Entwicklung und Charakterisierung nanoskaliger Lipidformulierungen als Ultraschallkontrastmittel zur sonothrombolytischen Therapie

In dieser Arbeit wurden Entwicklung, Charakterisierung und erste in vitro Versuche eines neuen, nanoskaligen Ultraschallkontrastmittels (NUSCA) vorgestellt. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines NUSCA zur Verbesserung der Behandlung thromboembolischer Erkrankungen. Kapitel 1 enthält eine allgemeine Einführung in das Thema der Arbeit, während in Kapitel 2 die verwendeten Methoden zusammengefasst werden. Kapitel 3 gibt verschiedene Herstellungsmethoden und Lipidmischungen und ihren Einfluss auf physikochemische Eigenschaften der NUSCA wieder. Die Auswirkungen von Extrusion, Lyophilisation, DPPG-Zusatz und Veränderungen der PEG40S-Konzentration bei zusätzlicher Beschallung mit einem Ultraschallhomogenisator auf Größe, Zetapotential und Struktur der NUSCA wurden getestet. Dabei konnten liposomale Strukturen bei DPPC/CH-Formulierungen und Mischungen aus Liposomen und Mizellen für PEG40S-haltige Formulierungen gefunden werden. Die Extrusion führte zu einer deutlichen Verringerung der hydrodynamischen Durchmesser aller Formulierungen. Lyophilisation, als Möglichkeit die Lagerstabilität zu verbessern, führte zu einer deutlichen Vergrößerung der Formulierungen. Das negative Lipid DPPG, zugesetzt um eine Aggregation der Partikel zu verhindern, veränderte Größe und PDIs der Formulierungen nicht, senkte aber ab einer Konzentration von 1 mol% das Zetapotential deutlich auf Werte kleiner -20 mV ab. Die zusätzliche Beschallung der PEG40S-haltigen NUSCA am Ultraschallhomogenisator führte zu einer deutlichen Verminderung der Größen. Ein Einfluss der PEG40S-Konzentration konnte dabei sowohl auf die Struktur als auch auf die Größe festgestellt werden. Die Ultraschallkontrastverstärkung der einzelnen NUSCA wurde in Kapitel 4 in einem speziellen Durchflussmodell getestet. Der Einfluss der verschiedenen Herstellungsmethoden auf die Echogenizität war in den meisten Fällen negativ. Nach der Extrusion verschwand der Kontrast der DPPC/CH-Liposomen vollständig und der Kontrast der PEG40S-haltigen NUSCA wurde deutlich schwächer. Die Lyophilisation, die eigentlich dafür bekannt ist die Echogenizität zu verbessern, schwächte den Kontrast, außer bei Zusatz von PEG4000 zu den DPPC/CH-Liposomen, ab. Eine Konzentrationsabhängigkeit der Echogenizität war für den DPPG-Zusatz zu beobachten, aber auch hier blieb der Kontrast hinter den Werten der Formulierungen ohne DPPG zurück. Die zusätzliche Beschallung konnte die Echogenizität verbessern, wobei eine Abhängigkeit von der PEG40S-Konzentration deutlich wurde. Das Verhältnis der Liposomen und Mizellen zueinander schien einen Einfluss auf die Echogenizität zu haben, allerdings waren zwischen den DPPC- und DSPC-Formulierungen Unterschiede sichtbar. Untersuchungen zur Mischbarkeit von DPPC und DSPC mit PEG40S wurden daher in Kapitel 5, zur weiteren Erklärung der Kontrastverstärkungen, durchgeführt. Mit Hilfe von П/A - Isothermen wurde eine Mischbarkeit für DPPC und PEG40S in der flüssig-expandierten Phase festgestellt. DSPC und PEG40S dagegen waren nicht miteinander mischbar. Epifluoreszenzmessungen nach Beimischung eines fluoreszenzmarkierten Lipids konnten diese Ergebnisse bestärken. Die Konformation der PEG-Ketten in den Formulierungen wurde als weitere Erklärung für die konzentrations-abhängige Echogenizität aus diesen Ergebnissen abgeleitet. Bei den DPPC/PEG40S-NUSCA war das PEG40S gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt und lag daher länger in der geknäulten mushroom- Konformation vor. Höhere Konzentrationen an PEG40S führten zu einer stärkeren Interaktion der PEG-Ketten und einer Veränderung der Anordnung dieser in die gestreckte brush- Konformation. Bei Formulierungen aus den nicht mischbaren DSPC und PEG40S bildeten sich PEG40S-Domänen, in denen die Ketten sehr früh stark interagierten und daher in der brush- Konformation vorlagen. Die weiter in das Medium herausstehenden Ketten dieser Anordnung konnten stärker mit dem Ultraschall (US) interagieren und sorgten so für eine bessere Echogenizität. Eine in vitro Studie zur Bestimmung des sonothrombolytischen Potentials des NUSCA mit den besten Eigenschaften wurde in Kapitel 6 beschrieben. Thromben aus menschlichem Vollblut wurden dabei einer Behandlung mit diagnostischem US und verschiedenen Kombinationen der thrombolytischer Arzneistoffe und des NUSCA ausgesetzt. Die ermittelten Gewichtsverluste waren deutlich höher als in vergleichbaren in vitro Studien und Effekte des NUSCA auf das Fibrinnetz konnten gezeigt werden. NUSCA und US alleine führten zu einer deutlichen Zunahme der Porengröße im Fibrinnetz. Nach der Kombination von US, NUSCA und Arzneistoff konnte kein Fibrinnetz mehr auf der Oberfläche der Thromben nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse machen unser NUSCA zu einem vielversprechenden neuen Ansatz in der sonothrombolytischen Therapie.
In this work development, characterisation and first in vitro experiments with a new, nanoscaled ultrasound contrast agent (NUSCA) are presented. The aim of this work was improving the therapy of thromboembolic diseases with the use of a NUSCA. Chapter 1 gives an introduction into the topic of this thesis and chapter 2 summarises the methods used. In chapter 3 the influence of different preparation methods und lipid mixtures on the physicochemical properties of the NUSCA’s are shown. Effects of extrusion, lyophilisation, DPPG addition and changes of PEG40S concentration in combination with additional sonication with an US-tip on size, Zetapotential and structure of the NUSCA were examined. Liposomal structure was visible for DPPC/CH formulations while PEG40S containing formulations form a mixture of liposomes and micelles. Extrusion led to a reduction of hydrodynamic diameter of all the formulations while lyophilisation, as a possibility to increase storage stability, increases particle size. Addition of the negative charged lipid DPPG to prevent particle aggregation didn’t change particle size and structure but the Zetapotential decreases to less than -20 mV. Additional sonication with an ultrasound-tip decreases the size of the formulation. An influence of PEG40S concentration on the structure as well as the hydrodynamic diameter could be shown. The echogenicity of the NUSCA was tested in a custom build flow-model and the results are summarised in chapter 4. Variations of the preparation method had mostly negative effect on the echogenicity. After extrusion no contrast enhancement was measurable for DPPC/CH liposomes and the echogenicity of PEG40S containing formulations was weakened. Lyophilisation, normally known to increase echogenicity, also reduces the contrast enhancement of our formulation, beside an addition of PEG4000 to the DPPC/CH liposomes. Depending on the concentration of DPPG the echogenicity increases, but never exceed echogenicity of formulation without DPPG. Additional sonication increased the contrast enhancement dependent on the PEG40S concentration. The ratio of liposomes to micelles seems to influence the echogenicity, however a difference between DPPC and DSPC formulations was found. The miscibility of the compound was therefore investigated in chapter 5. Langmuir monolayer studies revealed miscibility in fluid-expanded phase for DPPC and PEG40S while DSPC and PEG40S were not miscible. Epifluorescence measurements after adding a fluorescent labelled lipid ensure these results. Based on these results the regime of PEG-chains was derived as a further explanation for PEG40S concentration dependent echogenicity of the formulations. For the DPPC/PEG40S formulations the PEG chains exist longer in the supercoiled mushroom regime due to the equal distribution of the PEG40S on the surface. Increase of the PEG40S concentration leads to interaction of the PEG chains and thus a change of the conformation to brush regime. For the immiscible DSPC and PEG40S a formation of PEG40S domains was visible. A strong interaction of the PEG chains in this domains cause stronger PEG chain interaction at lower concentration and thus an early change of the regime. PEG chains in the brush regime extend further into the surrounding medium leading to stronger interaction with ultrasound (US) and thus higher echogenicity. Chapter 6 summarises the results of an in vitro sonothrombolysis study using the best NUSCA. Blood clots of human whole blood were exposed to diagnostic US and different combination of thrombolytic drugs and NUSCA. The clot mass loss was higher than in comparable in vitro studies. Furthermore an effect of the NUSCA on the fibrin network could be proven. NUSCA and US lead to a clearly visible increase in pore size of the fibrin network. After treatment with US, NUSCA and thrombolytic agent no fibrin could be detected at the thrombus surface. These results make our NUSCA a promising new approach for sonothrombolytic therapy.