofagia em um modelo animal de obesidade induzida por dieta hiperlipídica com 8 ou 16 semanas de dieta e também em resposta a injeções intracerebroventriculares de ácido graxo esteárico. Demonstramos que a exposição crônica à dieta hiperlipídica levou ao aumento da expressão de marcadores inflamatórios e diminuição de autofagia. Além disso, o tratamento intracerebroventricular com ácido esteárico parece ser capaz de diminuir a autofagia em hipotálamo, sugerindo que ácidos graxos saturados podem ser os responsáveis pela diminuição da autofagia encontrada nos animais obesos. Por fim, a indução de autofagia em animais obesos com rapamicina foi capaz de melhorar a homeostase da glicose e reverter parâmetros inflamatórios e metabólicos, sem alterar o peso e a ingestão alimentar dos animais. Entender os mecanismos celulares e moleculares destes processos é crucial para identificar novos alvos terapêuticos para a obesidade Abstract: The mediobasal hypothalamus is known as the primary site which coordinates the balance between food ingestion and energy expenditure. In this context, diets with high content of saturated fatty acids are pointed as the main diet factor responsible for the development of obesity. Recent data have shown that autophagy, a process which regulates cellular homeostasis by degrading dysfunctional proteins and organelles, is crucial to maintain the functionality of hypothalamic AgRP and POMC neurons, which in turn are responsible for coordinate body energy homeostasis. In this study we evaluated the hypothalamic distribution and content of autophagy's machinery proteins in an animal model of diet-induced obesity at 8 or 16 weeks of high-fat diet and in response to intracerebroventricular injections of a saturated fatty acid. We demonstrate that chronic exposure to a high-fat diet can lead to an increased expression of inflammatory markers and downregulation of autophagy. Also, intracerebroventricular treatment with stearic acid appears to contribute to the decrease of hypothalamic autophagy, suggesting that saturated fatty acids can contribute to the downregulation of autophagy found in obese mice. Finally, induction of autophagy in obese mice with rapamycin was able to improved glucose homeostasis and reverse inflammatory and apoptosis markers, the main mechanisms involving dysregulation of energy balance related to hypothalamic neurons, while no weight loss was observed during the treatment Mestrado Metabolismo e Biologia Molecular Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo

Orientador: Marciane Milanski Ferreira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas Resumo: O excesso na ingestão calórica e a obesidade têm afetado um número crescente de pessoas em diferentes países, sendo que a obesidade durante a gestação e lactação desempenha impacto negativo no fenótipo prole. Na vida adulta, a obesidade e a sobrecarga de lipídeos constituem fatores que resultam no comprometimento da autofagia, um processo de degradação lisossomal essencial para a manutenção da homeostase celular. A autofagia é responsável pela degradação e reciclagem de componentes citoplasmáticos como organelas senescentes, proteínas agregadas ou mal formadas, microrganismos invasores e macromoléculas. Apesar do conhecimento acerca do prejuízo na atividade autofágica no contexto da obesidade, alterações na homeostase deste processo na prole de mães obesas ainda não foram investigadas. Neste estudo, foi avaliada a hipótese de que a obesidade materna induzida por dieta hiperlipídica seria capaz de modular proteínas da via autofágica no hipotálamo e no fígado da prole de camundongos. Embora sem nenhuma alteração na atividade de autofagia no hipotálamo, a prole de mães obesas ao nascimento (d0) apresentou prejuízo nos marcadores de autofagia no fígado representado por aumento no conteúdo proteico de p62 e diminuição no conteúdo proteico de LC3-II. Ao desmame (d18), a prole de mães obesas teve comprometimento no conteúdo proteico dos marcadores de autofagia em ambos os tecidos (fígado e hipotálamo) quando comparados à prole de mães magras. Após o desmame, a prole de mãe controle e a prole de mãe obesa receberam dieta controle até a vida adulta (d82). Nessa condição não houve modulação dos marcadores de autofagia em nenhum dos tecidos avaliados, sendo que somente a reexposição à dieta hiperlipídica (dos 42 dias até 82 dias) foi responsável por alterar o conteúdo proteico dos marcadores de autofagia quando comparados aos animais com dieta hiperlipídica sem reexposição. Assim, parece que dieta hiperlipídica é essencial para a modulação negativa dos marcadores de autofagia na prole de mães obesas. Em conclusão, a prole de mãe obesa apresentou comprometimento precoce de marcadores de autofagia no fígado e no hipotálamo, o que poderia estar associado ao desenvolvimento de distúrbios metabólicos na prole na idade adulta Abstract: The nutritional excess and obesity have affected a growing number of people in different countries, being that obesity during pregnancy and lactation has negative impact on offspring phenotype. In adulthood, obesity and lipids overload constitute factors that result in impairment of autophagy, a lysosomal degradation process essential for maintaining cellular homeostasis. Thus, autophagy is responsible for degradation and recycling of cytoplasmic components as senescent organelles, aggregated proteins or proteins poorly formed, microorganisms invaders and macromolecules. It is known that obesity and the use of high fat diet have a negative impact on cellular homeostasis. However, modulation of autophagy in the offspring of obese mothers has yet to be investigated. This study tested the hypothesis that maternal obesity induced by high fat diet would be able to modulate proteins of autophagy in the hypothalamus and liver of mice offspring. At birth (d0), the offspring exhibited prejudice in autophagy markers in liver and after weaning (d18) both tissues (liver and hypothalamus) had compromised autophagy markers. The animals receiving control diet after weaning until adulthood (d82) had no impairment of autophagy proteins in both tissues examined. However, when the animals were re-exposed to high-fat diet they had alteration in protein content of autophagy, when compared to animals with high fat diet without re-exposure. Thus, high fat diet seems to be essential for negative modulation of autophagy markers. In conclusion, the offspring of obese mothers presented early impairment of autophagy proteins in the liver and hypothalamus, which may be associated with the development of metabolic disorders in the offspring in adulthood Mestrado Metabolismo e Biologia Molecular Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo FAEPEX FAPESP

Orientadores: Marciane Milanski Ferreira, Adriana Souza Torsoni Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas Resumo: A autofagia é um processo de degradação lisossomal que mantém a viabilidade celular ao degradar, por exemplo, organelas senescentes e agregados proteicos. Alterações na atividade da autofagia parecem romper a homeostasia no controle do balanço energético hipotalâmico bem como prejuízo à atividade neuronal. Neste trabalho, o nosso objetivo foi investigar a relação entre lipídeos e modulação de autofagia neuronal. Para tanto, inicialmente utilizamos modelo de exposição aguda a dieta hiperlipídica (HFD) durante 1 e 3 dias. Nessas condições encontramos que a dieta é capaz de alterar parâmetros metabólicos e inflamatórios dos camundongos, associados a alterações na expressão gênica de marcadores de autofagia no tecido hipotalâmico. Apesar disso, a atividade global de autofagia parece estar preservada, visto que não foi possível observar diferença estatística no conteúdo proteico de importantes marcadores do processo em relação ao controle. Avaliamos também o efeito do uso intracerebroventricular (i.c.v) de palmitato (PA), importante ácido graxo saturado. Novamente, encontramos apenas alterações na expressão gênica dos marcadores de autofagia. Finalmente, em cultura de neurônios hipotalâmicos imortalizados que expressam Npy/AgRP, encontramos que o PA caracterizou-se como importante indutor da atividade de autofagia, associado a perturbações na viabilidade celular. Interessantemente, não houve indução no processo autofágico quando utilizamos uma mistura de ácidos graxos contendo representantes saturados e insaturados. Além disso, o ácido graxo palmitoleico (PO), importante ácido graxo insaturado que possui o mesmo número de carbonos do que o palmitato, foi capaz de diminuir a atividade de autofagia nos neurônios. Ao realizar um co-tratamento entre PA combinado com PO, encontramos que a autofagia induzida em resposta ao PA foi atenuada. O mesmo efeito foi encontrado quando realizamos o pré-tratamento com a droga miriocina, importante inibidor da síntese de de novo ceramidas. Avaliamos também a influência da via de TLR4 na indução de autofagia em resposta ao PA por meio do bloqueio do receptor pelo uso da droga TAK242. Encontramos que nessas condições o PA permaneceu induzindo a autofagia, independente do uso ou não da droga. Assim, concluímos nesse projeto que o grau de saturação da cadeia de ácidos graxos parece ser responsável por diferentes perfis de modulação de autofagia neuronal, sendo que a síntese de de novo ceramidas parece ser importante alvo promissor relacionado a ativação de autofagia em resposta ao palmitato. O estabelecimento da relação entre lipídios dietéticos e modulação de autofagia em neurônios que controlam a ingestão alimentar pode representar importante passo na identificação de alvos terapêuticos para o controle da obesidade, importante problema de saúde pública da atualidade Abstract: Autophagy is a lysosomal degradation pathway that helps cells to sustain viability by degrading, for example, senescent organelles and protein aggregates. Alterations in autophagy activity in the hypothalamus tissue seems to disrupt energy balance control as well as impairing neuronal activity. In this work, our objective was to investigate the relationship between lipids and neuronal autophagy modulation. Therefore, we initially used an acute exposure model by feeding animals with high fat diet (HFD) for 1 and 3 days. Under these conditions we found that the diet is capable of altering metabolic and inflammatory parameters of mice, associated with alterations in gene expression of autophagy markers in hypothalamic tissue. Nevertheless, the global autophagy activity seems to be preserved, since it was not possible to observe statistical difference in the protein content of important process markers. We also evaluated the effect of palmitate (PA) intracerebroventricular (i.c.v) treatment, an important saturated fatty acid. Again, we found only alterations in gene expression of autophagy markers. Finally, using culture of immortalized hypothalamic neurons expressing Npy / AgRP, we found that palmitate was characterized as an important inducer of autophagy activity, associated with disturbances in cell viability. Interestingly, there was no induction in the autophagic process when we used a mixture containing saturated and unsaturated fatty acids. In addition, palmitoleic (PO) fatty acid, an important unsaturated fatty acid that has the same number of carbons as PA, was able to decrease autophagy activity in neurons. When we performed a co-treatment between PA combined with PO, we found that the PA-induced autophagy was attenuated. The same effect was found when we pretreated the neurons with the drug miriocin, an important inhibitor of de novo ceramide synthesis. We also evaluated the influence of the TLR4 pathway on induction of autophagy in response to PA by blocking the receptor with the comercial drug TAK242. We found that under these conditions, PA remained inducing autophagy. Thus, we conclude in this project that the saturation of lipids chain seems to be responsible for different neuronal autophagy modulation profiles with and ceramide synthesis being an important promising target. The establishment of the relationship between dietary lipids and autophagy modulation in neurons that control food intake may represent an important step in identifying therapeutic targets for obesity control, an important public health problem in our society Doutorado Nutrição Doutora em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo FAPESP 2015257106

Orientadores: Marciane Milanski Ferreira, Adriana Souza Torsoni Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas Resumo: A obesidade é um problema de saúde global e está diretamente associada com o risco de desenvolvimento de outras doenças metabólicas. Um estilo de vida saudável, incluindo uma alimentação equilibrada, é essencial para a manutenção da eutrofia. Os mamíferos possuem um poderoso sistema que é responsável pela regulação da homeostasia energética, sendo que, no hipotálamo estão localizados neurônios relacionados com o acoplamento entre a fome e a saciedade. Estes neurônios são afetados pela ingestão excessiva de lipídeos, especialmente por ácidos graxos saturados de cadeia longa, e pela obesidade. Sabe-se que a obesidade é marcada pela presença de uma inflamação subclínica e alteração em diversas vias relacionadas ao estresse celular. Em camundongos com obesidade induzida por dieta hiperlipídica, há falha na regulação da macroautofagia e do sistema ubiquitina-proteasoma em neurônios do hipotálamo, que são mecanismos responsáveis pela proteostasia celular. Este trabalho teve como objetivo investigar a modulação de autofagia mediada por chaperonas em neurônios hipotalâmicos de animais obesos. Esse tipo de autofagia é responsável por degradar proteínas citosólicas que contém um motivo específico de aminoácidos, por meio da atuação principal de duas proteínas, denominadas de HSC-70 e LAMP-2A. Nossos resultados mostraram que animais que consumiram dieta hiperlipídica por 3 dias apresentaram maior ativação de autofagia mediada por chaperonas em hipotálamo. Após este período, houve menor ativação de autofagia mediada por chaperonas nesta região. Além disso, neurônios hipotalâmicos expostos ao palmitato, um ácido graxo saturado, apresentaram ativação de autofagia mediada por chaperonas. A exposição destes neurônios hipotalâmicos a um ambiente inflamatório também levou à ativação de autofagia mediada por chaperonas nessas células. Em situações de estresse celular, a ativação da autofagia mediada por chaperonas é essencial para a manutenção da proteostasia. Em contrapartida, a diminuição neste sistema leva a maior suceptibilidade celular a estímulos estressores. Portanto, o excesso de ácidos graxos saturados afeta a autofagia mediada por chaperonas em neurônios do hipotálamo, fato que pode contribuir para a disfunção neuronal e formação de agregados proteicos. A manutenção dos níveis basais de autofagia por meio de intervenções farmacológicas ou dietéticas pode representar uma terapia importante no tratamento de doenças metabólicas Abstract: Obesity has become a global health issue and is directly related to increased risk of developing other metabolic diseases. A healthy lifestyle, including a balanced diet, is essential for the maintenance of a healthy body mass. Mammals have a powerful system responsible for the regulation of energy homeostasis. Neurons from hypothalamus are responsible for the coupling between food intake and satiety. These neurons are affected by lipid excess, especially long-chain saturated fatty acids and obesity. A subclinical inflammatory state is the hallmark of obesity. Also, obesity leads to the dysregulation of several systems related to stress response. In mice with diet-induced obesity, there is a failure in the regulation of macroautophagy and ubiquitin-proteasome system in hypothalamic neurons. These systems are responsible for the cytosolic protein renewal and therefore for cellular proteostasis. This work aimed to study the chaperone-mediated autophagy modulation in obese mice. This type of autophagy is responsible for the degradation of proteins which have a specific amino acid motif. There are two main proteins responsible for chaperone-mediated autophagy machinery, called HSC-70 and LAMP-A. Our results showed an upregulation in chaperone-mediated autophagy in the hypothalamus of mice fed a high-fat diet for 3 days. Longer exposure to high-fat diet led to the downregulation in hypothalamic chaperone-mediated autophagy. Furthermore, direct exposure of hypothalamic neurons to palmitate, a saturated fatty acid, led to chaperone-mediated autophagy activation. After an insult, the activation of chaperone-mediated autophagy is essential for proteostasis maintenance. On the other hand, failure in this system could lead to increased cellular susceptibility to stressors. Thus, saturated fatty acid excess affects neuronal chaperone-mediated autophagy and this could contribute to neuronal dysfunction and protein aggregate formation in hypothalamic neurons. Therefore, the maintenance of basal chaperone-mediated autophagy levels with pharmacology or dietary interventions could represent an important therapy in the treatment of metabolic disorders Doutorado Metabolismo e Biologia Molecular Doutora em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo FAPESP 2013/10911-0

Orientadores: Raquel Franco Leal, Marciani Milanski Rodrigues Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: A retocolectomia total com reservatório ileal (RI) e anastomose ao canal anal tem sido considerada o tratamento cirúrgico padrão para doentes portadores de retocolite ulcerativa (RCU) refratária ao tratamento clínico e para pacientes com polipose adenomatosa familiar (PAF) com mais de 20 pólipos retais. Bolsite é uma das complicações mais comuns após este procedimento nos pacientes com RCU. Defeitos na autofagia têm sido relatados em doenças inflamatórias intestinais. No entanto, não há estudos na mucosa do RI. Objetivo: Avaliar marcadores moleculares de autofagia na mucosa do RI de pacientes com RCU ou com PAF comparando-os com controle de íleo distal normal. Casuística e Método: Dezesseis pacientes submetidos à retocolectomia total e confecção do RI em "J", assintomáticos e com RI endoscopicamente normal foram avaliados. O grupo controle foi constituído por 8 pacientes com colonoscopia normal. As biópsias foram congeladas em nitrogênio líquido e os níveis proteicos e transcricionais dos marcadores de autofagia foram avaliados por meio de imunoblot de extrato proteico total e por PCR em Tempo Real (qPCR), respectivamente. A ausência de ileíte do RI foi determinada por parâmetros clínicos, histológicos e endoscópicos, de acordo com o Índice de Atividade da Ileíte do RI. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Unicamp e os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). Utilizaram-se testes não paramétricos para a análise estatística. Nível de significância adotado foi p