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The aim of this thesis was to investigate if and how repertoire focusing of epitope-specific T cells during chronic viral infection reflects selection based on structural avidity. Structural avidity decreased during chronic infection and was associated with expansion of low avidity T cells. Loss of immunodominance of high avidity T cells was likely caused by replicative senescence. Clonal succession towards lower avidity TCRs would in turn explain the observed reverse TCR repertoire evolution., Untersucht wurde, ob und wie die Fokussierung des Repertoires von Epitop-spezifischen T Zellen während einer chronischen Virusinfektion eine Selektion auf Basis der strukturellen Avidität widerspiegelt. Diese nahm während der chronischen Infektion ab und ging mit einer Expansion von T-Zellen mit niedriger Avidität einher. Der Verlust der Immundominanz von hochaviden T Zellen wurde wahrscheinlich durch replikative Seneszenz verursacht. Eine klonale Sukzession hin zu TCRs mit geringerer Avidität würde die beobachtete umgekehrte Evolution des TCR-Repertoires erklären.

Immunchromatographische Schnelltests sind die wichtigste verfügbare erstorientierende diagnostische Methode zum Nachweis biologischer Agenzien vor Ort. Im Kontext des med. B-Schutzes haben Y.pestis, F.tularensis und B.anthracis eine hohe Relevanz. Zu den Nachweisgrenzen (LOD) verschiedener Schnelltests für diese drei Agenzien gibt es jedoch keine verlässlichen Daten. In der vorliegenden Arbeit wurden die LODs von vier verschiedenen Hersteller zum Nachweis der drei genannten Erreger ermittelt., Fast detection of agents concerning biodefense is crucial regarding medical countermeasures. Y.pestis, F.tularensis and B.anthracis belong to the most relevant bacteria in biological warfare/bioterrorism. For their detection, response forces use lateral flow assays. They offer quick results, are convenient and applicable in field. But reliable data regarding the limits of detection is scarce. Here, I determined the LODs for four different tests for the detection of the above-named pathogens.

In this work, the development of immune responses derived from single naive CD8+ T cells was studied. It was found that the precursors of central memory T cells displayed slower cell cycle speeds than those of short-lived effector T cells, already during the early stages of the clonal expansion phase. Upon premature depletion of antigen-presenting dendritic cells, the cell cycle of these central memory precursors was further delayed and the generation of secondary immune responses was impaired., In dieser Arbeit wurde die Entwicklung von Immunantworten ausgehend von einzelnen naiven CD8+ T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Vorläufer zentraler Gedächtnis-T-Zellen schon während der frühen Expansionsphase einen langsameren Zellzyklus aufweisen, als diejenigen kurzlebiger Effektor-T-Zellen. Nach vorzeitiger Depletion Antigen-präsentierender Dendritischer Zellen wurde der Zellzyklus dieser zentralen Gedächtnisvorläufer weiter verlangsamt und die Ausbildung sekundärer Immunantworten war gestört.

The aim of this thesis was to investigate if and how repertoire focusing of epitope-specific T cells during chronic viral infection reflects selection based on structural avidity. Structural avidity decreased during chronic infection and was associated with expansion of low avidity T cells. Loss of immunodominance of high avidity T cells was likely caused by replicative senescence. Clonal succession towards lower avidity TCRs would in turn explain the observed reverse TCR repertoire evolution., Untersucht wurde, ob und wie die Fokussierung des Repertoires von Epitop-spezifischen T Zellen während einer chronischen Virusinfektion eine Selektion auf Basis der strukturellen Avidität widerspiegelt. Diese nahm während der chronischen Infektion ab und ging mit einer Expansion von T-Zellen mit niedriger Avidität einher. Der Verlust der Immundominanz von hochaviden T Zellen wurde wahrscheinlich durch replikative Seneszenz verursacht. Eine klonale Sukzession hin zu TCRs mit geringerer Avidität würde die beobachtete umgekehrte Evolution des TCR-Repertoires erklären.

Tmem51 is upregulated in CD8 T cells derived from chronic infection. In acute infection, overexpression of it leads to downregulation of effector cytokine production without impacting T cell development. Exhausted CD8 T cells in chronic infection cannot be reactivated by deletion of Tmem51. PTPN2 was known to impact exhausted CD8 T cells subsets in chronic infection. In acute infection, deficiency of PTPN2 improves T cell survival by rendering T cells less dependent on survival-promoting cytokines., Tmem51 ist in CD8-T-Zellen, die von chronischen Infektionen stammen, hochreguliert. In akuter Infektion führt eine Überexpression von Tmem51 zu einer Herunterregulierungvon Effektorzytokinen, ohne die T-Zell-Entwicklung zu beeinträchtigen. Erschöpfte CD8-T-Zellen werden durch Tmem51-deletion nicht reaktiviert. PTPN2 hat in chronischen Infektionen einen Einfluss auf erschöpfte CD8-T-Zellen. Bei akuten Infektionen erhöht ein PTPN2-Mangel die Überlebensfähigkeit von CD8-T-Zellen.

The transfer of regulatory T cells (Tregs) represents a promising therapeutic approach to dampen misdirected immune responses, like autoimmune diseases, chronic inflammatory syndromes and graft versus host disease. Clinical isolation of highly pure Treg populations is still challenging. The isolation reagents can influence their viability and functionality, potentially altering the potency of isolated Treg cell products. Reversible Fab multimer-based Treg purification can prevent these conventional antibody label-induced interferences in vitro and in vivo., Der Transfer regulatorischer T-Zellen (Treg) ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz, um fehlgeleitete Immunreaktionen wie Autoimmunerkrankungen, chronische Entzündungssyndrome und Graft-versus-Host-Erkrankungen zu dämpfen. Die klinische Isolierung von hochreinen Tregs ist immer noch eine Herausforderung, da Isolationsreagenzien die Lebensfähigkeit und Funktionalität von Tregs beeinflussen können. Reversible Fab-Multimer-basierte Treg-Aufreinigung kann diese Antikörpermarkierungs-induzierte Interferenzen der Funktionalität in vitro und in vivo verhindern.

Immunchromatographische Schnelltests sind die wichtigste verfügbare erstorientierende diagnostische Methode zum Nachweis biologischer Agenzien vor Ort. Im Kontext des med. B-Schutzes haben Y.pestis, F.tularensis und B.anthracis eine hohe Relevanz. Zu den Nachweisgrenzen (LOD) verschiedener Schnelltests für diese drei Agenzien gibt es jedoch keine verlässlichen Daten. In der vorliegenden Arbeit wurden die LODs von vier verschiedenen Hersteller zum Nachweis der drei genannten Erreger ermittelt., Fast detection of agents concerning biodefense is crucial regarding medical countermeasures. Y.pestis, F.tularensis and B.anthracis belong to the most relevant bacteria in biological warfare/bioterrorism. For their detection, response forces use lateral flow assays. They offer quick results, are convenient and applicable in field. But reliable data regarding the limits of detection is scarce. Here, I determined the LODs for four different tests for the detection of the above-named pathogens.

In this work, the development of immune responses derived from single naive CD8+ T cells was studied. It was found that the precursors of central memory T cells displayed slower cell cycle speeds than those of short-lived effector T cells, already during the early stages of the clonal expansion phase. Upon premature depletion of antigen-presenting dendritic cells, the cell cycle of these central memory precursors was further delayed and the generation of secondary immune responses was impaired., In dieser Arbeit wurde die Entwicklung von Immunantworten ausgehend von einzelnen naiven CD8+ T-Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Vorläufer zentraler Gedächtnis-T-Zellen schon während der frühen Expansionsphase einen langsameren Zellzyklus aufweisen, als diejenigen kurzlebiger Effektor-T-Zellen. Nach vorzeitiger Depletion Antigen-präsentierender Dendritischer Zellen wurde der Zellzyklus dieser zentralen Gedächtnisvorläufer weiter verlangsamt und die Ausbildung sekundärer Immunantworten war gestört.

Cytomegalovirus (CMV) establishes a life-long latent infection and is still a major source of morbidity after transplantation. In this thesis we report the characterization of HLA-C*0702/IE-1309-317-specific T cells and the generation of reversible HLA-C7-StrepTamers, suitable for the ex vivo isolation of T cells and usage in adoptive T cell therapy. In addition, we analyzed the risk factors predisposing for CMV-infection and identified a correlation of cold ischemic time and primary CMV-infection after kidney transplantation., Eine Primärinfektion durch das Zytomegalievirus (CMV) führt zu einer lebenslangen Persistenz und zählt zu den häufigsten Begleiterkrankungen nach Transplantation. Diese Arbeit behandelt die Charakterisierung von HLA-C*0702/IE-1309-317-spezifischen T Zellen und die Herstellung von reversiblen HLA-C7-StrepTameren für die Isolierung von T Zellen und die anschließende Verwendung in der adoptiven T Zelltherapie. Des Weiteren wurde eine Korrelation von kalter Ischämiezeit und primärer CMV-Infektion nach Nierentransplantation identifiziert.

The transfer of regulatory T cells (Tregs) represents a promising therapeutic approach to dampen misdirected immune responses, like autoimmune diseases, chronic inflammatory syndromes and graft versus host disease. Clinical isolation of highly pure Treg populations is still challenging. The isolation reagents can influence their viability and functionality, potentially altering the potency of isolated Treg cell products. Reversible Fab multimer-based Treg purification can prevent these conventional antibody label-induced interferences in vitro and in vivo., Der Transfer regulatorischer T-Zellen (Treg) ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz, um fehlgeleitete Immunreaktionen wie Autoimmunerkrankungen, chronische Entzündungssyndrome und Graft-versus-Host-Erkrankungen zu dämpfen. Die klinische Isolierung von hochreinen Tregs ist immer noch eine Herausforderung, da Isolationsreagenzien die Lebensfähigkeit und Funktionalität von Tregs beeinflussen können. Reversible Fab-Multimer-basierte Treg-Aufreinigung kann diese Antikörpermarkierungs-induzierte Interferenzen der Funktionalität in vitro und in vivo verhindern.

Bacteria-host interaction leading to bacterial clearance and immunity induction were studied by Listeria monocytogenes infection in the mouse model. It could be revealed that CD8alpha+ dendritic cells (DCs) in the spleen collaborate with other cell types in order to induce adaptive immunity and clear the infection. These findings are of clinical significance since CD8alpha+ DCs are interesting target cells for antigen delivery in immunotherapy, as they are potent inducers of cytotoxic T cell responses., Untersucht wurden die Interaktionen zwischen bakteriellem Pathogen und Immunsystem in der Modellinfektion von Listeria monocytogenes im Mausmodell. Es konnte gezeigt werden, dass CD8alpha+ dendritische Zellen (DCs) in der Milz mit anderen Zelltypen zusammenarbeiten, um eine adaptive Immunantwort zu erzeugen und die Infektion zu beseitigen. Diese Erkenntnisse sind interessant für die Entwicklung von Immuntherapien, da CD8alpha+ DCs durch ihre Fähigkeit sehr effizient zytotoxische T Zellantworten zu erzeugen interessante Zellen für die gerichtete Aufnahme von Antigenen sind.

T cells with high avidity for their specific ligand are believed to be most effective in clearing viral infections and inducing tumor regression. Thereby, an important part of the avidity seems to be hard wired in the structure of the T cell receptor (TCR). Existing methods do not allow for the exact measurement of this structural avidity on living cells. We therefore developed a novel assay, where the dissociation of monomeric MHC-molecules bound to surface expressed TCRs can be observed by real-time microscopy and can be quantified as koff-rate. Experiments with preclinical mouse models showed a clear correlation between functional avidity, koff-rate and protectivity of the T cells. This led to the assumption that the koff-rate might be an important parameter for determination of the quality of T cells used e.g. for adoptive immunotherapy. Hence, the assay was adapted to the measurement of human T cells. To achieve this, fundamental changes of the setups turned out to be necessary. Validation of the method with CMV-specific T cells showed that the assay allows for precise and reproducible determination of the koff-rate. High variability of the koff-rate assed for different CMV-positive donors indicates that this parameter might be important for the selection of high quality T cells for adoptive T cell therapy., T-Zellen mit hoher Avidität für ihren spezifischen Liganden sind effizienter bei der Bekämpfung viraler Infektionen und Tumoren. Ein wichtiger Teil der Avidität scheint in der Struktur des T-Zellrezeptors (TZR) verankert. Existierende Methoden erlauben nicht, diese strukturelle Avidität auf lebenden Zellen exakt zu bestimmen. Daher wurde ein neues Testsystem entwickelt, bei dem die Dissoziation von monomeren MHC-Molekülen von TZRs unter dem Mikroskop verfolgt und die koff-rate quantifiziert werden kann. Versuche mit präklinischen Mausmodellen indizieren, dass die koff-rate ein wichtiger Parameter zur Qualitätsbestimmung von T-Zellen ist. Daher wurde die Methode auf die Messung humaner T-Zellen übertragen, wofür grundlegende Details im Versuchsaufbau verändert werden mussten. Die Validierung mit CMV-spezifischen T-Zellen zeigte, dass die Bestimmung der koff-rate präzise und gut reproduzierbar ist. Die hohe Variabilität in den koff-rates verschiedener Spender weist darauf hin, dass dieser Parameter zur Auswahl geeigneter Zellen für die adoptive Zelltherapie wichtig sein könnte.

RIG-I/MAVS und cGAS/STING sind Signalwege des Immunsystems zur Erkennung von spezifischen RNS- oder DNS-Mustern. Die Arbeit zeigt, dass endogene und gezielte therapeutische Aktivierung dieser Signalwege den Darm vor Gewebeschaden nach Bestrahlung oder Chemotherapie und während der Graft-versus-Host-Krankheit nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation schützt. Die Aktivierung von RIG-I/MAVS und STING führt hierbei zu einer Typ I Interferon Antwort, welche die Barrierefunktion der Darmschleimhaut in vivo schützt und das Wachstum von intestinalen epithelialen Stammzellkulturen in vitro fördert., RIG-I/MAVS and cGAS/STING are innate recognition pathways that sense specific RNA or DNA patterns. The study shows that endogenous and targeted activation of these pathways reduces intestinal injury after irradiation or chemotherapy and during graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Activation of RIG-I/MAVS and STING results in a type I interferon response that protects intestinal mucosal barrier function in vivo and promotes growth of intestinal organoids in vitro.

Bei 22 Patienten mit Hymenopterengiftallergie, die bei der sIgE-Bestimmung eine Doppelpositivität auf Bienen- und Wespengift mit häufig unklarer klinischer Relevanz aufwiesen, wurden Basophilenaktivierungstests (BATs) durchgeführt und sIgE auf rekombinante Allergene und kreuzreagierende Kohlenhydratseitenketten (CCDs) bestimmt. Mittels des BAT konnte in 14 Fällen ein einzelnes, für die Immuntherapie relevantes Insektengift definiert werden. Der erweiterte sIgE-Nachweis war überwiegend nicht weiterführend., In 22 patients with an allergy to hymenoptera and a positive sIgE to both bee and wasp venom with frequently unclear clinical relevance basophil activation tests (BATs) were performed and sIgE to recombinant allergens and cross-reactive carbohydrate determinants (CCDs) were determined. By means of BAT a single insect venom relevant for immunotherapy could be defined in 14 patients. The more detailed determination of sIgE was not supportive in the vast majority of the cases.

The aim of the thesis work was to access rare antigen specific T cells from a healthy donor repertoire. With a combination of existing and recent methods for enrichment and extraction of TCRs (T cell receptors), we were successful in establishing a workflow for multimer based T cell identification, screening and extraction of TCR sequences. In conclusion, using a more economic workflow we were able to identify and isolate a broad spectrum of TCRs for different tumor and viral antigens for future applications., Das Ziel der Diplomarbeit war seltene Antigen-spezifische T-Zellen aus einem gesunden Spender Repertoire zuzugreifen. Mit einer Kombination aus bestehenden und kürzlich Verfahren zur Anreicherung und Gewinnung von TZR (T-Zell-Rezeptoren) waren wir erfolgreich in einen Workflow für Multimer basierte T-Zell-Identifizierung Festlegung, Screening und Extraktion von TCR-Sequenzen. Abschließend einen wirtschaftlicheren Workflow konnten wir ein breites Spektrum an TCRs für verschiedene Tumor und virale Antigene für zukünftige Anwendungen zu identifizieren und zu isolieren.

IL-22 restores epithelial integrity upon injury in a wide array of tissues and diseases and is a prototypic mediator of ‚immuno-epithelial‘ signaling. We characterized the role of IL-22 in several different mouse models of human kidney disease and found disease- and time-point specific changes in gene expression of the Notch/Ahr/IL22 axis. The effect of IL-22 in the kidney is confined to tubular epithelial cells on which it acts both as a pro-survival and a pro-regenerative factor., IL-22 reguliert die Epithelfunktion in verschiedenen Organen und Erkrankungen und ist ein prototypischer Mediator der 'immuno-epithelialen' Signaltransduktion. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von IL-22 in Mausmodellen verschiedener Nierenerkrankungen untersucht. Es zeigten sich Krankheits- und Zeitpunkts-spezifische Veränderungen der Genexpression der Notch/Ahr/IL22-Achse.In der Niere wirkt IL-22 Tubuluszell-spezifisch positiv auf Überleben und Regeneration des Epithels.

IL-22 restores epithelial integrity upon injury in a wide array of tissues and diseases and is a prototypic mediator of ‚immuno-epithelial‘ signaling. We characterized the role of IL-22 in several different mouse models of human kidney disease and found disease- and time-point specific changes in gene expression of the Notch/Ahr/IL22 axis. The effect of IL-22 in the kidney is confined to tubular epithelial cells on which it acts both as a pro-survival and a pro-regenerative factor., IL-22 reguliert die Epithelfunktion in verschiedenen Organen und Erkrankungen und ist ein prototypischer Mediator der 'immuno-epithelialen' Signaltransduktion. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von IL-22 in Mausmodellen verschiedener Nierenerkrankungen untersucht. Es zeigten sich Krankheits- und Zeitpunkts-spezifische Veränderungen der Genexpression der Notch/Ahr/IL22-Achse.In der Niere wirkt IL-22 Tubuluszell-spezifisch positiv auf Überleben und Regeneration des Epithels.

RIG-I/MAVS und cGAS/STING sind Signalwege des Immunsystems zur Erkennung von spezifischen RNS- oder DNS-Mustern. Die Arbeit zeigt, dass endogene und gezielte therapeutische Aktivierung dieser Signalwege den Darm vor Gewebeschaden nach Bestrahlung oder Chemotherapie und während der Graft-versus-Host-Krankheit nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation schützt. Die Aktivierung von RIG-I/MAVS und STING führt hierbei zu einer Typ I Interferon Antwort, welche die Barrierefunktion der Darmschleimhaut in vivo schützt und das Wachstum von intestinalen epithelialen Stammzellkulturen in vitro fördert., RIG-I/MAVS and cGAS/STING are innate recognition pathways that sense specific RNA or DNA patterns. The study shows that endogenous and targeted activation of these pathways reduces intestinal injury after irradiation or chemotherapy and during graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Activation of RIG-I/MAVS and STING results in a type I interferon response that protects intestinal mucosal barrier function in vivo and promotes growth of intestinal organoids in vitro.

Bei 22 Patienten mit Hymenopterengiftallergie, die bei der sIgE-Bestimmung eine Doppelpositivität auf Bienen- und Wespengift mit häufig unklarer klinischer Relevanz aufwiesen, wurden Basophilenaktivierungstests (BATs) durchgeführt und sIgE auf rekombinante Allergene und kreuzreagierende Kohlenhydratseitenketten (CCDs) bestimmt. Mittels des BAT konnte in 14 Fällen ein einzelnes, für die Immuntherapie relevantes Insektengift definiert werden. Der erweiterte sIgE-Nachweis war überwiegend nicht weiterführend., In 22 patients with an allergy to hymenoptera and a positive sIgE to both bee and wasp venom with frequently unclear clinical relevance basophil activation tests (BATs) were performed and sIgE to recombinant allergens and cross-reactive carbohydrate determinants (CCDs) were determined. By means of BAT a single insect venom relevant for immunotherapy could be defined in 14 patients. The more detailed determination of sIgE was not supportive in the vast majority of the cases.

The aim of the thesis work was to access rare antigen specific T cells from a healthy donor repertoire. With a combination of existing and recent methods for enrichment and extraction of TCRs (T cell receptors), we were successful in establishing a workflow for multimer based T cell identification, screening and extraction of TCR sequences. In conclusion, using a more economic workflow we were able to identify and isolate a broad spectrum of TCRs for different tumor and viral antigens for future applications., Das Ziel der Diplomarbeit war seltene Antigen-spezifische T-Zellen aus einem gesunden Spender Repertoire zuzugreifen. Mit einer Kombination aus bestehenden und kürzlich Verfahren zur Anreicherung und Gewinnung von TZR (T-Zell-Rezeptoren) waren wir erfolgreich in einen Workflow für Multimer basierte T-Zell-Identifizierung Festlegung, Screening und Extraktion von TCR-Sequenzen. Abschließend einen wirtschaftlicheren Workflow konnten wir ein breites Spektrum an TCRs für verschiedene Tumor und virale Antigene für zukünftige Anwendungen zu identifizieren und zu isolieren.

Important determinants of persistence and functionality of adoptively transferred T cells are attributed to the original cell phenotype. Therefore, the efficacy of T cell-based therapies might improve by developing strategies to purify defined cell populations. We successfully established a GMP-conform, multi-parameter cell selection strategy allowing to purify a most promising T cell subset (central memory T cells) to highest purities., Wichtige Eigenschaften, die Langlebigkeit und Funktionalität von adoptiv transferierten T-Zellen bestimmen, sind auf den jeweiligen Phänotyp der Ausgangszellen zurückzuführen. Deshalb könnte die Wirksamkeit von T-Zell-basierten Therapien durch Strategien zur Aufreinigung definierter Zellpopulationen verbessert werden. In dieser Arbeit wurde erfolgreich ein GMP-konformes Serienaufreinigungsverfahren zur Isolierung einer vielversprechenden T-Zell-Subpopulation (so genannte zentrale Gedächtnis-T-Zellen) etabliert.

Bacteria systemically circulating in murine blood have been described to bind blood platelets. In this thesis the interaction of Listeria monocytogenes (L.m.) with blood platelets was examined and how complex-formation altered bacterial clearance from the bloodstream. It was found that circulating L.m. and L.m.-platelet complexes are cleared in the liver by two independent mechanisms, balancing rapid restoration of blood sterility and antigen-targeting to the spleen for the generation of a robust adaptive immune response., Systemisch zirkulierende Bakterien in der Maus binden an Blutplättchen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von Listeria monocytogenes (L.m.) mit Blutplättchen und der Einfluss dieser Interaktion auf die Entfernung von L.m. aus der Blutbahn untersucht. Es wurde gefunden, dass L.m. und L.m.-Blutplättchen-Komplexe in der Leber von zwei verschiedenen Mechanismen aufgenommen werden. Diese gewährleisten, dass ausreichend Bakterien in die Milz gelangen um eine robuste adaptive Immunantwort zu generieren, als auch eine rasche Sterilisierung des Blutes.

The novel Streptamer-based "koff-rate assay" enables accurate measurement of TCR-ligand dissociation- (koff-) rates on the surface of living T cells as a crucial parameter determining structural TCR avidity. For latent expressed ligands in chronic CMV infection, the frequency of T cell populations correlated to the mean koff-rates. This correlation indicates an expansion of low avidity T cells with decreased effector functions in response to continuous long-term antigen re-stimulation., Der neuartige Streptamer-basierte "koff-rate assay" ermöglicht eine akkurate Messung der TZR-Liganden Dissoziations- (koff-) Rate auf der Oberfläche von lebenden T Zellen als entscheidenden Parameter der strukturellen TZR Avidität. Für latent exprimierte Liganden in einer chronischen CMV Infektion korrelierte die Frequenz der T Zellen mit den koff-Raten. Diese Korrelation deutet auf eine Expansion von niedrig aviden T Zellen mit verminderten Effektor Funktionen als Antwort auf kontinuierliche Langzeit Antigen Re-Stimulation hin.

Die Aufnahme von Antigen gekoppelt an spezifische Antikörper, die Oberflächenrezeptoren auf Dendritischen Zellen binden (kurz: Targeting), stellt ein vielversprechendes Vorgehen zur Entwicklung neuer Vakzine dar. Die Auswirkungen des Targeting von DC-SIGN wurden in einem transgenen Mausmodell mit dem Namen hSIGN untersucht. Die in vitro und in vivo Daten zeigen, dass mit Hilfe von anti-DC-SIGN Antikörpern in erster Linie die Proliferation CD8+ zytotoxischer T-Zellen ausgelöst wird., Targeting antigens to dendritic cells via specific antibodies against surface receptors represents a successful approach for new vaccination strategies. The follow-ups of antigen targeting of the human DC-SIGN were analyzed in a transgenic hSIGN mouse model. The in vitro and in vivo data show that the use of anti-DC-SIGN antibodies mainly results in the proliferation of CD8+ cytotoxic T cells.

Cytomegalovirus (CMV) establishes a life-long latent infection and is still a major source of morbidity after transplantation. In this thesis we report the characterization of HLA-C*0702/IE-1309-317-specific T cells and the generation of reversible HLA-C7-StrepTamers, suitable for the ex vivo isolation of T cells and usage in adoptive T cell therapy. In addition, we analyzed the risk factors predisposing for CMV-infection and identified a correlation of cold ischemic time and primary CMV-infection after kidney transplantation., Eine Primärinfektion durch das Zytomegalievirus (CMV) führt zu einer lebenslangen Persistenz und zählt zu den häufigsten Begleiterkrankungen nach Transplantation. Diese Arbeit behandelt die Charakterisierung von HLA-C*0702/IE-1309-317-spezifischen T Zellen und die Herstellung von reversiblen HLA-C7-StrepTameren für die Isolierung von T Zellen und die anschließende Verwendung in der adoptiven T Zelltherapie. Des Weiteren wurde eine Korrelation von kalter Ischämiezeit und primärer CMV-Infektion nach Nierentransplantation identifiziert.

In this study, key parameters of the innate immune system were studied in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 13 healthy volunteers aged 22 to 32 years before and after vaccination against the yellow fever virus, i.e. YF-17D, during a time window of 14 days. Using a combination of quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses to determine the mRNA expression profiles of DDX58 (RIG-I) itself and of several IFN-inducible genes (ISGs), Western blot analyses to measure expression of RIG-I full length (RIG-I FL), RIG-I splice variant (RIG-I SV), and RIG-I short form (RIG-I SF) proteins, together with fluorescence-activated cell sorting (FACS) analyses to examine alterations in the relative number of key innate immune cells in the circulation, the following results were obtained: qRT-PCR analysis revealed a marked and transient induction of RIG-I mRNA and of the type I ISGs, i.e. IRF7 (IFN regulatory factor 7; IRF7), ISG15 (ISG15 ubiquitin-like modifier; ISG15), MX1 (MX dynamin-like GTPase 1; MX1), and CXCL10 (C-X-C motif ligand 10; IP-10): mRNAs of IRF7, ISG15, MX1, and CXCL10 were markedly and transiently up-regulated on days 3 and 7 after vaccination, while their expression returned to baseline levels on day 14; Western blot analyses revealed that RIG-I FL protein but not its isoforms RIG-I SV or RIG-I SF, were constitutively expressed before vaccination and its expression level was further transiently enhanced during the observation period. Both RIG-I SV and RIG-I SF were induced on day 3 with RIG-I SF peaking on day 7 with a still markedly elevated level on day 14. In contrast to RIG-I, protein expression of melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5) revealed inhibition at day 3 and thereafter though the protein of the virus sensor laboratory of genetics and physiology 2 (LGP2) showed similar kinetics as RIG-I, i.e. induction at days 3 and 7 and return at day 14 to prevaccination levels. These data are the first to d, In dieser Arbeit wurden Schlüsselparameter des Immunsystems in mononukleären Zellen des peripheren Bluts (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) von 13 gesunden Probanden im Alter von 22-32 Jahren vor und nach einer Impfung mit dem Gelbfieberimpfstoff YF-17D innerhalb eines Zeitfensters von 14 Tagen untersucht. Durch eine Kombination von quantitativer Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) und Western Blot Analysen wurde die Expression der Isoformen des Virussensors Retinoic-acid inducible gene RIG-I full length (RIG-I FL); RIG-I splice variant (RIG-I SV) und RIG-I short form (RIG-I SF), der Typ I Interferon (IFN)-induzierbaren Gene (ISGs) IRF7 (IFN regulatory factor 7; IRF7), ISG15 (ISG15 ubiquitin-like modifier; ISG15), MX1 (MX dynamin-like GTPase 1; MX1) und CXCL10 (C-X-C motif ligand 10; IP-10) untersucht. Zusätzlich wurde die Frequenz zentraler zirkulierender Immunzellen des angeborenen Immunsystems mittels Durchflußzytometrie bestimmt. Die mRNA der Typ I IFN ISGs RIG-I, IRF7, ISG15, MX1 und CXCL10 wurden an den Tagen 3 und 7 signifikant induziert und kehrten am Tag 14 zum Ausgangsniveau zurück; vor der Impfung (Tag 0) wurde das RIG-I FL Protein, nicht aber die RIG-I SV oder RIG-I SF Proteine, konstitutiv exprimiert. Am Tag 3 nach der Gelbfieberimpfung zeigte sich ein Anstieg der RIG-I SV und der RIG-I SF Proteine mit einem Gipfel der RIG-I SF am Tag 7 und einem anhaltend signifikant erhöhten Niveau dieser RIG-I Variante am Tag 14. Im Gegensatz zur Regulation von RIG-I zeigte sich bei der Regulation des Virussensors melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5) Proteins eine Inhibition am Tag 3, 7 und 14, während für das Protein des Virussensors laboratory of genetics and physiology 2 (LGP2) eine ähnliche Kinetik wie bei RIG-I beobachtet werden konnte, d.h. eine Aufregulation an den Tagen 3 und 7 und eine Rückkehr zum Ausgangsniveau am Tag. 14. Die Prozentsätze der Monozyten und dendritischen Zellen (DC) innerhalb der PBMCs sowie der

In this study, key parameters of the innate immune system were studied in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 13 healthy volunteers aged 22 to 32 years before and after vaccination against the yellow fever virus, i.e. YF-17D, during a time window of 14 days. Using a combination of quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) analyses to determine the mRNA expression profiles of DDX58 (RIG-I) itself and of several IFN-inducible genes (ISGs), Western blot analyses to measure expression of RIG-I full length (RIG-I FL), RIG-I splice variant (RIG-I SV), and RIG-I short form (RIG-I SF) proteins, together with fluorescence-activated cell sorting (FACS) analyses to examine alterations in the relative number of key innate immune cells in the circulation, the following results were obtained: qRT-PCR analysis revealed a marked and transient induction of RIG-I mRNA and of the type I ISGs, i.e. IRF7 (IFN regulatory factor 7; IRF7), ISG15 (ISG15 ubiquitin-like modifier; ISG15), MX1 (MX dynamin-like GTPase 1; MX1), and CXCL10 (C-X-C motif ligand 10; IP-10): mRNAs of IRF7, ISG15, MX1, and CXCL10 were markedly and transiently up-regulated on days 3 and 7 after vaccination, while their expression returned to baseline levels on day 14; Western blot analyses revealed that RIG-I FL protein but not its isoforms RIG-I SV or RIG-I SF, were constitutively expressed before vaccination and its expression level was further transiently enhanced during the observation period. Both RIG-I SV and RIG-I SF were induced on day 3 with RIG-I SF peaking on day 7 with a still markedly elevated level on day 14. In contrast to RIG-I, protein expression of melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5) revealed inhibition at day 3 and thereafter though the protein of the virus sensor laboratory of genetics and physiology 2 (LGP2) showed similar kinetics as RIG-I, i.e. induction at days 3 and 7 and return at day 14 to prevaccination levels. These data are the first to d, In dieser Arbeit wurden Schlüsselparameter des Immunsystems in mononukleären Zellen des peripheren Bluts (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) von 13 gesunden Probanden im Alter von 22-32 Jahren vor und nach einer Impfung mit dem Gelbfieberimpfstoff YF-17D innerhalb eines Zeitfensters von 14 Tagen untersucht. Durch eine Kombination von quantitativer Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) und Western Blot Analysen wurde die Expression der Isoformen des Virussensors Retinoic-acid inducible gene RIG-I full length (RIG-I FL); RIG-I splice variant (RIG-I SV) und RIG-I short form (RIG-I SF), der Typ I Interferon (IFN)-induzierbaren Gene (ISGs) IRF7 (IFN regulatory factor 7; IRF7), ISG15 (ISG15 ubiquitin-like modifier; ISG15), MX1 (MX dynamin-like GTPase 1; MX1) und CXCL10 (C-X-C motif ligand 10; IP-10) untersucht. Zusätzlich wurde die Frequenz zentraler zirkulierender Immunzellen des angeborenen Immunsystems mittels Durchflußzytometrie bestimmt. Die mRNA der Typ I IFN ISGs RIG-I, IRF7, ISG15, MX1 und CXCL10 wurden an den Tagen 3 und 7 signifikant induziert und kehrten am Tag 14 zum Ausgangsniveau zurück; vor der Impfung (Tag 0) wurde das RIG-I FL Protein, nicht aber die RIG-I SV oder RIG-I SF Proteine, konstitutiv exprimiert. Am Tag 3 nach der Gelbfieberimpfung zeigte sich ein Anstieg der RIG-I SV und der RIG-I SF Proteine mit einem Gipfel der RIG-I SF am Tag 7 und einem anhaltend signifikant erhöhten Niveau dieser RIG-I Variante am Tag 14. Im Gegensatz zur Regulation von RIG-I zeigte sich bei der Regulation des Virussensors melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5) Proteins eine Inhibition am Tag 3, 7 und 14, während für das Protein des Virussensors laboratory of genetics and physiology 2 (LGP2) eine ähnliche Kinetik wie bei RIG-I beobachtet werden konnte, d.h. eine Aufregulation an den Tagen 3 und 7 und eine Rückkehr zum Ausgangsniveau am Tag. 14. Die Prozentsätze der Monozyten und dendritischen Zellen (DC) innerhalb der PBMCs sowie der

Im Kontext des Cancer Immunoediting stellt das NKG2D-Rezeptor-Liganden System eine Möglichkeit zur Unterscheidung zwischen nativen und transformierten Zellen dar. Mit einer murinen B16 Melanom Zelllinie (Tetrazyklin-abhängige Liganden-Expression) wurde gezeigt, dass eine frühe - im Gegensatz zu einer späten - Expression von H60 (ein NKG2D-Ligand) auf Tumorzellen in vivo zu einem verminderten Tumorwachstum führt. Experimente mit Knockout-Mäusen bestätigten die zentrale Rolle des NKG2D-Rezeptors., In the context of cancer immunoediting the NKG2D receptor-ligand system is one possible mechanism for the immune system to distinguish between native and transformed cells. It was demonstrated by using a murine B16 melanoma cell line (tetracycline dependent expression of ligands), that early – in contrast to late – expression of H60 (a NKG2D ligand) on tumor cells in vivo leads to decreased tumor growth. Experiments with knockout mice confirmed the central role of the NKG2D receptor.

Wir haben eine neue Methode entwickelt, mit der es erstmals möglich ist, die Dissoziationgeschwindigkeit monomerer Peptid-MHC-Komplexe, gebunden an T-Zellerezeptoren vitaler T-Zellen zu messen und so Aussagen über die strukturelle Avidität dieser Bindung treffen zu können. In einem Listeriose-Modell in BALB/c Mäusen zeigten sich starke Hinweise, dass die T-Zellantwort von sekundär infizierten Mäusen einen deutlich höheren Anteil an hochaviden LLO91-99-spezifischen T-Zellen besitzt als die T-Zellantwort von primär infizierten Mäusen. Auch sprechen die Daten dafür, dass in der T-Zellantwort von sekundär infizierten Mäusen die CD8+-T-Zellen, die spezifisch das immundominante Epitop LLO91-99 erkennen, durchschnittlich signifikant höhere Aviditäten zeigen als die CD8+-T-Zellen, die spezifisch die subdominanten Epitope p60217-225 und p60476-484 erkennen. Diese erstaunliche Entdeckung ist unserer Meinung nach der bisher überzeugendste Hinweis, dass eine Korrelation zwischen struktureller Avidität und Immundominanz besteht., We developed a new method which enables us for the first time to measure dissociation kinetics of monomeric peptide-MHC complexes bound to T-cell receptors on living T-cells, giving us the possibility to investigate structural avidity of that bond. Experiments in a listeriosis model in BALB/c mice suggest that T-cell response in secondary infected mice shows a significantly higher proportion of high avidity LLO91-99 specific T-cells than the T-cell response of primary infected mice. Our data also suggest that in the T-cell response of secondary infected mice, the CD8+ T-cells that specifically recognize the immunodominant epitope LLO91-99, show significantly higher avidities than the CD8+ T-cells that specifically recognize the subdominant epitopes p60217-225 and p60476-484. This amazing discovery is in our opinion the up to now most convincing data suggesting a correlation between structural avidity and immunodominance.

The present study reveals high levels of the transcription factor HIF-1α in somatotroph pituitary tumors from patients with acromegaly. Further investigation shows that HIF-1α expression under hypoxic conditions increases PKA activity via the transcriptional repression of the PKA regulatory subunit IIβ (PRKARIIβ) through the sequestration of SP1, the major regulator of PRKARIIβ transcription. In primary cultures of somatotroph tumor tissue, hypoxic incubation could blunt the response to octreotide on GH secretion. Further analysis revealed that high HIF-1α expression is associated with lower rates of IGF-1 normalization in patients following treatment with somatostatin analogs., Die vorliegende Studie zeigt gesteigerte Expression des Transkriptionsfaktors HIF-1α im Tumorgewebe von Patienten mit Akromegalie. Es konnte gezeigt werden, dass unter Hypoxie, HIF-1α den Transkriptionsfaktor Sp1 bindet und von dem Promoter der PKA regulatorischen Untereinheit IIβ (PRKARIIβ) sequestriert. In Primärzellkulturen von Tumorgewebe von Patienten mit Akromegalie führte Hypoxie zu einem Wirkungsverlust von SSA auf GH Sekretion. Zudem war eine starke Expression von HIF-1α im Tumorgewebe von Patienten mit Akromegalie mit einem geringeren therapeutischen Effekt auf IGF-1 assoziiert.

Our goal was to test out a new flow cytometric method for the detection of antibodies to Borrelia and to compare these results with those of the established methods. For our study we analysed 101 sera from patients, who were examined at the Department of Dermatology and Allergy Biederstein either with suspicion of a Borrelia infection or in order to exclude one. These sera were analysed using the standard Immunoblot method and the new flow cytometric method., Ziel dieser Arbeit war es eine neue durchflusszytometrische Methode zum Nachweis von Borrelienantikörpern zu testen und diese Ergebnisse mit denen der etablierten Methoden zu vergleichen. Für unsere Studie haben wir 101 Seren von Patienten, die mit Verdacht auf eine oder zum Ausschluss einer Borrelieninfektion an der Klinik für Dermatologie und Allergologie am Biederstein untersucht wurden. Diese Seren wurden mit Hilfe der Standard-Immunoblot-Methode und der neuen durchflusszytometrischen Methode analysiert.

We show here that CD4+ T cell immune responses occur within a probabilistic framework, in which T cell receptor avidity to cognate peptide modulates the likelihood of T cells to divide or differentiate., Wir zeigen hier, dass CD4+ T-Zell-Immunantworten in einem probabilistischen Rahmen stattfinden, in dem die T-Zellrezeptor-Avidität zu einem spezifischen Peptid die Wahrscheinlichkeit moduliert mit der sich eine T-Zelle teilt oder differenziert.

Bacteria-host interaction leading to bacterial clearance and immunity induction were studied by Listeria monocytogenes infection in the mouse model. It could be revealed that CD8alpha+ dendritic cells (DCs) in the spleen collaborate with other cell types in order to induce adaptive immunity and clear the infection. These findings are of clinical significance since CD8alpha+ DCs are interesting target cells for antigen delivery in immunotherapy, as they are potent inducers of cytotoxic T cell responses., Untersucht wurden die Interaktionen zwischen bakteriellem Pathogen und Immunsystem in der Modellinfektion von Listeria monocytogenes im Mausmodell. Es konnte gezeigt werden, dass CD8alpha+ dendritische Zellen (DCs) in der Milz mit anderen Zelltypen zusammenarbeiten, um eine adaptive Immunantwort zu erzeugen und die Infektion zu beseitigen. Diese Erkenntnisse sind interessant für die Entwicklung von Immuntherapien, da CD8alpha+ DCs durch ihre Fähigkeit sehr effizient zytotoxische T Zellantworten zu erzeugen interessante Zellen für die gerichtete Aufnahme von Antigenen sind.

Staphylococcus aureus ist ein maßgeblicher Provokationsfaktor für das atopische Ekzem und der am häufigsten nachgewiesene Keim bei der Impetigo contagiosa. In Zeiten steigender Resistenzraten gegenüber systemischen Antibiotika stellen die in dieser Arbeit getesteten Antiseptika Chlorhexidin und Octenidin sowie das topische Antibiotikum Retapamulin noch immer wirksame Behandlungsalternativen für Staphylococcus aureus dar. Die nachhaltige Wirksamkeit von Triclosan für obige Indikationen sollte jedoch in einem lipophileren Set-up in weiteren Studien überprüft werden., Staphylococcus aureus is a significant provocation factor in atopic dermatitis and the most common pathogen in impetigo contagiosa. This study shows that chlorhexidine and octenidine as antiseptics and topically applied retapamulin as antibiotic remain effective treatment modalities despite rising resistance rates to various systemic antibiotics. However, the sustained effect of triclosan for these indications should be reexamined in a more lipophilic set-up in further studies.

T cells with high avidity for their specific ligand are believed to be most effective in clearing viral infections and inducing tumor regression. Thereby, an important part of the avidity seems to be hard wired in the structure of the T cell receptor (TCR). Existing methods do not allow for the exact measurement of this structural avidity on living cells. We therefore developed a novel assay, where the dissociation of monomeric MHC-molecules bound to surface expressed TCRs can be observed by real-time microscopy and can be quantified as koff-rate. Experiments with preclinical mouse models showed a clear correlation between functional avidity, koff-rate and protectivity of the T cells. This led to the assumption that the koff-rate might be an important parameter for determination of the quality of T cells used e.g. for adoptive immunotherapy. Hence, the assay was adapted to the measurement of human T cells. To achieve this, fundamental changes of the setups turned out to be necessary. Validation of the method with CMV-specific T cells showed that the assay allows for precise and reproducible determination of the koff-rate. High variability of the koff-rate assed for different CMV-positive donors indicates that this parameter might be important for the selection of high quality T cells for adoptive T cell therapy., T-Zellen mit hoher Avidität für ihren spezifischen Liganden sind effizienter bei der Bekämpfung viraler Infektionen und Tumoren. Ein wichtiger Teil der Avidität scheint in der Struktur des T-Zellrezeptors (TZR) verankert. Existierende Methoden erlauben nicht, diese strukturelle Avidität auf lebenden Zellen exakt zu bestimmen. Daher wurde ein neues Testsystem entwickelt, bei dem die Dissoziation von monomeren MHC-Molekülen von TZRs unter dem Mikroskop verfolgt und die koff-rate quantifiziert werden kann. Versuche mit präklinischen Mausmodellen indizieren, dass die koff-rate ein wichtiger Parameter zur Qualitätsbestimmung von T-Zellen ist. Daher wurde die Methode auf die Messung humaner T-Zellen übertragen, wofür grundlegende Details im Versuchsaufbau verändert werden mussten. Die Validierung mit CMV-spezifischen T-Zellen zeigte, dass die Bestimmung der koff-rate präzise und gut reproduzierbar ist. Die hohe Variabilität in den koff-rates verschiedener Spender weist darauf hin, dass dieser Parameter zur Auswahl geeigneter Zellen für die adoptive Zelltherapie wichtig sein könnte.

Staphylococcus aureus ist ein maßgeblicher Provokationsfaktor für das atopische Ekzem und der am häufigsten nachgewiesene Keim bei der Impetigo contagiosa. In Zeiten steigender Resistenzraten gegenüber systemischen Antibiotika stellen die in dieser Arbeit getesteten Antiseptika Chlorhexidin und Octenidin sowie das topische Antibiotikum Retapamulin noch immer wirksame Behandlungsalternativen für Staphylococcus aureus dar. Die nachhaltige Wirksamkeit von Triclosan für obige Indikationen sollte jedoch in einem lipophileren Set-up in weiteren Studien überprüft werden., Staphylococcus aureus is a significant provocation factor in atopic dermatitis and the most common pathogen in impetigo contagiosa. This study shows that chlorhexidine and octenidine as antiseptics and topically applied retapamulin as antibiotic remain effective treatment modalities despite rising resistance rates to various systemic antibiotics. However, the sustained effect of triclosan for these indications should be reexamined in a more lipophilic set-up in further studies.

Our goal was to test out a new flow cytometric method for the detection of antibodies to Borrelia and to compare these results with those of the established methods. For our study we analysed 101 sera from patients, who were examined at the Department of Dermatology and Allergy Biederstein either with suspicion of a Borrelia infection or in order to exclude one. These sera were analysed using the standard Immunoblot method and the new flow cytometric method., Ziel dieser Arbeit war es eine neue durchflusszytometrische Methode zum Nachweis von Borrelienantikörpern zu testen und diese Ergebnisse mit denen der etablierten Methoden zu vergleichen. Für unsere Studie haben wir 101 Seren von Patienten, die mit Verdacht auf eine oder zum Ausschluss einer Borrelieninfektion an der Klinik für Dermatologie und Allergologie am Biederstein untersucht wurden. Diese Seren wurden mit Hilfe der Standard-Immunoblot-Methode und der neuen durchflusszytometrischen Methode analysiert.

We show here that CD4+ T cell immune responses occur within a probabilistic framework, in which T cell receptor avidity to cognate peptide modulates the likelihood of T cells to divide or differentiate., Wir zeigen hier, dass CD4+ T-Zell-Immunantworten in einem probabilistischen Rahmen stattfinden, in dem die T-Zellrezeptor-Avidität zu einem spezifischen Peptid die Wahrscheinlichkeit moduliert mit der sich eine T-Zelle teilt oder differenziert.

T cells are a major component of the adaptive immune system. They recognize peptide antigens in the context of MHC molecules (pMHC) with their T cell receptor (TCR). The efficiency by which a T cell can react to antigen encounter is dependent on functional and structural factors, especially the physical binding strength of the TCR to the pMHC. Since this parameter could not be precisely determined before, we developed a novel assay system for the measurement of TCR binding strengths that is based on a reversible MHC multimer staining technique. Using this assay system we could show that T cell function is to a large degree dependent on TCR binding strength, and took first steps towards the use of highly functional T cells as therapeutic agents., T-Zellen stellen eine Hauptkomponente des adaptiven Immunsystems dar. Sie erkennen mit ihrem T-Zellrezeptor (TCR) Peptidantigene im Kontext von MHC Molekülen (pMHC). Die Effizienz mit der eine T-Zelle auf Antigenkontakt reagieren kann hängt von funktionellen und strukturellen Faktoren ab, insbesondere von der physikalischen Bindungsstärke zwischen TCR und pMHC. Da dieser Parameter bisher nicht präzise bestimmt werden konnte, haben wir eine neue Messmethode zur Bestimmung der TCR-Bindungsstärke entwickelt, die auf reversibler MHC-Multimerfärbung beruht. Mit Hilfe dieser neuen Methode konnten wir zeigen, dass T-Zellfunktion in hohem Masse von der TCR-Bindungsstärke abhängt und haben erste Schritte hin zu einer Nutzung von hochfunktionellen T-Zellen als Therapeutikum unternommen.

Main task of this thesis was the development and evaluation of immunological screening protocols for a standardized mouse phenotyping. Therefore, established assays like ELISA and flow cytometry were adapted to "high-throughput" technologies, as well as innovative bead array systems. With the help of these screening protocols, more than 5000 ENU mutagenized mice were tested for the cellular composition of the peripheral blood and the concentration of immunoglobulin subclasses in the blood plasma, and more than 25 new mutant mouse lines with immunological alterations could be established. In addition, the prerequisites and the workflow for a Listeria monozytogenes "challenge screen" of ENU mutagenized was established, in order to be able to specifically identify mouse mutants with defects in the immune response., Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Evaluierung von immunologischen Testverfahren für eine standardisierte Maus-Phänotypisierung. Dabei wurden etablierte Messmethoden wie ELISA und Durchflusszytometrie an „High-Throughput“ Bedingungen angepasst, sowie innovative Bead Array Systeme in die Untersuchungen integriert. Mit Hilfe der entwickelten Screeningprotokolle konnten mehr als 5000 ENU-mutagenisierte Mäuse hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung des peripheren Blutes und der Konzentration von Immunglobulin-Subklassen im Blutplasma charakterisiert, und mehr als 25 neue Mausmutantenlinien mit immunologischen Abnormalitäten etabliert werden. Zusätzlich wurden die Vorraussetzungen und Arbeitsabläufe für einen „Challengescreen“ von ENU mutagenisierten Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes etabliert, um zukünftig gezielt Mausmutanten mit Defekten in der Immunabwehr zu identifizieren.

Main task of this thesis was the development and evaluation of immunological screening protocols for a standardized mouse phenotyping. Therefore, established assays like ELISA and flow cytometry were adapted to "high-throughput" technologies, as well as innovative bead array systems. With the help of these screening protocols, more than 5000 ENU mutagenized mice were tested for the cellular composition of the peripheral blood and the concentration of immunoglobulin subclasses in the blood plasma, and more than 25 new mutant mouse lines with immunological alterations could be established. In addition, the prerequisites and the workflow for a Listeria monozytogenes "challenge screen" of ENU mutagenized was established, in order to be able to specifically identify mouse mutants with defects in the immune response., Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Evaluierung von immunologischen Testverfahren für eine standardisierte Maus-Phänotypisierung. Dabei wurden etablierte Messmethoden wie ELISA und Durchflusszytometrie an „High-Throughput“ Bedingungen angepasst, sowie innovative Bead Array Systeme in die Untersuchungen integriert. Mit Hilfe der entwickelten Screeningprotokolle konnten mehr als 5000 ENU-mutagenisierte Mäuse hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung des peripheren Blutes und der Konzentration von Immunglobulin-Subklassen im Blutplasma charakterisiert, und mehr als 25 neue Mausmutantenlinien mit immunologischen Abnormalitäten etabliert werden. Zusätzlich wurden die Vorraussetzungen und Arbeitsabläufe für einen „Challengescreen“ von ENU mutagenisierten Mäusen nach Infektion mit Listeria monocytogenes etabliert, um zukünftig gezielt Mausmutanten mit Defekten in der Immunabwehr zu identifizieren.

The microenvironment of solid tumors (TME) has a significant impact on all stages of tumorigenesis including response to treatment. Cancer associated fibroblasts (CAFs) are the most abundant cells in the TME, and through the secretion of multiple factors, they are known to be key effectors for many of the functions attributed to the TME. IKKβ driven NF-κB activation is a central driver for many inflammation-driven tumors. A pro-inflammatory NF-κB gene signature in CAFs has been suggested to promote tumorigenesis in models of pancreatic, mammary skin cancer. Using an autochthonous model of colitis-associated carcinogenesis (CAC) we provide evidence for a tumor suppressive function of IKKβ /NF-κB in CAFs. Fibroblast restricted deletion of Ikk stimulates intestinal epithelial cell proliferation, suppresses tumor cell death, enhances accumulation of CD4+Foxp3+ Treg cells and promotes angiogenesis ultimately promoting colonic tumor growth. In Ikkβ-deficient fibroblasts transcription of negative regulators of TGFβ signaling including Smad7, Smurf 1 and Smurf2 is impaired causing up-regulation of a TGFβ gene signature and elevated HGF secretion. Overexpression of Smad7 in Ikkβ-deficient fibroblasts prevents HGF secretion and pharmacological inhibition of Met during the CAC model confirms that enhanced tumor promotion is dependent on HGF/Met signaling in mucosa of Ikkβ-mutant animals. Collectively, these results highlight an unexpected tumor suppressive function of IKKβ/NF-κB in CAFs linked to HGF release and raise potential concerns about the use of IKK inhibitors in CRC patients., Die Tumor Mikroumgebung (TMU) spielt in allen Stadien der Tumorentwicklung eine essentiell wichtige Rolle, der Verlauf der Behandlung eingeschlossen. Der Großteil an Zellen in der TMU wird durch krebs-assoziierte Fibroblasten representiert. Durch die Sekretion diverser Faktoren spielen sie eine Schlüsselrolle in der Funktion der TMU. Die Aktivierung von NF-κB durch IKKβ ist ein zentraler Punkt in entzündungs-assoziierten Tumoren. Dadurch unterstützt die entzündungsfördernde NF-κB Signatur in krebs-assoziierten Fibroblasten die Tumorprogression in Modellen von Bauchspeicheldrüßenkrebs und Brustkrebs. Durch die intensive Charakterisierung und Analyse unseres etablierten kolitis-assoziierten Krebs(KAK)-models können wir eine tumorhemmende Funktion der IKKβ/NF-κB Aktivierung in krebs-assoziierten Fibroblasten zeigen. Eine auf Fibroblasten beschränkte IKKβ deletion stimuliert die Proliferation intestinaler Epithelialzellen, die Ansammlung von CD4+Foxp3+ Treg Zellen und die Gefäßneubildung und verringert zusätzlich den Zelltod der Tumorzellen, was letztendlich zur Unterstützung des Darmkrebswachstums beiträgt. In den IKKβ-defizienten Firbroblasten ist die Transkription von negativen Regulatoren von TGFβ, wie Smad7, Smurf1 und Smurf2 beeinträchtigt, was eine Hochregulation von TGFβ zur Folge hat und zu einer erhöhten HGF Sekretion führt. Die Überexpression von Smad7 in IKKβ-defizienten Fibroblasten hingegen, verhindert die HGF Sekretion und die pharmakologische Inhibition von Met während des KAK-models bestätigt, dass eine dramatischere Tumorentwicklung von der HGF/Met Produktion in der Mukosa in IKKβ mutierten Tieren abhängt. Zusammengefasst, zeigen diese Ergebnisse eine unerwartete tumorunterdrückende Funktion von IKKβ/NF-κB in krebs-assoziierten Fibroblasten, die auf die HGF Ausschüttung zurückzuführen ist. Diese Ergebnisse stellen die Behandlung von Patienten mit Dickdarmkrebs mit IKK Inhibitoren in Frage.

Schistosomiasis is a chronic infection caused by parasitic blood flukes (e.g. Schistosoma mansoni). Previous research has demonstrated how S. mansoni-derived soluble egg antigen (SEA) can dampen immune responses. The results presented within this thesis demonstrate that (glyco-)lipids within SEA dampen Toll-like receptor-mediated immune responses, whereas (glyco-)proteins activate the NLRP3 inflammasome and thus IL-1ß production. This SEA-mediated NLRP3 inflammasome activation depends on the Dectin-2/FcRγ receptor complex, spleen tyrosine kinase, Card9 complex, mitochondrial reactive oxygen species and potassium efflux. Further work described in this thesis display the critical role for NLRP3 inflammasome activation during the TH2 polarized immune responses of Schistosomiasis and allergic asthma., Schistosomiasis ist eine chronische Infektion, ausgelöst durch parasitisch lebende Pärchenegel (z.B. Schistosoma mansoni). Untersuchungen haben gezeigt, dass schistosomales Eierantigen (SEA) Immunantworten unterdrückt. Die in dieser Arbeit dargelegten Ergebnisse zeigen, dass im SEA enthaltende (Glyko-)Lipide Toll-like Rezeptor-vermittelte Immunantworten unterdrücken, wohingegen (Glyko-)Proteine das NLRP3 Inflammasom aktivieren, was zur IL-1ß Ausschüttung führt. Die SEA-vermittelte Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms ist abhängig vom Dectin-2/FcRγ Rezeptorkomplex, der Milz-Tyrosin-Kinase, dem Card9 Komplex, reaktive Sauerstoffspezies aus dem Mitochondrium und Kaliumsekretion. Darüber hinaus konnte eine entscheidende Rolle des NLRP3 Inflammasoms während TH2 polarisierten Immunantworten der Schistosomiasis und allergischen Asthma aufgezeigt werden.

Universal varicella zoster vaccination programs have been adopted by several countries. Policy makers were hoping this would be cost saving to public health providers and society. The aim of this paper is to assess the vaccination program's economic effectiveness in a meta analysis. From payer's perspective, strategy “vaccination program” is not significantly superior to strategy “no vaccination program”. From society's perspective, strategy “vaccination program” is significantly superior., Allgemeine Varizella Zoster Impfungen wurden in einigen Ländern eingeführt. Davon wurden sich Einsparungen für Krankenkassen und die Gesellschaft versprochen. In dieser Arbeit wird die Wirtschaftlichkeit der allgemeinen Varizella Zoster Impfungen in einer Metaanalyse beurteilt. Aus der Perspektive der Krankenkassen ist die Strategie „Allgemeine VZV Impfungen“ nicht signifikant besser als die Strategie „keine allgemeinen VZV Impfungen“. Aus der Perspektive der Gesellschaft ist die Strategie „Allgemeine VZV Impfungen“ signifikant besser.

Bacteria systemically circulating in murine blood have been described to bind blood platelets. In this thesis the interaction of Listeria monocytogenes (L.m.) with blood platelets was examined and how complex-formation altered bacterial clearance from the bloodstream. It was found that circulating L.m. and L.m.-platelet complexes are cleared in the liver by two independent mechanisms, balancing rapid restoration of blood sterility and antigen-targeting to the spleen for the generation of a robust adaptive immune response., Systemisch zirkulierende Bakterien in der Maus binden an Blutplättchen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von Listeria monocytogenes (L.m.) mit Blutplättchen und der Einfluss dieser Interaktion auf die Entfernung von L.m. aus der Blutbahn untersucht. Es wurde gefunden, dass L.m. und L.m.-Blutplättchen-Komplexe in der Leber von zwei verschiedenen Mechanismen aufgenommen werden. Diese gewährleisten, dass ausreichend Bakterien in die Milz gelangen um eine robuste adaptive Immunantwort zu generieren, als auch eine rasche Sterilisierung des Blutes.

The novel Streptamer-based "koff-rate assay" enables accurate measurement of TCR-ligand dissociation- (koff-) rates on the surface of living T cells as a crucial parameter determining structural TCR avidity. For latent expressed ligands in chronic CMV infection, the frequency of T cell populations correlated to the mean koff-rates. This correlation indicates an expansion of low avidity T cells with decreased effector functions in response to continuous long-term antigen re-stimulation., Der neuartige Streptamer-basierte "koff-rate assay" ermöglicht eine akkurate Messung der TZR-Liganden Dissoziations- (koff-) Rate auf der Oberfläche von lebenden T Zellen als entscheidenden Parameter der strukturellen TZR Avidität. Für latent exprimierte Liganden in einer chronischen CMV Infektion korrelierte die Frequenz der T Zellen mit den koff-Raten. Diese Korrelation deutet auf eine Expansion von niedrig aviden T Zellen mit verminderten Effektor Funktionen als Antwort auf kontinuierliche Langzeit Antigen Re-Stimulation hin.

Platelets form thrombi at vascular injuries thereby preventing excessive bleeding. Platelets are considered to be immotile, firmly attaching to subendothelial matrix or plasma proteins. By single cell tracking in multicolor platelet reporter mice, we demonstrate autonomous locomotion of activated platelets within their physiological environment. Governed by the local adhesiveness of the microenvironment, platelet migration facilitates the redistribution of individual platelets towards regions of higher adhesiveness, thereby reorganizing thrombi in vivo., Blutplättchen bilden Thromben in verletzten Blutgefäßen und verhindern dadurch starke Blutungen. Man geht davon aus, dass diese Zellen unbeweglich sind und fest an subendotheliale Matrixproteine oder an Plasmaproteine binden. Mit Hilfe einer mehrfarbigen Plättchen-Reportermaus können wir nun zeigen, dass aktivierte Plättchen autonom in ihrer physiologischen Umgebung wandern können. Instruiert durch die Adhäsivität der Umgebung wandern einzelne Plättchen in Bereiche höherer Adhäsivität und tragen dadurch im lebenden Organismus zur Reorganisation von Thromben bei.

Recombinant viral MVA vectors are used for vaccination to induce antigen-specific cytotoxic T-cell responses. In this study, MVA expressed ovalbumin as model antigen which, by distinct genetic modifications, was targeted for rapid proteasomal degradation. Degradable ovalbumin induced low CTL responses in primary, but was an optimal inducer in secondary immunizations indicating alternative antigen presentation pathways and offering new options for prime/boost vaccination strategies with MVA., Rekombinante virale MVA Vektoren induzieren als Impfstoffe starke antigen-spezifische zytotoxische T-Zellantworten. In dieser Studie wurden Varianten des Modellantigens Ovalbumin von MVA produziert, welche durch genetische Modifikation einem schnelleren proteasomalen Abbau zugeführt wurden. Schnell degradiertes Ovalbumin induzierte schwache CTL-Antworten im Priming, aber signifikante Sekundärantworten, was auf verschiedene Antigenpräsentationswege hinweist und neue Möglichkeiten für Prime/Boost- Immunisierungsstrategien mit MVA eröffnet.

Important determinants of persistence and functionality of adoptively transferred T cells are attributed to the original cell phenotype. Therefore, the efficacy of T cell-based therapies might improve by developing strategies to purify defined cell populations. We successfully established a GMP-conform, multi-parameter cell selection strategy allowing to purify a most promising T cell subset (central memory T cells) to highest purities., Wichtige Eigenschaften, die Langlebigkeit und Funktionalität von adoptiv transferierten T-Zellen bestimmen, sind auf den jeweiligen Phänotyp der Ausgangszellen zurückzuführen. Deshalb könnte die Wirksamkeit von T-Zell-basierten Therapien durch Strategien zur Aufreinigung definierter Zellpopulationen verbessert werden. In dieser Arbeit wurde erfolgreich ein GMP-konformes Serienaufreinigungsverfahren zur Isolierung einer vielversprechenden T-Zell-Subpopulation (so genannte zentrale Gedächtnis-T-Zellen) etabliert.

We tested the hypothesis that pulmonary exposure to sterile carbon nanoparticles (CNP), a main constituent of urban air pollution, generates an acute inflammatory response by involving the p50 subunit of NFkB1, a pathway generally crucial for inflammatory gene expression in sepsis. Exposing wt and p50-deficinet mice to CNP caused an acute, aseptic neutrophilic alveolitis. While the storm of acute phase cytokines was much more pronounced in p50 mice, no genotype related difference in the number of to the airspace recruited inflammatory leukocytes could be detected. Nuclear profiling of CNP exposed lung however detected NFkB activation only for WT and not p50 mice. Even the activation potential of alveolar macrophages (AM), which are known to be the primary source of inflammatory cytokine production in infected lungs, revealed a rather antiinflammatory skewed phenotype for p50 AMs. Finally our results indicate that inflammatory pathways described for infectious, septic triggers might differ from those during aseptic, sterile inflammation and may thus require further investigations., Die Inhalation von sterilen, Kohlenstoff-Nanoteilchen einem wichtigen Bestandteil urbanen Luftverschmutzung, bewirkt eine lokale Entzündungsreaktion. Da der NFkB Transkriptionsfaktor für septische Entzündungsreaktion bestens beschrieben ist, wurde hier untersucht inwieweit die NFkB p50-Untereinheit für die Ausprägung der aseptischen, Partikelinduzierten Entzündungsreaktion von Bedeutung ist. Partikelexposition von wt und p50-defizienten Mäusen bewirkte in Lungen von Mutanten eine verstärkte Expression und Freisetzung von Akutphase-Cytokinen. Die zelluläre Entzündungsreaktion, d.h. die Akkumulation von Leukozyten im Alveolarbereich war dagegen unabhängig vom Genotyp und NFkB-Aktivierung wurde nur in wt aber nicht p50-Lungen beobachtet. Die Aktivierbarkeit von Alveolarmakrophagen, den Zellen der Cytokinfreisetzung, zeigen ebenfalls einen antiinflammatorischen Phänotyp für p50 Mäuse auf. Die Signalwege der septischen Entzündungsreaktion scheinen damit denen der aseptischen nicht unbedingt zu entsprechen und bedürfen genauerer Untersuchung.