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Transmembrane receptors are proteins that translate extracellular information into intracellular signals. These proteins are categorised based on the way they transduce signals through the plasma membrane. In many cases such transduction involves the formation of dimers, either ligand-induced or constitutive dimers. For example, while the enzyme-linked receptors, such as the Epidermal Growth Factor (EGF) receptor, may be ligand-induced dimers, the G protein-coupled receptors (GPCR) activated by the neurotransmitter glutamate are covalently linked constitutive dimers. Understanding how a signal can be transduced from the extracellular domain into the cell is important to develop novel drugs targeting such receptors.The EGF receptor is a member of the receptor tyrosine kinase (RTK) class and is involved in cell differentiation and proliferation. Inhibition of the EGF receptor by medication is used as a successful treatment for a variety of cancers, but side effects and resistance to medication remain common major obstacles. The full-length EGF receptor crystal structure is unknown, which leaves ambiguity to the precise activation process and the effect of inhibitors. Its activation mechanism has been described as either ligand-induced dimerization or conformational changes within pre-assembled dimers. This is followed by phosphorylation of the intracellular domain of the receptor and the generation of intracellular signalling cascades. By generating a fluorescent conformational biosensor, we showed that the activation of the EGF receptor by its endogenous agonists results from ligand-induced dimerization. We also found that some non-competitive tyrosine kinase (TK) inhibitors also induce dimer formation, without activating the receptor, through a direct contact of the TK domains. Strikingly, internalization induced by its endogenous ligand is not blocked by the non-competitive inhibitors, demonstrating it does not require TK domain activity and is likely mainly dependent on receptor dimer conformation. This is supported by our observation that TK inhibitors promoting dimer formation slowed down the internalization process. This finding shows that the activation/dimerization process of the EGF receptor can be changed by inhibitors and that internalization of the EGF receptor is regulated by monomeric/dimeric conformations rather than by phosphorylation of the receptor.In contrast to the EGF receptor, the metabotropic glutamate (mGlu) 4 receptor is a constitutive dimer that is important for the regulation of many synapses in the brain. Recently, an mGlu2-mGlu4 heterodimer was proven to exist in the brain, but its function remains unknown due to the lack of tools selectively controlling it. To further investigate mGlu4 homo- and heterodimers, an innovative nanobody that discriminates between these receptors was developed. The nanobody is selective for the human mGlu4 receptor, and stabilizes the active homodimer conformation, making it a full agonist. By combining molecular dynamics simulations and site-directed mutagenesis, the epitope and mechanism of action of the nanobody were identified, revealing a new way of activating mGlu receptors. Conversely, this nanobody is incapable of activating heterodimeric mGlu2-mGlu4, where it acts as positive allosteric modulator through asymmetric activation of the heterodimer. This nanobody is the first pharmacological tool that discriminates between homo- and heterodimers.Overall, our studies revealed how important is the conformation of dimeric receptors to control their signalling, as shown with the TK inhibitors controlling to conformation of the TK domain-induced dimers and the internalization process of the EGF receptor, or by showing that nanobodies can control specifically a receptor dimer made of specific subunits. These findings show the importance of allosteric and asymmetric regulation of dimeric transmembrane receptors., Les récepteurs transmembranaires traduisent les informations extracellulaires en signaux intracellulaires sont classés en fonction de leur mécanisme de transmission des signaux à travers la membrane plasmique. Nombre de ces récepteurs sont assemblés en dimères constitutifs ou induits par le ligand. Si les récepteurs liés à une enzyme, tels que le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF), peuvent être des dimères induits par le ligand, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) activés par le neurotransmetteur glutamate sont des dimères constitutifs liés de manière covalente. Il est important de comprendre comment ces récepteurs transmettent le signal pour développer des médicaments les ciblant. Le récepteur de l'EGF est un récepteur à domaine tyrosine kinase (RTK) impliqué dans la différenciation et la prolifération des cellules. Son inhibition par des médicaments est utilisée dans le traitement de cancers, mais les effets secondaires et la résistance aux traitements restent des obstacles majeurs. Sa structure tridimensionnelle complète étant inconnue, son processus d'activation n’est pas complétement compris et résulterait soit d’une dimérisation induite par le ligand soit de changements de conformation au sein de dimères pré-assemblés. Ceci est suivi par la phosphorylation du domaine intracellulaire du récepteur et la génération de cascades de signalisation intracellulaire. En générant un biocapteur conformationnel fluorescent, nous avons démontré que l'activation du récepteur par l’EGF résulte de sa dimérisation induite par le ligand. Nous avons également découvert que certains inhibiteurs non compétitifs du domaine tyrosine kinase (TK) induisent la formation de dimères par un contact des domaines TK, mais sans activer le récepteur. Il est à noter que l'internalisation induite par l’EGF n'est pas bloquée par les inhibiteurs des TKs (ITK), ce qui démontre qu'elle ne nécessite pas l'activité du domaine TK et qu'elle dépend probablement de la conformation du dimère. Ceci est soutenu par l’observation que les ITKs favorisant la formation de dimères ralentissent l'internalisation. Ce résultat montre que le processus d'activation/dimérisation du récepteur de l'EGF peut être modifié par des ITKs et que son internalisation est régulée par sa conformation monomère/dimère plutôt que par sa phosphorylation. Le récepteur métabotropique du glutamate (mGlu) 4 est un dimère constitutif qui joue un rôle important dans la régulation de nombreuses synapses dans le cerveau. Récemment, l'existence d'un hétérodimère mGlu2-mGlu4 a été prouvée dans le cerveau, mais sa fonction reste inconnue en raison du manque d'outils permettant de le contrôler sélectivement. Pour approfondir l'étude des homo- et hétérodimères mGlu4, un nanocorps innovant qui discrimine ces récepteurs a été développé. Ce nanocorps est sélectif pour le récepteur mGlu4 humain et stabilise la conformation active de l'homodimère, ce qui en fait un agoniste complet. En combinant des simulations de dynamique moléculaire et une mutagenèse dirigée, l'épitope et le mécanisme d'action du nanocorps ont été identifiés, révélant une nouvelle façon d'activer les récepteurs mGlu. À l'inverse, ce nanocorps est incapable d'activer les hétérodimères mGlu2-mGlu4, sur lesquels il agit comme un modulateur allostérique positif par une action asymétrique sur l'hétérodimère. Ce nanocorps est le premier outil pharmacologique qui permet de distinguer les homo- et les hétérodimères. Nos études ont révélé l'importance de la conformation des récepteurs dimériques pour contrôler leur signalisation, comme le montrent les ITKs contrôlant la conformation des dimères induits par les domaines TK et le processus d'internalisation du récepteur de l'EGF, ou en montrant que les nanocorps peuvent contrôler spécifiquement un dimère de récepteur composé de sous-unités spécifiques. Ces résultats montrent l'importance de la régulation allostérique et asymétrique des récepteurs transmembranaires dimériques.

In this thesis, the study focuses on the synthesis of semi-conducting polymers by an original pathway free from metals, in order to integrate them into organic electronic devices such as OLEDs (Organic light emitting diodes). The aim is to develop and optimize a new methodology using acyclic bis-aminoarylcarbenes as building blocks to synthesize new PPV-like polymers. First, the dimerization reaction is studied at a molecular level with the synthesis and characterization of diaminoalkenes obtained from monofunctional acyclic aminoarylcarbenes. The mechanism and the selectivity of this dimerization reaction is also investigated experimentally and theoretically. In a second step, the dimerization reaction was extended at a macromolecular level with the synthesis and characterization of new PPV-like polymers containing amino functions in α of the double bond. Subsequently, the influence of these chemically modified amino groups on the optoelectronic properties of these N-PPVs has been studied. Finally, the specific characteristics of the diaminoalkenes synthesized during this thesis has allowed a preliminary study on their potential applications as organocatalysts in the atom transfer radical polymerization reaction.; Dans cette thèse, la synthèse de polymères semi-conducteurs par une voie originale n’utilisant pas de métaux, afin de les intégrer dans des dispositifs électroniques organiques comme les OLED (Organic light emitting diode) a été developpée. Le but est de développer et d’optimiser une nouvelle méthode de synthèse en s’appuyant sur des bis-aminoarylcarbènes acyclique en tant que blocs constructeurs afin d’obtenir de nouveaux polymères PPV-like. Dans un premier temps, la réaction de dimérisation est étudiée au niveau moléculaire avec la synthèse et caractérisations de diaminoalcènes obtenu à partir de carbènes acycliques monofonctionnels. Le mécanisme et la sélectivité de cette réaction de dimérisation ont également été examiné par voies expérimentales et théoriques. Dans un deuxième temps, la réaction de dimérisation a été étendu au niveau macromoléculaire avec la synthèse et caractérisations de nouveaux PPV-like polymères contenant des fonctions amino en α de la double liaison. Par la suite, l’influence de ces groupements amino sur les propriétés optoélectroniques de ces N-PPV une fois modifiés chimiquement a pu être étudié. Enfin, les caractéristiques particulières des diaminoalcènes synthétisés au cours cette thèse ont permis une étude préliminaire sur leurs applications potentielles en tant que catalyseur organiques dans la réaction de polymérisation radicalaire par transfert d’atomes.

Evolution can help to provide valuable information to understand protein sequence, structure and function relationship. In a first project, I used molecular phylogeny to show the coevolution of “Testis expressed 19” (Tex19) and “Secreted and Transmembrane 1” (Sectm1) genes. Although Tex19 and Sectm1 are involved in different biological pathways, i.e. transposon regulation and immunity respectively, coevolution supports a strong functional relationship between both genes.Since Tex19 is expressed only in adult healthy testis and cancer cells, this result may be useful for cancer immunotherapy. In a second project, I used molecular modelling and sequence evolution analysis to question the validity of the glucocorticoïd receptor ɑ (GR ɑ ) ligand binding domain (LBD) homodimeric assembly [Bledsoe R.K. et al, 2002]. First, this complex is likely a crystallization artefact. Second, I have identified an alternative assembly that presents the molecular characteristics of a biological interface., Intégrer l’évolution peut aider à comprendre la relation séquence, structure, fonction des protéines. Dans un 1er projet, j’ai utilisé la phylogénèse moléculaire pour montrer que les gènes Testis expressed 19 » (Tex19) et « Secreted and transmembrane 1 » (Sectm1) coévoluent. Bien que Tex19 et Sectm1 interviennent dans des processus biologiques différents, régulation des transposons et immunité respectivement, la coévolution établit entre eux un lien fonctionnel très fort. Comme Tex19 ne s’exprime que dans le testicule de l’adulte sain et en cellule cancéreuse, ce résultat pourrait présenter un intérêt en immunothérapie du cancer. Dans un 2nd projet, je me suis appuyé sur des calculs de modélisation moléculaire et sur l’analyse d'évolution de séquence pour interroger la validité de la structure de l’homodimère du domaine de liaison au ligand (LBD) du récepteur ɑ aux glucocorticoïdes (GR ɑ) [Bledsoe R.K. et al, 2002]. Premièrement, ce complexe serait vraisemblablement un artefact de contact cristallin. Deuxièmement, j’ai identifié un assemblage alternatif présentant les caractéristiques moléculaires d’une interface de contact biologique.

G-Protein Coupled Receptors form the largest family of human membrane proteins and are involved in many cellular signaling processes. Thus, they constitute a pool of already identified or potential pharmacological targets. The activation of a GPCR starts with the binding of a ligand in its extra-cellular part, further modifying its intrinsic dynamical properties. These structural rearrangements are then transmitted along the transmembrane domains and promote the dissociation of the G-protein on the other side of the bilayer, thus propagating the signal into the intra-cellular compartment. This activation process can be modulated by the binding of many other partners of GPCRs. Despite many structural data now available, these mechanisms are still badly known at the molecular scale. In agreement, molecular dynamics simulations appear to be a method of choice to get a better description of these mechanisms. Nevertheless, the size and the time scales required for the simulation of these membrane systems limit such studies to laboratories having access to large computational facilities.The objective of this work was to predict and get a dynamical view of the interactions of several GPCRs with their partners, by developing an affordable molecular dynamics protocol that combines the coarse-grained MARTINI force field to Replica-Exchange MD simulations.In a first step, we validated our protocol by showing its ability to predict the dynamical binding of peptides to their receptors, through the study of Neurotensin, an agonist of the Neurotensin-1 receptor and CVX15, an antagonist of the CXCR4 chemokine receptor. We also show that the same protocol is able to predict the selectivity of several Neurotensin derived peptides against several wild-type/mutated receptors differing by a single residue.In a second step, we were concerned by the dynamical assembly of a GPCR heterodimer involving the Ghrelin and the Dopamine D2 receptors, respectively coupled to Gq and Gi proteins. Our model was validated by LRET measurements confirming a large protein:protein interface and a high complementarity between G-proteins. Based on this model, we designed and synthesized some peptides able to inhibit the assembly of this G-proteins heterodimer.Finally, we describe other applications of our protocol and how it can be employed and confronted to experiments to : predict the dynamical binding of toxins from snake’s venom to the Vasopressin-1a and Vasopressin-2 receptors ; predict the binding of the Ghrelin and Leap2 peptides to their GHSR-1a receptor and predict the coupling selectivity of several receptors to peptides mimicking the C-terminus of the α subunit of G-proteins.; Les Récepteurs Couplés aux Protéines-G forment la plus importante famille de protéines membranaires chez l’homme et sont impliqués dans de nombreux processus de signalisation cellulaire. Aussi, ils forment un vivier très important de cibles thérapeutiques, déjà identifiées ou potentielles. L’activation d’un RCPG est amorcée par la liaison d’un ligand dans sa partie extra-cellulaire, modifiant ainsi ses propriétés dynamiques intrinsèques. Ces changements structuraux vont alors se répercuter le long des domaines trans-membranaires et promouvoir la dissociation de la Protéine-G hétéro-trimérique, de l’autre côté de la membrane, propageant ainsi le signal au compartiment intra-cellulaire. Ce processus peut être modulé par la liaison de nombreux autres partenaires des RCPGs. Malgré de nombreuses données structurales existantes, ces mécanismes restent encore mal connus à l’échelle moléculaire. Ainsi, la dynamique moléculaire s’est révélée être un outil formidable pour mieux comprendre ces mécanismes. Toutefois, les échelles de taille et de temps requises pour discuter de la dynamique de ces systèmes membranaires limitent ces études aux laboratoires ayant accès à une très grande puissance de calcul. L’objectif des travaux présentés dans ce manuscrit a été de prédire et de mieux comprendre la dynamique d’interaction de différents récepteurs de cette famille avec leurs partenaires, en développant un protocole de dynamique moléculaire, peu coûteux en ressources de calcul, combinant le champ de forces gros-grains MARTINI à un protocole de dynamique moléculaire « Replica-Exchange ».Dans un premier temps, nous présentons la validation de notre protocole pour la prédiction de la liaison de peptides à leur récepteur avec l’étude des peptides Neurotensine, agoniste du Récepteur de la Neurotensine-1, et CVX15, antagoniste du Récepteur Chemokine C-X-C de type-4. Nous montrons également que notre protocole est capable de prédire la sélectivité de plusieurs peptides dérivés de la Neurotensine envers plusieurs récepteurs sauvages et mutés, ne présentant qu’un résidu de différence.Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la dynamique de formation d’un hétéro-dimère de RCPGs impliquant le Récepteur de la Ghréline et le récepteur de la Dopamine D2, couplés aux protéines Gq et Gi respectivement. Ce modèle validé au laboratoire par des mesures LRET montre une interface impliquant une forte complémentarité entre les protéines-G. En se basant sur notre modèle, nous avons conçu et synthétisé des peptides inhibiteurs de la formation de cet hétéro-dimère de protéines-G.Enfin, nous présentons d’autres exemples d’applications de notre protocole et comment il peut être utilisé de concert avec l’expérience avec : la prédiction de la liaison de toxines de serpents aux Récepteurs de la Vasopressine-1a et V2 ; la prédiction de la liaison des peptides Ghréline et Leap2 au Récepteur GHSR-1a et la prédiction de la sélectivité de couplage de différents récepteurs aux peptides C-terminaux de la sous-unité α des protéines-G.

G-Protein Coupled Receptors form the largest family of human membrane proteins and are involved in many cellular signaling processes. Thus, they constitute a pool of already identified or potential pharmacological targets. The activation of a GPCR starts with the binding of a ligand in its extra-cellular part, further modifying its intrinsic dynamical properties. These structural rearrangements are then transmitted along the transmembrane domains and promote the dissociation of the G-protein on the other side of the bilayer, thus propagating the signal into the intra-cellular compartment. This activation process can be modulated by the binding of many other partners of GPCRs. Despite many structural data now available, these mechanisms are still badly known at the molecular scale. In agreement, molecular dynamics simulations appear to be a method of choice to get a better description of these mechanisms. Nevertheless, the size and the time scales required for the simulation of these membrane systems limit such studies to laboratories having access to large computational facilities.The objective of this work was to predict and get a dynamical view of the interactions of several GPCRs with their partners, by developing an affordable molecular dynamics protocol that combines the coarse-grained MARTINI force field to Replica-Exchange MD simulations.In a first step, we validated our protocol by showing its ability to predict the dynamical binding of peptides to their receptors, through the study of Neurotensin, an agonist of the Neurotensin-1 receptor and CVX15, an antagonist of the CXCR4 chemokine receptor. We also show that the same protocol is able to predict the selectivity of several Neurotensin derived peptides against several wild-type/mutated receptors differing by a single residue.In a second step, we were concerned by the dynamical assembly of a GPCR heterodimer involving the Ghrelin and the Dopamine D2 receptors, respectively coupled to Gq and Gi proteins. Our model was validated by LRET measurements confirming a large protein:protein interface and a high complementarity between G-proteins. Based on this model, we designed and synthesized some peptides able to inhibit the assembly of this G-proteins heterodimer.Finally, we describe other applications of our protocol and how it can be employed and confronted to experiments to : predict the dynamical binding of toxins from snake’s venom to the Vasopressin-1a and Vasopressin-2 receptors ; predict the binding of the Ghrelin and Leap2 peptides to their GHSR-1a receptor and predict the coupling selectivity of several receptors to peptides mimicking the C-terminus of the α subunit of G-proteins., Les Récepteurs Couplés aux Protéines-G forment la plus importante famille de protéines membranaires chez l’homme et sont impliqués dans de nombreux processus de signalisation cellulaire. Aussi, ils forment un vivier très important de cibles thérapeutiques, déjà identifiées ou potentielles. L’activation d’un RCPG est amorcée par la liaison d’un ligand dans sa partie extra-cellulaire, modifiant ainsi ses propriétés dynamiques intrinsèques. Ces changements structuraux vont alors se répercuter le long des domaines trans-membranaires et promouvoir la dissociation de la Protéine-G hétéro-trimérique, de l’autre côté de la membrane, propageant ainsi le signal au compartiment intra-cellulaire. Ce processus peut être modulé par la liaison de nombreux autres partenaires des RCPGs. Malgré de nombreuses données structurales existantes, ces mécanismes restent encore mal connus à l’échelle moléculaire. Ainsi, la dynamique moléculaire s’est révélée être un outil formidable pour mieux comprendre ces mécanismes. Toutefois, les échelles de taille et de temps requises pour discuter de la dynamique de ces systèmes membranaires limitent ces études aux laboratoires ayant accès à une très grande puissance de calcul. L’objectif des travaux présentés dans ce manuscrit a été de prédire et de mieux comprendre la dynamique d’interaction de différents récepteurs de cette famille avec leurs partenaires, en développant un protocole de dynamique moléculaire, peu coûteux en ressources de calcul, combinant le champ de forces gros-grains MARTINI à un protocole de dynamique moléculaire « Replica-Exchange ».Dans un premier temps, nous présentons la validation de notre protocole pour la prédiction de la liaison de peptides à leur récepteur avec l’étude des peptides Neurotensine, agoniste du Récepteur de la Neurotensine-1, et CVX15, antagoniste du Récepteur Chemokine C-X-C de type-4. Nous montrons également que notre protocole est capable de prédire la sélectivité de plusieurs peptides dérivés de la Neurotensine envers plusieurs récepteurs sauvages et mutés, ne présentant qu’un résidu de différence.Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la dynamique de formation d’un hétéro-dimère de RCPGs impliquant le Récepteur de la Ghréline et le récepteur de la Dopamine D2, couplés aux protéines Gq et Gi respectivement. Ce modèle validé au laboratoire par des mesures LRET montre une interface impliquant une forte complémentarité entre les protéines-G. En se basant sur notre modèle, nous avons conçu et synthétisé des peptides inhibiteurs de la formation de cet hétéro-dimère de protéines-G.Enfin, nous présentons d’autres exemples d’applications de notre protocole et comment il peut être utilisé de concert avec l’expérience avec : la prédiction de la liaison de toxines de serpents aux Récepteurs de la Vasopressine-1a et V2 ; la prédiction de la liaison des peptides Ghréline et Leap2 au Récepteur GHSR-1a et la prédiction de la sélectivité de couplage de différents récepteurs aux peptides C-terminaux de la sous-unité α des protéines-G.

International audience; Potentiometric titration and Vapour Pressure Osmometry were used to characterise the acidic properties in an acidic chloride solution and the aggregation behaviour in n-heptane of a series of four extractants synthesized in the present work and derived from bis-(2-ethyl-hexyl-phosphoric) acid, a commercial extractant noted D2EHPA. Four other commercial organophosphorus extractants (D2EHPA, Cyanex 272, Cyanex301, Ionquest 801) were also characterized by these techniques. Their hydrophobicity was also investigated by determining the partition coefficient of the monomeric form between an acidic chloride solution and n-dodecane. The pKa values, the dimerization and trimerisation constants were deduced from experimental results by means of appropriate physicochemical models.

Serotonergic neurons are organized in complex networks interacting with other neurotransmitter systems in the brain. The 5-HT2B receptor contribution in these networks remains unclear. Using 5-HT2B receptor genetic ablation or a viral overexpression in the serotoninergic neurons, we have demonstrated its participation to the excitability of these neurons. In fact, 5-HT2B receptors are necessary for serotonin accumulation induced by ecstasy and antidepressants effects. Moreover, 5-HT2B receptors activation counteracts the 5-HT1A dependant inhibition on serotonergic neurons activity. Here we propose 5-HT2B receptor as positive modulator of serotonergic neurons. Then, studying 5-HT2B receptors and CIPP scaffold protein interaction allow us to identify the subcellular distribution of the receptor and a functional role of CIPP. Indeed, overexpression of both proteins in primary hippocampal cultures of neurons increases 5-HT2B receptors somatodendritic targeting at excitatory synapses. Thus CIPP increases dendritic calcium release dependent on 5-HT2B receptor stimulation. In synergy with CIPP, this stimulation increases NMDA receptors clustering suggesting a role in synaptic plasticity that could explain some of the previous findings.; Les neurones sérotoninergiques forment des réseaux complexes avec les autres systèmes de neurotransmission dans le système nerveux central. Le rôle du récepteur 5-HT2B dans ces réseaux est peu connu. L’ablation génétique ou la surexpression virale du récepteur 5-HT2B dans les neurones sérotoninergiques, nous ont permis de mettre en évidence sa participation à l’excitabilité de ces neurones. De fait, le récepteur 5-HT2B est nécessaire à l’action des antidépresseurs et de l'ecstasy qui provoquent une accumulation extracellulaire de sérotonine. Aussi, le récepteur 5-HT2B est capable d’agir tel un modulateur positif, à l’opposé des autorécepteurs 5-HT1A, sur l’activité des neurones sérotoninergiques. Ensuite, l’étude de la distribution du récepteur 5-HT2B et de son interaction avec la protéine de pontage CIPP nous a permis de décrire la distribution subcellulaire du récepteur 5-HT2B dans des cultures primaires de neurones d’hippocampe. La co-expression du récepteur 5-HT2B avec CIPP augmente significativement son adressage somatodendritique dans les synapses excitatrices. Au niveau fonctionnel, CIPP augmente la libération dendritique de calcium dépendante de la stimulation du récepteur 5-HT2B. En synergie avec CIPP, cette stimulation augmente le regroupement des récepteurs glutamatergiques NMDA suggérant un rôle dans la plasticité synaptique pouvant expliquer certains résultats précédents.

Integrase (IN) is an essential enzyme in retroviral replicative cycle, which catalyzes the integration of the viral DNA into the target cell genome. Structural data previously obtained by our team led to rational design of molecules likely to block IN in an inactive oligomeric form. In vitro concerted integration assays made it possible to study their effect on IN enzymatic activity. Pig has an endogenous gammaretrovirus called Porcine Endogenous RetroVirus (PERV) which can be transmitted to humans during xenotransplantation. The aim of the structural study of the recombinant virus PERV-A/C IN is to better understand its mechanism and thus guide the rational design of inhibitors limiting xenozoonosis risk. I modeled the PERV-A/C IN intasome in complex with raltegravir, a drug used for HIV treatment. Then I developed purification protocols to study the isolated and complexed PERV-A/C IN Carboxy-Terminal Domain (CTD) with the human cellular cofactor Brd2. The SAXS envelope of the complex was determined. In parallel, a histone array study, performed with the PERV-A/C IN CTD alone, revealed a specificity profile for modified H2B and H3 histone tails, L'intégrase (IN) est une enzyme essentielle du cycle réplicatif des rétrovirus, qui catalyse l'intégration de l'ADN viral rétrotranscrit dans le génome de la cellule cible. Des données structurales, précédemment obtenues par notre équipe, ont conduit à la conception rationnelle de molécules susceptibles de bloquer l'IN sous une forme oligomérique inactive. Des tests d'intégration concertée in vitro ont permis d'étudier leur effet sur l'activité enzymatique de l'IN.Le porc est porteur d'un Gammaretrovirus endogène appelé Porcine Endogenous RetroVirus (PERV), susceptible d'être transmis à l'homme lors d'une xénotransplantation. L'étude structurale de l'IN du virus recombinant PERV-A/C a pour but de mieux comprendre son fonctionnement et de guider le développement rationnel d'inhibiteurs limitant le risque de xénozoonose. J'ai modélisé l'intasome de l'IN de PERV-A/C en complexe avec le raltégravir, un médicament utilisé comme traitement anti-VIH. J'ai ensuite mis au point des protocoles de purification permettant d'étudier le domaine carboxy-terminal (Carboxy Terminal Domain ou CTD) de l'IN de PERV-A/C isolé et en complexe avec le CTD du cofacteur cellulaire humain Brd2. L'enveloppe SAXS de ce complexe a été déterminée. En parallèle, une étude par histone array, réalisée avec le CTD seul de l'IN de PERV-A/C, a révélé un profil de spécificité pour des queues d'histones H2B et H3 portant des modifications post-traductionnelles

Serotonergic neurons are organized in complex networks interacting with other neurotransmitter systems in the brain. The 5-HT2B receptor contribution in these networks remains unclear. Using 5-HT2B receptor genetic ablation or a viral overexpression in the serotoninergic neurons, we have demonstrated its participation to the excitability of these neurons. In fact, 5-HT2B receptors are necessary for serotonin accumulation induced by ecstasy and antidepressants effects. Moreover, 5-HT2B receptors activation counteracts the 5-HT1A dependant inhibition on serotonergic neurons activity. Here we propose 5-HT2B receptor as positive modulator of serotonergic neurons. Then, studying 5-HT2B receptors and CIPP scaffold protein interaction allow us to identify the subcellular distribution of the receptor and a functional role of CIPP. Indeed, overexpression of both proteins in primary hippocampal cultures of neurons increases 5-HT2B receptors somatodendritic targeting at excitatory synapses. Thus CIPP increases dendritic calcium release dependent on 5-HT2B receptor stimulation. In synergy with CIPP, this stimulation increases NMDA receptors clustering suggesting a role in synaptic plasticity that could explain some of the previous findings., Les neurones sérotoninergiques forment des réseaux complexes avec les autres systèmes de neurotransmission dans le système nerveux central. Le rôle du récepteur 5-HT2B dans ces réseaux est peu connu. L’ablation génétique ou la surexpression virale du récepteur 5-HT2B dans les neurones sérotoninergiques, nous ont permis de mettre en évidence sa participation à l’excitabilité de ces neurones. De fait, le récepteur 5-HT2B est nécessaire à l’action des antidépresseurs et de l'ecstasy qui provoquent une accumulation extracellulaire de sérotonine. Aussi, le récepteur 5-HT2B est capable d’agir tel un modulateur positif, à l’opposé des autorécepteurs 5-HT1A, sur l’activité des neurones sérotoninergiques. Ensuite, l’étude de la distribution du récepteur 5-HT2B et de son interaction avec la protéine de pontage CIPP nous a permis de décrire la distribution subcellulaire du récepteur 5-HT2B dans des cultures primaires de neurones d’hippocampe. La co-expression du récepteur 5-HT2B avec CIPP augmente significativement son adressage somatodendritique dans les synapses excitatrices. Au niveau fonctionnel, CIPP augmente la libération dendritique de calcium dépendante de la stimulation du récepteur 5-HT2B. En synergie avec CIPP, cette stimulation augmente le regroupement des récepteurs glutamatergiques NMDA suggérant un rôle dans la plasticité synaptique pouvant expliquer certains résultats précédents.

Plants are increasingly faced with a decrease in soil’s water availability, leading to a hydric and osmotic stress and impacting on their survival. Plant tolerance to this stress will be dependent on its perception. One of the signaling mechanisms related to this stress is called MultiStep Phosphorelay (MSP) and is composed by 3 partners: a histidine-aspartate receptor kinase (HK), histidine phosphotransfer proteins (HPt) and response regulators (RR), including the B-type RR transcription factors. In Arabidopsis, an MSP with AHK1, AHP2 and ARR18 has been identified for osmotic stress signaling. For poplar, HK1a and b, paralogous genes and homologous with AHK1, 10 HPt and 9 B-type RR genes have been isolated respectively. The osmosensor function of HK1a was proposed, and an osmosensing signaling pathway composed by HK1a, 3 HPt proteins, and 6 B-type RR has been suggested. The purpose of this work was focused on the identification and characterization of B-type RR transcription factors specifically linked to osmotic stress in poplar. The main results of this work are the highlight of the transcription factor function of two B-type RR, RR13 and RR19, through the study of their ability to dimerize and transactivate or not osmotic stress-responsive genes. The RR13 seems to be specific for cytokinins signaling pathway, whereas the RR19 seems to be specific for the osmosensing one. This work strongly supports the involvement of RR19 in the osmosensing MSP. Many studies have also been initiated during this work and will facilitate the characterization of the studied MSP., Les plantes sont de plus en plus confrontées à une diminution de la disponibilité en eau du sol, constituant une contrainte hydrique et osmotique impactant leur survie. La tolérance des plantes face à cette contrainte sera conditionnée par la perception de celle-ci. Un des mécanismes de signalisation de cette contrainte est appelé MultiStep Phosphorelay (MSP) et est composé de 3 partenaires : un récepteur Histidine-aspartate Kinase (HK), des protéines Histidine Phosphotransfert (HPt) et des Régulateurs de Réponse (RR), dont les facteurs de transcription RR-B. Chez Arabidopsis, un MSP constitué d’AHK1, AHP2 et ARR18 a été identifié dans le cadre de la contrainte osmotique. Pour le peuplier, HK1a et b, gènes paralogues et homologues à AHK1, ainsi que 10 et 9 gènes codant respectivement des HPt et des RR-B ont été isolés. La fonction d’osmosenseur d’HK1a a été avancée, et une voie de signalisation de la contrainte osmotique chez le peuplier constituée de ce récepteur, 3 HPt et 6 RR-B a été proposée. L’objectif de la thèse visait à déterminer et caractériser des facteurs de transcription RR-B liés à la contrainte osmotique de façon spécifique. Les résultats phares de cette thèse sont la mise en évidence de la fonction de facteur de transcription de deux RR-B, RR13 et RR19, via l’étude de leur capacité à dimériser et à transactiver ou non des gènes de réponses à la contrainte osmotique. Le RR13 semblerait spécifique de la voie cytokinines et le RR19 de la voie osmosensing. Ce travail étaye fortement l’implication du RR19 dans le MSP dédié à cette contrainte. De nombreuses études ont par ailleurs été initiées durant ce travail de thèse et pourront faciliter la caractérisation du MSP étudié.

The GPR147, also known as Neuropeptide FF1 Receptor (Bonini et al., 2000), is a seven-transmembrane G protein-coupled receptor (GpCR) that binds the Gonadotropin inhibitory hormone (GnIH) or the RFamide-related peptide-3 (RfRP3) peptide (Smith & Clarke, 2010).These ligands play a role in the control of reproduction in mammals and birds. The GPR147 is expressed in neurons (i.e GnRH neurons) and takes part with other GpCR, as GnRHr and GPR54 (GnRH and Kiss peptide receptor respectively), in the regulation of the hypothalamic-pituitary-gonadal axe. We have generated plasmids to express all these receptors as fusion fluorescent proteins and studied the homodimerization of GPR147 and the heterodimerization with GPR54 and GnRHr receptors, by FRET, BiFC and in the current approach by Fluorescence anisotropy.

Peptide ligand-induced dimerization of the extracellular region of the epidermal growth factor receptor (sEGFR) is central to the signal transduction of many cellular processes. A small molecule microarray screen has been developed to search for non-peptide compounds able to bind to sEGFR. We describe the discovery of nitro-benzoxadiazole (NBD) compounds that enhance tyrosine phosphorylation of EGFR and thereby trigger downstream signaling pathways and other receptor tyrosine kinases in cancer cells. The protein phosphorylation profile in cells exposed to NBD compounds is to some extent reminiscent of the profile induced by the cognate ligand. Experimental studies indicate that the small compounds bind to the dimerization domain of sEGFR, and generate stable dimers providing allosteric activation of the receptor. Moreover, receptor phosphorylation is associated with inhibition of PTP-1B phosphatase. Our data offer a promising paradigm for investigating new aspects of signal transduction mediated by EGFR in cancer cells exposed to electrophilic NBD compounds.

ATP-sensitive potassium channels (KATP) play an important role in many cellular processes. The modulation of these channels by activating molecules may constitute very interesting pharmacological and medicinal applications. For this purpose, we have designed and synthesized new hybrid molecules cromakalim-diazoxide and diazoxide-amine/aminoacid. We also evaluated the relaxant activity of these compounds on aorta of rats. The obtained results do not show a significant relaxant effect. Studies on other tissues, including pancreatic  cells and uterine muscle, are envisaged to explore the potency of these compounds and their possible tissue selectivity.Otherwise, Protein-protein interactions play a fundamental role in almost all cellular processes. They are strongly involved in the formation of the dimeric structure of HIV-1 protease and β amyloid peptide aggregation involved in Alzheimer's disease. Inhibition of these interactions would be a therapeutic advantage for the treatment of AIDS and Alzheimer's disease. We designed and synthesized on one hand, molecular tongs based on carbonylhydrazide oligohydrazid (Azatide) fragments and in the other hand, pentapeptide molecules with a central fluorinated and hydroxylated aminoacid. Finally, we tested the ability of molecular tongs to disrupt the terminal β sheet of the HIV-1 PR to inhibit its dimerization and thus its activity. We have also conducted a structure-activity relationship study and According to the results it seems that flexibility is detrimental to the inhibitory activity. We evaluated as well the ability of new fluorinated and hydroxylated peptidomimetics to accelerate or inhibit the aggregation of Aβ1-42 peptide in order to reduce the presence of small toxic oligomers. The results are very promising that we succeeded in developing a pentapeptide able to completely inhibit the aggregation of Aβ1-42, and in the other hand pseudopentapeptides able to accelerate its aggregation. We also demonstrated the influence of fluorine on the structure of a pentapeptides. Studies by NMR and DC are in progress.; Les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP) jouent un rôle primordial dans plusieurs processus cellulaires. La modulation de ces canaux par des molécules activatrices constituerait des applications pharmacologiques et médicinales très intéressantes. À cet effet nous avons conçu et synthétisé de nouvelles molécules hybrides cromakalim-diazoxide et diazoxide-amine/aminoacide. Nous avons également, évalué l’activité myorelaxante de ces composés sur l’aorte de rates. Les résultats obtenus ne montrent pas un effet myorelaxant significatif. Des études sur d’autres tissus, notamment les cellules β pancréatiques et le muscle utérin, sont envisagées afin d’explorer une éventuelle sélectivité tissulaire. Par ailleurs, les interactions protéine-protéine jouent un rôle fondamental dans presque tous les processus cellulaires. Elles sont fortement impliquées dans la formation de la structure dimérique de la protéase du VIH-1 et l’agrégation du peptide β amyloïde impliquée dans la maladie d’Alzheimer. L’inhibition de ces interactions serait donc d’un avantage thérapeutique pour le traitement du SIDA et de la maladie d’Alzheimer. Nous avons conçu et synthétisé d’une part, des pinces moléculaires à base de motifs carbonylhydrazides et oligohydrazides (Azatide), et d’autre part, des molécules pentapeptidiques avec un peudoaminoacide central alcoolfluoré. Enfin, nous avons testé la capacité des pinces moléculaires à perturber le feuillet β terminal de la PR du VIH-1 afin d'inhiber sa dimérisation et donc son activité. Nous avons réalisé de même une étude de relation structure-activité et d’après l’ensemble des résultats obtenus, il semblerait que la flexibilité est délétère pour l’activité inhibitrice. Nous avons également évalué la capacité des nouvelles molécules peptidomimétiques alcool fluorées à accélérer ou inhiber l’agrégation du peptide Aβ1-42 dans le but de diminuer la présence de petits oligomères neurotoxiques. Les résultats obtenus sont très prometteurs, nous avons réussi à développer d’une part un pentapeptide capable d’inhiber totalement l’agrégation de Aβ1-42, et d’autre part des pseudopentapeptides capables d’accélérer son agrégation. Nous avons aussi démontré l’influence de l’atome de fluor sur la structuration d’un pentapeptide. Des études par RMN et DC sont en cours.

BACKGROUND: Nuclear receptors (NR) regulate transcription of genes involved in many biological processes such as development, cell proliferation, differentiation and cell death. Amongst them, PPARG2 and THR control tissue glucose and lipid homeostasis which are deregulated in severe pathophysiological conditions such as metabolic syndromes. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Here, we describe a real time BRET approach to monitor heterodimerization between RXR and PPARG2 or THR in vitro or in living cells. The presence of a specific DNA target was required to induce in vitro a BRET shift reflecting heterodimerization of RXR/PPARG2 or RXR/THR. As in electrophoretic mobility shift assay (EMSA), the stringency and specificity of the BRET shift assay depended upon assay condition optimization including MgCl2 concentration. For the nuclear receptors, we found by mutagenesis analysis that each heterodimer partner must harbor an intact DNA binding domain to induce BRET and heterodimerization on a DNA target. Moreover the interaction between the PPARG2 ligand binding domain and the RXR DNA binding domain stabilized the heterodimer on its DNA target. BRET microscopy in living cells highlighted the heterodimerization of RXR/PPARG2 within the nucleus clustered in discrete foci that may represent active target gene transcription regulation regions. BRET imaging also suggested that heterodimerization between RXR and PPARG2 required the DNA binding of PPARG2. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: The BRET approach described here allowed us to study the dynamic interactions which exist between NR in vitro or in living cells and can provide important information on heterodimerization modes, affinity with a given RE and subcellular localization of the heterodimers. This method could be used to study real time changes of NR heterodimers occurring on DNA depending upon cell activation, chromatin state and help to define the mechanisms of ligands or drug action designed to target NRs.

Multistep His-to-Asp phosphorelay systems are signaling pathways devoted to signal perception and transduction for establishment of specific responses. These systems are composed of three successive partners: Histidine-aspartate Kinases (HKs), Histidine-containing Phosphotransfer proteins (HPts), and Response Regulators (RRs). One of the best characterized corresponding systems is the osmo-responsive pathway in yeast. Such systems are also suspected in Arabidopsis. This work aimed to characterize the involvement of an osmosensing pathway in Populus by identifying HPt and RR elements downstream of HK1 and to reveal the underlying mechanisms for the activity of a RR-B. HK1, membrane osmosensor, is expected to be responsible for signal detection and propagation by triggering the activation of three preferential HPt. Furthermore, an interacting partnership between those HPts and particular B-type RRs was observed. Two of them appear to be regulated by an osmotic stress, suggesting their possible involvement in this pathway. The B-type RR members, the final output elements of the pathway, act as transcription factors, as shown for at least for one of them in planta. Taken together, the dimerization of the RR receiver domain and its interaction with its DNA binding domain (GARP), are likely key checkpoints in the regulation of RR-B activity. Besides, the ability of one RR-B to bind its cognate specific DNA sequences (AGAT boxes) was confirmed in vitro and those were found in promoters of osmotic response genes. This work opens up prospects for the involvement of RR-B in the osmotic stress signaling pathway and suggests mechanisms tuning induction of specific responses., Les relais de phosphorylation de type histidine/aspartate constituent des voies de signalisation impliquées dans la perception et la transduction des signaux jusqu’à la mise en place de réponses spécifiques. Ils mettent en jeu un récepteur ou Histidine aspartate Kinase (HK), des protéines navettes en charge de la transmission du phosphate (HPt) et des Régulateurs de Réponse (RR). L’implication d’un tel système dans la transduction du signal de la contrainte osmotique est avérée chez la levure et fortement suspectée chez Arabidopsis. Ce travail de thèse visait d’une part à caractériser l’implication de cette voie de transduction de la contrainte osmotique chez le peuplier, avec l’identification de partenaires HPt et RR en aval du récepteur HK1 et d’autre part à caractériser le mode de fonctionnement d’un RR de type-B. HK1, un osmosenseur membranaire détecterait le signal et le transmettrait à trois HPt préférentielles. De plus, un partenariat d’interaction se dégagerait entre ces trois HPt et certains RR-B. La régulation transcriptionnelle observée lors d’une contrainte osmotique pour deux des représentants des RR-B témoigne d’une possible implication de ces RR dans cette voie. Ces protéines sont des facteurs de transcription dont la fonction a été confirmée in planta pour l’un d’entre eux. La dimérisation du domaine receveur du RR et son interaction avec le domaine de fixation à l’ADN ou domaine GARP apparaissent comme des points de contrôle clés dans la régulation de l’activité effectrice des RR-B. De plus, la capacité d’un RR-B à se fixer sur ses motifs de reconnaissance (boîtes AGAT) a pu être vérifiée in vitro et la présence de ces séquences a d’ailleurs été retrouvée dans des gènes régulés par la contrainte osmotique. Ce travail prospectif ouvre des perspectives concernant l’implication des RR-B dans la voie de transduction du signal de la contrainte osmotique, et propose notamment des mécanismes fins pour l’élaboration d’une réponse hautement spécifique.

ATP-sensitive potassium channels (KATP) play an important role in many cellular processes. The modulation of these channels by activating molecules may constitute very interesting pharmacological and medicinal applications. For this purpose, we have designed and synthesized new hybrid molecules cromakalim-diazoxide and diazoxide-amine/aminoacid. We also evaluated the relaxant activity of these compounds on aorta of rats. The obtained results do not show a significant relaxant effect. Studies on other tissues, including pancreatic  cells and uterine muscle, are envisaged to explore the potency of these compounds and their possible tissue selectivity.Otherwise, Protein-protein interactions play a fundamental role in almost all cellular processes. They are strongly involved in the formation of the dimeric structure of HIV-1 protease and β amyloid peptide aggregation involved in Alzheimer's disease. Inhibition of these interactions would be a therapeutic advantage for the treatment of AIDS and Alzheimer's disease. We designed and synthesized on one hand, molecular tongs based on carbonylhydrazide oligohydrazid (Azatide) fragments and in the other hand, pentapeptide molecules with a central fluorinated and hydroxylated aminoacid. Finally, we tested the ability of molecular tongs to disrupt the terminal β sheet of the HIV-1 PR to inhibit its dimerization and thus its activity. We have also conducted a structure-activity relationship study and According to the results it seems that flexibility is detrimental to the inhibitory activity. We evaluated as well the ability of new fluorinated and hydroxylated peptidomimetics to accelerate or inhibit the aggregation of Aβ1-42 peptide in order to reduce the presence of small toxic oligomers. The results are very promising that we succeeded in developing a pentapeptide able to completely inhibit the aggregation of Aβ1-42, and in the other hand pseudopentapeptides able to accelerate its aggregation. We also demonstrated the influence of fluorine on the structure of a pentapeptides. Studies by NMR and DC are in progress., Les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP) jouent un rôle primordial dans plusieurs processus cellulaires. La modulation de ces canaux par des molécules activatrices constituerait des applications pharmacologiques et médicinales très intéressantes. À cet effet nous avons conçu et synthétisé de nouvelles molécules hybrides cromakalim-diazoxide et diazoxide-amine/aminoacide. Nous avons également, évalué l’activité myorelaxante de ces composés sur l’aorte de rates. Les résultats obtenus ne montrent pas un effet myorelaxant significatif. Des études sur d’autres tissus, notamment les cellules β pancréatiques et le muscle utérin, sont envisagées afin d’explorer une éventuelle sélectivité tissulaire. Par ailleurs, les interactions protéine-protéine jouent un rôle fondamental dans presque tous les processus cellulaires. Elles sont fortement impliquées dans la formation de la structure dimérique de la protéase du VIH-1 et l’agrégation du peptide β amyloïde impliquée dans la maladie d’Alzheimer. L’inhibition de ces interactions serait donc d’un avantage thérapeutique pour le traitement du SIDA et de la maladie d’Alzheimer. Nous avons conçu et synthétisé d’une part, des pinces moléculaires à base de motifs carbonylhydrazides et oligohydrazides (Azatide), et d’autre part, des molécules pentapeptidiques avec un peudoaminoacide central alcoolfluoré. Enfin, nous avons testé la capacité des pinces moléculaires à perturber le feuillet β terminal de la PR du VIH-1 afin d'inhiber sa dimérisation et donc son activité. Nous avons réalisé de même une étude de relation structure-activité et d’après l’ensemble des résultats obtenus, il semblerait que la flexibilité est délétère pour l’activité inhibitrice. Nous avons également évalué la capacité des nouvelles molécules peptidomimétiques alcool fluorées à accélérer ou inhiber l’agrégation du peptide Aβ1-42 dans le but de diminuer la présence de petits oligomères neurotoxiques. Les résultats obtenus sont très prometteurs, nous avons réussi à développer d’une part un pentapeptide capable d’inhiber totalement l’agrégation de Aβ1-42, et d’autre part des pseudopentapeptides capables d’accélérer son agrégation. Nous avons aussi démontré l’influence de l’atome de fluor sur la structuration d’un pentapeptide. Des études par RMN et DC sont en cours.

My thesis was declined in three fields of research. First, a bibliographical study was conduct on the data available about genetic parameters of beef tenderness. This research allowed me to develop a scenario which would explain the chronology of the events occurring after animal death by which proteases inhibitors and the mitochondrion seem to play an paramount role. The second research was carried out on structure function relationship of a bovine serine protease inhibitor (serpin), bovSERPINA3-3. This study has shown the significance of the amino acid D371 in the cross-class inhibition mechanism against a cysteine protease, caspase 3, involved in apoptosis, a mechanism which would occur after the death of the animal. This study confirms serpins importance during meat ageing. Moreover, it underlined the necessity of this residue for the dimerization of bovSERPINA3-3 under denaturing conditions. This situation could be used as a model for the human serpins polymerization phenomenon found in some diseases such as Alzheimer’s, cirrhosis or emphysema. Finally, the last point was related to the development and validation of an ELISA test, using the bacterial recombinant bovSERPINA3-3 as reference. This test will allow to quantify the bovine serpinA3s rate in samples of interest and to carry out a spatio-temporal study of the bovine serpinA3s at different developmental stages and organs or tissues., Ma thèse fut orientée selon trois axes. Le premier a consisté en une étude bibliographique des données existantes sur les paramètres génétiques liés à la tendreté des viandes bovines. Ces recherches m’ont permis de formuler un scénario hypothétique expliquant la chronologie des événements pouvant se mettre en place après la mort de l’animal et dans lequel les inhibiteurs protéasiques ainsi que la mitochondrie joueraient un rôle tout particulier. Le deuxième volet concernait l’étude de la relation « structure-fonction » de la protéine bovSERPINA3-3, un inhibiteur de protéase à sérine. Cette étude a permis de mettre en évidence l’importance du résidu D371 dans l’inhibition de la caspase 3, protéase à cystéine impliquée dans le phénomène apoptotique qui surviendrait juste après la mort de l’animal. Elle conforte ainsi le rôle des serpines dans la maturation de la viande. De plus, ce résidu semble également impliqué dans le phénomène de dimérisation de cette protéine observé en conditions dénaturantes. Le modèle structural que nous proposons pourrait permettre de mieux appréhender le phénomène de polymérisation des serpines humaines responsables de pathologies telles que l’emphysème, la cirrhose ou encore la maladie d’Alzheimer. La troisième partie de ma thèse a été consacrée à la mise au point d’un test ELISA, utilisant l’anti-protéase recombinante comme protéine référente de la gamme d’étalonnage. L’utilisation de ce test devrait permettre de quantifier le taux de serpines bovines dans des échantillons d’intérêt mais également dans des études spatio-temporelles à différents stades de développement et dans différents tissus ou organes.

MORIN-ALLORY L.,Professeur, Universitéd'Orléans : Président GENEST Monique, Directeur de recherche, CNRS : Directeur de thèse ETCHEBST C.,Professeur, Université Paris 7 : Rapporteur STURGIS J., Professeur, Université Aix Marseille 2 : Rapporteur BESWICK V., Maitre de conférence, Université d'Evry : Rapporteur DUFOURC E.,Directeur de recherche, CNRS : Examinateur; Ligand-induced dimerization is necessary for tyrosine kinase receptor activation. The unique transmembrane domain of these proteins plays a crucial role in these mechanisms. The rodent Neu receptor and its human homologous ErbB2 are involved in several cancers induced by the Val to Glu substitution in the transmembrane domain or by overexpression. The structureof the transmembrane domain in the receptor dimer is a key determinant for dimerization and activation processes. Molecular dynamics simulations performed in hydrated DMPC and POPC membranes show that the transmembrane helices of the wild and the oncogenic Neu receptor form a left-handed structure with a symmetrical helix-helix interface. In the oncogenic form of Neu, the polar Glu residue is embedded into the membrane and stabilizes helix-helix interactions by forming strong inter helical hydrogen bonds.; La dimérisation induite par la fixation de ligand est nécessaire à l'activation des récepteurs tyrosine kinase. Le domaine transmembranaire unique de ces protéines joue un rôle crucial dans ces mécanismes. Le récepteur Neu chez le rat et son homologue ErbB2 chez l'humain sont à l'origine de nombreux cancers provoqués par la mutation ponctuelle Val/Glu dans le segment transmembranaire ou la surexpression du récepteur. La structure du domaine transmembranaire dans le récepteur dimère semble déterminante dans les processus d'activation. Les simulations de dynamique moléculaire montrent que, dans une membrane modèle constituée de DMPC ou de POPC hydratés, les hélices transmembranaires de Neu sauvage et oncogénique s'associent préférentiellement en enroulement gauche formant une interface symétrique. Dans le cas de Neu oncogénique le résidu polaire Glu, enfoui dans la membrane, stabilise les interactions entre hélices en formant de fortes liaisons hydrogène

MORIN-ALLORY L.,Professeur, Universitéd'Orléans : Président GENEST Monique, Directeur de recherche, CNRS : Directeur de thèse ETCHEBST C.,Professeur, Université Paris 7 : Rapporteur STURGIS J., Professeur, Université Aix Marseille 2 : Rapporteur BESWICK V., Maitre de conférence, Université d'Evry : Rapporteur DUFOURC E.,Directeur de recherche, CNRS : Examinateur; Ligand-induced dimerization is necessary for tyrosine kinase receptor activation. The unique transmembrane domain of these proteins plays a crucial role in these mechanisms. The rodent Neu receptor and its human homologous ErbB2 are involved in several cancers induced by the Val to Glu substitution in the transmembrane domain or by overexpression. The structureof the transmembrane domain in the receptor dimer is a key determinant for dimerization and activation processes. Molecular dynamics simulations performed in hydrated DMPC and POPC membranes show that the transmembrane helices of the wild and the oncogenic Neu receptor form a left-handed structure with a symmetrical helix-helix interface. In the oncogenic form of Neu, the polar Glu residue is embedded into the membrane and stabilizes helix-helix interactions by forming strong inter helical hydrogen bonds.; La dimérisation induite par la fixation de ligand est nécessaire à l'activation des récepteurs tyrosine kinase. Le domaine transmembranaire unique de ces protéines joue un rôle crucial dans ces mécanismes. Le récepteur Neu chez le rat et son homologue ErbB2 chez l'humain sont à l'origine de nombreux cancers provoqués par la mutation ponctuelle Val/Glu dans le segment transmembranaire ou la surexpression du récepteur. La structure du domaine transmembranaire dans le récepteur dimère semble déterminante dans les processus d'activation. Les simulations de dynamique moléculaire montrent que, dans une membrane modèle constituée de DMPC ou de POPC hydratés, les hélices transmembranaires de Neu sauvage et oncogénique s'associent préférentiellement en enroulement gauche formant une interface symétrique. Dans le cas de Neu oncogénique le résidu polaire Glu, enfoui dans la membrane, stabilise les interactions entre hélices en formant de fortes liaisons hydrogène

PAOLETTI J., Professeur, Université d'Orléans : Président GENEST D., Directeur de recherche, CNRS : Directeur de thèse GHOMI M., Professeur, Université Paris 6 : Rapporteur LAVERY R., Directeur de recherche, CNRS : Rapporteur MORIN-ALLORY L.,Professeur, Université d'Orléans : Examinateur; The genome of HIV-1, the agent responsible for AIDS, is composed of two identical RNA molecules non-covalently linked near their 5' ends. It was shown that the stem loop SL1 localized in this area is able to initiate the dimerization. The dimerization is a key-step of the life cycle of the virus and involves two kinds of complexes: a kissing-complex and an extended duplex looking like a double helix with two internal bulges. Several divergent structures were published for these two complexes and different mechanisms for the transition between these complexes were considered until now. This work permitted to study the stability of the different published structures and particularly to identify the most probable conformation. In parallel, the study of the mechanism of the transition reveals an intermediate structure in the process. The present study gives a set of informations which are expected to be used in the future for the conception of inhibitors of the dimerization process.; Le génome du VIH-1, l'agent responsable du SIDA, est composé de deux molécules identiques d'ARN liées de façon non-covalente par une région de leur extrémité 5'. Il a été montré que la tige-boucle SL1, localisée dans cette région, était capable d'initier cette dimérisation. La dimérisation constitue une étape clé du cycle de réplication du virus et fait intervenir deux types de complexe de SL1 : un « kissing-complex » et un complexe en forme de double hélice contenant deux boucles internes. Plusieurs structures contradictoires ont été publiées pour ces deux complexes, et différents mécanismes de transition entre ces complexes ont été envisagés jusque là. Ce travail a permis d'étudier la stabilité des différentes structures publiées, et en particulier de faire ressortir de l'ensemble des structures de « kissing-complex » publiées une conformation plus probable. Parallèlement, l'étude du mécanisme de transition a mis en évidence une structure intermédiaire dans ce processus. Ce travail constitue un ensemble d'informations qui pourra par la suite être utilisé pour la conceptions d'inhibiteurs de la dimérisation.

Like all retroviruses, the human immunodeficience virus (HIV) genome is made up of two identical copies of genomic RNA. Those are related in a non covalent way to their 5' leader. The dimerization phenomenon interferes with various key stages of the retroviral cycle life, including encapsidation and maturation of the virion. The dimerization inhibition represents a new way of processing against HIV. This work concerns the NMR structural study of different conformations for the SL1 RNA fragment. This sequence initiates the retrovirus dimerization. It was a first approach for the comprehension of the interactions between the both RNA of VIH-1Laï during the dimerization step. These structural investigations constitute a solid base study in the drug-design strategies implying the development of inhibitors likely to interfere with the dimerization phenomenon; Le génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est constitué, comme tous les rétrovirus, de deux copies identiques d'ARN génomique. Ce phénomène de dimérisation interfère avec différentes étapes du cycle rétroviral. Il est en outre corrélé aux étapes d'encapsidation de l'ARN génomique et de maturation des particules virales. L'inhibition de la dimérisation représente une nouvelle voie de traitement potentiel du VIH. Ce travail a permis de déterminer par RMN la structure tridimensionnelle de différentes conformations de la séquence SL1 qui joue un rôle clé dans l'initiation de la dimérisation du rétrovirus. Il constitue une première approche dans la compréhension des interactions entre les 2 brins d'ARN de l'ARN génomique de VIH-1Laï lors de l'étape de dimérisation. Ces différentes investigations structurales constituent une base d'étude dans les stratégies de drug design impliquant le développement d'inhibiteurs susceptibles d'interférer avec les sites d'interactions ARN/ARN.

The use of the furan compounds as raw materials is largely justified by the availability and the renewable character of vegetable biomass, the source from which they are obtained. In this project, the photosensitive character of the conjugated furan compounds was exploited for the elaboration of new photo-crosslinkable polymers for their application on lithographic Offset plates. Model photosensitive compounds were first synthesized and characterized in order to simulate the synthesis and the photochemical behaviour of the corresponding photo-polymer. During the irradiation in a concentrated media, these compounds underwent a [pi2+pi2] cycloaddition between an excited and a ground state chromophore leading to the formation of cyclobutane moieties. The most interesting compounds were selected and used as monomers for the preparation of the photo-reactive polyester containing the chromophore group in the main chain. After a structural and thermal characterization, these photosensitive polymers were studied photochemically and showed a good aptitude to induce the crosslinking of the starting materials., L'utilisation des composés furaniques comme matières premières est largement justifiée par la disponibilité et l'aspect renouvelable de ces sources (biomasse végétale). Dans ce projet, nous nous sommes intéressés au caractère photosensible des composés furaniques pour l'élaboration de nouveaux polymères photo-réticulables en vue de leur application sur plaques d'impression Offset. Des structures photosensibles simples ont été synthétisées et caractérisées afin d'étudier la synthèse et le comportement photochimique du photopolymère final. Lors de l'irradiation dans un milieu concentré, ces composés subissent une [pi2+pi2] cycloaddition entre un chromophore à l'état excité et un chromophore à l'état stable formant des motifs cyclobutanes. Les composés les plus prometteurs ont été utilisés comme monomères pour la préparation des photopolymères, basés sur une structure polyester, contenant le groupement chromophore dans la chaîne principale. Après une étude structurelle et thermique, ces polymères photosensibles ont été étudié photochimiquement et ont montré une bonne aptitude à induire la réticulation des matériaux initiaux.

M. Gérald Guillaumet président M. Serge Fermandjian rapporteur Mme Brigitte Hartmann rapporteur Mme Françoise Vovelle examinateur M. Jacques Paoletti examinateur M. Gérard Lancelot directeur de thèse; Like all retroviruses, the human immunodeficience virus (HIV) genome is made up of two identical copies of genomic RNA. Those are related in a non-covalent way to their 5' leader. This dimerization phenomenon interferes with various key stages of the retroviral cycle life. Therefore, the dimerization inhibition represents a new way of processing against HIV. The first part of this work concerns the RNA SL1 sequence who initiating the HIV-1Lai dimerization. We were interested in the structural determination, by NMR and molecular modeling, of the species present in the dimerization process. After having isolated both RNA different dimer, we highlighted the stable dimer structure which makes it possible to advance assumptions of their relative stability. The second part of this work still concerns the study of the deoxyribose SL1 fragment. Here again, two forms of different stability may be isolate. The unstable dimer is organized in the form of "kissing-complex" and represents the first structure of this type elucidated for a DNA. The structure of stable dimer remains of type "kissing-complex" although presenting distinctions at the origin of the stability difference. The presence of the hydroxyl group distinguishing DNA from RNA explains this behavior difference. These structural investigations constitute a solid base study in the "drug-design" strategies implying the development of inhibitors likely to interfere with the dimerization phenomenon.; Le génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est constitué, comme tous les rétrovirus, de deux copies identiques d'ARN génomique. Celles-ci sont liées de manière non covalente au niveau de leur région 5'-terminale. Ce phénomène de dimérisation interfère avec différentes étapes clés du cycle rétroviral. C'est pourquoi, l'inhibition de la dimérisation représente une nouvelle voie de traitement potentiel du VIH. La première partie de ce travail porte sur la séquence d'ARN SL1 initiant la dimérisation chez VIH-1Lai. Nous nous sommes intéressés à la détermination structurale, par RMN et modélisation moléculaire, des espèces présentes dans le processus de dimérisation sous forme instable. Après avoir isolé les deux différents dimère d'ARN, nous avons mis en évidence la structure du dimère stable qui permet d'avancer des hypothèses quant à leur stabilité relative. La seconde partie de ce travail porte sur l'étude du fragment désoxyribose de SL1. Là encore, deux conformères de stabilité différente sont isolables. Le dimère instable s'organise sous forme de “kissing-complex” et représente la première structure de ce type élucidée pour un ADN. La structure du dimère stable demeure de type “kissing-complex” bien que présentant des différences à l'origine du changement de stabilité. La présence du groupement hydroxyle distinguant l'ADN de l'ARN explique cette différence de comportement. Ces investigations structurales constituent une solide base d'étude dans les stratégies de “drug-design” impliquant le développement d'inhibiteurs susceptibles d'interférer avec le phénomène de dimérisation.

Not available, Par la technique du stopped-flow nous avons mené une étude systématique de l'effet du microenvironnement, apporte par des polyélectrolytes, des cyclodextrines, des micelles et des microémulsions, sur la cinétique de transfert d'électron entre un donneur, le dithionite de sodium et différents accepteurs, une série de dialkyl viologénes d'hydrophobie variable. Ceci nous a permis d'avoir une meilleure compréhension des contributions respectives des interactions électrostatiques et hydrophobes, qui jouent un rôle primordial dans le phénomène de séparation de charges directement lié au problème de conversion et de stockage de l'énergie solaire. Les constantes de vitesse apparentes pour la réduction des viologénes ont été déterminées dans les différents milieux. L'effet de retard le plus important (environ 50 fois) a été obtenu avec un copolymère de l'acide maléique et du cetyl vinyl éther. Des modèles théoriques ont été développés pour rendre compte de l'effet des polyélectrolytes. Les différents milieux considérés peuvent avoir un effet de stabilisation sur les viologénes réduits à caractère fortement hydrophobe, en empêchant leur dimerisation. Les constantes de vitesse apparentes pour la dimerisation ont été déterminées à partir de modèles théoriques et l'effet de stabilisation confirme par RPE

Not available, Par la technique du stopped-flow nous avons mené une étude systématique de l'effet du microenvironnement, apporte par des polyélectrolytes, des cyclodextrines, des micelles et des microémulsions, sur la cinétique de transfert d'électron entre un donneur, le dithionite de sodium et différents accepteurs, une série de dialkyl viologénes d'hydrophobie variable. Ceci nous a permis d'avoir une meilleure compréhension des contributions respectives des interactions électrostatiques et hydrophobes, qui jouent un rôle primordial dans le phénomène de séparation de charges directement lié au problème de conversion et de stockage de l'énergie solaire. Les constantes de vitesse apparentes pour la réduction des viologénes ont été déterminées dans les différents milieux. L'effet de retard le plus important (environ 50 fois) a été obtenu avec un copolymère de l'acide maléique et du cetyl vinyl éther. Des modèles théoriques ont été développés pour rendre compte de l'effet des polyélectrolytes. Les différents milieux considérés peuvent avoir un effet de stabilisation sur les viologénes réduits à caractère fortement hydrophobe, en empêchant leur dimerisation. Les constantes de vitesse apparentes pour la dimerisation ont été déterminées à partir de modèles théoriques et l'effet de stabilisation confirme par RPE