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In dieser Arbeit wurden neue, lipidbasierte, nanoskalige Formulierungen zur Anwendung als Ultraschallkontrastmittel und zum Targeting von arteriosklerotischen Plaques entwickelt und charakterisiert. Ziel war eine sehr gute Kontrastverstärkung bei Verwendung von diagnostischem, nicht-invasivem Ultraschall bei Frequenzen zwischen 1 und 3 MHz. Es konnte eine Methode zur Bestimmung elastischer Eigenschaften nanoskaliger Systeme mittels AFM entwickelt und am Beispiel von PLGA-Nanopartikeln getestet werden. Und schließlich wurde ein in vitro Plaque-Modell aufgebaut und das erfolgreiche Plaque-Targeting gezeigt. Die Grundlagen zu Ultraschall und die Anwendung von Ultraschall in Diagnose und Therapie sowie besonders die Anwendung von ultraschallkontrastverstärkenden Mitteln wurden in der Einleitung (Kapitel 1) dargestellt. Ein kurzer Überblick zur Gefäßkrankheit Arteriosklerose, die Visualisierung dieser Erkrankung und in vivo Charakterisierungsmöglichkeiten wurde gegeben. Die verwendeten Methoden, zur Herstellung der Ultraschallkontrastmittel bzw. PLGA-Nanopartikel (Filmmethode, Salting-out), deren physiko-chemische und morphologische Charakterisierung (PCS, LDA, Cryo-TEM, 31P-NMR, AFM), die Messung der ultraschallkontrastverstärkenden Eigenschaften (Flussmodell) und der Nachweis des Fibrin-Targetings (in vitro-Plaque-Modell) wurden in Kapitel 2 erläutert. Kapitel 3 befasste sich mit den Ergebnissen der physiko-chemischen und morphologischen Charakterisierung der hergestellten liposomalen Formulierungen sowie von Polymer-Nanopartikeln. Es konnte sowohl mit PCS-Messungen, also auch mit AFM und Cryo-TEM gezeigt werden, dass bei der Herstellung der liposomalen Ultraschallkontrastmittel zwei Größenfraktionen auftraten und mithilfe des 31P-NMR wurde deutlich, dass Mizellen und Liposomen nebeneinander vorlagen. Die Herstellung von anderen Lipidmischungen führte zu ähnlichen Ergebnissen, was anhand von PCS-Messungen gezeigt wurde. Die erfolgreiche Kopplung von Antikörpern an die liposomalen Formulierungen und die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung, konnten mit dem AFM nachgewiesen werden. Ebenfalls mittels PCS, wurde die erfolgreiche Steuerung der Größen der PLGA-Nanopartikel durch unterschiedliche Rührgeschwindigkeiten, des bei der Herstellung verwendeten Ultra-Turrax®, gezeigt. Kapitel 4 stellte die Ergebnisse der Ultraschallkontrastmessungen dar. Durch die Verwendung eines Flussmodells konnten die Kontraststärken und auch die Lagerungsstabilität der Ultraschallkontrastmittel schnell und effektiv gemessen und mittels der ImageJ-Software als mittlere Grauwerte ausgewertet werden. Dabei wurden alle Kontrastmittel mit SonoVue®, einem käuflichen Ultraschallkontrastmittel mit Bläschengrößen zwischen 2 und 8 µm, verglichen. Kapitel 5 befasste sich mit den Ergebnissen der Verbesserung der Kontrastintensität durch Variation der Herstellungsmethode, der Lipidzusammensetzung, sowie dem Gefriertrocknen. Die verschiedenen Mischungen wurden wieder im Flussmodell untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die Herstellungsmethode teilweise starken Einfluss auf die Kontraststärke hatte. Durch die Verwendung des Ultraschallstabes, statt des Ultraschallbades, bei der Herstellung, konnten deutlich bessere Ergebnisse erzielt werden. Auch die Zusammensetzung der liposomalen Formulierungen war entscheidend für die Kontrastintensität. Das Gefriertrocken hatte ebenfalls einen großen Einfluss auf die Kontraststärke und führte beinahe immer zu einer Kontrastverbesserung. Selbst wenn die Herstellung der liposomalen Formulierungen mit dem Ultraschallbad geschah und diese dadurch einen schwächeren Ultraschallkontrast aufwiesen, wurde dieser nach dem Gefriertrocknen enorm verbessert. In Kapitel 6 wurden, mit Hilfe des Rasterkraftmikroskops, elastische Eigenschaften am Beispiel von Polymer-Nanopartikeln bestimmt. Da die elastischen Eigenschaften der liposomalen Ultraschallkontrastmittel einen Einfluss auf die Ultraschallkontrastintensität hätten haben können, wurde zunächst ein Modellsystem zur Messung von Elastizitäten entwickelt. Hierzu wurden Polymer-Nanopartikel unterschiedlicher Größen hergestellt und vermessen. Dabei zeigten sich auch die an der Partikeloberflächliche stattfindenden Abbauphänomene der PLGA-Nanopartikel. Kapitel 7 stellte ein selbst entwickeltes in vitro Plaque-Modell zur Untersuchung der spezifischen Targeting-Eigenschaften vor. Es konnte das erfolgreiche Fibrin-Targeting an künstlichen Plaques, bestehend aus Fibrin-Pulver, und an menschlichen, in kleine Stücke geschnittenen Plaques, gezeigt werden. Die mit Antikörpern gekoppelten liposomalen Formulierungen blieben auch unter Strömung an den künstlichen und menschlichen Plaques haften und die Plaques waren als helle Flecken im Ultraschallbild sehr gut zu erkennen., In this work, new, lipid-based formulations for use as nanoscaled ultrasound contrast agents and for targeting of atherosclerotic plaques were developed and characterized. The aim was a very good contrast enhancement in the use of diagnostic, non-invasive ultrasound at frequencies between 1 and 3 MHz. A method to determine elastic properties of nanoscale systems using AFM was developed and tested with PLGA nanoparticles. And finally an in vitro model has been established and the successful plaque targeting was shown. The basics of ultrasound and the use of ultrasound in diagnosis and therapy, and particularly the use of ultrasound contrast-enhancing agents have been shown in the introduction (Chapter 1). A brief overview of the vascular disease atherosclerosis, the visualization of the disease and in vivo characterization of the lesions were given. The methods used for the preparation of the ultrasound contrast agents and PLGA nanoparticles (film method, salting-out method), the physico-chemical and morphological characterization (PCS, LDA, cryo-TEM, 31P NMR, AFM), measurement of the ultrasound contrast-enhancing properties (flow model) and the results of fibrin targeting (in vitro plaque model) were explained in chapter 2. Chapter 3 dealt with the results of physico-chemical and morphological characterization of the liposomal formulations as well as of the polymer nanoparticles. It has been shown with PCS measurements and also with AFM and cryo-TEM that two size fractions occurred in the preparation of the liposomal ultrasound contrast agents. And with using the 31P-NMR it could be shown that micelles and liposomes were present together. The preparation of other lipid mixtures revealed similar results by PCS measurements. The successful coupling of antibodies to the liposomal formulations and the antigen-antibody interaction could be detected with the AFM. The successful control of the size of the PLGA nanoparticles with different stirring speeds during preparation with the Ultra-Turrax ®, was shown by PCS. Chapter 4 presented the results of the ultrasonic contrast measurements. With the use of a flow model, the contrast intensities could be determined and evaluated as mean gray values using the ImageJ software. All contrast agents were compared to SonoVue ®, a commercially available ultrasound contrast agent with bubbles sizes between 2 and 8 microns. Chapter 5 dealt with the results of the improvement of the contrast intensity by variation of the preparation method, the lipid composition, as well as freeze-drying. The various mixtures were again examined in the flow model. It turned out that the method of preparation had strong influence on the contrast. By the use of the ultrasonic tip, instead of the ultrasonic bath for preparation, significantly better results were achieved. The composition of the liposomal formulations was crucial for the contrast intensity. Lyophilization had also a large influence on the contrast enhancement and almost always led to an improvement in contrast. Even if the preparation of liposomal formulations was done with the ultrasonic bath and the formulations had a weaker ultrasonic contrast, this was after freeze-drying greatly improved. In chapter 6 elastic properties of polymer nanoparticles were measured with the atomic force microscope. Since the elastic properties of the liposomal ultrasound contrast agents could have an effect on the intensity of ultrasound contrast, this model system for the measurement of elasticity was developed. The polymer nanoparticles were prepared with different sizes, and measured. The experiments also revealed degradation phenomena of PLGA nanoparticles. Chapter 7 introduced a self-made in vitro plaque model to study the specific targeting properties. The successful targeting of artificial fibrin plaques, consisting of fibrin powder, and of human plaques, cut into small pieces, was shown. The liposomal formulations with coupled antibodies adhered even under flow on the artificial and human plaques and the plaques could be seen as bright spots in the ultrasound image.

In dieser Arbeit wurden Entwicklung, Charakterisierung und erste in vitro Versuche eines neuen, nanoskaligen Ultraschallkontrastmittels (NUSCA) vorgestellt. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines NUSCA zur Verbesserung der Behandlung thromboembolischer Erkrankungen. Kapitel 1 enthält eine allgemeine Einführung in das Thema der Arbeit, während in Kapitel 2 die verwendeten Methoden zusammengefasst werden. Kapitel 3 gibt verschiedene Herstellungsmethoden und Lipidmischungen und ihren Einfluss auf physikochemische Eigenschaften der NUSCA wieder. Die Auswirkungen von Extrusion, Lyophilisation, DPPG-Zusatz und Veränderungen der PEG40S-Konzentration bei zusätzlicher Beschallung mit einem Ultraschallhomogenisator auf Größe, Zetapotential und Struktur der NUSCA wurden getestet. Dabei konnten liposomale Strukturen bei DPPC/CH-Formulierungen und Mischungen aus Liposomen und Mizellen für PEG40S-haltige Formulierungen gefunden werden. Die Extrusion führte zu einer deutlichen Verringerung der hydrodynamischen Durchmesser aller Formulierungen. Lyophilisation, als Möglichkeit die Lagerstabilität zu verbessern, führte zu einer deutlichen Vergrößerung der Formulierungen. Das negative Lipid DPPG, zugesetzt um eine Aggregation der Partikel zu verhindern, veränderte Größe und PDIs der Formulierungen nicht, senkte aber ab einer Konzentration von 1 mol% das Zetapotential deutlich auf Werte kleiner -20 mV ab. Die zusätzliche Beschallung der PEG40S-haltigen NUSCA am Ultraschallhomogenisator führte zu einer deutlichen Verminderung der Größen. Ein Einfluss der PEG40S-Konzentration konnte dabei sowohl auf die Struktur als auch auf die Größe festgestellt werden. Die Ultraschallkontrastverstärkung der einzelnen NUSCA wurde in Kapitel 4 in einem speziellen Durchflussmodell getestet. Der Einfluss der verschiedenen Herstellungsmethoden auf die Echogenizität war in den meisten Fällen negativ. Nach der Extrusion verschwand der Kontrast der DPPC/CH-Liposomen vollständig und der Kontrast der PEG40S-haltigen NUSCA wurde deutlich schwächer. Die Lyophilisation, die eigentlich dafür bekannt ist die Echogenizität zu verbessern, schwächte den Kontrast, außer bei Zusatz von PEG4000 zu den DPPC/CH-Liposomen, ab. Eine Konzentrationsabhängigkeit der Echogenizität war für den DPPG-Zusatz zu beobachten, aber auch hier blieb der Kontrast hinter den Werten der Formulierungen ohne DPPG zurück. Die zusätzliche Beschallung konnte die Echogenizität verbessern, wobei eine Abhängigkeit von der PEG40S-Konzentration deutlich wurde. Das Verhältnis der Liposomen und Mizellen zueinander schien einen Einfluss auf die Echogenizität zu haben, allerdings waren zwischen den DPPC- und DSPC-Formulierungen Unterschiede sichtbar. Untersuchungen zur Mischbarkeit von DPPC und DSPC mit PEG40S wurden daher in Kapitel 5, zur weiteren Erklärung der Kontrastverstärkungen, durchgeführt. Mit Hilfe von П/A - Isothermen wurde eine Mischbarkeit für DPPC und PEG40S in der flüssig-expandierten Phase festgestellt. DSPC und PEG40S dagegen waren nicht miteinander mischbar. Epifluoreszenzmessungen nach Beimischung eines fluoreszenzmarkierten Lipids konnten diese Ergebnisse bestärken. Die Konformation der PEG-Ketten in den Formulierungen wurde als weitere Erklärung für die konzentrations-abhängige Echogenizität aus diesen Ergebnissen abgeleitet. Bei den DPPC/PEG40S-NUSCA war das PEG40S gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt und lag daher länger in der geknäulten mushroom- Konformation vor. Höhere Konzentrationen an PEG40S führten zu einer stärkeren Interaktion der PEG-Ketten und einer Veränderung der Anordnung dieser in die gestreckte brush- Konformation. Bei Formulierungen aus den nicht mischbaren DSPC und PEG40S bildeten sich PEG40S-Domänen, in denen die Ketten sehr früh stark interagierten und daher in der brush- Konformation vorlagen. Die weiter in das Medium herausstehenden Ketten dieser Anordnung konnten stärker mit dem Ultraschall (US) interagieren und sorgten so für eine bessere Echogenizität. Eine in vitro Studie zur Bestimmung des sonothrombolytischen Potentials des NUSCA mit den besten Eigenschaften wurde in Kapitel 6 beschrieben. Thromben aus menschlichem Vollblut wurden dabei einer Behandlung mit diagnostischem US und verschiedenen Kombinationen der thrombolytischer Arzneistoffe und des NUSCA ausgesetzt. Die ermittelten Gewichtsverluste waren deutlich höher als in vergleichbaren in vitro Studien und Effekte des NUSCA auf das Fibrinnetz konnten gezeigt werden. NUSCA und US alleine führten zu einer deutlichen Zunahme der Porengröße im Fibrinnetz. Nach der Kombination von US, NUSCA und Arzneistoff konnte kein Fibrinnetz mehr auf der Oberfläche der Thromben nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse machen unser NUSCA zu einem vielversprechenden neuen Ansatz in der sonothrombolytischen Therapie., In this work development, characterisation and first in vitro experiments with a new, nanoscaled ultrasound contrast agent (NUSCA) are presented. The aim of this work was improving the therapy of thromboembolic diseases with the use of a NUSCA. Chapter 1 gives an introduction into the topic of this thesis and chapter 2 summarises the methods used. In chapter 3 the influence of different preparation methods und lipid mixtures on the physicochemical properties of the NUSCA’s are shown. Effects of extrusion, lyophilisation, DPPG addition and changes of PEG40S concentration in combination with additional sonication with an US-tip on size, Zetapotential and structure of the NUSCA were examined. Liposomal structure was visible for DPPC/CH formulations while PEG40S containing formulations form a mixture of liposomes and micelles. Extrusion led to a reduction of hydrodynamic diameter of all the formulations while lyophilisation, as a possibility to increase storage stability, increases particle size. Addition of the negative charged lipid DPPG to prevent particle aggregation didn’t change particle size and structure but the Zetapotential decreases to less than -20 mV. Additional sonication with an ultrasound-tip decreases the size of the formulation. An influence of PEG40S concentration on the structure as well as the hydrodynamic diameter could be shown. The echogenicity of the NUSCA was tested in a custom build flow-model and the results are summarised in chapter 4. Variations of the preparation method had mostly negative effect on the echogenicity. After extrusion no contrast enhancement was measurable for DPPC/CH liposomes and the echogenicity of PEG40S containing formulations was weakened. Lyophilisation, normally known to increase echogenicity, also reduces the contrast enhancement of our formulation, beside an addition of PEG4000 to the DPPC/CH liposomes. Depending on the concentration of DPPG the echogenicity increases, but never exceed echogenicity of formulation without DPPG. Additional sonication increased the contrast enhancement dependent on the PEG40S concentration. The ratio of liposomes to micelles seems to influence the echogenicity, however a difference between DPPC and DSPC formulations was found. The miscibility of the compound was therefore investigated in chapter 5. Langmuir monolayer studies revealed miscibility in fluid-expanded phase for DPPC and PEG40S while DSPC and PEG40S were not miscible. Epifluorescence measurements after adding a fluorescent labelled lipid ensure these results. Based on these results the regime of PEG-chains was derived as a further explanation for PEG40S concentration dependent echogenicity of the formulations. For the DPPC/PEG40S formulations the PEG chains exist longer in the supercoiled mushroom regime due to the equal distribution of the PEG40S on the surface. Increase of the PEG40S concentration leads to interaction of the PEG chains and thus a change of the conformation to brush regime. For the immiscible DSPC and PEG40S a formation of PEG40S domains was visible. A strong interaction of the PEG chains in this domains cause stronger PEG chain interaction at lower concentration and thus an early change of the regime. PEG chains in the brush regime extend further into the surrounding medium leading to stronger interaction with ultrasound (US) and thus higher echogenicity. Chapter 6 summarises the results of an in vitro sonothrombolysis study using the best NUSCA. Blood clots of human whole blood were exposed to diagnostic US and different combination of thrombolytic drugs and NUSCA. The clot mass loss was higher than in comparable in vitro studies. Furthermore an effect of the NUSCA on the fibrin network could be proven. NUSCA and US lead to a clearly visible increase in pore size of the fibrin network. After treatment with US, NUSCA and thrombolytic agent no fibrin could be detected at the thrombus surface. These results make our NUSCA a promising new approach for sonothrombolytic therapy.