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Orientador: Maria Helena Andrade Santana Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica Resumo: Este trabalho visa o desenvolvimento tecnológico de uma vacina gênica, destinada ao combate à tuberculose, na qual o DNA encontra-se veiculado em lipossomas. Foram enfocados três aspectos principais: 1.A preparação e caracterização de estruturas lipídicas funcionais veiculando o DNA, projetadas para atenderem aos requisitos de imunização contra a tuberculose; 2. Complexação do DNA com peptídio sintético promotor de transporte nuclear e veiculação na estrutura lipossomal que se mostrou mais promissora nos ensaios in vitro e in vivo realizados no CPT-RP. 3. Análise do escalonamento da produção da estrutura lipossomal mais promissora para subsequente veiculação do DNA. Duas estruturas lipossomais foram compostas por lipídios com as seguintes funcionalidades: estrutural, de incorporação do DNA e atração eletrostática com a superfície das células, de intensificação da liberação do DNA no citoplasma celular. Foram preparadas pelo método da desidratação-rehidratação, gerando DRVs (¿dehydrated-hydrated vesicles¿). O DNA foi associado à essas estruturas, localizando-se no interior, [DRV(DNA)] ou prefencialmente na sua superfície [DRV-DNA]. A terceira estrutura, um agregado lipídico não lipossomal designado por lipoplexo, foi preparado na ausência do lipídio estrutural, contendo o DNA associado em toda a sua superfície. As estruturas foram caracterizadas através do seu diâmetro hidrodinâmico e distribuição de tamanhos, razão de cargas para completa incorporação do DNA, carga superficial, transição de fases, acessibilidade de sonda de fluorescência ao DNA e morfologia. O peptídio sintético com seqüência não convencional foi associado à estrutura DRV-DNA. O escalonamento da produção de lipossomas foi analisado através de dados experimentais e simulação matemática da cinética de produção de lipossomas em sistema multitubular. Dos resultados conclui-se que a estrutura DRV-DNA é promissora para a produção de vacina contra a tuberculose tanto pela sua efetividade biológica quanto do ponto de vista tecnológico Abstract: This work contributes to the technological development of a gene vaccine against tuberculosis, where DNA is transported within liposomes. The three main aspects focused on were: 1. Functional lipid structures for DNA delivery were prepared and characterized in the attempt to obtain immunization standards against tuberculosis; 2. The best lipid structure was chosen from in vitro and in vivo assays performed in the ¿Centro de Pesquisas em Tuberculose de Ribeirão Preto¿ ¿ CPT-RP. A synthetic peptide that promotes nuclear transport was complexed to DNA and included into the best lipid structure. 3. Scale up analysis for the production of the best lipid structure that was used for DNA delivery. Two types of liposomes were composed by lipids with the following properties: (i) structure, (ii) DNA incorporation and electrostatic attraction with cell surface, and (iii) helper, that facilitates the DNA release to the citosol. These structures were prepared by the dehydrated-hydrated method, generating DRVs (dehydrated-hydrated vesicles). The DNA was associated in the inner compartment, [DRV(DNA)], or mostly at the surface [DRV-DNA] of these structures. The third structure, a lipid aggregate that does not form liposomes and was named lipoplex, was prepared in the absence of the structural lipid, used in previous preparations, which contained DNA associated with all of the aggregate¿s surface. The physico-chemical characterization of the structures were based on the hydrodynamic diameter and size distribution of the lipid particles, charge ratio for DNA incorporation into the lipid structure, surface charge, phase transition temperatures, the fluorescent probe accessibility to DNA and morphology of the particles. A synthetic peptide, with non-conventional sequence was associated to the DRV-DNA structure. The scale up for the liposome production was analyzed through the acquisition of experimental data and mathematical simulation of the liposomes production in a multitubular system. The results demonstrate that the incorporation of DNA into a lipid structure is very promising as a tuberculosis vaccine, especially in regards to the complexation of DNA with empty DRVs. The technological aspects of scaling up also confirm the viability of preformed liposomes production Doutorado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Doutor em Engenharia Química

Agradecimentos: The authors gratefully acknowledge the financial support of the Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo - FAPESP (Sao Paulo, Brazil, Grant 2007/58323-9) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico - CNPq (Brazil, Grant 471971/2011-1). We also thank the Laboratorio de Espectroscopia e Calorimetria (LEC), Laboratorio Nacional de Biociencias - LNBio (Campinas, Brazil), and the National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC), UNICAMP, for the support for the analysis of recombinant T-Rp3. Finally, we thank Professor Maricilda Palandi de Mello, CBMEG, UNICAMP (Campinas, Brazil), for support for the HeLa cell culture Abstract: Gene therapy and DNA vaccination trials are limited by the lack of gene delivery vectors that combine efficiency and safety. Hence, the development of modular recombinant proteins able to mimic mechanisms used by viruses for intracellular trafficking and nuclear delivery is an important strategy. We designed a modular protein (named T-Rp3) composed of the recombinant human dynein light chain Rp3 fused to an N-terminal DNA-binding domain and a C-terminal membrane active peptide, TAT. The T-Rp3 protein was successfully expressed in Escherichia coli and interacted with the dynein intermediate chain in vitro. It was also proven to efficiently interact and condense plasmid DNA, forming a stable, small (similar to 100 nm) and positively charged (+28.6 mV) complex. Transfection of HeLa cells using T-Rp3 revealed that the vector is highly dependent on microtubule polarization, being 400 times more efficient than protamine, and only 13 times less efficient than Lipofectamine 2000 (TM), but with a lower cytotoxicity. Confocal laser scanning microcopy studies revealed perinuclear accumulation of the vector, most likely as a result of transport via microtubules. This study contributes to the development of more efficient and less cytotoxic proteins for non-viral gene delivery FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Fechado

Orientadores: Lucimara Gaziola de la Torre, Sávio Souza Venâncio Vianna Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: A demanda por vacinas e medicamentos para o combate de doenças impulsiona a busca por novas tecnologias na área de nanobiotecnologia, como é o caso recente da corrida para a vacina da COVID-19. Nesse sentido, a terapia e vacinação gênicas emergem como potenciais ferramentas de combate. No entanto, um dos maiores obstáculos para o sucesso desta técnica consiste em entregar eficientemente o material genético (DNA/RNA) nas células-alvo. Para contornar esse problema, nanocarreadores não virais podem ser explorados. Dentre eles, lipossomas catiônicos e nanopartículas lipídicas se destacam como potenciais veículos de sistema de entrega de fármacos. A produção dessas nanoestruturas em sistemas microfluídicos operando em regime laminar permite se obter um melhor controle da mistura e das variáveis do processo, em comparação com os métodos convencionais bulk de produção. Porém, sistemas microfluídicos à base de difusão possuem baixa produtividade. Com o intuito de explorar o aumento de produtividade, a advecção caótica pode ser empregada, mas ainda requer compreensão do processo de formação destas nanoestruturas. Para auxiliar na compreensão da fluidodinâmica e do processo de mistura nos canais microfluídicos, simulações computacionais podem ser desenvolvidas, como o estudo de fluidodinâmica computacional (CFD). Nesse contexto, nosso grupo de pesquisa realizou o estudo de CFD e investigou a síntese de lipossomas em dispositivo microfluídico 3D de alta vazão (HFR-MD). No entanto, não foi analisada a potencial aplicação deste dispositivo na síntese de lipoplexos e nanopartículas lipídicas (LNPs). Baseado nisso, este projeto visa a incorporação de material genético (pDNA) em sistemas lipídicos (lipoplexos e LNPs) através do estudo de CFD e aplicação de técnica microfluídica de advecção caótica no dispositivo HFR-MD, visando contribuições na área da medicina. Para tal, investigou-se a melhor configuração de malha que pudesse fornecer a simulação computacional mais precisa. Dessa maneira, a análise de CFD permitiu antever o padrão de mistura e as condições de advecção caótica nas diferentes vazões testadas, que posteriormente serviu de apoio para a otimização das melhores condições de processo para a síntese das nanoestruturas. Foi observado que para a síntese de lipossomas catiônicos e stealth, apesar da advecção caótica melhorar as propriedades de diâmetro hidrodinâmico médio (tamanho) e polidispersão (PDI) das nanoestruturas, ela não se mostrou fundamental, pois a incorporação do lipídio PEGlado foi possível mesmo sem advecção caótica. Além disso, investigação entre o uso de água pura e tampão PBS na fase aquosa mostrou que a água pura foi mais eficaz na síntese adequada de lipossomas. Já para lipoplexos e LNPs, a advecção caótica em alta vazão se mostrou fundamental para evitar a formação de microagregados no canal e fornecer propriedades físico-químicas ótimas para aplicações. Além disso, a presença de uma barreira difusiva mostrou ser benéfica na formação de complexos pDNA/lipídios. Estudos de morfologia apontaram estruturas majoritariamente unilamelares para os lipossomas e lipoplexos stealth, estruturas mistas para lipoplexos catiônicos e possível núcleo denso de elétrons para LNPs. Por fim, teste in vitro realizado em colaboração com o Instituto de Ciências Biomédicas da USP apontou maior eficiência de transfecção para as LNPs, o que condiz com a literatura, porém sem relatar diferenças estatísticas com os lipoplexos. Como contribuição deste trabalho, a validação do dispositivo HFR-MD na síntese de nanoestruturas complexas em condições de alta produtividade infere seu potencial uso para futuras investigações de LNPs com lipídios ionizáveis de última geração, bem como aplicações in vivo visando a produção de vacinas gênicas e aumento de escala Abstract: The demand for vaccines and medicines to fight diseases drives the search for new technologies in nanobiotechnology, as it is the recent case of the race for the immunization of COVID-19. In this sense, gene therapy and vaccination emerge as potential combat tools. However, one of the greatest obstacles to this technique's success lies in efficiently delivering the genetic material (DNA/RNA) to the target cells. To overcome this problem, non-viral nanocarrier vehicles can be explored. Cationic liposomes and lipid nanoparticles stand out as potential vehicles for drug delivery systems. The production of these nanostructures in microfluidic systems operating in a laminar flow enables better control over the mixture and over the process variables compared to the conventional bulk production methods. However, diffusion-based microfluidic systems have low productivity. To explore the increase in productivity, the chaotic advection can be employed, but it still requires a comprehension of the formation process of these nanostructures. To help the fluid dynamics and the mixing process comprehension in microfluidic channels, computational simulations can be developed, such as the study of computational fluid dynamics (CFD). In this context, our research group carried out the CFD study and investigated the synthesis of liposomes in a high flow rate 3D microfluidic device (HFR-MD). However, the potential application of this device in the synthesis of lipoplexes and lipid nanoparticles (LNPs) was not analyzed. Based on that, this project aims to incorporate genetic material (pDNA) into lipid systems (lipoplexes and LNPs) by CFD study and application of chaotic advection microfluidic technique in HFR-MD, aiming contributions in the field of medicine. For this, the best mesh configuration that could provide the most accurate computational simulation was investigated. In this way, the CFD analysis allowed the prediction of the mixing pattern and the chaotic advection conditions in the different flow rates tested, which later served as support for optimization of the best process conditions to synthesize nanostructures. It was observed that for the synthesis of cationic and stealth liposomes, despite the chaotic advection improvements in the hydrodynamic mean diameter (size) and polydispersity (PDI) properties of the nanostructures, it was not fundamental, since the incorporation of the PEGlated lipid was possible even without chaotic advection. Furthermore, investigation between the use of pure water and PBS buffer in the aqueous phase showed that pure water was more effective in the proper synthesis of liposomes. For lipoplexes and LNPs, high flow chaotic advection proved to be fundamental to avoid the formation of microaggregates in the channel and provide optimal physicochemical properties for applications. Furthermore, the presence of a diffusive barrier was shown to be beneficial in the formation of pDNA/lipid complexes. Morphology studies showed mostly unilamellar structures for liposomes and stealth lipoplexes, mixed structures for cationic lipoplexes and possible electron dense core for LNPs. Finally, in vitro test carried out in collaboration with Instituto de Ciências Biomédicas of USP showed greater transfection efficiency for LNPs, which is consistent with literature, however, without reporting statistical differences with lipoplexes. As a contribution of this work, the validation of HFR-MD for the synthesis of complex nanostructures under high throughput conditions infers its potential use for future investigations of LNPs with ionizable lipids, as well as in vivo applications aiming the production of gene vaccines and scale-up Mestrado Engenharia Química Mestre em Engenharia Química CAPES 001 CNPQ 130575/2020-8

Orientador: Lucimara Gaziola de la Torre Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Este trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento e otimização de um processo escalonável de produção de lipossomas contendo ?-caroteno, visando sua posterior aplicação em produtos de interesse da indústria alimentícia. Para tanto, os efeitos das variáveis que influenciam o processo foram analisados, proporcionando um maior conhecimento a respeito da fenomenologia envolvida na produção dos nanoagregados e maior controle sobre as respostas produzidas pelo sistema. O ?-caroteno é um antioxidante natural, pró-vitamínico e que pode ser empregado como corante natural em formulações alimentícias. Porém sua elevada hidrofobicidade dificulta a aplicação em alimentos de base aquosa. Dentre as metodologias disponíveis para produção de lipossomas, o método de injeção de etanol apresenta-se como o mais facilmente adaptável as necessidades da indústria, possuindo baixo custo de implantação e operação. Na primeira etapa deste trabalho o método de injeção de etanol foi investigado visando a otimização dos parâmetros operacionais para a produção de nanoagregados tendo como objetivo obter propriedades físico químicas tais como diâmetro médio e polidispersidade de forma. Análises estatísticas dos resultados foram realizadas para determinação dos efeitos de cada variável e modelos foram desenvolvidos para predição do comportamento do sistema em diferentes condições de processo. Em seguida, a incorporação de ?-caroteno nos lipossomas obtidos na melhor condição foi avaliada em razões ?-caroteno/lipídio pré-definidas. Ensaios de incorporação de ?-caroteno aos lipossomas revelaram que proporções molares ?-caroteno/lipídio de até 0,5% mostram-se estáveis e solúveis em meio aquoso, resultado confirmado pelos ensaios de monocamadas de Langmuir realizados. A formulação otimizada foi submetida a testes de estabilidade em condições controladas de stress e, em um segundo momento, incorporada a nanofibras de álcool polivinílico e óxido de polietileno através de processo de electrospinning, conferindo proteção extra ao ?-caroteno internalizado. Estas nanofibras produzidas foram caracterizadas quanto a morfologia, diâmetro, presença de fosfolipídios, homogeneidade da distribuição de ?-caroteno e estabilidade a exposição a luz ultravioleta. Testes de rehidratação destas nanofibras foram conduzidos, verificando através de microscopia eletrônica de transmissão a liberação de lipossomas na fase aquosa. Dessa forma, a partir dos resultados obtidos conclui-se que o método de injeção de etanol foi otimizado, sendo que os efeitos de cada uma das variáveis de processo foram elucidados, contribuindo para o desenvolvimento tecnológico da técnica. Os ensaios de aplicação de condições de stress mostram que existe uma barreira a ser vencida no que diz respeito a estabilidade de lipossomas em formulações alimentícias complexas, principalmente para situações de elevada concentração de sacarose e altos teores de NaCl. Por fim, os testes de incorporação em nanofibras mostraram-se bastante promissores, mostrando a viabilidade e benefícios que podem ser agregados ao sistema através da utilização de técnica de eletrofiação contribuindo no desenvolvimento de novos materiais e produtos a serem utilizados pelo setor industrial alimentício Abstract: The main goal of the present work was the development and optimization of a scalable process for production of ?-carotene loaded liposomes, aiming its application in the food industry. In that way, the effects of the variables that have influence on the process were analysed, providing greater information about the phenomenology evolving the production of these nano aggregates and improved control over the system responses. ?-carotene is a natural antioxidant, pro-vitaminic, and can be employed as a natural colorant in food formulations. However, its high hydrophobicity makes it difficult to be applied in water based foods. The development of feasible processes that can be implemented in the food industry for ?-carotene encapsulation is a actual research challenge. On the first step of this work the ethanol injection method was investigated aiming process parameters optimization for liposomes production with controlled size and polidispersity. Statistical analyses of the results were performed for variables effects determination and mathematical models development for system behaviour prediction. Then, ?-carotene incorporation on liposomes produced at the optimized condition was evaluated studying different ?-carotene/lipid ratios. ?-carotene incorporation experiments revealed that 0.5% ?-carotene/lipid ratios show to be stable and soluble in aqueous media, result confirmed by Langmuir monolayer experiments. The optimized formulation was submitted to stability tests under controlled stress conditions and, in a second stage, incorporated to polyvinyl alcohol and polyethylene oxide nanofibers using electrospinning technique for extra ?-carotene protection. The produced nanofibers were characterized regarding morphology, diameter, phospholipids presence, ?-carotene homogeneity and stability to UV light exposure. Nanofibers rehydration tests were conducted, verifying using transmission electron microscopy that liposomes were released in the aqueous media. In that way, from the obtained results we can conclude that the ethanol injection method was successfully optimized and the evaluation of the effects of each variable was elucidated, contributing to the technological development of the technique. Experiments regarding application of different stress conditions to liposomes formulations show that there is a barrier that must be overcome related to stability of liposomes to complex food formulations. Finally, incorporation tests on nanofibers showed to be promising, demonstrating the feasibility and benefits that can be aggregated to the system by using electrospinning, contributing to the development of new materials and products to be used by the food processing industries Mestrado Engenharia Química Mestre em Engenharia Química

Orientador: Elias Basile Tambourgi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: O presente trabalho consiste no tratamento de efluentes produzidos no setor têxtil, empregando a fotocatálise heterogênea e modelagem matemática dos processos. Os materiais baseados em alumina como suporte e funcionalizados com até 25% em massa de Zn apresentaram as melhores opções para o tratamento fotocatalítico. Durante a degradação dos corantes em fotorreatores foi verificado que quanto menor o diâmetro de partícula do catalisador, maior o rendimento do tratamento, devido ao aumento da área superficial do catalisador, e que o efeito da fotólise nas moléculas dos corantes causado pela radiação UV influência o ajuste dos modelos matemáticos para a fotodegradação temporal de corantes. Estes modelos previram que o efeito da concentração inicial apresenta pequena influência no rendimento da degradação máxima alcançada. A interação entre os fatores pH, concentração inicial e massa de catalisador decorrente do planejamento fatorial, bem como o tratamento estatístico revelaram que as condições ótimas para o tratamento dos efluentes reais foi a pH=10,4, massa de catalisador ZnO de 1,1 g com carga de corantes de 23 mg/L, empregando o fotorreator tubular, operado no modo batelada. O estudo exploratório do catalisador de ZnO, revelou que a massa específica, diâmetro médio de partículas, área superficial e porosidade foram: 5,55 g/cm3, 0,55 µm por Zetasizer e 0,119 µm por Mastersizer, 16,830 m2/g, e 0,1 respectivamente. O tratamento fotoquímico dos corantes em efluentes reais, demonstrou uma grande redução da carga orgânica do meio, corroborando para um forte indício da degradação destes compostos de maneira geral pelo processo de oxidação avançado quando empregado o catalisador ZnO. A modelagem matemática proposta para os sistemas de tratamento de soluções do corante RB 21, bem como para os corantes em efluentes reais se ajustaram de maneira satisfatória aos dados experimentais para os efluentes contendo os seguintes corantes: RB 19 e RB 21. Entretanto, no efluente com o RY 145, o modelo matemático sofreu maiores desvios para tempos de reação superior a 5,5 horas Abstract: The present work consists of the treatment of effluents produced in the textile sector, using heterogeneous photocatalysis and modeling the process mathematically. Alumina based materials as support and functionalized with up to 25 % by weight of Zn was considered as the best options for heterogeneous photocatalysis. During the degradation of dyes in photoreactors, it was found that the smaller the catalyst particle diameter, the higher the treatment yield due to the increase of catalyst surface area. The impact of photolysis on dye molecules caused by UV radiation influences the adjustment of mathematical models. These models predicted that the effect of the initial concentration has little influence on maximum degradation yield achieved. The interaction between pH, initial concentration and catalyst mass factors. due to the factorial planning, as well as the statistical treatment, revealed that the optimal conditions for the treatment of the real effluents were at pH = 10.4, 1.1 g ZnO catalyst mass with 23 mg dye per liter of solution, using the tubular photoreactor. The specific mass, mean particle diameter, surface area and porosity of the ZnO catalyst were: 5.55 g/cm3, 0.55 µm by Zetasizer and 0.119 µm by Mastersizer, 16.830 m2/g, and 0.1 respectively. The photochemical treatment of dyes in effluents showed a great reduction of the organic load, corroborating strong evidence of the degradation of these compounds in general by the advanced oxidation process when the ZnO catalyst was employed. The photocatalytic degradation process was then modeled based on mass conservation law. This model was fitted satisfactorily to the experimental data for the RB 19 and RB 21 dyes, while from experimental photodegradation data for RY 145 dye in effluent presented deviation for reaction time higher than 5.5 hours Doutorado Engenharia Química Doutor em Engenharia Química CAPES 1590853

Orientador: Antonio José Gomez Cobo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: A hidrogenação de compostos aromáticos é uma reação química de grande interesse industrial. Diante das crescentes restrições à presença desses compostos em combustíveis, a hidrodesaromatização catalítica é um dos processos mais importantes nas refinarias. Nesse contexto, o presente trabalho tem por objetivo estudar a hidrogenação de compostos aromáticos em fase líquida, empregando catalisadores à base de metais básicos (Fe, Co, Ni) e nobres (Ru, Pd, Pt) suportados em Al2O3 via impregnação úmida. Especificamente, buscou-se avaliar a influência da composição química, da redução sob H2 e do reuso de tais catalisadores sobre o desempenho catalítico. Catalisadores mono e bimetálicos foram preparados a partir de precursores clorados, através de coimpregnação úmida conduzida a 353 K (80 oC) e pH igual a 10. Durante a impregnação úmida, os sólidos foram reduzidos em fase líquida com formaldeído, sendo posteriormente reduzidos ex situ ou in situ sob H2. Os sólidos preparados foram caracterizados através das técnicas de titulação potenciométrica, adsorção de N2, espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X, microscopia eletrônica (varredura e transmissão) e redução à temperatura programada. O desempenho dos catalisadores foi avaliado na hidrogenação do tolueno e de uma mistura de aromáticos. As reações foram realizadas num reator Parr do tipo slurry, sob pressão de H2 de 5 MPa (50 atm) e à temperatura de 373 K (100 oC), com a adição de água e de solventes ao meio reacional. Na hidrogenação do tolueno, os catalisadores à base de Ru são muito mais ativos e seletivos ao produto da hidrogenação parcial (metilcicloexeno). O efeito da redução sob H2 sobre a atividade catalítica se mostra dependente da natureza do metal básico, enquanto os catalisadores à base de metais nobres têm a atividade diminuída. A adição de metal básico ao catalisador de Ru/Al2O3 também leva a uma diminuição da atividade, mas um efeito sinergético é obtido com a associação Ru-Pt. Para a mistura de aromáticos, a taxa de hidrogenação com o catalisador de Ru-Pt/Al2O3 segue a ordem: benzeno > tolueno > o-xileno > p-xileno. Nesse caso, a adição de solventes ao meio reacional e o reuso do catalisador diminuem a taxa de hidrogenação do benzeno e do tolueno, favorecendo a hidrogenação dos xilenos Abstract: The hydrogenation of aromatic compounds is a chemical reaction of major industrial interest. Given the increasing restrictions on the presence of these compounds in fuels, the catalytic hydrodearomatization is one of the most important processes in refineries. In this context, the present work aims to study the hydrogenation of aromatic compounds in liquid phase employing catalysts based on base metals (Fe, Co, Ni) and noble metals (Ru, Pd, Pt) supported on Al2O3 by wet impregnation. Specifically, one has sought to evaluate the influence of the chemical composition, H2 reduction and reuse of the solids on its catalytic performances. Mono and bimetallic catalysts were prepared from chlorinated precursors by wet co-impregnation conducted at 353 K (80 °C) and pH of 10. During the wet impregnation, the solids were reduced with formaldehyde in liquid phase and subsequently reduced in situ or ex situ under H2. The prepared solids were characterized by potentiometric titration, N2 adsorption, X-ray photoelectron spectroscopy, scanning and transmission electron microscopy and temperature programmed reduction. Catalysts performances were evaluated for toluene and aromatics mixture hydrogenations. The reactions were performed in a "slurry" Parr reactor under H2 pressure of 5 MPa (50 atm) and at a temperature of 373 K (100 °C) with the addition of water and solvents to the multiphase reaction medium. For toluene hydrogenation, Ru-based catalysts are much more active and selective to the product of the partial hydrogenation (methylcyclohexene). The effect of H2 reduction on the catalytic activity is shown dependent on the nature of the base metal, while the noble metal catalysts have decreases its activities. The addition of base metal to the Ru/Al2O3 catalysts also leads to a decrease in activity, but a synergetic effect is obtained with the Pt-Ru association. For the aromatics mixture hydrogenation, the reaction rate to Ru-Pt/Al2O3 catalyst follows the order: benzene > toluene > o-xylene > p-xylene. In this case, the addition of solvents to the reaction medium, as well as the reuse of the catalyst decreases the benzene and toluene hydrogenation rates, favoring the xylenes hydrogenation Doutorado Sistemas de Processos Químicos e Informática Doutor em Engenharia Química

Orientadores: Ângela Maria Moraes, Mara Elga Medeiros Braga Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: As lesões de pele representam um grande desafio para os profissionais da saúde, sendo que os curativos mais modernos disponíveis atualmente são, em sua maioria, importados e de alto custo. Existe, assim, a necessidade de criar recursos mais acessíveis à população, os quais utilizem matérias-primas renováveis e sejam produzidos por meio de tecnologias simples e de baixo custo. A quitosana e o alginato são biopolímeros biocompatíveis, apresentam propriedades cicatrizantes e são abundantes na natureza, características estas que os tornam atrativos para a confecção de curativos de lesões de pele. A inclusão de agentes antimicrobianos, como polihexametileno biguanida (PHMB), aos curativos produzidos a partir destes biopolímeros pode levar a um melhor desempenho dos mesmos. Neste trabalho de tese, membranas densas e porosas de quitosana-alginato foram obtidas na presença de diferentes quantidades do tensoativo Pluronic F68. Os resultados obtidos mostraram que a inclusão de até 10% (m/m) de tensoativo provoca o aumento da porosidade (de 0,46 para 0,84), da espessura (de 0,08 para 0,50 mm), da rugosidade (de 1,27 para 21,20 µm), da capacidade de absorção de fluidos (de 14,22 para 21,27 g/g para NaCl a 0,9%) e de vapor d¿água (de 15,5 para 36,5%) e a diminuição da resistência à tração (de 31,1 para 1,1 MPa) e do alongamento na ruptura (de 4,0 para 2,0%) das membranas. Os materiais obtidos não se mostraram citotóxicos a fibroblastos de camundongos. O agente antimicrobiano PHMB foi incorporado às membranas por três diferentes métodos: adição à mistura polimérica, adsorção a partir de solução aquosa e impregnação mediada por CO2 supercrítico. A incorporação de PHMB por adição à mistura polimérica foi considerada como a mais satisfatória, pois não provocou alterações no aspecto e morfologia das membranas e resultou em altas eficiências de incorporação, variando entre 72 e 86 %. Observou-se também adequado controle da cinética de liberação, sendo que grande parte do antimicrobiano incorporado não foi liberada em tampão fosfato-salino (PBS), indicando alta afinidade entre o PHMB e a matriz de quitosana-alginato. As membranas apresentaram atividade antimicrobiana adequada, o que sugere que possam ser empregadas como barreira contra microrganismos comumente presentes em lesões de pele, tais como Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa Abstract: Skin lesions represent a great challenge for health professionals, since most of the existing modern wound dressings are imported and expensive. Therefore, there is a need to create more accessible products to the public, made from renewable raw materials and processed through simple and low cost technologies. Chitosan and alginate are biocompatible biopolymers that have healing properties and are abundant in nature, which are attractive characteristics to the production of wound dressings. The incorporation of antimicrobial agents, such as polyhexamethylene biguanide (PHMB), to these dressings can lead to a better performance. In this work, dense and porous chitosan-alginate membranes were obtained in the presence of different proportions of the surfactant Pluronic F68. It was noticed that inclusion of up to 10% (w/w) Pluronic F68 caused an increase in porosity (from 0.46 to 0.84), thickness (from 0.08 to 0.50 mm), roughness (from 1.27 to 21.20 µm), fluids absorption capacity (from 14.22 to 21.27 g/g for 0.9% NaCl) and water vapor absorption capacity (from 15.5 to 36.5%) and a decrease in tensile strength (from 31.1 to 1.1 MPa) and elongation at break (from 4.0 to 2.0%) of the membranes. The obtained materials were not toxic to mouse fibroblasts. The antimicrobial agent PHMB was incorporated to the membranes through three different methods: addition to the polymeric mixture, adsorption in aqueous solution and via supercritical fluid. The addition to the polymeric mixture was considered the most promising incorporation method, since it had high yields (between 72 and 86 %) and did not cause changes in the membranes aspect and morphology. Release kinetic studies in PBS showed that most of the PHMB loaded remained in the membranes, indicating high affinity between PHMB and the polymeric matrix. The obtained membranes showed adequate antimicrobial activity, having potential applicability as barriers against microorganims commonly found in skin wounds, such as Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa Doutorado Engenharia Química Doutora em Engenharia Química

Orientador: Mônica Alonso Cotta Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin Resumo: Nesta tese investigamos processos de adesão da Xylella fastidiosa, bactéria gram-negativa, fitopatógena, que forma biofilmes no xilema de plantas. O trabalho teve como objetivos entender alguns aspectos do processo de adesão bacteriana e do mecanismo de transporte de células e biofilmes em sistemas que simulam os vasos do xilema. Consideramos em particular as estratégias utilizadas pela X.fastidiosa para aderir à superfície, dentre elas, a secreção de substâncias poliméricas extracelulares (EPS), a presença de adesinas fimbriais (pili) e afimbriais (XadA1) e moléculas sinalizadoras de detecção de quórum (relacionadas à formação de agregados). Como ponto de partida quantificamos as propriedades elásticas do sistema composto pelo EPS e células bacterianas, em diferentes tempos de cultivo bacteriano. Para isso utilizamos medidas de espectroscopia de força e Raman confocal durante os estágios iniciais de adesão celular e formação de agregados. Mostramos que a rigidez do sistema célula/EPS diminui progressivamente com o aumento do tempo de crescimento bacteriano. Verificamos que existe uma mudança no valor de rigidez em diferentes partes da célula, região polar e corpo bacteriano; os menores valores de rigidez encontrados no polo sugerem uma resposta mecânica mais flexível nesta região, associada com o ponto de adesão inicial da célula à superfície. No estudo de adesão e mobilidade da X.fastidiosa, utilizamos dispositivos microfluídicos modificados quimicamente, via funcionalização de superfície (em microcanais Polidimetilsiloxano/vidro) e via introdução de molécula de detecção de quórum (em microcanais impressos em poliácido láctico), para tornar o ambiente mais próximo ao do xilema da planta. Foram feitas funcionalizações de superfície com uma celulose sintética, simulando a composição química dos vasos do xilema (majoritariamente composto por celulose), e com a adesina XadA1, e observamos os efeitos sobre a adesão, crescimento e mobilidade celular. Verificamos que a adesina XadA1 aumenta a densidade bacteriana se comparada às demais superficies, além de aumentar a força de adesão bacteriana à superfície. Quanto a inserção de molécula sinalizadora, observamos que a presença destas moléculas no cultivo bacteriano aumenta a densidade celular e altera a forma de pequenos agregados Abstract: In this thesis we investigated the adhesion processes of Xylella fastidiosa, a gram-negative, phytopathogenic bacterium that forms biofilms in the xylem of plants. The objective of this work was the understanding of several aspects of the bacterial adhesion process, as well as the mechanism of cell and biofilm transport in systems that simulate xylem vessels. In particular, we considered the strategies used by X.fastidiosa to adhere to a surface; among them, the secretion of extracellular polymeric substances (EPS), the presence of fimbrial (pili) and afimbrial (XadA1) adhesins and quorum detection molecules (related to cluster formation). As a starting point we quantified the elastic properties of the system composed of EPS and bacterial cells, at different times of bacterial culture. For this purpose, we used force spectroscopy and confocal Raman measurements during the initial stages of cell adhesion and cluster formation. We have shown that stiffness decreases progressively with increasing bacterial growth time. We observed that stiffness values varied along different parts of the cell, polar region and bacterial body. The lower stiffness values found at the pole suggest a more flexible mechanical response in this region, associated with the initial adhesion point of the cell to the surface. For the investigation on X.fastidiosa adhesion and mobility, we used chemically modified microfluidic devices via surface functionalization (in Polydimethylsiloxane / glass microchannels) and via the introduction of a quorum detection molecule (in microchannels printed on polylactic acid) to make the environment more closely resemble the plant xylem. Surface functionalizations were performed with a synthetic cellulose, simulating the chemical composition of xylem vessels (mainly composed of cellulose), and the XadA1 adhesin, and we observed the effects on cell adhesion, growth and mobility. Our results showed that immobilized XadA1 increased the bacterial density when compared to other surfaces studied; furthermore, it increased the bacterial adhesion force to the surface. Regarding the addition of the signaling molecules, we observed that their presence in the bacterial culture increases cell density and changes the shape of small clusters Doutorado Física Doutora em Ciências FAPESP 2010/51748-7 CNPQ 479486/2012-3 CAPES

Orientadores: Eneida de Paula, Daniele Ribeiro de Araújo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) e carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) têm sido utilizados com sucesso como sistemas de liberação modificada. O anestésico local dibucaína (DBC) foi encapsulado em SLN e NLC objetivando aplicação tópica, para melhora de sua disponibilidade redução de efeitos adversos. As nanopartículas lipídicas foram preparadas pelas técnicas de sonicação (Son) ou homogeinização à alta pressão (HP), sendo utilizados palmitato de cetila (CP) ou miristato de miristila (MM) como matrizes lipídicas sólidas, acrescidos (NLC) ou não (SLN) de uma mistura de triglicerídeos de ácido cáprico e caprílico; poloxamer 188 foi usado como tensoativo. A DBC encapsulada foi quantificada por metodologia validada por cromatografia líquida de alta eficiência. As análises físico-químicas compreenderam diâmetro médio, potencial zeta, distribuição de tamanhos e morfologia das nanopartículas, percentual de encapsulação além de medidas de calorimetria exploratória de varredura (DSC), espectroscopia de infravermelho (FTIR), ressonância paramagnética eletrônica (RPE) e difração de raios X à baixo ângulo (SAXS). Medidas in vitro do perfil de liberação do fármaco, da estimativa de fluxo, deformação e elasticidade das partículas através de membranas artificiais e de toxicidade em cultura de células (fibloblastos 3T3 e queratinócitos HaCat) foram feitas. A estabilidade das amostras foi avaliada em função do tempo e testes de antinocicepção (tail flick, em ratos Wistar) foram usados para avaliar a atividade terapêutica in vivo. O diâmetro médio das partículas de SLN e NLC produzidas foi similar (ca. 200nm). A estabilidade física das nanopartículas foi satisfatória por até 240 dias de armazenamento a 4 ºC, principalmente para NLCMM/HP com e sem DBC, sugerindo que a metodologia de HP produz partículas mais estáveis. Todas as formulações apresentaram eficiência de encapsulação maior que 70%, sendo que NLCMMDBC/HP apresentou a maior encapsulação (90,54 ± 0,95%). Medidas de FTIR e DSC revelaram a DBC molecularmente dispersa na matriz lipídica das nanopartículas. Quanto à organização molecular das SLN e NLC, resultados de SAXS indicaram a existência de arranjos lipídicos lamelares no interior das SLN, não alterados pela adição da DBC; as medidas de RPE com marcadores de spin doxil-estearato revelaram espectros compatíveis com bicamadas, com maior organização molecular dos lipídios das SLN e NLC, após inserção da DBC. Ensaios in vitro confirmaram a liberação modificada da dibucaína associada às partículas, governada por difusão de Fick. Tanto a elasticidade quanto o fluxo das partículas in vitro apresentaram baixos valores evidenciando deposição das mesmas nas membranas com poros de 30 nm. A citotoxicidade intrínsica da DBC sobre ambos os tipos celulares foi reduzida após encapsulação nas SLN e NLC. O efeito analgésico in vivo da DBC a 0,05% aplicada topicamente (dispersa em gel de carbopol) aumentou significativamente após encapsulação nas formulações, em particular para SLNCPDBC liofilizada com o crioprotetor maltose. Assim, formulações de dibucaína em SLN ou NLC, preparadas com MM ou CP mostraram-se promissoras como bases para produtos farmacêuticos de liberação modificada, para anestesia dérmica Abstract: Solid lipid nanoparticles (SLN) and nanostructured lipid carriers (NLC), intended for topical application, were successfully prepared as sustained release systems for the encapsulation of the local anesthetic dibucaine (DBC), aiming to reduce its toxic effects and to improve its availability. The particles were prepared by two differents procedures: sonication (Son) or high pressure homogenization (HP), employing either cetyl palmitate (CP) or myristyl myristate (MM) as the solid lipid matrix, in the presence (NLC) or absence (SLN) of a mixture of capric and caprylic acids; poloxamer 188 was used as surfactant. DBC was quantified through a validated HPLC procedure. Physico-chemical analysis of the nanoparticles included measurements of size distribution, zeta potential, morphology, DBC encapsulation efficiency, as well as exploratory scanning calorimetry (DSC), infrared spectroscopy (FTIR), electron paramagnetic resonance (EPR) and small angle X-ray scattering (SAXS) tests. In vitro analysis of the release profile, flow and elasticity of the particles were performed through artificial membranes while toxicity was tested in 3T3 fibroblasts and HaCaT keratinocytes in culture. Stability of the formulations as a function of time was also measured. The therapeutic activity of the formulations was determined using antinociception tests (tail flick) in Wistar rats. SLN and NLC produced by both methodologies were similar (~200 nm), but HP produced more stable nanoparticles. The physical stability of the nanoparticles was satisfactory during a storage period of 240 days, especially for NLCMM/HP with or without DBC. All formulations showed encapsulation efficiencies higher than 70%, the greatest being assigned for NLCMMDBC/HP (90.54 ± 0.95%). FTIR and DSC revealed that DBC was molecularly dispersed in the lipid matrix of the nanoparticles. As for the SLN and NLC molecular packing, SAXS diffractrograms indicated the existence of lamellar repeats in SLN core region, which were not disturbed by the addition of DBC while EPR data with doxyl stearate probes revealed spectra compatible with bilayers, with higher molecular order in the presence of DBC. In vitro assays confirmed the prolonged release of dibucaine from the nanoparticles, by Fickian diffusion. Nanoparticles's elasticity and flow were low showing deposition on the surface of 30 nm pore membranes. The intrinsic cytotoxicity of DBC against both cell types was decreased, when encapsulated in SLN and NLC. The in vivo analgesic effect of 0.05% DBC topically applied (dispersed in carbopol gel) was significantly prolonged in the nanoparticle formulations, largely for SLNCPDBC lyophilized with maltosis as crioprotector. In conclusion, dibucaine formulations in SLN or NLC prepared with MM or CP are promising for the development of pharmaceutical products intended for prolonged dermal anesthesia Doutorado Bioquímica Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Lucimara Gaziola de La Torre, Reinaldo Gaspar Bastos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: A microfluídica é uma ciência que opera em pequenos volumes de fluídos dentro de canais em dimensões de micrômetros (10-6 m). Estes sistemas permitem controlar moléculas no espaço e no tempo, gerando resultados rápidos e confiáveis num sistema precisamente controlado e capaz de mimetizar ambientes celulares. Os dispositivos microfluídicos apresentam uma diversidade de geometrias aplicáveis para diversas áreas de pesquisas, sendo que a capacidade de formar gradientes permite avaliar as condições e o desempenho celular microbiano. Assim, este trabalho teve como objetivo desenvolver dispositivos microfluídicos capazes de formar gradiente de concentração difusivo e investigar sua aplicabilidade em bioprocessos. Diante disso, foram propostos três modelos de dispositivos usando materiais biocompatíveis: (i) dispositivo em base de vidro, denominado de Vidro-vidro; (ii) em base de vidro e poli dimetilsiloxano (PDMS), chamado de Vidro-PDMS e (iii) vidro e PDMS modificado quimicamente para tornar a superfície hidrofílica, Vidro-mPDMS. Os três dispositivos foram avaliados quanto à capacidade de formação de gradiente de concentração difusivo, os quais apresentaram um perfil linear. Além disso, validou-se o estudo do comportamento de Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 num gradiente de concentração de glicose de 0 a 40 g/L de glicose, sendo usado o dispositivo vidro-vidro. Foi observado que houve crescimento de células ao longo das câmaras microfluídicas, e isso possibilitou na determinação de parâmetros cinéticos, os quais não apresentaram diferença estatisticamente significativa com o cultivo em batelada convencional. As condições da microfluídica possibilitaram também a determinação da cinética de Monod, usando menores intervalos de gradiente. Portanto, este dispositivo microfluídico mostrou-se uma ferramenta com potencial para investigar comportamento celular frente à diferença de concentração e contribuirá para a otimização de bioprocessos através da determinação de parâmetros cinéticos Abstract: Microfluidic is a science that operates in small amounts of fluids inside channels in dimensions of micrometers (10-6 m). These systems allow the precise control of molecules in space and time, generating fast and reliable results and it can also be used to mimics environment cellular . Microfluidic devices can be produced in diversity of geometries, it can be applied in several scientific areas and especially the formation of concentration gradients can be used to evaluate conditions and performance of microbial cell. Therefore, this work had the objective to develop microfluidic devices that are able to generate diffusive concentration gradients and investigate their applicability in bioprocesses. In this context, we propose three models of microfluidics devices using biocompatible materials: (i) Glass-based device, named glass-glass; (ii) glass and poli dimetilsiloxane (PDMS) based device, Glass-PDMS and (iii) glass and chemically modified PDMS (hydrophilic surface), Glass-mPDMS. The three devices were evaluated by their capacity of generating difusive concentration gradient, demonstrating linear concentration profile. Furthermore, the behavior of Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 inside of glucose concentration gradient ranging from 0 to 40 g/L were validated, using the glass-glass device . It was observed that cell growth along the microfluidic chambers, having determined the kinetic parameters, which was considered statistically similar to conventional batch cultivation. Conditions of microfluidics also allowed determination of the Monod kinetic, using smaller intervals gradient Therefore, the use of concentration gradient in microfluidic device is a potential tool for investigate of microbial cell behavior against the concentration difference and it can contribute to the optimization of bioprocesses through the determination of kinetic parameters Mestrado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Mestra em Engenharia Química

Orientadores: Maria Helena Andrade Santana, Lucimara Gaziola de la Torre Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Este trabalho apresenta um estudo comparativo de processos escalonáveis dos tipos "top-down" (cominuição) e "bottom-up" (síntese), visando a produção de lipossomas funcionais para a vacinação gênica contra a tuberculose. Na abordagem "top-down" os lipossomas foram produzidos através da alimentação de uma dispersão de fosfolipídios em água e simultânea cominuição através de cisalhamento produzido por agitadores mecânicos dos tipos Caules (C) e Ultra-turrax® (U-T). Os lipossomas provenientes do U-T foram posteriormente submetidos a maiores níveis de cisalhamento, pela passagem através de microcanais tortuosos a pressões da ordem de 100 atm, em microfluidizador (M). A influência das variáveis operacionais sobre o diâmetro, polidispersidade e potencial zeta foi analisada através de planejamento estatístico fatorial e superfícies de resposta. Para C e U-T, os efeitos do cisalhamento prevaleceram em relação à vazão de alimentação. Para M, a pressão exerceu maior influência que o número de passagens. A taxa de cisalhamento aplicada variou na faixa de 102 a 7.106 s-1, produzindo diâmetros médios de 957 a 90 nm, polidispersidades de 0,60 a 0,25 e potenciais zeta de -60 a -44 mV. O diâmetro médio dos lipossomas variou com o inverso da raiz quadrada da taxa de cisalhamento. No processo "bottom-up" os lipossomas foram produzidos continuamente na interface etanol/fosfolipídio e água, formada por focalização hidrodinâmica em microcanal reto de 0,14 mm de largura. A velocidade de formação dos lipossomas variou com a razão água/etanol, concentração e composição lipídica. As propriedades físico-químicas originais dos lipossomas funcionais foram aproximadamente reproduzidas em ambos os processos escalonáveis. Comparativamente, o processo "top-down" é mais robusto, de fácil operação, permite utilizar altas concentrações lipídicas (400 mM), com obtenção de maior produtividade. Porém é descontínuo e requer maior consumo energético. O processo "bottom-up" é menos robusto, opera de forma estável a mais baixas concentrações lipídicas (100 mM), porém a produção é contínua e com menor consumo energético Abstract: The work presents a comparative study of scalable process with a top-down (comminution) and bottom-up (synthesis) approach, aiming the production of functional liposomes for the genetic vaccination against tuberculosis. For the top-down approach, liposomes were produced through the feed of a phospholipid in water solution and simultaneous comminution by cowls (C) and Ultra-Turrax® (U-T) mechanical dispersers. The liposomes obtained by U-T were then submitted to greater levels of shear through the processing in tortuous microchannels under a pressure in the order of 100 atm, in a microfluidizer (M). The influence of the operational variables on the diameter, polydispersity and zeta potential was analyzed through statistics factorial planning and response surface. For C and U-T the effects of shear overcame the effects of feed flow rate, and for M the effects of shear had greater influence than the number of passes.The applied hear rate varied in the range of 102 a 7.106 s-1, resulting in liposomes with mean diameter of 957 to 90 nm, polydispersity of 0,60 to 0,25 and zeta potential of -60 to -44 mV. The mean diameter varied with the inverse of the square root of the shear rate applied. In the bottom-up process liposomes were produced continuously at the interface ethanol/phospholipid and water, formed by the hydrodynamic focusing in a straight microchannel with 0,14 mm of width. The liposome formation velocity varied with the ethanol/water flow ratio, the lipid concentration and composition. The original physico-chemical properties of the functional liposomes were approximately reproduced in both scalable approaches. Comparatively, the top-down approach was more robust, easy to operate and allows the use of high lipid concentration (400 mM), achieving a greater productivity. However, it is discontinuous and requires a higher energetic consumption. The bottom-up approach is less robust, is stably operated with lower lipid concentration (100 mM), but it is a continuous production with a low energetic consumption Mestrado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Mestre em Engenharia Química

Orientador: Nelson Eduardo Durán Caballero Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: A alopecia é uma doença caracterizada pela diminuição ou ausência de cabelos e/ou pelos, que gera estresse emocional para milhões de homens e mulheres no mundo. O tratamento da alopecia é realizado, em geral, com aplicação tópica de medicamentos como o 17-alfa-estradiol, que é um estereoisômero do hormônio sexual 17-beta-estradiol. Entretanto este fármaco, assim como outros utilizados no tratamento de alopecia, apresentam baixa eficácia. Para tentar reverter essa situação, a associação deste fármaco com sistemas de liberação sustentada pode aumentar a sua eficácia e reduzir os efeitos colaterais. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento e a caracterização físico-química e biológica de carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) no encapsulamento de estradiol visando aumentar a eficácia deste fármaco no tratamento de alopecia. Os CLN foram preparados pelo método de microemulsão à quente/sonicação, e foram caracterizados quanto ao diâmetro e potencial Zeta, utilizando-se as técnicas de espectroscopia de correlação de fótons e mobilidade eletroforética respectivamente, sendo o diâmetro médio obtido no valor de 96 ± 15 nm e o potencial zeta médio foi de -16 ± 6 mV. A eficiência de encapsulamento (EE) do 17-alfa-estradiol avaliada por cromatografia líquida/fluorescência foi de 99,6 ± 0,3%. No estudo de estabilidade física dos CLN armazenados em temperatura ambiente foi observado que após dois meses os parâmetros de diâmetro, potencial Zeta, pH, EE e índice de recristalização (IR) não sofreram alterações significativas, demonstrando que a formulação de CLN desenvolvida neste projeto tem grande potencial como sistema de liberação do 17-alfa-estradiol. O poder de penetração cutânea dos CLN foi avaliado em célula de difusão de Franz e microscopia confocal, sendo que os resultados indicam que há acumulo dos CLN nas porções mais externas da epiderme, o que sugere que esta formulação está dentro dos padrões de biossegurança, principalmente no folículo piloso, sítio de ação do fármaco. Além disso, as avaliações de internalização dos CLN em células de queratinócitos demonstraram que os nanocarreadores foram internalizados e acumularam-se principalmente em seu citoplasma Abstract: Alopecia is a disease characterized by decreased or absent hair, which creates emotional stress for millions of men and women worldwide. The treatment of alopecia is carried out usually with topical application of drugs such as, sex hormone. However, this drug as well as others used in the treatment of alopecia have low efficacy. In this way the association of this drug with sustained delivery systems may increase the efficacy and reduce side effects. Thus, the aim of this work is the development and physico-chemical characterization of nanostructured lipid carriers (NLC) in the encapsulation of a steroid, aiming to increase the effectiveness of this drug in the treatment of alopecia. NLCs were prepared by the microemulsion of hot sonication method. The diameter and zeta potential were characterized , by using the technique of photon correlation spectroscopy and the average diameter obtained was 96 ± 15 nm while the average zeta potential was -16 ± 6mV. The encapsulation efficiency (EE) of the steroid measured by liquid chromatography with fluorescence detection was 99.6 ± 0.3%. In the study of physical stability of CLN stored at room temperature was observed that after two months the parameters diameter , zeta potential , pH , EE and recrystallization index (RI ) did not change significantly , demonstrating that this project has developed CLN great potential as a delivery system of 17-alpha- estradiol. The power dermal penetration of CLN was evaluated in Franz diffusion cell and confocal microscopy, and the results indicate that there is accumulation of CLN in the outer portions of the epidermis, especially the hair follicle, suggesting that this formulation is within the standards of biosecurity. Furthermore, evaluations of internalization of CLN on keratinocytes cells demonstrated that nanocarriers were internalized and accumulated mainly in the cytoplasm Mestrado Físico-Química Mestra em Química

Orientador: Maria Helena Andrade Santana Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Neste trabalho foram estudadas as reações de modificação química do ácido hialurônico (AH) com divinilsulfona (DVS) para preparação de géis reticulados e com carbodiimidas para preparação de fosfolipídios derivatizados. A modificação com DVS envolve os grupos hidroxílicos do AH, enquanto a modificação mediada por carbodiimida envolve os grupos carboxílicos do AH e o grupo amina do fosfolipídio. A extensão da reação de reticulação do AH com divinilsulfona (DVS) foi estudada em relação à razão mássica AH/DVS e concentração de NaOH na mistura reacional. O grau de modificação dos géis foi correlacionado com a reologia e a razão de intumescimento (RI). As reações de reticulação foram realizadas com AH de origem bacteriana de massa molar média da ordem de 105 Da. O gel plano preparado com concentrações de AH e NaCl de 3g/100g e em pH alcalino foi submetido a alto cisalhamento para produção de partículas. A reologia desses géis foi estudada em relação ao diâmetro médio das partículas e razão mássica gel/fluido. Um gel com propriedades reológicas semelhantes ao fluido sinovial foi preparado com partículas entre 75 e 100 µm e razão mássica gel/fluido (AH 1g/100g) de 75:25, o qual foi avaliado quanto à sua citotoxicidade em ensaios in vitro. Os resultados mostraram que a concentração de DVS é diretamente proporcional à dureza e à viscoelasticidade do gel, mas inversamente proporcional a RI. Os géis mostraram comportamento não Newtoniano pseudoplástico em toda a faixa de taxa de cisalhamento estudada. Nas medidas oscilatórias, foi observado comportamento característico de géis, com o módulo elástico maior que o viscoso (G'>G"), ambos independentes da frequência. Baseado nos parâmetros reológicos, os géis foram classificados em covalentes e fracos. A alcalinidade da mistura reacional foi inversamente proporcional à viscosidade do meio e à dureza do gel. O tamanho de partícula foi diretamente proporcional à dureza do gel e à viscosidade. O aumento da porcentagem da fase fluida (solução de AH 1% não reticulado) causou redução em G' e G" e nas forças de extrusão. O gel analisado in vitro não apresentou efeitos citotóxicos. O conjugado AH-fosfolipídio foi preparado através da ativação do AH com 1-ethyl-3-[3-dimethyl)aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDCA) em pH 4,0 e adição do fosfolipídio 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) em pH 8,6. Os conjugados obtidos foram separados por ultrafiltração e caracterizados por cromatografia em camada delgada, ressonância magnética nuclear de próton, teor de fosfato e AH. A capacidade de incorporação do conjugado em bicamada lipídica foi avaliada através da preparação de lipossomas compostos de lecitina de ovo e DPPE, contendo 5, 10 e 15% do conjugado. Os resultados obtidos indicaram modificação do tamanho, polidispersidade e das propriedades de superfície dos lipossomas preparados com incorporação do conjugado AH DPPE. Esses resultados contribuem para o desenvolvimento de produtos à base de AH, para aplicações nas áreas médica, farmacêutica e de cosméticos Abstract: In this work, it was studied the chemical modification of hyaluronic acid (HA) with divinyl sulfone (DVS) for the preparation of cross-linked hydrogels and with carbodiimides for the preparation of derivatized phospholipids. The modification with DVS involves the hydroxyl groups of HA, while the carbodiimidemediated modification involves the carboxylic groups of HA and the amino group of the phospholipid. The cross-linking reaction of HA with DVS has been studied regarding the HA/DVS mass ratio and NaOH concentration in the reaction mixture. The modification degree of the gels was correlated with their rheological properties and swelling ratios (SR). The crosslinking reactions were performed with bacterial hyaluronic acid of molecular weight around 105 Da. The hydrogels plans prepared with concentrations of HA and NaCl of 3g/100g and at alkaline pH were subjected to high shear to produce particles. The rheology of these hydrogels was studied in relation to the average particle size and gel/fluid mass ratio. A gel with rheological properties similar to synovial fluid was prepared with particles between 75 and 100 micrometres and gel/fluid mass ratio (HA 1g/100g) of 75:25. The cytotoxicity of this gel was evaluated through tests in vitro. The results showed that the DVS concentration was directly proportional to the hardness and viscoelasticity of the hydrogel, but it was inversely proportional to the SR. The hydrogels showed non-Newtonian pseudoplastic behavior in the range of shear rate studied. In the oscillatory measurements, the cross-linked HA hydrogels exhibited characteristic behavior of gels, with the elastic modulus higher than the viscous modulus (G' > G"), both frequency independent. Furthermore, based on the rheological parameters, the gels were classified as covalent and weak. The alkalinity of the reaction mixture was inversely proportional to the viscosity of the medium and to the hardness of the hydrogel. The particle size was directly proportional to the hardness and viscosity of the hydrogel. The increase in the percentage of fluid phase caused a reduction in G' and G" and the extrusion forces. The hydrogel analised in vitro showed no cytotoxic effects. The HA-phospholipid conjugate was prepared through the activation of HA with 1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDCA) at pH 4.0 and addition of the phospholipid 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) at pH 8.6. The conjugates were separated by ultrafiltration and characterized by thin layer chromatography, proton nuclear magnetic resonance, phosphate and HA content. The incorporation ability of the conjugate into the lipid bilayer was evaluated through the preparation of liposomes composed of egg lecithin and DPPE containing 5, 10 and 15% of the conjugate. The liposomes were characterized by size, polydispersity and zeta potential, and compared with the control (no conjugate). The results indicated modification of the size, polydispersity and surface properties of liposome-conjugates HA-DPPE. These results contribute to the development of HA-based products for applications in medical, pharmaceutical and cosmetic industries Mestrado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Mestre em Engenharia Química

Orientador: Sávio Souza Venâncio Vianna Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Uma emergente estratégia em estudos de aumento de vorticidade devido a advecção caótica em microcanais tem sido a aplicação de ferramentas computacionais. A fluidodinâmica computacional (CFD) tem sido amplamente utilizada devido à suas vantagens em poder gerar resultados precisos, e em minimizar os custos de testes experimentais nos quais necessitam da fabricação de microdispositivos e do consumo de reagentes. No entanto, a aquisição da licença de um programa de CFD ainda requer elevado investimento econômico. Além disso, em análises de escoamento em microescala, a melhoria na formação de vórtices ainda é um grande empecilho para muitos pesquisadores. Isso pode ser explicado devido ao perfil de escoamento ser predominantemente laminar, prevalecendo assim o transporte por difusão molecular sobre o transporte convectivo, de modo a desfavorecer a geração dos vórtices. Essa pesquisa tem como objetivo desenvolver um código que descreva o escoamento de fluidos ao longo de microcanais, assim como, obter uma intensificação na vorticidade do fluido por meio de pequenas mudanças na geometria de um dispositivo no formato de bocal convergente acoplado à um microcanal com saliências convexas. O código foi programado utilizando linguagem computacional Fortran 95 no qual o domínio espacial e as equações de conservação foram discretizados a partir do Método dos Volumes Finitos (FVM) e do esquema híbrido, respectivamente. Adicionalmente, essas equações foram iteradas até atingir a convergência por meio da implementação do algoritmo SIMPLE co-localizado (Semi-Implicit Method for Pressure-Linked Equations). Por fim, os dados coletados mostram que a largura do microcanal e a inserção de saliências favorecem consideravelmente o aumento da vorticidade e a criação de zonas de recirculação para maiores números de Reynolds, enquanto que a contribuição da posição da alimentação é apenas localizada na entrada dos microdispositivos Abstract: An increasing strategy to stimulate vorticity due to chaotic advection in microchannels has been involving the use of computational tools. Computational fluid dynamics (CFD) has been widely used due to its advantages in obtaining accurate results, and minimizing the costs of experimental tests, which includes the fabrication of prototypes of microdevices and the consumption of reagents. However, acquiring a CFD software is still expensive. Moreover, in a microfluidic pattern study, the improvement in the formation of vortices still represents a burden for many researchers. The reason is that diffusion transport at molecular level prevails over the convective forces in laminar regimes, contributing to a no chaotic flow performance. The purpose of this study is to develop a code that describes the fluid flow along a microchannel; and also, to propose an improvement of the vortex formation of a fluid by varying slightly the geometry of a converging nozzle coupled to a bumpy microchannel. The code was programmed by employing the Fortran 95 language in which the spatial domain and the derivative conservation equations were discretized by applying the Finite Volume Method (FVM) and the hybrid scheme, respectively. Consequently, these equations were iterated until convergence through the co-located SIMPLE (Semi-Implicit Method for Pressure-Linked Equations) algorithm. Finally, the data collected show that the width of the microchannel and the insertion of bumps considerably favor the increase in vorticity and the creation of recirculation zones for larger numbers of Reynolds, while the contribution of the position of the feed is only located at the entrance of the microdevices Mestrado Engenharia Química Mestre em Engenharia Química CNPQ 137742/2018-5

Orientador: Laura de Oliveira Nascimento Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas Resumo: A doxiciclina (DX) é um medicamento antimicrobiano de uso consolidado e que pode ser utilizado para tratar infecções respiratórias e bucais. No entanto, o uso da DX é limitado devido à sua instabilidade em meio aquoso, resistência bacteriana e baixa penetração celular. Sabe-se que a inclusão de fármacos em complexos de ciclodextrina ou em nanopartículas (NPs) podem superar essas desvantagens. Assim, este trabalho teve como objetivo desenvolver complexos de inclusão DX/sulfobutiléter-?-ciclodextrina (SBE-?-CD) e nanopartículas de quitosana carregadas com DX e em seguida, avaliar suas propriedades físico-químicas e antimicrobianas. A formação dos complexos DX/SBE-?-CD foi confirmada por ressonância magnética nuclear, espectroscopia de infravermelho, análises térmicas, difração de raios X e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Não foram observadas melhorias na estabilidade da DX em solução após a formação do complexo, entretanto, o complexo no estado sólido proporcionou maior estabilidade térmica para o fármaco. Nanopartículas carregadas com DX foram caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz (DLS) e SEM. A metodologia aplicada resultou em nanopartículas monodispersas satisfatórias (índice de polidispersão: 0,039, tamanho de partícula: 209,7 nm, potencial zeta: +17,5 mV) com taxa de encapsulação (25,2%) suficiente para ser avaliada em estudos microbiológicos. Ambas as formulações (NPs e complexo) mantiveram a atividade antimicrobiana da DX contra Staphylococcus aureus, enquanto apenas os complexos de inclusão DX/SBE-?-CD foram ativos contra Klebsiella pneumoniae. Acreditamos que NPDX não tenha mostrado ação contra K. pneumoniae devido a concentração testada estar próxima ao limite da concentração inibitória mínima para essa cepa, porém, é possível solucionar essa questão através da liofilização das NPs, que permitiria o aumento da concentração da formulação. Assim, as formulações obtidas foram capazes de proteger o fármaco termicamente e têm potencial para serem utilizadas como sistemas de liberação de fármacos para o tratamento de infecções locais Abstract: Doxycycline (DX) is a well-established antimicrobial drug that could be used to treat respiratory and buccal infections. Nonetheless, DX use is limited due to its instability in aqueous media, bacterial resistance, and low cellular penetration. It is known that the inclusion of drugs in cyclodextrin complexes or nanoparticles (NPs) can overcome these drawbacks. Thus, this study aimed to develop DX/sulfobutylether-?-Cyclodextrin (SBE-?-CD) inclusion complexes and DX-loaded chitosan nanoparticles and evaluate their physicochemical and antimicrobial properties. The formation of DX/SBE-?-CD complexes were confirmed by nuclear magnetic resonance, infrared spectroscopy, thermal analysis, X-ray diffraction and scanning electron microscopy (SEM). No improvements in DX stability in solution were observed after complex formation, however, it was identified that the complex in solid state provided increased thermal stability for the drug. DX-loaded nanoparticles were characterized by dynamic light scattering (DLS) and SEM. The applied methodology resulted in appropriate monodisperse nanoparticles (polydispersity index: 0.039, particle size: 209.7 nm, zeta potential: 17.5 mV) with sufficient encapsulation rate (25.2%) to be evaluated in microbiological studies. Both formulations (NPs and complex) maintained the antimicrobial activity of DX against Staphylococcus aureus, while only the DX/SBE-?-CD inclusion complexes were active against Klebsiella pneumoniae. We believe that NPDX has not shown action against K. pneumoniae due to the concentration tested being close to the limit of minimum inhibitory concentration, however, it is possible to solve this issue through lyophilization of NPs, which would allow increased concentration. Thus, the formulations obtained are able to protect the drug thermally and have the potential to be used as drug delivery systems for the treatment of local infections Mestrado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Mestra em Ciências FAPESP 2019/08281-5 CAPES 0

Orientadores: Lucimara Gaziola de la Torre, Hernandes Faustino de Carvalho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: O câncer é um problema de saúde mundial. Devido à complexidade e alta variabilidade entre os pacientes, os medicamentos atualmente utilizados são em muitos casos ineficientes, causando resistência das células ao tratamento sem propiciar ação esperada. Assim, muitos esforços estão direcionados ao desenvolvimento de novos fármacos, estima-se que o custo para o desenvolvimento de novos fármacos é na faixa de 2,5 bilhões de dólares por ano. Uma estratégia adotada para melhorar a eficácia dos tratamentos é a utilização de combinações de medicamentos já existentes. Para se alcançar a máxima eficiência, as combinações deveriam ser estudadas e avaliadas para cada paciente em direção a uma nova tendência denominada medicina personalizada. Dentro deste âmbito, a microfluídica emerge como uma plataforma tecnológica promissora para agilizar ensaios pré-clínicos de novos fármacos e também viabilizar o estudo individualizado de cada paciente. Microfluídica é uma área multidisciplinar que opera em dispositivos em escala micrométrica e trabalha com pequenas quantidades de fluidos. Neste contexto, o presente projeto teve por objetivo o desenvolvimento de um novo microdispositivo, reutilizável e reversível para avaliação do efeito de fármacos em células tumorais. O microdispositivo foi fabricado de polidimetilsiloxano laminado, que lhe confere reversibilidade funcionalidade. Além disso, o microdispositivo é reutilizável diminuindo os custos na fabricação do microdispositivo. O microdispositivo tem a capacidade de gerar gradiente de concentração difusivo, gerando 6 diferentes concentrações de fármacos simultaneamente e ainda permite utilizar dois fármacos simultaneamente, aumentando a eficiência na aquisição de informações do comportamento celular. Como prova de conceito, foram utilizadas células de câncer de mama (MCF-7) e dois quimioterápicos (doxorrubicina e paclitaxel). As células foram cultivadas na conformação 3D (isoladas e no formato de esferoides), nas quais foi possível observar as respostas bioquímicas em diferentes concentrações de quimioterápicos. Os resultados obtidos nos ensaios utilizando um ou dois fármacos foram muito próximos aos resultados encontrados em ensaios in vivo. A análise de viabilidade e morfologia apresentaram resultados bem próximo aos cultivos realizados em placas. Para avaliar a eficácia dos fármacos nas células, foi realizado o ensaio para quantificar a presença da enzima lactato desidrogenase-LHD. A reação entre a enzima e o regente enzimático foi realizada no microdispositivo e por meio do método tradicional. Os resultados obtidos foram comparados com curva analítica de LDH. O microdispositivo contribui para a criação de novas tecnologias nacionais, que permitam auxiliar no desenvolvimento de novos fármacos e na escolha de tratamentos adequados Abstract: Cancer is a global health problem and due to the complexity and high variability among patients, the drugs currently used are in many cases inefficient, causing cell resistance (MRD) to the treatment without providing the expected action. Thus, many efforts are directed towards the development of new drugs, it is estimated that the cost for the development of new drugs is in the range of 2.5 billion dollars per year. One strategy adopted to improve the effectiveness of treatments is the use of existing drug combinations. To achieve maximum efficiency, combinations should be studied and evaluated for each patient towards a new trend called personalized medicine. Therefore, microfluidics emerges as a promising technological platform to streamline preclinical trials of new drugs and enable each patient's individualized study. Microfluidics is a multidisciplinary area that operates on micrometric scale devices and works with small amounts of fluids. In this context, this project aimed to develop a new microfluidic device for evaluating the effect of drugs on tumor cells. The microdevice was built in laminated polydimethylsiloxane, which confers reversibility to the microdevice. The microdevice can be disassembled and assembled without losing its functionality. In addition, the microdevice can be reusable, decreasing the cost of manufacturing the microdevice. It is a microdevice capable of generating a diffusive concentration gradient, generating different simultaneous concentrations of drugs (6 concentrations). The microdevice also allows the use of two drugs simultaneously, increasing the efficiency in the acquisition of cellular behavior information. As proof of concept, breast cancer cells (MCF-7) and two conventional chemotherapeutics (doxorubicin and paclitaxel) were used. Cells were cultured in 3D conformation (isolated and in spheroid conformation), in which it was possible to observe the biochemical responses at different concentrations of chemotherapeutics. Results obtained in trials using one or two drugs were similar to results in in vivo trials. The analysis of viability and morphology also showed results similar to cultures carried out in plates. To assess the effectiveness of drugs in cells, the lactate dehydrogenase-LHD assay was performed. The reaction between the enzyme and the enzymatic reagent was carried out in the microdevice and in the traditional way and the results obtained were compared with the analytical curve of LDH. The microdevice contributes to the creation of national new technologies, which allow to assist in the development of new drugs and in the choice of suitable treatments for patients Doutorado Engenharia Química Doutora em Engenharia Química CAPES 88882.3296884/2019-01

Orientador: Rosiane Lopes da Cunha Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A capacidade de formação e estabilidade são características fundamentais a serem investigadas durante o desenvolvimento de emulsões visando aplicações tecnológicas. Por outro lado, em processos como os fermentativos e petrolíferos, em que ocorre a produção ou extração de compostos apolares, é desejada uma baixa estabilidade das emulsões inerentes ao processo, visando aumentar a recuperação eficiente do óleo. Neste contexto, a análise da estabilidade das emulsões é de suprema importância para se determinar a melhor composição dependendo das características da emulsão desejada. Ademais, desvendar os mecanismos de (des)estabilização seria de grande valia para o desenvolvimento destes importantes sistemas coloidais. Neste sentido, estratégias baseadas na microfluidica foram aplicadas para o estudo da (des)estabilização de gotas, uma vez que esta tecnologia pode alcançar tanto a formação das emulsões quanto sua separação eficiente das fases. Dentro deste viés, o presente estudo objetivou investigar a (des)estabilização de emulsões-modelo (usando surfactantes convencionais ou agentes tensoativos de sistemas fermentativos como estabilizantes) em microcanais. As estratégias aplicadas para tal foram, principalmente, alterações da geometria e das propriedades de parede dos canais, porém a adição de agentes externos (soluções aquosas) também foi realizada para induzir a desestabilização inclusive das emulsões mais estáveis. Por conseguinte, foi possível identificar os principais parâmetros relacionados aos mecanismos de (des)estabilização das emulsões, além de se determinar as condições de escoamento e os microcanais mais adequados para a indução deste fenômeno. De modo geral, foi observado que microcapilares de vidro não foram eficientes para a avaliação dos eventos de coalescência devido ao formato tridimensional, enquanto que os canais planares cujas dimensões são moduláveis foram mais adequados para a avaliação dos fenômenos de desestabilização. Ademais, constatou-se a dificuldade em se desestabilizar emulsões com alta concentração de estabilizantes utilizando microdispositivos que induzem o choque entre as gotas, todavia tal efeito foi alcançado através da injeção forçada de soluções aquosas em gotas concentradas. De fato, dependendo da solução aquosa adicionada (salina ou água deionizada), diferentes mecanismos de desestabilização foram visualizados (fratura, ruptura da gota na parede do canal e/ou coalescência). Tais mecanismos também foram modificados dependendo das propriedades de superfície dos microcanais (potencial zeta e hidrofobicidade). Desta maneira, o entendimento do papel da parede dos microcanais foi essencial para induzir tanto a formação quanto a desestabilização das gotas, permitindo modular a estabilidade cinética das emulsões. De modo geral, foi constatado que os estabilizantes carregados devem possuir cargas de mesmo sinal que os microcanais para que as gotas sejam formadas, além de que a fase contínua da emulsão deve possuir a mesma natureza (polar ou apolar) que a parede dos canais. Em contrapartida, a aderência das gotas de óleo nas paredes dos dispositivos foi observada em duas ocasiões: (i) quando os microcanais possuíam uma alta hidrofobicidade e reduzida carga superficial e (ii) quando as gotas das emulsões possuíam cargas opostas às das paredes dos microcanais. Finalmente, este estudo permitiu indicar a utilização de microcanais em série para a determinação da estabilidade das gotas, no entanto ressalta-se que é necessário entender a priori as potenciais interações gotas-parede dos canais Abstract: The ability of formation and stability are fundamental attributes to be investigated during the development of emulsions aiming at technological applications. Notwithstanding, in other processes, such as fermentative and petroleum-related, in which the production or extraction of nonpolar compounds is triggered, the minimum stability of the emulsions inherent to the process is desirable in order to increase the oil recovery. In this sense, the evaluation of emulsion stability is of paramount importance to determine the optimized composition depending on the characteristics of the sought-after emulsion. Furthermore, unraveling the mechanisms of (de)stabilization would be of outmost value for the development of these important colloidal systems. In this light, strategies based on microfluidics were applied to the investigation of droplets (de)stabilization, since this technology can achieve both the formation of emulsions and their efficient separation of phases. Due to the above, the present study aimed to investigate the (de)stabilization of model emulsions (using conventional surfactants or tensoactive agents of fermentative systems as stabilizers) in microfluidic channels. In such devices, the applied strategies were mainly related to changes in the geometry and surface properties. However, the addition of external agents (aqueous solutions) was also performed to induce the destabilization even of the most stable emulsions. Therewith, it was possible to identify the main parameters related to the mechanisms of emulsion (de)stabilization, in addition to determining the flow conditions and set of channels most suitable for inducing this phenomenon. Overall, it was observed that glass microcapillaries were not efficient to evaluate the events of coalescence due to the 3D geometry, while planar channels (whose dimensions can be modified) were most suitable to assess the destabilization phenomena. Moreover, it was verified extreme difficulty in destabilizing emulsions (especially those with a high concentration of stabilizing agents) using microdevices inducing the contact between the droplets. Nonetheless, such destabilization was achieved through the forced injection of aqueous solution in concentrated droplets. Indeed, depending on the aqueous solution added (saline solution or water), varied mechanisms of destabilization were visualized (fracture, droplet burst on the channel surface and/or coalescence). Such mechanisms were also dependent on the surface properties of the microchannels (zeta potential and hydrophobicity). Therefore, understanding the role of the microchannel wall was essential to induce both formation and destabilization of the droplets, allowing modulating the kinetic stability of the emulsions. In general, it was found that charged stabilizing agents must have charges of the same signal as microchannels to allow droplets formation. In addition, the continuous phase of the emulsions must have the same nature (polar or nonpolar) as the channel surface. On the other hand, adherence of oil droplets on the device walls was observed on two occasions: (i) when the microchannels possessed both high hydrophobicity and reduced surface charges and (ii) when the emulsion droplets had opposite charges to those of the walls of the microchannels. Ultimately, this study allowed indicating the use of channels coupled in series to determine the stability of the droplets; however, it was emphasized that a prior understanding of the potential interactions between the droplets and the channels needs to be accomplished Doutorado Engenharia de Alimentos Doutora em Engenharia de Alimentos FAPESP 2017/18109-0 CNPQ 140700/2017-0

Orientador: Rosiane Lopes da Cunha Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A formação de nanopartículas para sistemas de encapsulamento pode ser realizada por vários processos e, entre eles, pode-se citar os processos espontâneos, que são simples e produzidos com baixo consumo de energia. Dentre esses processos encontra-se a complexação eletrostática que ocorre entre pelo menos dois polímeros com cargas opostas que interagem através de forças intermoleculares. A quitosana é um polissacarídeo carregado positivamente que apresenta propriedades mucoadesivas, porém apresenta baixa solubilidade em água. Nesse sentido, a hidrólise enzimática deste composto surge como uma alternativa para garantir maior homogeneidade e solubilidade na formação dos complexos. A gelana é um polissacarídeo aniônico solúvel em água e resistente a baixos valores de pH, o que facilita sua utilização como material encapsulante. Nesse contexto, este estudo teve como objetivo avaliar a formação de nanopartículas através da produção de complexos eletrostáticos utilizando a gelana (G) em combinação com a quitosana (C) ou a quitosana hidrolisada (HC), obtida a partir de hidrólise enzimática. Dois diferentes métodos foram utilizados para a produção das nanopartículas e comparados, "bulk" e microfluídica, sendo estas partículas incorporadas de cafeína em diferentes condições de processo. As nanopartículas foram caracterizadas quanto às seguintes análises: potencial zeta, distribuição de tamanho, índice de polidispersão (PDI), MEV-T (microscopia eletrônica de varredura no modo de transmissão), cristalinidade, turbidez, FTIR (espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier) e eficiência de encapsulação da cafeína. De modo geral, a hidrólise da quitosana permitiu a formação de estruturas menores e mais solúveis, o que facilitou a formação dos complexos. Além disso, partículas com maior concentração de gelana (razões G:C ou G:HC de 7:3 e 8:2) foram as que mostraram menor potencial zeta, tamanho de partícula e polidispersão. Dentre os processos utilizados, a microfluídica permitiu obter complexos com menor polidispersão (PDI ~0.1) e tamanho médio (~200 nm). No entanto, ambos os métodos de formação dos complexos permitiram o encapsulamento da cafeína, porém a microfluídica foi mais eficaz mostrando eficiência de encapsulação de aproximadamente 70%. Sendo assim, os resultados obtidos permitem afirmar que a microfluídica é uma técnica mais eficiente para a formação de nanocomplexos incorporados de cafeína quando comparada a processos tradicionais Abstract: The formation of nanoparticles for encapsulating systems can be carried out by various processes and, among them, there are spontaneous processes which are simple and produced with low energy consumption. Among these processes is the electrostatic complexation that occurs between at least two oppositely charged polymers interacting by intermolecular forces. Chitosan is a positively charged polysaccharide that shows mucoadhesive properties, but has low water solubility. In this sense, the enzymatic hydrolysis of this compound emerges as an alternative to ensure greater homogeneity and solubility in the complex formation. Gellan is a water-soluble anionic polysaccharide resistant to low pH values, which facilitates its use as an encapsulating material. In this context, this study aimed to evaluate the formation of nanoparticles by the production of electrostatic complexes using gellan (G) in combination with chitosan (C) or hydrolyzed chitosan, obtained from enzymatic hydrolysis. Two different methods were used for the production of nanoparticles and compared, bulk and microfluidic, and different process conditions were used to incorporate caffein in these particles. The nanoparticles were characterized according to the following analyzes: zeta potential, size distribution, polydispersity index (PDI), STEM (scanning transmission electron microscopy), crystallinity, turbidity, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and encapsulation efficiency. In general, the hydrolysis of chitosan allowed the formation of smaller and more soluble structures, which facilitated the formation of complexes. In addition, the particles with a higher gellan concentration (ratios G: C or G:HC of 7: 3 and 8: 2) showed the lowest zeta potential, particle size and polydispersity. Among the processes used, microfluidics allowed to obtain complexes with less polydispersity (PDI ~ 0.1) and lower mean size (~ 200 nm). However, both methods of complex formation allowed caffeine encapsulation, but microfluidics showed higher encapsulation efficiency (~ 70%). Thus, our results showed that microfluidics is a more efficient technique for the formation of nanocomplexes incorporated with caffeine as compared to traditional processes Mestrado Engenharia de Alimentos Mestra em Engenharia de Alimentos CAPES 88882.329560/2019-01

Orientadores: Éric Fujiwara, Lucimara Gaziola de la Torre Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica Resumo: O projeto de dois microfermentadores de perfusão que utilizam membranas com poros de 470 nm e são instrumentados com um sensor de fibra óptica baseado em refletância e espalhamento de luz é apresentado. O projeto é modularizado, com componentes optoeletrônicos fisicamente separados da região de detecção, e sistema fabricado apenas com dispositivos de telecomunicações comerciais (laser 1310 nm, fibras ópticas monomodo, acoplador 2x1 e fotodetector). Quando a luz atinge a interface entre a fibra e o caldo fermentativo, parte dela é refratada e transmitida, e parte é refletida novamente e redirecionada pelo acoplador ao fotodetector. Devido à presença de partículas com diâmetros comparáveis em ordem de grandeza ao comprimento de onda do laser, o fenômeno de espalhamento quase-elástico da luz é observado, e aumenta a dispersão dos dados coletados. Por meio de estatísticas de autocorrelação da intensidade refletida, é possível, então, avaliar a concentração instantânea de células. As fibras são alocadas no interior de microcâmaras por meio de duas estratégias diferentes: inserção por tampa de vidro furada, em dispositivo fabricado a partir da ablação a laser de PDMS laminado; e inserção lateral em dispositivo fabricado pela cura de PDMS sobre moldes obtidos por manufatura aditiva. Embora o segundo caso resulte em menores desvios dimensionais e em maiores pressões suportadas, ocorre um aumento significativo das dificuldades de fabricação e operação, de modo que o primeiro caso é preferível. O uso do primeiro reator de perfusão com sete concentrações diferentes de substrato (2,5 a 30 g/L de sacarose) resultou nos parâmetros cinéticos de Monod KM = 4,1 g/L e ?m = 0,49 h-1, valores que estão concordância tanto com a literatura quanto com o teste de controle tradicional (realizado em paralelo), sendo a presença do crescimento celular no interior dos microdispositivos comprovada por observação ao microscópio óptico. O microfermentador instrumentado consiste, portanto, em um sistema adequado à rápida obtenção de parâmetros cinéticos de crescimento celular Abstract: The design of two perfusion microfermentors which use membranes with pores of 470 nm and are instrumented with an optical fiber sensor based on reflectance and light scattering is presented. The design is modularized, with optoelectronic components physically separated from the detection region, and system fabricated only with commercial telecommunication devices (1310 nm laser, single-mode optical fibers, 2x1 coupler and photodetector). When light reaches the interface between the fiber and the fermentation broth, part of it is refracted and transmitted, and part is reflected back and redirected by the coupler to the photodetector. Due to the presence of particles with diameters comparable in order of magnitude to the laser wavelength, the phenomenon of the quasi-elastic light scattering is observed, and enhances the dispersion of the collected data. Through autocorrelation statistics of the reflected intensity, it is possible, then, to evaluate the instant concentration of cells. The fibers are allocated into the microchambers by two different strategies: insertion through a glass cover with holes, in a device fabricated by laser ablation of laminated PDMS; and lateral insertion into a device fabricated by the cure of PDMS on molds obtained by additive manufacture. Despite the fact that the second case results in lower dimensional deviations and in higher pressure supported, a significant increase on the fabrication and operation difficulties occurs, so the first case is preferable. The use of the first perfusion reactor with seven different substrate concentrations (2,5 to 30 g/L of sucrose) resulted in the Monod kinetic parameters KM = 4,1 g/L e ?m = 0,49 h-1, values that are in agreement with both the literature and the traditional control test (performed in parallel), with the presence of cellular growth inside the microdevices proven by optical microscope observation. The instrumented microfermentor consists, therefore, in a system adequate for the fast obtention of the cellular growth kinetic parameters Mestrado Mecatrônica Mestre em Engenharia Mecânica FAPESP 2017/20445-8

Orientador: Cátia Cristina Capelo Ornelas Megiatto Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: As infecções causadas por microorganismos resistentes a múltiplas drogas (MDR) são um dos maiores problemas da saúde global. O surgimento de novas cepas resistentes destaca a necessidade de desenvolver novos agentes antimicrobianos. Para abordar esta problemática, este trabalho teve como objetivo sintetizar materiais nanoestruturados com elevado potencial antimicrobiano. Na primeira parte deste estudo, sintetizamos nanopartículas baseadas em dextrana acetalada (Ac-Dex) encapsulando nanopartículas de prata (Ag NPs) e antibióticos convencionais. As nanopartículas de Ac Dex foram desenvolvidas por meio de uma metodologia inovadora, que emprega a formamida com dupla função; solvente emulsificante e agente redutor dos íons de prata. As partículas de Ac-Dex foram caracterizadas pelas técnicas de microscopia eletrônica e espalhamento dinâmico de luz (DLS). Os resultados dessas análises possuem profunda coerência entre si, e revelam que as nanopartículas de Ac-Dex exibem diâmetro médio de aproximadamente 100 nm. Ainda, os resultados sugerem que as Ag NPs são formadas dentro da rede polimérica das nanopartículas de Ac-Dex. As vacâncias com dimensões nanométricas determinam o tamanho, formato e polidispersidade das Ag NPs formadas. As nanopartículas de Ac-Dex demonstraram elevada capacidade de carreamento de fármacos e resposta às variações de pH. Na segunda parte deste estudo, desenvolvemos nanopartículas de ouro (Au NPs) funcionalizadas com dendrons catiônicos e aniônicos. Descrevemos a síntese de dois dendrons com características desejáveis: elevada biodegradabilidade e solubilidade em água, além da presença de grupos carregados nas extremidades e grupo tiol na posição focal. Ambos os dendrons foram sintetizados através de dezessete etapas com rendimentos globais desejáveis (38-40%). Os dendrons derivados de amina e ácidos carboxílicos foram caracterizados por espectroscopia magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massas (MS). Subsequentemente, os dendrons foram utilizados para funcionalizar Au NPs obtidas comercialmente. As Au NPs funcionalizadas com os dendrons foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), DLS e potencial zeta. O conjunto de resultados sugerem que a funcionalização das Au NPs ocorreram precisamente através do grupo tiol. Interessantemente, as Au NPs funcionalizadas com os dendrons demonstraram elevada absorção na região de 560 nm, o que torna possível a exploração de suas propriedades fototérmicas, especialmente para tratar infecções superficiais de pele. Na terceira parte do trabalho, descrevemos a agregação espontânea de três dendrímeros com terminais ferroceno. Esses agregados moleculares tendem a possuir elevada atividade antimicrobiana, uma vez que a maquinaria molecular dos microorganismos não possuem recursos para inativar esses materiais. Desse modo, desenvolvemos uma metodologia de nanoprecipitação para formar partículas de dendrímeros com elevada esfericidade e baixa polidispersidade. Surpreendentemente, observamos na ausência de fluoróforos tradicionais, a fluorescência dos agregados de dendrímeros. Considerando a relevância dessa observação, buscamos entender esse fenômeno de fluorescência não-tradicional para contribuir com o desenvolvimento de materiais com propriedades avançadas, incluindo atividade antimicrobiana. Neste trabalho, ainda não avaliamos as atividades antimicrobianas dos materiais desenvolvidos. No entanto, os três materiais nanoestruturados foram sintetizados com propriedades bem definidas e após uma revisão sistemática da literatura sobre o tema da resistência antimicrobiana. Assim, pretendemos demonstrar em trabalhos futuros o elevado caráter antimicrobiano de cada um dos materiais apresentados neste trabalho Abstract: Infections caused by multi-drug resistant (MDR) microorganisms is one of the most critical issues in global health. The emergence of new resistant strains stresses the need for discovery of novel antimicrobial agents. To address this issue, this work aimed to develop nanostructured materials with antimicrobial potential. In the first part of this study, we synthesized nanoparticles based on acetalated dextran (Ac-Dex) loaded with silver nanoparticles (Ag NPs) and conventional antibiotics. The Ac-Dex nanoparticles were developed through a novel methodology, which employs formamide as the emulsifying-solvent and reducing agent of silver ions. The resulting particles were characterized by electron microscopy and dynamic light scattering (DLS) techniques. These analyses exhibit profound coherence and reveal that Ac-Dex nanoparticles exhibit mean diameters of approximately 100 nm. Moreover, the results suggest that Ag NPs are formed inside the polymeric network. The nanoscopic vacancies inside the Ac-Dex nanoparticles tune the formation of Ag NPs in terms of size, shape, and polydispersity. The Ac-Dex nanoparticles exhibited high drug-loading capability and pH responsiveness. In the second part of this study, we developed gold nanoparticles (Au NPs) functionalized with cationic- and anionic-dendrons. We reported the synthesis of two dendrons with desirable features: high water solubility and biodegradability, presence of charged groups and a thiol moiety at the focal position. Both dendrons were synthesized through seventeen steps with suitable global yields (38-40%). The amine- and carboxyl- terminated dendrons were characterized by nuclear magnetic spectroscopy (NMR) and mass spectrometry (MS). Subsequently, the dendrons were employed to functionalize commercially available Au NPs. The dendronized Au NPs were assessed by scanning electron microscopy (SEM), DLS technique, and zeta potential. The results support that the functionalization of Au NPs occurred precisely from the thiol group at the focal point. Also, the dendronized Au NPs revealed a plasmonic absorption at 560 nm, which makes this nanomaterial a promising candidate for photothermal and antimicrobial therapy essentially to treat skin infections. Subsequently, in the final part of this study, we described the spontaneous self-assembly of three ferrocenyl dendrimers. The use of supramolecular-based antimicrobials might be an effective alternative since the molecular machinery of microorganisms does not have resources to inactivate molecular aggregates. Therefore, we developed a reproducible nanoprecipitation method to generate dendrimer-microparticles with high sphericity and low polydispersity. Surprisingly, we observed a strong fluorescence for the dendrimer self assemblies in the absence of traditional fluorophores. Considering the uniqueness of the phenomenon, we endeavored to understand the non-traditional fluorescence and further contribute to the development of advanced materials. In this work, we did not evaluate the antimicrobial activities of the new materials. However, the three different nanostructured systems were synthesized after a systematic survey concerning the antimicrobial resistance. Thus, we aim to demonstrate in future works the high antimicrobial potential of each material presented in this work Mestrado Química Orgânica Mestre em Química CAPES 0 CNPQ 134593/2018-9

Orientadores: Marisa Masumi Beppu, Hernandes Faustino de Carvalho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: O câncer de próstata (CaP) é uma neoplasia silenciosa que possui, quando diagnosticado em suas fases iniciais, grandes chances de cura. Dessa forma, a busca por métodos de detecção de células tumorais circulantes (CTCs) e de marcadores prognósticos para o CaP é necessária a fim de reduzir sua crescente taxa de mortalidade entre os homens. Para fins biomédicos, o desenvolvimento de superfícies que permitam a interação com células tumorais e o controle da adesão celular é, sem dúvidas, um grande desafio na Ciência dos Materiais. A técnica layer-by-layer (LbL) se destaca nesse contexto como uma ferramenta eficiente de funcionalização de superfícies, em virtude do controle rigoroso sobre a funcionalidade, composição e propriedades dos materiais que produz. Neste estudo, foram desenvolvidos filmes LbL compostos de quitosana (CHI) e ácido hialurônico (HA) a fim de capturar CTCs, explorando a interação específica HA-CD44. O CD44 é uma glicoproteína extracelular envolvida em múltiplos processos celulares, entre eles a adesão celular, tendo como seu principal ligante o HA. Aqui, foi investigada a influência de propriedades físico-químicas de filmes HA/CHI, controladas pelas condições de montagem (pH e força iônica das soluções poliméricas, grau de desacetilação da quitosana e número de bicamadas depositadas), nos seus potenciais de captura de células tumorais prostáticas (linhagem PC3). Sugere-se que superfícies menos rugosas, com menor mobilidade de carga e com concentrações médias a baixas de HA induzem a adesão de células tumorais. Também foi investigada a funcionalização dos filmes HA/CHI com aglutinina de gérmen de trigo (WGA) e quitosana sulfatada (ChiS), que se mostraram estratégias eficazes para, respectivamente, aumentar o potencial de interação célula-substrato e conferir propriedades antitrombogênicas aos filmes. Além disso, eletrodos interdigitados foram recobertos com multicamadas de HA/CHI, apresentando significativa capacidade de detecção de células tumorais a partir de medidas de impedância elétrica, validada pelo uso de mapas de visualização. Em suma, este estudo destaca os filmes HA/CHI como plataformas promissoras para a captura de CTCs, apontando seu uso em aplicações diversas, tais como sensoriamento, mecanismos rápidos de diagnóstico e cascatas de sinalização celular Abstract: Prostate cancer is a silent neoplasm that has higher chances of cure if detected in early stages. Thus, it is necessary to develop methods for the detection of circulating tumor cells (CTCs), and also to improve the prognostic markers of prostate cancer in order to reduce its increasing mortality rate among men. For biomedical purposes, the development of surfaces that provide the interaction with tumor cells, and the control of cell adhesion is a major challenge in materials science. In this scenario, the Layer-by-layer (LbL) technique stands out as a promising method for surface functionalization, due to its precise control over the materials functionality, composition and properties. In this study, LbL films based on chitosan (CHI) and hyaluronan (HA) were developed aiming to capture CTCs, exploring the specific interaction HA-CD44. CD44 is an extracellular glycoprotein involved in multiple cellular processes, including cell adhesion, and has a specific binding domain for HA. This study explores different film assembly conditions (pH and ionic strength of the polymeric solutions, chitosan degree of deacetylation, and number of deposited bilayers) of the polyelectrolyte solutions, as well as both substrate and cell surface modifications, to investigate PC3 cells adhesion properties. In summary, it is suggested that smoother surfaces with lower charge mobility, and containing low to medium concentrations of HA induce the tumor cell adhesion. The conjugation of wheat germ agglutinin (WGA) and sulfated chitosan (ChiS) on the film surface was also investigated, which proved to be a suitable strategy to boost the PC3 cell adhesion and confer anti-thrombogenic properties, respectively. In addition, interdigitated electrodes functionalized with HA/CHI presented a significant analytical performance for cell detection via impedance spectroscopy measurements, validated by visualization maps. This study highlights HA/CHI films as promising platforms able to pave the road for the development of surfaces suitable for rapid diagnostic, cell signaling and biosensing mechanisms Doutorado Engenharia Química Doutor em Engenharia Química FAPESP 2016/19976-6 CNPQ 147536/2016-2

Orientador: Rosiane Lopes da Cunha Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Estruturas emulsionadas e gelificadas são amplamente utilizadas como sistemas encapsulantes devido à alta eficiência de encapsulação, sendo interessante para a veiculação e liberação sustentada de compostos de interesse. Partículas de celulose surgiram como promissores estabilizadores para emulsões de Pickering nas indústrias alimentícia, farmacêutica e de cosméticos. Na primeira parte, foi realizado o estudo do efeito das condições dos processos mecânicos nas propriedades das partículas de celulose, a proporção de partículas de cristais de celulose:óleo nas propriedades das emulsões e o efeito do processo de ultrassom nas emulsões estabilizadas com cristais de celulose. Após a preparação da emulsão, as gotículas de óleo de linhaça foram envolvidas pelos cristais menores, corroborando que os cristais de celulose podem inicialmente estabilizar as interfaces óleo-água pelo mecanismo Pickering. O efeito da proporção entre a concentração de partículas de celulose e o óleo nas propriedades da emulsão foi muito importante. Uma quantidade excessiva de partículas de celulose foi associada ao fenômeno de floculação em ponte. A alta quantidade de cristais de celulose com tamanho maiores contribuiu para formar uma rede viscoelástica que teve importante papel na estabilidade das emulsões. O processo de ultrassom ajudou a melhorar a estabilidade das emulsões, pois estas apresentaram maior estabilidade cinética, menor tamanho de gotículas e maior viscosidade. Na segunda parte, foi realizado o estudo do ultrassom associado à filtração a vácuo que permitiu a produção de partículas de celulose com distribuição monomodal em escala nanométrica, o que apresentou algumas vantagens para a estabilização da emulsão. Os nanocristais de celulose não contribuíram para a redução da tensão interfacial entre a água e o óleo de linhaça. Cristais menores cobriram as gotas de óleo de linhaça, sendo o efeito da proporção entre a concentração de partículas de celulose e o óleo de linhaça relevante mais uma vez para a estabilização das emulsões. Emulsões com menor concentração de nanocristais de celulose apresentaram melhor estabilidade cinética em comparação com emulsões com maior concentração de nanocristais de celulose. O processo de ultrassom melhorou a estabilidade das emulsões, que apresentaram maior estabilidade cinética, com distribuição monomodal do tamanho das gotículas e viscosidade da emulsão ligeiramente mais alta. Na última parte, usamos dispositivos microfluidicos capilares de vidro para a fabricação de microgéis de alginato e microgéis de alginato com núcleo emulsificado (O/A), através de gelificação interna. As microgotas de óleo, que foram o núcleo dos microgéis de alginato, foram estabilizadas utilizando alginato, nanocristais de celulose e carbonato de cálcio ultrafino (CaCO3) na fase aquosa. Através do estudo de vazões foi possível observar diferentes regimes de formação de gota, tais como: gotejamento, jateamento e squeezing. Os microgéis de alginato e microgéis de alginato com núcleo emulsificado (O/A) apresentaram forma esférica e uniforme e uma distribuição de tamanho altamente monodispersa. A viscosidade da fase dispersa e as vazões das fases contínua e dispersa foram as variáveis que mais influenciaram no tamanho das partículas. Tamanhos menores de gotículas que mostraram maior monodispersidade foram obtidos com a maior vazão de fase contínua e menor vazão de fase dispersa. Os resultados mostraram a viabilidade técnica de processos microfluidicos para a produção de microgéis com núcleo aquoso e emulsificado (O/A), com base em um polímero biocompatível e biodegradável. Estas estruturas podem ser exploradas como partículas modelo para encapsular compostos lipofílicos para aplicação na área de alimentos, cosméticos e fármacos Abstract: Emulsified and gelled structures are widely used as encapsulating systems due to the high encapsulation efficiency, being interesting for delivery and sustained release of target compounds. Cellulose particles have emerged as promising stabilizers for Pickering emulsions in the food, pharmaceutical and cosmetics industries. First, the effect of mechanical process conditions on the properties of cellulose particles, the proportion of particles of cellulose crystals: oil on the properties of emulsions and the effect of the ultrasound process on emulsions stabilized with cellulose crystals were studied. After preparing the emulsion, the flaxseed oil droplets were involved by the smaller crystals, corroborating that the cellulose crystals can initially stabilize the oil-water interfaces by the Pickering mechanism. The effect of the proportion between the concentration of cellulose particles and the oil on the properties of the emulsion is very important. An excessive amount of cellulose particles has been associated with the phenomenon of bridging flocculation. The high amount of cellulose crystals with larger size contributed to form a viscoelastic network that had an important role in the stability of the emulsions. The ultrasound process helped to improve the stability of the emulsions, as they showed greater kinetic stability, smaller droplet size and higher viscosity. Second, the ultrasound associated with vacuum filtration allowed the production of cellulose particles with monomodal distribution on a nanometric scale, which presented some advantages for the stabilization of the emulsion. Cellulose nanocrystals did not contribute to reducing the interfacial tension between water and flaxseed oil. Smaller crystals covered the drops of flaxseed oil, the effect of the proportion between the concentration of cellulose particles and flaxseed oil being relevant again for the stabilization of the emulsions. Emulsions with a lower concentration of cellulose nanocrystals showed better kinetic stability compared to emulsions with a higher concentration of cellulose nanocrystals. The ultrasound process improved the stability of the emulsions, which showed greater kinetic stability, with a monomodal distribution of droplet size and slightly higher emulsion viscosity. In the last part, we use glass capillary microfluidic devices for the manufacture of alginate microgels and alginate microgels with an emulsified core (O/W), through internal gelation. The oil microdroplets, which were the nucleus of alginate microgels, were stabilized using alginate, cellulose nanocrystals and ultrafine calcium carbonate in the aqueous phase. Through the study of flow rates, it was possible to observe different regimes of drop formation, such as dripping, jetting and squeezing. The alginate microgels and alginate microgels with an emulsified core (O / W) showed spherical and uniform shape and a highly monodisperse size distribution. The viscosity of the dispersed phase and the flow rates of the continuous and dispersed phases were the variables that most influenced the particle size. Smaller droplet sizes that showed greater monodispersity were obtained with the highest flow of continuous phase and the lowest flow rate of dispersed phase. The results showed the technical viability of microfluidic processes for the production of microgels with an aqueous and emulsified core (O/W), based on a biocompatible and biodegradable polymer. These structures can be used as model particles to encapsulate lipophilic compounds for application in food, cosmetics and drugs industries Doutorado Engenharia de Alimentos Doutor em Engenharia de Alimentos CAPES 001 CNPQ FINEP

Orientador: Lucimara Gaziola de La Torre Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Carreadores não-virais, especialmente os baseados em lipídeos, têm sido bastante utilizados como sistemas de liberação sustentada de genes e fármacos para o tratamento de doenças no âmbito das terapias medicamentosa e gênica. Dentre os métodos de obtenção, o campo da microfluídica viabiliza a produção de sistemas nanoparticulados uniformes e em processos reprodutíveis. Nesse contexto, esse trabalho visou desenvolver processos microfluídicos para a produção de micro e nanocarreadores lipídicos, compreendendo lipossomas catiônicos funcionalizados com polietilenoglicol (PEG) (stealth) e, ainda, microbolhas revestidas por lipídeos. Na primeira etapa desse projeto, por meio de dispositivos microfluídicos baseados em focalização hidrodinâmica, verificou-se que o aumento da força iônica levou à alteração do mecanismo de auto-agregação lipídica, evitando a formação de micelas e promovendo a síntese de lipossomas catiônicos stealth (SCL) (contendo 1% de lipídeo DSPE-PEG2000) monodispersos. Condições de elevada força iônica resultaram na formação de SCL com diâmetro médio em torno de 140 nm e índice de polidispersidade (PDI) abaixo de 0,2. Os SCL foram caracterizados através das técnicas de espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) e criomicroscopia eletrônica de transmissão (cryo-TEM), indicando a formação de SCL multilamelares concomitantemente ao aumento da força iônica. Por fim, estudou-se a complexação destes nanocarreadores lipídicos com material genético (DNA plasmidial) e avaliou-se a capacidade de entrega gênica a partir da transfecção em células de câncer de próstata (PC3) e em células normais do epitélio da próstata (PNT2). Na segunda etapa desse trabalho, diferentes dispositivos microfluídicos foram estudados para formação de microbolhas estabilizadas por lipídeos. Investigou-se a influência dos parâmetros de processo para otimização da produção de microbolhas monodisperas, visando futuras aplicações como agentes de contraste para imagem ultrassônica ou como vetores de liberação gênica. Assim, este estudo contribuiu para a fundamentação fenomenológica e para o desenvolvimento de processos microfluídicos para síntese de carreadores lipídicos. Esta tecnologia destaca-se como ferramenta promissora para diversas aplicações na área da nanomedicina Abstract: Non-viral carriers, especially lipid-based ones, have been used as sustained drug and gene delivery systems for the treatment of diseases in the fields of drug and gene therapy. Among the production methods, microfluidic platforms allow the synthesis of nanoparticulate systems with uniform properties in reproducible processes. In this context, this work aimed at developing microfluidic processes for production of lipid-based micro and nanocarriers, regarding cationic liposomes functionalized with poly(ethylene glycol) (PEG) (stealth) and lipid-coated microbubbles. In the first phase of this project, through microfluidic devices based on hydrodynamic focusing, we discovered that the increase in ionic strength leads to the modulation of lipid self-assembly mechanism, preventing micelle formation and promoting the synthesis of monodisperse stealth cationic liposomes (SCL) (with 1% of DSPE-PEG2000 lipid). High ionic strength conditions resulted in SCL with mean diameter of 140 nm and polydispersity index (PDI) lower than 0.2. The SCL were further characterized by small-angle X-ray scattering (SAXS) and transmission electron cryomicroscopy (cryo-TEM) techniques, indicating the formation of multilamellar SCL concomitantly to the increase in ionic strength. Finally, we studied the complexation of these lipid nanocarriers with genetic material (plasmidial DNA) and we assessed their gene delivery ability in terms of transfection efficiency in prostate cancer cells (PC3) and normal prostate epithelium cells (PNT2). In the second stage of this project, different microfluidic devices were studied for the formation of monodisperse lipid-stabilized microbubbles. We investigated the influence of process parameters for the optimization of monodisperse microbubbles production, aiming at future applications as ultrasound contrast agents and as gene delivery vectors. Thus, this study contributed to the phenomenological understanding and to the development of microfluidic processes for synthesis of lipid carriers. This technology stands out as a promising tool for different applications in the field of nanomedicine Doutorado Engenharia Química Doutora em Engenharia Química FAPESP 2017/08636-2; 2018/05278-0 CAPES 001

Orientadores: Lucimara Gaziola de la Torre, Marcelo Bispo de Jesus Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Este trabalho teve como objetivo o estudo da síntese de nanopartículas de Poli(?-amino éster) (PBAE) e DNA para futuras aplicações em terapia gênica. Nesta pesquisa, foi sintetizado o PBAE 557 com massa molar média de 3 kDa. A produção das nanopartículas foi realizada através da complexação eletrostática entre o PBAE e DNA em método convencional bulk (escala laboratorial) e também em microfluídica. Para isso, a metodologia bulk foi padronizada quanto à ordem de adição dos reagentes, tipo de mistura, tipo de pipetagem para adição dos componentes, razão mássica entre PBAE e DNA, tempo de complexação e crioprotetor para liofilização. Na microfluídica, foram exploradas configurações de processo e tratamento de superfície do dispositivo a fim de minimizar os efeitos de precipitação. A partir da configuração com uma corrente de água central, uma corrente lateral de DNA e a outra de PBAE, foi investigada a influência do método de mistura nas propriedades das nanopartículas através de dispositivos que possuem a difusão como controladora do processo ou a advecção caótica. Para nanopartículas de PBAE/DNA, concluiu-se que a mistura deve ocorrer de forma lenta e ordenada, em que prevalece a difusão. Além disso, uma geometria simples que apresenta pequeno tempo de residência e baixo índice de mistura é suficiente para organizar as moléculas inicialmente antes da mistura se completar em bulk, gerando nanopartículas com boas características físico-químicas e biológicas. O estudo do impacto das variáveis operacionais, como velocidade de escoamento e proporção entre as correntes comprovou que a síntese das nanopartículas deve se processar de forma lenta e evitando o contato direto entre os reagentes, o que foi verificado através da obtenção do diâmetro, índice de polidispersidade e potencial zeta das nanopartículas e sua eficiência de transfecção em células PC3 (câncer de próstata) e PNT2 (células normais do epitélio da próstata). Sendo assim, este trabalho contribui para o entendimento da forma de associação eletrostática entre PBAE e DNA, apresentando variáveis importantes na síntese, que podem ser adaptadas visando à melhoria do vetor para terapia gênica Abstract: This research focused on the study of the synthesis of Poly(?-amino ester) (PBAE) and DNA nanoparticles for future applications in gene therapy. In this work, PBAE 557 with an average molecular weight of 3 kDa was synthesized. Nanoparticles were produced through electrostatic complexation between PBAE and DNA by bulk method and microfluidics. Bulk methodology was standardized regarding sequence of reagents addition, type of mixing, type of pipetting of components, mass ratio between PBAE and DNA, time of complexation and crioprotector for lyophilization. In microfluidic devices, process configurations and surface treatment were explored aiming to minimize precipitation effects. Using an aqueous central stream, a PBAE side stream and a DNA side stream, the influence of mixing conditions in nanoparticles properties was investigated through diffusion based devices and chaotic advection based device. It was found that for PBAE/DNA nanoparticles synthesis, mixing should preferably occur slowly and in an ordered way, in which diffusion controls the process. Furthermore, a simple device geometry, which presents low residence time and low mixing index is enough to previously organize molecules before the mixing is completed in bulk, generating nanoparticles with good physicochemical and biological characteristics. The study of the impact of operational variables, such as flow velocity and flow rate ratio, proved that nanoparticles synthesis should take place under slow conditions and avoiding direct contact between reagents, what was verified by nanoparticles diameter, polydispersity, zeta potential and transfection efficiency in PC3 cells (prostate cancer) and PNT2 cells (prostate normal epithelium cells). Therefore, this research contributes to the understanding of electrostatic association between PBAE and DNA, showing important features for synthesis, which can be adapted to create better gene therapy vectors Mestrado Engenharia Química Mestra em Engenharia Química CAPES 33003017034P8

Orientador: Maria Teresa Moreira Rodrigues Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: O processo de síntese de amônia completou 100 anos em 2013. Esta foi uma das maiores invenções do século XX. Além disso, este processo possui uma elevada gama de temperaturas e pressões, indo de 1 atm a 300 atm e de 200 K até 800 K (na qual a reação pode ocorrer). A produção de amônia acontece em reatores de 150 a 300 atm e de 600 a 810 K, com 30 % de conversão por passe, pois a reação é altamente exotérmica. Mais ainda, a amônia é um gás polar e hidrogênio é um gás quântico nessas condições. Logo, a predição de composição, temperatura e de pressão dentro de reatores de amônia usando modelos apropriados se faz importante. Muitas leis de reação foram propostas. Porém, muitas dessas expressões usavam atividade química sem computar interações entre os componentes. Dessa forma, a modelagem de reatores de amônia utilizando um modelo termodinâmico rigoroso foi proposta neste trabalho. As expressões de Peng e Robinson e de Soave Redlich Kwong foram usadas na taxa de reação proposta por Singh e Saraf. Dois modos de operação foram modelados: adiabático (no qual a reação não troca calor com a vizinhança) e autotérmico (operando não isotermicamente). A atividade catalítica foi ajustada a modelagem por equações de estado. Os dois modelos de reatores foram comparados com dados de planta reais e apresentaram boa concordância. O modelo adiabático apresentou um erro máximo relativo de 1.6 % com a temperatura e de 11.4 % com a conversão. Por outro lado, o modelo autotérmico teve um erro máximo de 2.7 % com a temperatura. Posteriormente uma análise de sensitividade foi realizada em variáveis de entrada de ambos os modelos. A operação adiabática se mostrou mais sensível à variação de pressão e temperatura, enquanto a autotérmica apresentou maiores conversões e melhor remoção de energia. Na parte final, uma estimativa de propriedades na camada limite mássica foi realizada. Os valores de difusão mássica foram pequenos devido à elevada pressão, contudo a resistência externa à transferência de massa se mostrou significativa. Mesmo assim, a maior resistência no reator de síntese de amônia é interna a partícula catalítica Abstract: Ammonia synthesis process completed 100 years in 2013. It was one of the most important inventions in 20th century. Moreover, the process has a variety of temperatures and pressures, going from 1 atm to 300 atm, and from 200 K to 810 K. The ammonia production takes place in reactors from 150 to 300 atm and 600 to 800 K with 30 % of conversion, because it is highly exothermic. Besides, ammonia is a polar gas and hydrogen is a quantic gas in these conditions. Therefore, the prediction of composition, temperature and pressure inside ammonia converters using appropriate models is important. Furthermore, many reaction rates were proposed for ammonia synthesis. However, most of the expressions used chemical activity without computing compositional interactions between components. So, the modeling of reactors using a rigorous thermodynamic model was proposed. The Peng Robinson and Soave Redlich Kwong expressions were used in Singh and Saraf rate expression. Two modes of operations were modeled: adiabatic (which reaction releases heat without removal) and autothermal (non isothermal operation). The catalyst activity was fitted to EoS modeling. Both models were validated with plant data and they presented good reliability. The adiabatic model presented maximum error of 1.6 % with temperature and 11.4 % with conversion. On the other hand, autothermal model presented maximum error of 2.7 % with temperature. Moreover, the sensitivity analysis of input variables was proposed in both models. The adiabatic operation showed more sensitive to inlet pressure and temperature variations, while the autothermal reactor presented higher conversions and better energy removal. In final part, the estimation of properties in mass boundary layer were made. The values of mass diffusion were low due to high pressure and external resistance was significant. However, when it was compared to internal resistance, the resistance computed by effectiveness factor was dominant in ammonia synthesis reactor Mestrado Sistemas de Processos Químicos e Informática Mestre em Engenharia Química CNPQ 131744/2016-0

Orientador: Rosiane Lopes da Cunha Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Os sistemas a base de lipídios destacam-se entre os sistemas para nanoencapsulação, principalmente devido a sua facilidade de produção e possibilidade de utilização de materiais e ingredientes seguros para aplicação em produtos alimentícios. Os métodos mais comuns de obtenção destas nanoestruturas em geral empregam grandes quantidades de energia, sendo cada vez mais interessante a utilização de métodos mais fáceis, rápidos e de menores custos operacionais e energéticos. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a produção de diferentes nanoestruturas lipídicas, como nanoemulsões, nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores lipídicos nanoestruturados via dois processos de baixa demanda energética: deslocamento de solvente (etanol) e processo microfluídico. Inicialmente, foram produzidas nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores lipídicos nanoestruturados utilizando-se tristearina e óleo de girassol alto oleico através do método de deslocamento de solvente, estabilizadas por surfactante Tween 80. As nanopartículas apresentaram um tamanho médio de 500 nanômetros e índices de polidispersidade entre 0,3 e 0,5. Foi possível observar o efeito positivo da adição de um óleo líquido na matriz sólida da nanopartícula, principalmente na sua capacidade de incorporar e proteger moléculas de ?-caroteno contra oxidação, apesar do óleo não alterar as características principais da nanopartícula, como tamanho e morfologia. Numa etapa seguinte, foi avaliada a capacidade de proteínas do leite, caseinato de sódio e lactoferrina, serem utilizadas como emulsificantes na estabilização de nanopartículas lipídicas sólidas, também produzidas pelo método de deslocamento de solvente. Estas proteínas se mostraram bons emulsificantes para as nanoestruturas, gerando partículas menores em relação àquelas com Tween 80, com tamanhos de partícula variando entre 100 e 400 nanômetros, e com maior capacidade de proteção e incorporação de beta-caroteno, provavelmente devido a interações hidrofóbicas destas proteínas com os lipídios e a modificação da estrutura cristalina dos mesmos. Por fim, foi avaliada a viabilidade de se obter nanoemulsões do tipo óleo/água utilizando-se óleo de girassol alto oleico via processos microfluídicos em duas diferentes configurações de dispositivos: um microcanal fabricado em polímero polidimetilssiloxano e uma configuração de microcanal produzida por capilares de vidro concêntricos, com geometrias e fluidodinâmicas distintas entre si. Ambos os dispositivos foram capazes de obter as nanogotas em diferentes condições de operação, com tamanhos de gotas variando entre 70 e 800 nanômetros, com o processo de formação das gotas sendo similarmente afetado por estas condições nos dois microcanais. Numa mesma condição de processo, no entanto, os microcanais fabricados em polidimetilssiloxano obtiveram menores tamanhos de gota, sugerindo um controle mais preciso do processo difusivo em comparação ao dispositivo em vidro, onde predominou a mistura entre os processos difusivos e convectivos de mistura. Foi destacado no processo microfluídico a capacidade de produzir sistemas com polidispersidade extremamente baixa, com valores inferiores a 0,2 na maioria dos tratamentos, justificando a utilização desta metodologia como tecnologia emergente na obtenção de nanoestruturas lipídicas. Desta forma, este trabalho destaca a facilidade e a eficácia dos processos de deslocamento de solvente e microfluídico aqui estudados em se obter diferentes nanoestruturas lipídicas utilizando baixas demandas energéticas para a produção de sistemas estáveis com baixa polidispersidade e boa eficiência na proteção de compostos bioativos, para veiculação em produtos alimentícios Abstract: Lipid-based systems stand out among nanoencapsulation systems mainly because of their ease of production and the possibility of using safe materials and ingredients for application in food products. The most common methods of obtaining these nanostructures generally employ large amounts of energy. Because of that, the use of easier, faster and with low energy and operating costs methods is becoming increasingly interesting. Thus, the objective of this work was the production of different lipid nanostructures, such as nanoemulsions, solid lipid nanoparticles and lipid carriers nanostructured through two processes of low energy demand: the solvent displacement and the microfluidic technique. Initially, solid lipid nanoparticles and nanostructured lipid carriers were produced using tristearin and high oleic sunflower oil through the solvent displacement method, stabilized by the surfactant Tween 80. Ethanol was used as solvent. Nanoparticles presented an average size of 500 nanometers and polydispersity index between 0.3 and 0.5. It was possible to observe the positive effect of the addition of a liquid oil in the solid matrix of the nanoparticle, mainly in its ability to incorporate and protect ?-carotene molecules against oxidation, although the oil does not alter the main characteristics of the nanoparticle, such as size and morphology. In a next step, the capacity of milk proteins, sodium caseinate and lactoferrin, were evaluated as emulsifiers in the stabilization of solid lipid nanoparticles. These proteins proved to be good emulsifiers for the nanostructures, generating particles smaller than those with Tween 80, with particles size ranging from 100 to 400 nanometers, and with greater capacity of protection and incorporation of beta-carotene, probably due to hydrophobic interactions of these proteins with the lipids and the modification of the crystalline structure of the same ones. Finally, the feasibility of obtaining oil/water nanoemulsions using high oleic sunflower oil by microfluidic processes in two different device configurations was evaluated: a microchannel made of polydimethylsiloxane polymer and a microchannel configuration produced by glass capillaries concentric geometries, with different geometries and fluid dynamics between them. Both devices were able to obtain the nanodroplets under different operating conditions, with nanodroplets size ranging from 70 to 800 nanometers, and the droplet formation process was similarly affected in the two microchannels. In a same operating condition, however, the microchannels manufactured in polydimethylsiloxane generated smaller droplet sizes, suggesting a more rigid control of the diffusive process in comparison to the glass device, where a combination between diffusive and convective mixing processes prevailed. It was highlighted in the microfluidic process the ability to produce systems with extremely low polydispersity, with polydispersity index values lower than 0.2 in most treatments, justifying the use of this methodology as emerging technology in obtaining lipid nanostructures. In this way, this work highlights the ease and effectiveness of the solvent displacement and microfluidic techniques in obtaining different lipid nanostructures using low energy demands, for the production of stable systems with low polydispersity and good efficiency in the protection of bioactive compounds, aiming an application in food products Doutorado Engenharia de Alimentos Doutor em Engenharia de Alimentos CNPQ 140270/2014-0

Orientadores: Osvaldir Pereira Taranto, Harrson Silva Santana Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: A microplanta química realiza o aumento da produção pela paralelização de micro/milirreatores. O escalonamento está diretamente relacionado com a distribuição uniforme de fluxo através dos micro/milirreatores, feita pelo distribuidor de vazão. Sendo que uma má distribuição, causada por designs inadequados de distribuidores, reduz a performance da microplanta. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi aplicar impressoras 3D e simulações numéricas no desenvolvimento de distribuidores de vazão e projetar e fabricar uma estrutura de suporte e milirreatores para o escalonamento da síntese de biodiesel. Além de obter dados sobre escoamento, uniformidade de fluxo e rendimento reacional através de ensaios experimentais e computacionais. A metodologia consistiu do design dos distribuidores, da estrutura de suporte e dos milirreatores; da fabricação das peças em impressora 3D; e dos testes experimentais e computacionais de vazão e reação. Nas simulações numéricas, foram utilizadas duas abordagens: escoamento multicomponente (MF) e volume de fluido (VOF). Inicialmente, foram testados nove distribuidores de fluxo, divididos em distribuidor retangular (RD), distribuidor cônico com obstáculo (DCO) e distribuidor cônico sem obstáculo (DCS). Os valores do coeficiente de fluxo de não uniformidade (?) foram obtidos para cada distribuidor em testes com água. O design do distribuidor influenciou na uniformidade de fluxo e os distribuidores DCO com 13 mm de altura (DCO13), o DCO com 52 mm de altura (DCO52) e DCS com 26 mm de altura (DCS26) apresentaram melhor desempenho atingindo ? abaixo de 1%. Nas simulações com água, o VOF foi o mais adequado para representar o escoamento. Os distribuidores DCO13, DCO52 e DCS26 foram testados experimental e computacionalmente para os ensaios com etanol, óleo de girassol e a mistura. De forma geral, as abordagens computacionais não se mostraram adequadas na representação dos dados experimentais. O DCS26 e DCO52 apresentaram melhor desempenho (? < 1%) para o escoamento de etanol e óleo de girassol, respectivamente. Para a mistura foram obtidos altos valores de ? e também foi observada a ocorrência de reação no distribuidor. Portanto, o escalonamento foi realizando utilizando a configuração com dois distribuidores (DCS26 e DCO52). No escalonamento, as tubulações utilizadas para o óleo e para o etanol seguiram a razão L/D (comprimento pelo diâmetro) de 39 e de 113, respectivamente, que ofereceram menor perda de carga. O desvio na uniformidade de fluxo obtido para a microplanta foi de 4,2% e o rendimento reacional global foi de 42%. Biodiesel foi produzido a uma taxa de 126,4 mL min-1. Conclui-se que a microplanta desenvolvida utiliza estratégias eficientes para o escalonamento da produção de biodiesel Abstract: Micro-chemical plants are chemical plants that use micrometrics structures using the numbering-up of microdevices. The flow uniformity distribution through these microdevices are made by the flow distributor. Inadequate designs reduce the micro-chemical plant performance. The present research aims to perform the 3D printing and numerical simulations of flow distributor designs and manufacture a support structure and millireactors for numbering-up of biodiesel synthesis. Also, evaluate the flow uniformity and the reaction yield obtained from experimental and numerical tests. The methodology consists of distributor, support structure and millireactor designs; 3D printing; and experimental tests and numerical simulations of flow and biodiesel synthesis. In the numerical simulations, two approaches were used: single-phase flow and volume of fluid (VOF). Initially, nine flow distributors divided into rectangular distributor (RD), conical distributor with obstacle (CDO) and conical distributor without obstacle (CD) were tested with water flow. The non-uniformity flow coefficient values (?) were obtained for each distributor. The distributor design influenced flow uniformity and DCO with 13 mm height (DCO13), DCO with 52 mm height (DCO52) and DCS with 26 mm height (DCS26) had a better performance, reaching ? below 1%. The VOF was the most adequate to represent the distributors flow. The DCO13, DCO52 and DCS26 distributors were numerically and experimentally tested for ethanol, sunflower oil and mixture. In general, the numerical approaches were not adequate in representation of experimental data. DCS26 and DCO52 presented best performance (?

Orientador: Lucimara Gaziola de la Torre Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Este trabalho teve como foco o desenvolvimento de nanopartículas baseadas em peptídeos e a avaliação de sua complexação com DNA modelo em sistemas microfluídicos. A primeira fase deste trabalho teve como objetivo averiguar a viabilidade tecnológica de sistemas microfluídicos baseados em dispositivo de focalização hidrodinâmica para a polimerização em fluxo contínuo de arginina (Arg) na presença do agente de acoplamento diisopropilcarbodiimida (DIC) e o catalisador hidroxisuccinimida (NHS), para aplicação em nanotecnologia. Para determinar a melhor configuração do processo de síntese, avaliou-se a influência de diferentes razões molares Arg/DIC (RArg/DIC), temperatura, pH e tempo de residência. A reação mostrou-se viável para RArg/DIC de 0,25 em pH de 9,55, tempo de residência de 1,8s e processadas a 70ºC. Análises qualitativas de espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios-x (XPS) e espectrometria do infravermelho com transformada de fourier (FT-IR) indicaram a presença de ligações na região Amida II que são responsáveis pela síntese de peptídeos. Na segunda fase do trabalho investigou-se a síntese de nanopartículas baseadas em polipeptídeos, formando complexos polilisina (PLL)/DNA e PLL/ácido poliglutâmico (PGA). Desta forma, este trabalho demonstra a potencialidade de síntese de peptídeos, a formação de suas respectivas nanopartículas e a formação de complexos com DNA em sistemas microfluídicos, com possibilidade de aplicações no campo da nanomedicina Abstract: This work focused on the development of peptide-based nanoparticles and the evaluation of their complexation with a model DNA in microfluidic systems. The first step of this work consisted on the technological development of microfluidic systems based on the hydrodynamic flow focusing technique for the synthesis of peptide-based nanoparticles through the continuous flow polymerization of arginine (Arg) in the presence of diisopropylcarbodiimide (DIC) cross-linking agent and hydroxysuccinimide (NHS) catalyst, aiming applications in nanotechnology. In order to determine the best configuration of the synthesis process, the effects of different Arg/DIC molar ratios (RArg/DIC), temperature, pH and residence time. Feasible reactions were observed under the process conditions of RArg/DIC of 0.25, pH of 9.55, 1.8s of residence time and process temperature of 70 ºC. Qualitative analyses of X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and Fourier transform infrared spectrometry (FT-IR) indicated the presence of amide II bonds that are responsible for the synthesis of peptides. In the second phase of this work, we investigated the synthesis of nanoparticles based on polypeptides, more precisely forming complexes between polylysine (PLL)/DNA and PLL/ poly glutamic acid (PGA).Thus, this work demonstrates the potentiality of peptide synthesis, peptide-based nanoparticles formation and formation of complexes with DNA in microfluidic systems, for applications in the field of nanomedicine Mestrado Engenharia Química Mestra em Engenharia Química CNPQ 161235/2015-8 CNPEM

Orientador: Liliane Maria Ferrareso Lona Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: De todos os insetos transmissores de doenças, os mosquitos representam a maior ameaça, pois são capazes de transmitir doenças como malária, febre amarela e dengue. Mesmo que a principal forma de combate à proliferação dessas doenças seja o controle da população de vetores, o uso de repelentes de insetos ainda é fundamental. Embora algumas substâncias repelentes possam ser aplicadas na pele sob a forma de loções, o seu uso é restrito, já que a sua aplicação em bebê não é recomendada. Além disso, o tempo de proteção fornecido por essas substâncias é limitado pela rápida evaporação desses compostos. Assim, a encapsulação dessas substâncias e o seu uso como repelentes ambientais em tintas ou em impregnação de tecidos surge como uma alternativa promissora. A encapsulação pode ser realizada por muitas técnicas, mas a polimerização em miniemulsão é uma técnica simples que permite a formação de partículas poliméricas de dimensões controladas e, sob determinadas condições, possibilita a encapsulação de substâncias. A polimerização em miniemulsão requer uma substância coestabilizadora para minimizar a degradação difusional do sistema coloidal. Existem muitos trabalhos na literatura que evidenciam a eficiência de coestabilizadores como o hexadecano e óleos vegetais, mas até o presente momento não foram encontrados trabalhos que avaliem a eficiência do N,N-dietil-meta-toluamida (DEET) e do óleo de citronela, os quais apresentam propriedades características de um bom coestabilizador, como alta hidrofobicidade. A utilização dessas substâncias como coestabilizadores na formulação da miniemulsão garantiria não somente a minimização da degradação difusional, mas também uma aplicação adicional devido a sua atividade repelente. Portanto, no presente trabalho, propôs-se o estudo da encapsulação do DEET e do óleo de citronela e o desenvolvimento de um sistema termorresponsivo para a liberação sustentada desses ativos encapsulados. Na primeira etapa, buscou-se determinar uma composição de monômeros cuja polimerização resultasse em um copolímero com uma temperatura de transição vítrea (Tg) adequada. Nessa etapa, também se avaliou a influência dessa composição na cinética de copolimerização, massa molar e composição da cadeia polimérica. Na segunda etapa, estudou-se a encapsulação do DEET e do óleo de citronela e a influência desses compostos na cinética de copolimerização, massa molar, Tg, estabilidade coloidal e morfologia das nanopartículas. Concluiu-se que o óleo de citronela não foi um coestabilizador eficiente e que as nanopartículas sintetizadas com o DEET apresentaram a estrutura de nanoesferas ou matrizes poliméricas. Também foi evidenciada a melhora na estabilidade térmica do DEET aprisionado na matriz polimérica. Na terceira etapa do trabalho, a liberação do DEET aprisionado foi estudada. Os filmes poliméricos preparados foram capazes de manter taxas adequadas de liberação por pelo menos nove horas. Os dados de liberação foram ajustados a dois modelos matemáticos e se concluiu que a transferência de massa do DEET para o ar ocorre principalmente por dois mecanismos: difusão fickiana e transporte relaxacional, os quais dependem, entre outros aspectos, da Tg e temperatura de liberação Abstract: Among all disease transmitting insects, mosquitoes represent the major threat since they can transmit maladies like malaria, yellow and dengue fever. Even though the main way of combating the spreading of these diseases is the control of the vectors population, the use of repellents is fundamental. Although some repellents can be used topically applied, its application is restricted and not recommended for babies. Moreover, the protection time of such repellents is limited to their fast evaporation. Therefore, the encapsulation of these substances and their use in the formulation of paints or in the impregnation of fabrics rise as a promising alternative. The encapsulation of substances can be achieved with a large number of techniques, but the miniemulsion polymerization is a simple technique which allows the formation of polymer particles with controlled dimensions and, under certain circumstances, encapsulate substances. The formulation of this technique requires a substance called costabilizer, which is responsible for the minimization of the diffusional degradation. There are many works in the literature that show the efficiency of costabilizers like hexadecane and vegetable oils, but until the present time, no works were found regarding the efficiency of N,N-diethyl-meta-toluamide (DEET) and citronella oil, which possess some characteristic properties, like high hydrophobicity, of good costabilizers. The use of such substances as costabilizers in the miniemulsion formulation would ensure not only the minimization of the Ostwald ripening, but would also grant an additional application due to their repellent activity. Thus, in the presented work, it was proposed the study of the encapsulation of DEET and citronella oil and the development of a thermo-responsive system suitable for the sustained release of these encapsulated actives. In the first stage of the presented work, a monomer composition, which would ensure the synthesis of a copolymer with a suitable glass transition temperature (Tg), was determined. Also, in this stage, the influence of this composition on the polymerization kinetics, polymer molar mass and polymer chain composition was evaluated. In the second stage of the work, it was studied the encapsulation of DEET and citronella oil and the influence of these substances on the polymerization kinetics, polymer molar mass, Tg, colloid stability and nanoparticle morphology. It was concluded that citronella oil is not an efficient costabilizer and that the structure of nanoparticles synthesized with DEET was of nanospheres or polymer matrices. It was also evidenced the thermal stability improvement of the entrapped DEET. In the third stage of the presented work, the release of DEET was studied. The polymeric films were able to sustain suitable DEET release rates for at least nine hours. The data regarding the release was fitted to two mathematic models and it was concluded that the mass transfer of DEET to the air occurs mainly by two distinct mechanisms: fickian diffusion and relaxational transport, which depend, among other aspects, on the Tg and the release temperature Mestrado Engenharia Química Mestre em Engenharia Química FAPESP 2016/13427-0 CNPQ 131715/2016-0

Orientadores: Rosiane Lopes da Cunha, David A. Weitz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Harvard University Resumo: Partículas de quitosana (Ch) e celulose (nanofibras de celulose; CNFs e cristais de celulose; CCrys) foram utilizadas como estabilizantes de emulsões Pickering óleo em água (O/A) produzidas por técnicas de alta (ultrassom e homogeneizador a alta pressão) e baixa energia (dispositivos de microfluídica). As características das partículas e emulsões foram avaliadas frente às variáveis de processo de emulsificação e condições gastrointestinais. Em uma primeira etapa, Ch foram produzidas e caracterizadas quanto aos efeitos da variação da potência aplicada e tempo de processamento em ultrassom sobre a estabilidade destas partículas e das emulsões. Os intensos efeitos de cavitação gerados com altas potências de ultrassom foram capazes de quebrar as partículas de quitosana e as gotas de óleo em menores tamanhos promovendo a formação de uma rede tridimensional entre gotas. Além disso, a alta estabilidade das emulsões foi associada à redução da tensão interfacial entre o óleo e a água e aumento da hidrofobicidade das partículas. Os efeitos das condições de emulsificação usando ultrassom e homogeneizador a alta pressão sobre as propriedades das CNFs obtidas da casca da banana e das emulsões Pickering foram avaliados na segunda etapa deste projeto. O fenômeno de coalescência foi observado nas emulsões produzidas no homogeneizador a alta pressão, enquanto que, a floculação das gotas ocorreu naquelas obtidas em ultrassom de alta intensidade. Nesta última, a estabilidade à coalescência foi associada com o ligeiro aumento da viscosidade da emulsão e rompimento das CNFs durante o processo de ultrassonicação. Em uma terceira etapa, um protocolo de digestibilidade in vitro foi utilizado para elucidar o papel das partículas (Ch, CNFs and CCrys) na taxa de digestão lipídica das emulsões tipo Pickering. A alta carga positiva das emulsões estabilizadas por quitosana levou à desagregação das gotas após a etapa gástrica, o que favoreceu a maior digestão lipídica na etapa intestinal. Por outro lado, a emulsão estabilizada com CNFs apresentou menor digestão lipídica e a forte aderência das partículas de CCrys na interface das gotas tornou-as resistentes ao deslocamento por componentes tensoativos. Na última etapa, a formação e propriedades de emulsões estabilizadas por CCrys foi estudada usando um dispositivo microcapilar. Gotas de óleo altamente monodispersas e emulsões estáveis ao longo do tempo foram produzidas a partir do balanço entre o tempo de geração das gotas e adsorção das partículas. Por outro lado, grandes gotas de óleo e emulsões menos estáveis foram obtidas após a ocorrência de eventos de coalescência dentro do microcanal ou devido ao aumento da viscosidade da fase dispersa. A abordagem microfluídica contribuiu para uma melhor compreensão das condições dinâmicas de estabilização das emulsões Pickering dentro e fora dos microcanais revelando eventos discretos que geralmente estão escondidos em emulsões produzidas por métodos convencionais de emulsificação Abstract: High-energy (ultrasound and high-pressure homogenizer) and low-energy (microfluidic devices) processes were used to obtain oil-in-water (O/W) Pickering emulsions stabilized by food-grade particles (chitosan nanoparticles; Ch, cellulose nanofibers; CNFs and cellulose crystals; CCrys). In the first step, the effect of time and ultrasound power on physicochemical properties of Ch and O/W Pickering emulsions were evaluated using an ultrasonic device. The surface activity of chitosan particles was evidenced with the reduction of interfacial tension between oil-water phases. The emulsion stability mechanism by deprotonated chitosan particles was also associated to an increase of the particle hydrophobicity and the formation of a droplet network structure due to the intense effects of cavitation generated at higher ultrasonication power. The effects of the emulsification conditions using ultrasound and high-pressure homogenization on the properties of the CNFs obtained from the banana peel and Pickering emulsions were evaluated in the second step. Coalescence phenomenon was observed in the emulsions produced using high-pressure homogenizer, whereas droplets flocculation occurred in emulsions processed by ultrasound. In the latter, coalescence stability was associated with effects of cavitation forces acting on the CNFs breakup. In the third step, an in vitro digestibility protocol was used to elucidate the role of different emulsifying polysaccharides particles (Ch, CNFs and CCrys) on the lipid digestion rate of oil-in-water Pickering emulsions. The highly positive charge of the emulsions stabilized by chitosan led to the disaggregation of droplets after the gastric step, which favored a more intense lipid digestion in the intestinal step. On the other hand, Tween 80, CCrys and CNFs were able to inhibit lipid digestion and no changes on droplet mean size were observed following intestinal step. CNFs-stabilized emulsion showed the lowest lipid digestion, whereas the strong adherence of the CCrys particles onto the droplet interface became them resistant to displacement by surface-active components. In the last step, the formation and stability of oil droplets in the presence of cellulose nanocrystals was studied using a microcapillary device. Monodisperse oil droplets and stable emulsions over time were produced from a balance between droplets generation time and particles adsorption. On the other hand, large oil droplets and less stable emulsions were obtained after coalescence events inside the microchannel or due to the increase on the dispersed phase viscosity. Microfluidic approach contributed to a better understanding of the dynamic conditions of stabilization inside and outside the microchannels revealing discrete events that usually are hidden in emulsions produced by conventional emulsification methods Doutorado Engenharia de Alimentos Doutora em Engenharia de Alimentos CNPQ 140710/2015-9; 204109/2017-5 CAPES FAPESP

Orientador: Marisa Masumi Beppu Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: A pesquisa em materiais bioativos, especialmente recobrimentos, permite produzir superfícies antimicrobianas resistentes, atóxicas, biodegradáveis e adequadas para contato com alimentos ou seres humanos. Este projeto combinou o efeito de diferentes tipos de quitosana (Chi) em filmes nanoestruturados para fabricação de recobrimentos ultrafinos sobre lâminas de silício (substrato modelo) e possível aplicação em substratos têxteis. Assim, filmes finos a base de quitosana foram construídos pela técnica layer-by-layer e a composição axial foi obtida pela espectroscopia de fotoelétrons excitados por raio X (XPS) com perfil de profundidade (depth profiling). Quitosanas possuindo diferentes valores de grau médio de acetilação (GA) e massa molar média viscosimétrica (Mv) foram combinadas com dois diferentes poliânions, denominados carboximetilcelulose (CMC) e poliestireno sulfonado de sódio (SPS). Quando a quitosana, um polímero carregado positivamente em meio aquoso ácido, foi combinada com o polieletrólito forte (SPS), a carga positiva total da Chi, diretamente relacionada com o seu grau médio de desacetilação, foi o fator chave para a modificação química e estrutural dos filmes. No entanto, quando o poliânion fraco (CMC) foi combinado com a quitosana, pH e massa molar afetaram fortemente a estrutura e composição do filme. Em seguida, foram feitos estudos de interdifusão molecular em filmes finos de CMC/Chi. São poucos os estudos que exploram a difusão de um polímero negativamente carregado (no caso, SPS) em um filme de biopolímeros. Este modelo serviu para ilustrar de forma simples como a quitosana interage com moléculas muito diferentes entre si (CMC e SPS). Ligações fortes são verificadas para o complexo Chi/SPS, resultado das interações eletrostáticas entre os polímeros. Já o sistema CMC/Chi é complementado por interações eletrostáticas de natureza mais fraca (e.g. ligação hidrogênio). Essas mudanças foram verificadas pelo estudo de espectros de XPS de alta resolução e são muito importantes para o entendimento dos sistemas de LbL que contém quitosana. Por fim, são mostradas análises de spray-LbL, uma vertente da técnica que tem como vantagem a redução de tempo e facilidade de aumento de escala em comparação ao método de imersão convencional de layer-by-layer. O entendimento da dinâmica da formação de filmes finos contendo quitosana e o ajuste apropriado de suas propriedades pode tornar os materiais adequados para a aplicação desejada, como exemplificado pelos testes antimicrobianos Abstract: The research on bioactive materials, especially coatings, enables the production of resistant, nontoxic, biodegradable, and suitable antimicrobial surfaces for contact with food or humans. This project combined the effect of different types of chitosan in the manufacture of nanostructured films for antimicrobial coatings on textile substrates and silicon slides. Chitosan-based thin films were assembled using the layer-by-layer technique and the axial composition was accessed by X-ray photoelectron spectroscopy with depth profiling. Chitosan (Chi) samples possessing different average degree of acetylation (DA) and viscosity average molecular weight (Mv) were used in this study as well as two different polyanions, namely sulfonated polystyrene (SPS) and carboxymethyl cellulose (CMC). When chitosan, a positively charged polymer in aqueous acidic medium was combined with a strong polyanion (SPS), the total positive charge of chitosan, directly related to its average degree of deacetylation, was the key factor affecting the film formation and its structure. However, when a weak polyanion (CMC) was combined with chitosan, pH and viscosity average molecular weight of chitosan strongly affected film structure and composition. Following, we studied the molecular interdiffusion in thin films of CMC/Chi. There are few studies in the literature which explore the diffusion of a negatively charged polymer (in our case, the SPS) into a biopolymer thin film. This system illustrated in a simple way how chitosan interacts with different macromolecules (CMC and SPS). Higher binding energy values were observed for the Chi/SPS complex, as a result of the strong electrostatic interactions between the polymers. The CMC/Chi system is complemented with electrostatic interactions of weaker nature (i.e. hydrogen bounds). These changes in the binding energies were verified by the XPS high resolution spectra and provided a better understanding of LbL systems containing chitosan. Finally, we explored the spray LbL approach as an easy methodology to scale-up and capable of reducing the time required for the film build-up in comparison to the traditional dipping method. The variation of chitosan architecture, polyanion pair and pH shows that it is possible to molecularly control the chemical and structural properties of nanostructured coatings at the molecular level, thus opening up new possibilities to adapt them for the desired application, as shown by the antimicrobials tests Doutorado Engenharia Química Doutor em Engenharia Química CNPQ 202523/2014-4 FAPESP 2013/05135-1

Orientadores: Rosiane Lopes da Cunha, Lucimara Gaziola de la Torre Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Este projeto teve como objetivo o desenvolvimento tecnológico de processos microfluídicos para a obtenção de estruturas lipossomais visando à sua utilização como sistemas de encapsulação para as indústrias de alimentos. Inicialmente foi avaliada a viabilidade técnica de obtenção de nanovesículas incorporadas com ?-caroteno utilizando diferentes lecitinas comerciais de soja pelo método de injeção de etanol. O tipo de lecitina utilizada para a produção de nanovesículas não influenciou na capacidade de carregamento do ?-caroteno, porém influenciou nas propriedades estruturais dos lipossomas formados. Assim, foi possível utilizar uma lecitina comercial de soja de baixo custo contendo triacilgliceróis para a produção de lipossomas visando à veiculação do ?-caroteno. Na segunda etapa, lipossomas foram produzidos continuamente utilizando dispositivos microfluídicos de focalização hidrodinâmica. Este estudo objetivou um aumento da taxa de produção de lipossomas para uma redução no número de canais visando a um sistema microfluídico paralelizado mais eficiente. Diferentes estratégias para o aumento da produtividade foram avaliadas em função dos impactos causados nas distribuições de tamanho dos lipossomas formados. Os resultados indicam que lipossomas com baixa polidispersidade podem ser obtidos continuamente com uma alta taxa de síntese, utilizando dispositivos microfluídicos com canais de seção retangular de elevada relação largura/altura em altas vazões volumétricas e alta concentração de lecitina. Na terceira etapa, lipossomas gigantes baseados em emulsões duplas A/O/A foram produzidos em um dispositivo microcapilar de vidro, empregando uma mistura de acetato de etila e pentano em substituição às misturas contendo clorofórmio e/ou hexano normalmente utilizadas para solubilizar os fosfolipídios. O tamanho das gotas das emulsões duplas foi precisamente ajustado com uma variação da vazão da fase contínua. Assim, de forma inédita, foi possível desenvolver um processo microfluídico para produção de lipossomas gigantes utilizando ingredientes e materiais com possibilidades reais de aplicação em sistemas alimentícios. Todos os resultados experimentais obtidos sugerem que lecitinas comerciais de soja amplamente disponíveis como emulsificantes para indústria de alimentos podem ser utilizadas como uma alternativa de baixo custo para obtenção de sistemas lipossomais incorporados com ?-caroteno. Além disso, podemos concluir que diferentes processos microfluídicos podem ser empregados para obtenção de diferentes estruturas lipossomais Abstract: The project evaluated the technological development of microfluidic processes for production of liposomal structures aiming their use as delivery systems for food industries. In the first step, it was evaluated the technical feasibility of obtaining ?-carotene-incorporated nanovesicles using different commercial soybean lecithin by the ethanol injection method. The lecithin-type used did not influence on loading capacity of ?-carotene, but it influenced on the structural properties of the liposomes generated. Thus, it was possible to use commercial low-cost soybean lecithin containing triacylglycerol for the production of liposomes for ?-carotene delivery. In the second step, liposomes were produced in a continuous mode using hydrodynamic flow-focusing microfluidic devices. This step aimed at increasing the production rate of liposome for a reduction in the number of channels to obtain a more efficient parallelized microfluidic system. Different strategies to increase liposome throughput were evaluated as a function of the impacts caused on the size distributions of the liposomes generated. The results indicate that liposomes with low polydispersity can be obtained in continuous mode at a high synthesis rate. The best results were observed using microfluidic devices with cross-section area of high aspect-ratio channels, at high volumetric flow rates and lecithin concentration. In the third step, giant liposomes based on W/O/W double emulsions were produced using a glass capillary device through an ethyl acetate/pentane mixture in replacement of a mixture containing chloroform and hexane normally used for phospholipid dissolution. The droplet size of the double emulsions was tuned by a flow variation of continuous phase. Thus, in an unprecedented way, it was possible to develop a microfluidic process for the production of giant liposomes using ingredients and materials with true possibilities of application in food systems. All experimental results obtained suggest that commercial soybean lecithins widely available as emulsifiers for the food industry can be used as a low-cost alternative to obtain ?-carotene-incorporated liposomal systems. Apart that, we can conclude that different microfluidic processes can be used to produce different liposomal structures Doutorado Engenharia de Alimentos Doutor em Engenharia de Alimentos CNPQ 140283/2013-7 FAPESP CAPES

Orientadores: Lucimara Gaziola de la Torre, Charles Baroud Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química, École Polytechnique - França Resumo: Este trabalho visou o uso de um sistema microfluídico de gotas para incorporar ácidos nucleicos em lipossomas catiônicos e outro para estudar o processo de transfecção em células de mamíferos. A primeira etapa do projeto utilizou um microdispositivo para incorporar pDNA em lipossomas catiônicos de modo a obter lipoplexos reprodutíveis e adequados para transfectar células dendríticas (DCs). Com esta finalidade, alguns parâmetros experimentais foram investigados, tais como vazões de entrada, manutenção das propriedades dos lipossomas após processamento no microdispositivo, características dos lipoplexos (tamanho, polidispersidade e carga) em função da razão molar de carga (R+/-) e do desenho do microdispositivo. Lipoplexos produzidos em microdispositivo com canal de serpentina largo e região de divisão de gotas que diminuem a polidispersidade dos lipoplexos, operando à razão de vazão água/óleo 0,25 e R+/- 1,5; 3; 5; 7 e 10 foram utilizados para transfectar DCs in vitro. Todos os lipoplexos foram capazes de transfectar as DCs e ao mesmo tempo proporciaonar a ativação das células. A segunda etapa do trabalho utilizou uma plataforma microfluídica de célula única para investigar e controlar as condições de transfecção, tendo em vista a otimização dos rendimentos de produção de proteínas recombinantes. Neste contexto, as células de ovário de hamster Chinês (CHO-S) foram transfectadas no microdispositivo com diferentes tipos de lipoplexos (R+/- 1,5; 3; 5) e monitoradas em relação à produção de proteína verde fluorescente (GFP) e viabilidade celular. A plataforma de célula única permite avaliar a heterogeneidade celular, revelando a presença de uma subpopulação que produz níveis elevados de GFP. Essas células com alta produção de GFP (HP) mostraram um aumento do tamanho celular em comparação à média da população. Além disso, a carga dos lipoplexes apresenta um importante papel na transfecção das células CHO-S, visto que os únicos lipoplexos com carga positiva R+/- 5 produziram mais HPs. A quantidade de pDNA entregue às células afeta a produção de proteína, já que os lipoplexos com mais pDNA R+/- 1,5 aumentaram a produtividade específica de GFP das HPs. Esta tese foi desenvolvida no âmbito de um programa de co-tutela entre a Universidade Estadual de Campinas, Brasil e a École Polytechnique, França. Em geral, este trabalho apresenta contribuições originais para as áreas da microfluídica e da entrega de genes Abstract: This work aimed at using one droplet-based microfluidic systems to incorporate nucleic acids into cationic liposomes and another one to study the mammalian cell transfection process. In the first part of this study we used a droplet-based microfluidic system to complex cationic liposomes with pDNA in order to obtain reproducible and suitable lipoplexes to dendritic cells (DCs) transfection. For this purpose, some experimental parameters were investigated, such as inlet flow rates, the maintenance of liposomes¿ properties after microfluidic processing, lipoplex characteristics (size, polydispersity and zeta potential) as function of molar charge ratio (R+/-) and microchip design. Lipoplexes produced in a microchip with large serpentine channel and split region, which decreases lipoplex polydispersity, operating at ratio aqueous/oil flow rate 0.25 and R+/- 1.5, 3, 5, 7 and 10 were used to transfect DCs in vitro. All lipoplexes transfected DCs and resulted in cell activation. In the second part of this study we used a single-cell microfluidic platform to investigate and control transfection conditions, in view of optimizing the recombinant protein production by transfected cells. Chinese hamster ovary cells (CHO-S) were transfected in microchip with different types of lipoplexes (R+/- 1.5, 3, 5) and monitored by green fluorescent protein (GFP) production and cell viability. The single-cell platform enables to assess the heterogeneities of CHO-S population, revealing the presence of a subpopulation producing significantly high levels of GFP. These high producers (HP) showed increased cell size in comparison to the average population. Moreover, the charge of lipoplexes shows an important role to transfect CHO-S, since the unique positive charged lipoplex R+/- 5 produced more HPs. Additionally, the amount of pDNA delivered affects protein production, since R+/- 1.5 with more pDNA increased GFP specific productivity of HPs. This thesis was developed under the joint graduate program of the University of Campinas, Brazil and École Polytechnique, France. In general, this work presents original contributions in the areas of microfluidics and gene delivery Doutorado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Doutora em Engenharia Química FAPESP 2012/24797-2, 2014/10557-5

Orientadores: Marisa Masumi Beppu, Diego Mantovani Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: O risco da colonização bacteriana em superfícies abióticas impõe desafios importantes para os diversos campos da ciência. Neste cenário, revestimentos antibacterianos têm sido desenvolvidos, usando um grande número de diferentes materiais. A modificação da superfície de polímeros permite melhorar as suas propriedades, com vistas ao desenvolvimento de materiais com respostas biológicas adaptadas ou adaptáveis ao ambiente onde serão implantados. A quitosana é um biopolímero com atividade antimicrobiana o qual pode ser utilizado numa ampla variedade de aplicações de cuidados de saúde e industriais, tornando-a particularmente interessante para o desenvolvimento e aplicação de novos materiais funcionalizados, ou seja, com propriedades antibacterianas. Neste estudo, diferentes tipos de quitosana foram caracterizadas de acordo com o seu grau de desacetilação (DDA) e massa molar (Mw), através de técnicas como ressonância magnética nuclear (13C RMN) e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), entre outras. Os resultados obtidos através dessas análises revelaram a grande importância da caracterização de biopolímeros, uma vez que suas propriedades podem variar de acordo com os métodos de produção, o que pode influenciar no seu uso como aplicação. Em seguida, a metodologia aplicada para o tratamento e modificação de superfícies empregando as técnicas de plasma, para a funcionalização de superfícies e o grafting para a imobilização do recobrimento de quitosana foi validada. Inicialmente, filmes de PTFE (politetrafluoretileno) foram utilizados para verificar a eficácia da metodologia proposta para o tratamento e modificação de superfície. Três moléculas "ancoradoras" com diferentes características anidrido glutárico (GA), poli(etileno glicol) bis(carboximetil) (PEGb) e poli(anidrido etileno-alt-maleico) (PA), foram utilizadas visando ligar covalentemente o recobrimento de quitosana às superfícies de PTFE aminadas. Cada etapa do tratamento da superfície foi verificada por espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS), por medições de ângulo de contato e colorimetria sendo evidenciada as mudanças na composição química da superfície e sua molhabilidade. As alterações topográficas e de rugosidade após o grafting também foram observadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e perfilometria. Esses resultados demonstraram que o tipo de molécula ancoradora tem uma influência primária no processo de produção dos recobrimentos seguido pela massa molecular dos diferentes tipos de quitosana. Para verificar a resposta antibacteriana dos diferentes tipos de recobrimentos obtidos, testes foram inicialmente realizados empregando a Xylella fastidiosa e revelaram a potencialidade dos substratos recobertos com quitosana. Assim, testes utilizando bactérias patogênicas como, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus foram realizados confirmando o comportamento antibacteriano das amostras PTFE-plasma- PA-CHIMW. Esses resultados encorajaram a aplicação desta metodologia em um substrato de PET (polietileno tereftalato), um polímero muito usado no ramo de têxteis convencionais como também na produção de têxteis hospitalares e biomateriais, demonstrando assim, que a metodologia de plasma-grafting aplicada neste estudo, para a produção de recobrimentos de quitosana, pode ser usada para a produção de superfícies onde a atividade antibacteriana é desejada, ou seja, esses revestimentos podem fornecer uma barreira adicional e complementar à transmissão de patógenos, enquanto podem atuar combinados com procedimentos normais de limpeza e desinfecção Abstract: The risk of bacterial colonization on abiotic surfaces poses important challenges in various fields of science. In this scenario, antibacterial coatings were developed, using a large number of materials. The surface modification of polymeric materials allows to improve surface properties, facilitating the development of optimized materials with biological responses adapted or adaptable to the environment in which they will be implanted. Chitosan is a biopolymer with inherent antimicrobial activity which can be used in a wide variety of health care and industrial applications, making it particularly interesting for the development and application of novel functionalized materials, i.e. antibacterial properties. In this study, different types of chitosan were characterized according to their degree of deacetylation (DDA) and molecular weight (Mw), using Nuclear Magnetic Resonance (13C NMR) and Size Exclusion Chromatography (SEC), among others. The results obtained through these analyses revealed the great importance of the characterization of biopolymers since their properties can vary according to the production methods, which can influence its use as an application. Afterward, the methodology applied for the treatment and modification of surfaces using plasma, for the surface functionalization and grafting of molecules was validated. Initially, PTFE (poly(tetrafluoroethylene)) films were used to verify the efficiency of the proposed methodology for the treatment and surface modification. Three spacer molecules glutaric anhydride (GA), poly (ethylene glycol) bis (carboxymethyl) (PEGb) and poly (ethylene-alt-maleic anhydride) (PA), with different characteristics were used to covalently attach the chitosan coating to the aminated PTFE surfaces. Each step of the surface treatment was verified by X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS), through changes in chemical composition, by contact angle measurements and by colorimetry. The topographic and roughness changes after grafting were also observed by Scanning Electron Microscopy (SEM) and profilometry. These results demonstrated that the type of anchors has a greater influence on the coating process than the molecular weight of the different types of chitosan. To verify the antibacterial response of the different types of coatings obtained, tests were initially carried out using Xylella fastidiosa and revealed the potentiality of the substrates covered with chitosan. Tests using pathogenic bacteria such as Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus were performed confirming the antibacterial behavior of PTFE- plasma-PA-CHIMW samples. These results encouraged the application of this methodology in PET (polyethylene terephthalate) substrate, a polymer widely used in the field of conventional textiles as well as in the production of hospital textiles and biomaterials. Thus, the plasma-grafting methodology developed in this study, for the production of chitosan coatings, can be applied to the production of surfaces where antibacterial activity is desired Doutorado Engenharia Química Doutora em Engenharia Química CAPES

Orientador: Lucimara Gaziola de la Torre ( Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de processos microfluídicos baseados em focalização hidrodinâmica para a produção de nanopartículas de quitosana (CHI) de baixa massa molar através de gelificação ionotrópica com adenosina trifosfato (ATP), para aplicação como vetores não virais de terapia gênica. Para determinar a configuração de processo microfluídico, avaliaram-se as condições dinâmicas de mistura em quatro diferentes geometrias, que demonstraram que o modo de contato entre as correntes de CHI e ATP e a presença de obstáculos podem favorecer a neutralização de cargas do polímero e o acúmulo de precipitados nos microcanais. A partir disso, desenvolveu-se um sistema empregando uma corrente aquosa central a fim de controlar a mistura gradual entre as moléculas de CHI e ATP, tornando-se possível estabelecer um processo contínuo e homogêneo de produção de nanopartículas CHI/ATP em dispositivo de focalização hidrodinâmica no formato T simples. Para esse sistema, investigou-se a influência de diferentes relações mássicas CHI/ATP (RCHI/ATP) na produção de nanopartículas CHI/ATP, resultando em nanopartículas, para RCHI/ATP de 1,7, de 181 nm de diâmetro, 0,28 de índice de polidispersidade (PDI) e 44 mV de potencial zeta. Em seguida, avaliou-se a complexação dessas nanopartículas com DNA plasmidial (DNAp) para as proporções de 36, 72 e 144% de DNAp (DNA/CHI, m/m). Ensaios de eletroforese em gel de agarose evidenciaram uma elevada eficiência de incorporação de DNAp nas nanopartículas de CHI/ATP, porém, experimentos preliminares de transfecção in vitro em células HEK 293ª apontaram uma baixa eficiência de transfecção para os poliplexos DNAp(36%)-CHI/ATP após 24 e 72h. Assim, este estudo contribuiu para o desenvolvimento de processos microfluídicos na área da nanobiotecnologia, representando uma alternativa promissora, tanto pela potencialidade tecnológica quanto biológica, para a produção de nanopartículas de quitosana, em especial para aplicação em terapia gênica Abstract: This research aimed at the development of microfluidic platforms based on hydrodynamic focusing for the production of nanoparticles composed by low molecular weight chitosan (CHI) and adenosine triphosphate (ATP), through ionotropic gelation, as non-viral vectors for gene therapy applications. To determinate the microfluidic process configuration, the mixture dynamic conditions were evaluated in four different designs, that demonstrated that the mode of contact between CHI and ATP¿s streams, as well as the presence of obstacles, may favor the polymer charge neutralization and the accumulation of precipitates within the microchannels. From this find, a system applying a central aqueous stream was developed in order to control the gradual mixture among CHI and ATP molecules, becoming possible to stablish a continuous and homogeneous production process of CHI/ATP nanoparticles in a simple hydrodynamic flow focusing microfluidic device. For this system, the influence of different CHI/ATP mass ratios (RCHI/ATP) on the production of CHI/ATP nanoparticles was investigated, which resulted in nanoparticles, for RCHI/ATP = 1,7, with mean size of 181 nm, polydispersity index (PDI) of 0,28 and +44 mV of zeta potential. Furthermore, these nanoparticles complexation with plasmid DNA (pDNA) was evaluated for 36, 72 and 144% of DNA (DNA/CHI w/w). Agarose gel electrophoresis assays revealed an elevated DNA entrapment efficiency for the CHI/ATP nanoparticles, however, preliminary in vitro transfection experiments in HEK 293A cells indicated a low transfection efficiency of the pDNA(36%)-CHI/ATP polyplexes after 24 and 72h. In view of this, this work contributes to the development of microfluidic processes in the nanobiotechnology field, that represent a promising alternative, due to its technological and biological potentiality, for the production of chitosan nanoparticles applicable for gene therapy research Mestrado Engenharia Química Mestra em Engenharia Química CNPQ 131666/2014-2

Orientador: Marisa Masumi Beppu Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: A obtenção de superfícies antibacterianas que possam revestir diversos substratos, como alimentos, tecidos e dispositivos biomédicos é de grande relevância para evitar a sua contaminação por bactérias patogênicas. Nos últimos anos, estes revestimentos, principalmente à base de quitosana, têm sido desenvolvidos visando evitar infecções nosocomiais. A técnica de deposição layer-by-layer (LbL) é uma técnica simples e versátil que pode ser empregada na construção de tais revestimentos, principalmente a partir de interações eletrostáticas entre polieletrólitos de cargas opostas. Neste trabalho, nanofilmes de ácido hialurônico (HA) e quitosana (CHI), dois polímeros naturais biocompatíveis e biodegradáveis, foram construídos pela técnica de deposição LbL de imersão em diferentes condições de pH e força iônica (FI) visando a obtenção de superfícies resistentes à adesão e proliferação de duas bactérias patogênicas humanas importantes, sendo estas: Pseudomonas aeruginosa, gram-negativa, e Staphylococcus aureus, gram-positiva. Os resultados mostraram que a modificação dos parâmetros de construção, pH e FI, foi fundamental para a obtenção de nanofilmes com características distintas, como ângulo de contato, espessura, rugosidade e disponibilidade de grupos funcionais dos polieletrólitos. O efeito de inibição bacteriana dos nanofilmes de HA/CHI foi avaliado pelo método de plaqueamento de superfície e os resultados indicaram que o efeito de inibição do crescimento bacteriano está diretamente relacionado com a quantidade de grupos amino livres da CHI na superfície dos nanofilmes. A redução bacteriana foi mais efetiva contra S. aureus com diminuição de aproximadamente 3, 4 e 1,5 ciclos decimais em 4, 8 e 24 horas, respectivamente. Contra P. aeruginosa, os nanofilmes apresentaram uma redução bacteriana inferior a 1 ciclo decimal nos tempos avaliados. Portanto, o efeito de inibição bacteriana contra S. aureus até 24 horas sugere que os revestimentos de HA/CHI construídos pela técnica de deposição LbL podem proteger diversos substratos, como dispositivos biomédicos, os quais são suscetíveis a proliferação bacteriana Abstract: Fabrication of antibacterial surfaces available to coat several substrates, such as food, textiles, and biomedical devices is of great relevance to prevent contamination by bacteria. In recent years, particularly chitosan-based coatings have been developed to prevent nosocomial infections. The layer-by-layer deposition technique (LbL) is a simple and versatile technique that can be employed in the construction of those coatings mainly from electrostatic interactions between oppositely charged polyelectrolyte. In this work, nanofilms of hyaluronic acid (HA) and chitosan (CHI), two biocompatible and biodegradable natural polymers, were assembled by LbL using different conditions of pH and ionic strength (IS) in order to obtain resistant surfaces to avoid the adhesion and proliferation of two important human pathogenic bacteria: Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, gram-negative and gram-positive bacteria, respectively. The obtained results indicated that pH and IS were key synthesis variables for obtaining different features, such as wettability, thickness, roughness and the availability of functional groups in nanofilms. The antibacterial effect of HA/CHI nanofilms was evaluated by the spread plate method for both bacteria strains; the results showed that the microbial inhibition is directly related with the amount of free amino groups on the surface of CHI nanofilms. The antibacterial effect was more effective against S. aureus with a reduction of approximately 3, 4, and 1.5 log reduction for 4, 8 and 24 hours of culture time, respectively. In the case of P. aeruginosa, the nanofilms presented a lower bacterial reduction: 1 log reduction in times evaluated. In conclusion, the results of the antibacterial effect against S. aureus in 24 hours, suggest that the HA/CHI nanofilms assembled by LbL can protect several substrates, such as biomedical devices, against bacterial proliferation Doutorado Ciência e Tecnologia de Materiais Doutor em Engenharia Química FAPEAM 0165/2012

Orientador: Osvaldir Pereira Taranto Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Essa tese investigou numérica e experimentalmente o processo de síntese e purificação do biodiesel em microcanais. A síntese de biodiesel foi realizada através da reação de óleo vegetal e álcool na presença de catalisador básico. Essa reação que ocorre com excesso de álcool para deslocar o equilíbrio da reação para os produtos, produz o biodiesel e o coproduto glicerol. Assim, além da reação de síntese, o processo de produção do biodiesel envolve a remoção do álcool não reagido e do glicerol. Na literatura são encontrados estudos que avaliam a aplicação de microdispositivos na síntese de biodiesel, porém, poucos trabalhos aplicam as características da microescala na purificação desse combustível (remoção do álcool em excesso e glicerol) e técnicas de modelagem e simulação que podem otimizar o processo de síntese e os microdispositivos utilizados. A síntese foi inicialmente avaliada numericamente para o óleo de Pinhão Manso e etanol em micromisturadores com diferentes geometrias e os resultados mostraram que a reação entre os reagentes é controlada pelos processos de mistura e cinética de reação e que o tempo de residência desempenha um papel importante na conversão do óleo, sendo demonstrado que a conversão é mais afetada pelo tempo de residência do que pelo tipo de geometria. Em seguida foi investigado a síntese de biodiesel a partir do óleo de girassol experimentalmente e numericamente. A máxima porcentagem dos ésteres etílicos (FAEE) obtida para o reator batelada convencional e para o microreator foi de 94,06% e 95,80%, respectivamente. Foi demonstrado que os parâmetros rendimento e seletividade representam melhor a simulação do processo de transesterificação do óleo de girassol. Com esses resultados foi possível desenvolver microdispositivos mais eficientes para a síntese de biodiesel. Os microdispositivos com obstruções circulares e com elementos estáticos mostraram experimentalmente elevadas FAEE com valores acima de 99%. Após os ensaios numéricos e experimentais de síntese foi explorado a purificação do biodiesel em microcanais. Os resultados da remoção do álcool mostraram que a temperatura influenciou positivamente a evaporação/separação do álcool, com um aumento dessa variável, a separação é maior. As variáveis vazão dos fluidos e razão molar possuem um efeito contrário. A remoção do glicerol do biodiesel em microcanais é influenciada estatisticamente pelo tempo de residência e a interação entre o tempo de residência e fração volumétrica dos fluidos glicerina e biodiesel Abstract: This thesis investigated numerically and experimentally the process of synthesis and purification of biodiesel in microchannels. The biodiesel synthesis was performed by reaction of vegetable oil and alcohol in the presence of basic catalyst. This reaction occurs with excess alcohol to displace the equilibrium of the reaction towards the products, produce biodiesel and glycerol. Thus, besides the synthesis reaction, the biodiesel production process involves the remotion of the unreacted alcohol and glycerol. No studies were found to apply the microscale features in purification of the biofuel (removal of alcohol in excess and glycerol), or the application of modeling techniques and simulation that can optimize the synthesis process and the microdevices used. The synthesis was initially evaluated numerically for the Jatropha curcas oil and ethanol in micromixers with different geometries for the microchannels and the results showed that the reaction between the reactants is controlled by the mixing and the reaction kinetics and residence time plays a key role in oil conversion. It was demonstrated that the conversion is more affected by the residence time that the geometry type. It was then investigated the synthesis of biodiesel from sunflower oil experimentally and numerically. The maximum percentage of ethyl esters (FAEE) obtained for the batch reactor and the microreactor was 94.06% and 95.80%, respectively. It was shown that the yield and selectivity parameters better represent the simulation of sunflower oil transesterification process. With these results it was possible to develop more efficient microdevices for biodiesel synthesis. The microdevices with circular obstructions and static elements showed high FAEE with values above 99%. After the synthesis was explored the biodiesel purification in microchannels. The results of the removal of alcohol showed that the temperature influenced positively evaporation/separation of alcohol, an increase of this variable, the separation is greater and the variable flow of fluids and molar ratio has the opposite effect. The biodiesel glycerol removal of microchannels is statistically affected by residence time, and the interaction between the residence time and volume fraction of glycerol and biodiesel Doutorado Engenharia de Processos Doutor em Engenharia Química CAPES

Orientador: Lucimara Gaziola de La Torre Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: A microfluídica permite a formação de diversas nanopartículas e sistemas nanocarreadores por meio da mistura controlada de correntes que escoam em canais micrométricos. Lipossomas catiônicos têm sido empregados como uma alternativa eficaz para o carreamento de material genético e diversos fármacos para aplicações biomédicas. O uso de processos microfluídicos para a formação de lipossomas e seus complexos com DNA (lipoplexos) possibilita uma redução do número de etapas em comparação a processos convencionais, permitindo ainda o desenvolvimento de processos passíveis a amplicação de escala. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de plataformas microfluídicas de fluxo contínuo para a obtenção de vetores não-virais baseados em lipossomas catiônicos e DNA plasmidial (pDNA) e suas aplicações em terapia gênica. Inicialmente, um dispositivo microfluídico de focalização hidrodinâmica foi empregado na complexação entre pDNA e lipossomas para a formação de lipoplexos. Em condições de alto carreamento de pDNA, as propriedades físico-químicas e estruturais de lipoplexos obtidos pelo processo microfluídico resultaram em respostas biológicas mais eficientes que aqueles obtidos pelo processo convencional "bulk". Em seguida, regiões de focalização hidrodinâmica foram associadas em série e em pseudo-paralelo para a formação lipossomas com maior produtividade por dispositivo. Em ambas configurações, foi possível preparar lipossomas protegidos estericamente pelo polímero polietilenoglicol (PEG), os quais apresentaram propriedades adequadas para aplicações em terapia gênica. Por fim, utilizando focalizações hidrodinâmicas consecutivas, foi possível desenvolver um dispositivo microfluídico com duas regiões distintas para a formação de lipossomas e a posterior complexação com pDNA em dispositivo único. Assim, com este trabalho foi possível aprimorar e desenvolver processos microfluídicos para a formação de lipossomas e de lipoplexos com redução significativa do número de etapas, contribuindo para a viabilização de nanocarreadores de material genético destinados a aplicações na área biomédica Abstract: Microfluidics allows the formation of a variety of nanoparticles and nanocarriers systems via controlled mixing of streams that flow within micro-sized channels. Cationic liposomes have been employed as an efficient alternative for the delivery of genetic material and therapeutic drugs for biomedical applications. The use of microfluidic processes for the formation of liposomes and their complexes with DNA (lipoplexes) enables the reduction of the number of steps compared to conventional processes, allowing the development of processes liable to scale amplification. The present work aimed at the development of continuous-flow microfluidic platforms to generate nonviral vectors based on cationic liposomes and plasmid DNA (pDNA) and their applications in gene therapy. Firstly, a microfluidic device based on the hydrodynamic flow-focusing technique was employed to form electrostatic complexes between pDNA and liposomes for the formation of lipoplexes. Under high pDNA loading conditions, physicochemical and structural properties of lipoplexes obtained in the microfluidic process resulted in more efficient biological assays than those obtained via conventional bulk process. Next, flow-focusing regions were associated in series and pseudo-parallel architectures for the formation of liposomes with higher productivity per device. In both architectures, it was possible to obtain liposomes with a protective and steric shield provided by poly(ethylene glycol) (PEG), whose properties were appropriate for gene therapy applications. Lastly, using consecutives flow-focusing regions, a microfluidic device was developed with two distinct regions for the formation of liposomes and lipoplexes with significantly reduced number of steps, contributing to the advances of gene nanocarriers for biomedical applications Doutorado Engenharia Química Doutor em Engenharia Química FAPESP 2012/23143-9 e 2013/14925-6 CAPES

Orientador: Lucimara Gaziola de la Torre Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: A microfluídica pode ser definida como a ciência que utiliza pequenos volumes de soluções que escoam em canais de dimensões na ordem de micrometros e tem sido amplamente difundida em várias áreas de pesquisa. Dentre suas possíveis aplicações, a microfluídica pode contribuir para avanços na área da biotecnologia industrial para o monitoramento do comportamento microbiano em diferentes condições de cultivo de forma simultânea, gerando as replicatas em um único experimento. Nesse contexto, este trabalho teve o objetivo de desenvolver um dispositivo microfluídico para monitorar o crescimento celular bacteriano e determinar os parâmetros cinéticos em condições similares a um biorreator. O dispositivo microfluídico foi projetado com a capacidade de gerar gradiente convectivo para criar diferentes condições simultâneas de cultivo. Assim, foi possível variar a concentração de substrato em três distintas câmaras de cultivo celular, construídas em paralelo, juntamente com suas respectivas triplicatas. Para isso, o sistema foi construído em dois níveis: inferior, onde estão localizadas as câmaras de cultivo fechadas com um sistema de membranas (que permite a difusão do meio de cultura e isola as bactérias) e o nível superior que foi composto por uma rede de microcanais, responsáveis pela geração do gradiente de concentração convectivo alimentando as câmaras de cultivo por meio das membranas. Diferentes materiais foram explorados a fim de estabelecer as melhores condições para o cultivo de células microbianas. Foram propostos quatro dispositivos construídos em vidro e polidimetilsiloxano nas formas natural (PDMS) e laminado (PDMSLAM), resultando nos protótipos: (i) PDMS-PDMS; (ii) PDMSLAM-Vidro; (iii) PDMSLAM-PDMSLAM; (iv) Vidro-Vidro. Estes dispositivos foram avaliados quanto à capacidade de geração de gradientes e a afinidade do micro-organismo com o material. Desta forma, a configuração considerada ideal foi empregada para cultivo e determinação de parâmetros cinéticos microbianos, sendo utilizado como prova de conceito a bactéria Escherichia coli JM109, que possui o plasmídeo pLAN-GFPHind codificante para proteína verde fluorescente (GFP). A fluorescência emitida pela bactéria permitiu investigar o crescimento celular por meio da correlação do número de células com a intensidade de fluorescência e, a partir disso, foram determinados o perfil de crescimento e os parâmetros cinéticos da bactéria. Os resultados apontaram a viabilidade do dispositivo projetado quanto ao cultivo microbiano frente a um gradiente de concentração de antibiótico, mostrando ainda que é possível definir uma sistemática de várias condições de cultivo em uma única etapa Abstract: Microfluidics is the science that utilizes small volumes of solutions that flow through channels of micrometric dimensions and has been widely applied in many areas of research. It can contribute to industrial biotechnology, especially in monitoring microbial behavior in different conditions simultaneously. This work aimed to develop a microfluidic device to assess bacterial cell growth and determine the kinetic parameters in conditions similar to those found in a bioreactor. The proposed microfluidic device was designed having the ability to generate convective gradients to simultaneously create different cultivation conditions. These varying conditions allowed to alter the substrate concentration in three different cell culture chambers arranged in parallel, along with its respective triplicates. The device was built on a two-tier mode: the inferior tier, where is located a cultivation chamber topped with a membrane system to allow the diffusion of culture medium and to isolate the cells from the second tier; and an upper tier composed of a network of microchannels arranged in such a way to induce the formation of a convective concentration gradient. This convective stream fed the culture chambers with fresh medium by flowing through the selective membranes. Different construction materials have been explored in order to provide the optimum conditions for cell growth. Four different devices were proposed and constructed using a combination of glass and polydimethylsiloxane, in both its natural (PDMS) and laminate forms (PDMSLAM), resulting in the prototypes: (i) PDMS-PDMS, (ii) PDMSLAM-Glass, (iii) PDMSLAM-PDMSLAM, (iv) Glass-glass. These devices were evaluated for their ability to generate concentration gradients and with regard to the affinity of the microorganism with the material. The ideal configuration was then used for cultivation of bacterial cells and for the estimation of kinetic parameters. Escherichia coli (JM109) was used as proof of concept, which have been modified to have a plan-GFPHind plasmid coding for Green Fluorescent Protein (GFP). The fluorescence emitted by the bacteria enabled the investigation of cell growth by correlating the number of cells with the intensity of fluorescence and, as a result, we determined the growth profile and the kinetic parameters for this bacteria. The results showed the feasibility of the designed device relative to cell cultivation in an antibiotic concentration gradient, presenting the capability of defining a system of several growth conditions in only one step Mestrado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Mestra em Engenharia Química CAPES 33003017034P8

Orientador: Rosiane Lopes da Cunha Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A técnica de emulsificação em dispositivos de microfluídica é utilizada para a produção de gotas de diâmetro reduzido e distribuição de tamanho monodispersa. A gelificação da fase dispersa de emulsões água em óleo pode levar à formação de microgéis com elevado potencial para encapsulação de compostos ativos. Do ponto de vista tecnológico, a utilização de partículas de tamanho reduzido permite entrega mais fácil e liberação do bioativo de forma mais eficiente no local alvo. Este trabalho teve como objetivo estudar o processo de formação de microgéis de goma gelana em dispositivos de microfluídica utilizando a técnica de focalização hidrodinâmica. Foram avaliadas as concentrações da goma gelana de 0,5 a 0,7% (m/m) e do agente gelificante acetato de cálcio nas concentrações de 0,5 e 2,0% (m/m) para formação dos microgéis. Na primeira etapa, emulsões simples água em óleo, sendo a fase dispersa constituída de água ou dispersões aquosas de goma gelana e fase contínua constituída por uma mistura composta por óleo de soja e o emulsificante polirricinoleato de poliglicerol (PGPR), foram avaliadas quanto ao regime de formação de gotas em diferentes vazões das fases e razões entre as vazões das fases dispersa e contínua. Também foram determinadas as velocidades reais das fases dentro dos dispositivos de microfluídica e os números adimensionais de Reynolds, Capilar e Weber que descrevem o escoamento dos fluidos no microcanais. Com o controle da condição de processo, vazão de entrada das fases dispersa e contínua, foi possível observar as variações no regime de formação de gotas, que variou desde o gotejamento até o jateamento. Em geral, todas as vazões calculadas (reais) das fases foram menores do que aquelas aplicadas na bomba, sendo este resultado relacionado às limitações das dimensões dos canais e alta viscosidade das fases. Desta forma, os números de Reynolds, Capilar e de Weber calculados a partir das velocidades reais das fases foram menores quando comparados com os valores obtidos usando as velocidades impostas na bomba. Na etapa seguinte, microgéis de goma gelana foram produzidos nos microcanais e caracterizados pela distribuição de tamanho de gotas e microscopia ótica. Os microgéis possuíam formato regular e esférico e distribuição de tamanho altamente monodispersa. O potencial da utilização de microgéis de goma gelana na encapsulação de compostos ativos foi avaliado adicionando o corante hidrofílico Rhodamina B na fase aquosa. As partículas obtidas na saída do dispositivo possuíam coloração vermelha, referente à boa retenção do corante hidrofílico. Desta forma, conclui-se que os microgéis obtidos pela técnica da microfluídica poderão ser utilizados na encapsulação de compostos hidrofílicos, inclusive aqueles sensíveis à temperatura, como as vitaminas e probióticos, na imobilização de proteínas e enzimas, bem como, na entrega de drogas, pois além de apresentarem baixa polidispersidade na distribuição de tamanho das partículas mostraram elevada capacidade de retenção do corante utilizado para simular o composto ativo de interesse Abstract: Emulsification in microfluidic devices is used for the production of droplets with reduced diameter and monodisperse particle size distribution. Gelation of the disperse phase of water in oil emulsions leads to formation of microgels with high potential for the encapsulation of active compounds. Small particle size allows more efficient release of the bioactive at the target site. This work aimed to study the production of gellan microgel using microfluidic devices through flow- focusing technique. Gellan gum concentration of 0.6% (w/w) and calcium acetate (gelling agent) in concentrations of 0.5 and 2.0% (w/w) were used for the formation of microgels. In the first step, it was evaluated of the droplets formation regime at different flow rates of the phases and flow rate ratio of the dispersed and continuous phases of water-in-oil emulsions, composed by dispersed phase of water or gellan aqueous solutions and continuous phase constituted of a mixture composed of soybean oil and the emulsifier polyglycerol polyricinoleate (PGPR). The real velocity of the phases within the microfluidic devices and dimensionless numbers of Reynols, Capilar and Weber that describe the flow of fluids in microchannels were also evaluated. By controlling the process conditions and the input flow rate of dispersed and continuous phases, variations in the drop formation regime were observed which varied from dripping to the jetting regime, such variation exerted strong influence on droplet size. In general, the real flow rate (calculated values) was lower than those applied by pump, which was related with limitations of the size of channels and high viscosity of the phases. Reynolds, Capilar and Weber numbers calculated from the real velocity were smaller compared with the values obtained using the speed imposed by pump. In the next step, gellan microgels were produced the microchannel and characterized by droplet size distribution and optical microscopy. The microgels exhibit uniform and spherical shape and highly monodisperse distribution size. Potential use as gellan microgels as encapsulating matriz of active compounds was evaluated by adding the hidrophilic dye, Rhodamine B, in the aqueous phase. Results showed a low polydispersity and high hidrophilic compound retention capacity, indicating that microgels obtained by microfluidic technique may be used for the encapsulation of hydrophilic compounds that are sensitive to temperature, such as vitamins, probiotics and immobilization of proteins and enzymes, as well as in drug delivery Mestrado Engenharia de Alimentos Mestra em Engenharia de Alimentos CNPQ CAPES FAPESP FINEP

Orientador: Nelson Eduardo Durán Caballero Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Neste trabalho nanofibras de quitosana/poli (óxido de etileno) (PEO) (5:1) com nanocristais de celulose (NCC) foram produzidas com sucesso por eletrofiação e foi verificado o efeito da adição dos NCC nas propriedades das nanofibras obtidas. Os ensaios de eletrofiação foram realizados com amostras de NCC obtidas por hidrólise ácida. A eletrofiação de soluções de quitosana, sem e com NCC, resultaram na formação de muitas gotas (beads). Portanto, foi necessário adicionar o PEO nas soluções. Embora a adição de PEO tenha favorecido a formação de fibras, as soluções de quitosana/PEO sem NCC geraram também gotas enquanto que as soluções de quitosana/PEO contendo NCC resultaram em fibras uniformes. As soluções de quitosana/PEO com NCC apresentaram maior viscosidade em relação à solução sem NCC, o que pode ter favorecido a formação de fibras uniformes. As soluções de quitosana/PEO contendo 10% (m/m) de NCC produziram fibras mais finas em relação às soluções com 5% (m/m) de NCC provavelmente devido à maior condutividade da solução. Análises termogravimétricas mostraram que os NCC interferem na decomposição do PEO, mas sem prejudicar o desempenho do material. As nanofibras de quitosana/PEO contendo NCC apresentaram menor cristalinidade em relação às nanofibras sem NCC. Resultados de ensaios com células em culturas de fibroblastos 3T3 mostraram que as nanofibras de quitosana/PEO (com 10% de NCC) promoveram a adesão celular e mantiveram a morfologia celular característica o que sugere um potencial dessas nanofibras para aplicações em engenharia de tecidos Abstract: In this work chitosan/ poly (ethylene oxide) (PEO) (5:1) nanofibers with cellulose nanocrystals (CNC) were successfully produced by the electrospinning technique and the effect of the addition of CNC on the nanofibers properties was evaluated. The electrospinning assays were performed with samples of CNC obtained by acid hydrolysis. The electrospinning of chitosan solutions, with and without CNC, resulted in the formation of many drops (beads). Therefore, it was necessary to add PEO on solutions. Although the PEO addition has favored the fiber formation, the chitosan/PEO solutions without CNC showed beads while chitosan/PEO solutions with CNC resulted in uniform fibers. The chitosan/PEO solutions with CNC showed higher viscosity compared to the solution without CNC, which may have favored the formation of uniform fibers. Solutions of chitosan/PEO containing 10% (w/w) of CNC produced thinner fibers compared to solutions containing 5% (w/w) of CNC probably due the higher solution conductivity. Thermogravimetric analysis (TGA) showed that the CNC has an effect on the PEO decomposition, however, it does not impair the performance of the material. The chitosan/PEO nanofibers with CNC showed lower crystallinity compared the nanofibers without CNC. Results from cell assay in cultures of 3T3 fibroblasts showed that the chitosana/PEO nanofibers (with 10% of CNC) promoted cell attachment and maintained the characteristic cell morphology which suggests potential applications of these nanofibers in cell tissue engineering Doutorado Físico-Química Doutora em Ciências

Orientador: Lucimara Gaziola de la Torre Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: O estudo de processos de produção de nanopartículas poliméricas, mais especificamente a quitosana (CHI), para aplicações em vacinação/terapia gênica é um desafio. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento do processo de produção de nanopartículas de CHI com o agente reticulante tripolifosfato de sódio (TPP), sendo dividido em 3 etapas. A primeira etapa consistiu na produção destas partículas, avaliando a influência do pH da solução inicial de CHI (pH 4; 5 e 5,5). Para isso, utilizou-se um sistema de reator com chicanas e agitação mecânica com impelidor do tipo cowles facilmente escalonável. A caracterização físico-química das nanopartículas permitiu verificar as diferenças das partículas produzidas nos diferentes pH¿s. Um estudo de estabilidade simulando o ambiente de aplicação biológica foi realizado para avaliar as nanopartículas produzidas em pH¿s diferentes e verificou-se que as partículas produzidas nos pH¿s menores apresentaram maior estabilidade no período estudado (4 horas). A avaliaçãp biológica dos complexos preparados (DNA-CHI/TPP), em termos de transfecção in vitro em células HeLa indicou que não houve diferença entre as partículas produzidas nos diferentes pHs. A segunda, etapa do trabalho avaliou a influência da temperatura durante o processo de produção de nanopartículas de CHI/TPP utilizando o mesmo sistema anteriormente descrito. Foram avaliadas três diferentes condições isotérmicas e também a variação de temperatura ao longo da gelificação ionotrópica. Para este último caso, obteve-se nanopartículas com índice de polidispersidade significativamente menor do que os processos isotérmicos. 2 porcentagens de DNA (10 e 40% m/m) foram incoporadas às nanopartículas e a diferença em termos de pDNA incoporado apresentou diferentes eficiências de transfecção em células A293 ao longo do tempo, indicando uma liberação sustentada. Em termos de citotoxicidade, observou-se queda da viabilidade celular após 120 horas de incubação, sem ocorrer dependência da dose. Na terceira etapa realizou-se o uma análise exploratória para o desenvolvimento de um processo microfluídico para produção de partículas de CHI/TPP. Dois métodos foram estudados: focalização hidrodinâmica e emulsão temporária. O processo de emulsão temporária não foi reprodutível visto que a finalização desta etapa foi comprometida devido a precipitação da quitosana nos microcanais. As condições avaliadas para o método de focalização hidrodinâmica geraram nanopartículas de CHI/TPP com alto índice de polidispersidade. Este trabalho apresenta uma nova área de desenvolvimento de processos de produção de partículas poliméricas Abstract: The study of polymeric nanoparticle production process, specifically chitosan (CHI), for gene vaccine/therapy application is a challenge. This work aims to the development of production process of chitosan (CHI) with the crosslinking agent pentasodium triphosphate (TPP), and it was divided into three steps. The first step was the production of these nanoparticles evaluating the influence of pH of chitosan solution (pH 4; 5; 5.5). For this purpose, the system used was a reactor with baffles, mechanical stirring with cowles impeller, easy to scale up. Physico-chemical characterization reveals the difference between the produced nanoparticle in the different pH¿s. One stability tests simulating the biological application environment was carried out to evaluate the nanoparticle produced in different pH¿s and it was possible to verify that the nanoparticles produced in lower pH¿s presented higher stability at the evaluated period (4 hours). The biological study of the prepared complexes (DNA-CHI/TPP), in terms of in vitro tranfection in in HeLa cells indicated no difference between between the nanoparticles produced in the different pHs. The second step of this work studied the influence of temperature the CHI/TPP nanoparticles production using the same system as previously reported. Three isothermal conditions and also temperature variation during the ionic gelation were tested. For this last condition, nanoparticles produced were significantly smaller in terms of PDI if compared to the isothermal process. 2 percentage of pDNA were incorporated (10 and 40% w/w) to the nanoparticles and the difference in terms of amount of pDNA showed different transfection efficiency in A293 cells over the time, suggesting sustained release capability. In terms of cytotoxicity, it was noticed that the cell viability decreased after 120 hours of incubation, and it is no dose-dependent. The third step was the exploratory investigation of microfluidic processes to obtain CHI/TPP nanoparticles. Two methods were studied: (i) temporary emulsion and (ii) hydrodynamic flow focusing. The temporary emulsion process was not reproducible since this step was not concluded due to the chitosan precipitation inside the microchannels. In hydrodynamic flow focusing, CHI/TPP nanoparticles presented high values of polydispersity index at the studied conditions. This work presents new area in the development of polymeric nanoparticles production processes. Keywords: chitosan nanoparticles, sodium triphsosphate, pH, temperature, plasmidial DNA, microfluidic, HeLa cells, A293 cells Doutorado Engenharia Química Doutora em Engenharia Química

Orientador: Rosiane Lopes da Cunha Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Microemulsões (ME) e cristais líquidos (CL) são sistemas auto-organizáveis com potencial capacidade de solubilização de compostos lipofílicos e hidrofílicos. Microemulsões são formadas por gotas de tamanho reduzido e apresentam aspecto translúcido, enquanto os cristais líquidos apresentam estrutura mais complexa, com fases lamelares, hexagonais ou cúbicas. Entretanto, o estudo de ME e CL compostos por ingredientes biocompatíveis ainda é restrito, assim como a avaliação dos efeitos de cada componente e da temperatura na estrutura e reologia dos sistemas. Desta maneira, o objetivo deste trabalho foi avaliar a estrutura e reologia de ME e CL compostos por água, misturas de surfactantes (Tween 80, Tween 20, Span 80, Span 20 e lecitina), triacilglicerol de cadeia média (TCM) e etanol, em diferentes proporções de TCM:etanol (1:0, 2:1 e 1:2). Diferentes estruturas e comportamentos reológicos foram obtidos dependendo da concentração de água, etanol, tipo de surfactante e temperatura. Inicialmente, o estudo de sistemas contendo somente Tween 80 como surfactante mostrou que o incremento de etanol diminuiu a região de cristal líquido e aumentou a área de microemulsão no diagrama de fases, expandindo a região de micelas reversas para maiores concentrações de água. Além disso, maiores concentrações de etanol produziram sistemas com menor tamanho de partícula (DLS), menor distância (d) entre os planos das estruturas (SAXS) e baixa pseudoplasticidade. Já a avaliação de sistemas contendo inicialmente 70 % (m/m) de Tween 80 como surfactante único e diluídos em água (linha de diluição 7) mostrou que a baixas concentrações de água formaram-se microemulsões A/O com comportamento Newtoniano e tamanho de gota nanométrico. Em concentrações intermediárias de água, cristais líquidos com elevada distância (d) entre os planos das estruturas e de reologia complexa foram produzidos, incluindo fluidos viscoelásticos e com comportamento dependente do tempo de cisalhamento (tixotrópico e anti-tixotrópico). Sistemas com concentração intermediária de água com ausência ou baixa concentração de etanol apresentaram temperatura de transição próximo a 50 °C. Estruturas cúbicas e hexagonais com comportamento do tipo gel foram produzidas a 25 °C, enquanto sistemas desordenados com menor distância (d) entre os planos da estrutura e comportamento do tipo solução diluída foram observados a altas temperaturas. Na última etapa, sistemas compostos por diferentes misturas de surfactantes foram avaliados. Estruturas do tipo micelar e hexagonal prevaleceram em sistemas compostos por Tween, enquanto estruturas lamelares foram também observadas em sistemas de Tween/Span e Tween/Lecitina. Estruturas cúbicas foram observadas somente nos sistemas Tween 80/Lecitina. Uma relação entre os parâmetros estruturais, comportamento reológico e propriedades das misturas de surfactantes (parâmetro crítico de empacotamento - P, e balanço hidrofílico-lipofílico - BHL) foi observada. Misturas de surfactantes com menor BHL produziram cristais líquidos pseudoplásticos e viscoelásticos em elevadas concentrações de surfactante. A maior pseudoplasticidade foi associada à estrutura cristalina ordenada susceptível à quebra ou reorientação sob cisalhamento. Além disso, as propriedades das misturas de surfactantes influenciaram no fenômeno de partição do etanol, levando a maiores parâmetros de cela (a) em sistemas de menor BHL. Conhecendo os efeitos da temperatura, composição, concentração e interação entre componentes, as propriedades dos sistemas, como estrutura e reologia, podem ser preditas ou moduladas de acordo com o interesse tecnológico Abstract: Microemulsions (ME) and liquid-crystals (LC) are self-assembly structures with potential ability to solubilise both lipophilic and hydrophilic components. Microemulsions are translucent systems formed by small swollen micelles, while liquid crystalline phases exhibit a more complex structure, as lamellar, hexagonal and cubic phases. However, the use of biocompatible ingredients in these systems was scarcely explored, as well as the effect of each component and temperature on the system structure and rheology. Thus, the aim of this work was to evaluate the structure and rheology of ME and LC systems formed by water, surfactant mixtures (Tween 80, Tween 20, Span 80, Span 20 and lecithin), medium-chain triacylglicerol (MCT) and ethanol, at different MCT:ethanol ratios (1:0, 2:1 and 1:2). Systems with different structures and rheology were produced according to water and ethanol concentration, surfactant type and temperature. In the first part of this work systems composed by Tween 80 as surfactant showed that the ethanol increment decreased the liquid crystalline area and increased microemulsion area in the pseudo-ternary diagram, expanding micelles production up to higher water content. Moreover, higher ethanol content produced systems with smaller particle size (DLS), smaller correlation distance (d) (SAXS) and lower pseudosplasticity. The evaluation of dilution line 7 of systems with only Tween 80 as surfactant showed that at W/O microemulsions with Newtonian behavior were produced at low water content. At intermediary water contents, liquid crystalline phases with larger correlation distance (d) and complex rheology were produced, including viscoelastic, thixotropic and anti-thixotropic behavior. Systems with intermediary water content and low water content (or absence) of ethanol showed temperature transition around 50 °C. Cubic and hexagonal structures with gel behavior were produced at 25°C, while disordered systems with smaller correlation distance and dilution solution behavior were produced at high temperatures. In the last part of this study, systems composed of different surfactant mixtures were evaluated. Micelle and hexagonal were the main phases observed on systems composed of Tween, while lamellar structures were also observed in Tween/Span and Tween/lecithin systems. Cubic structures were observed only in Tween 80/lecithin systems. A relationship between structural parameters, rheological behavior and surfactant mixture properties (critical packing parameter - CPP, and hydrophilic-lipophilic balance ¿ HLB) was observed. Surfactant mixtures with lower HLB produced pseudoplastic and viscoelastic liquid crystalline phases at high surfactant concentrations. The higher pseudoplasticity was associated with a structure susceptible to reorientation or to the structure broken under shear. In addition, characteristics of surfactant mixture affected the ethanol partition phenomenon, leading to higher lattice parameters (a) in systems with lower HLB. This discussion concerning the effects of temperature, composition, concentration and components interactions could be used to predict and design system properties, as structure and rheology, according to a variety of technological interest Doutorado Engenharia de Alimentos Doutora em Engenharia de Alimentos

Orientadores: Lucimara Gaziola de la Torre, Patrícia Cruz Bergami-Santos O texto da introdução e conclusão estão na lingua portuguesa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: Esta pesquisa teve como objetivo o desenvolvimento tecnológico de uma vacina lipossomal contendo RNA tumoral destinado à imunoterapia do câncer. Nesta estratégia, RNA total codificando o antígeno tumoral Her-2/neu extraído de linhagem de células de adenocarcinoma de mama humano SK-BR-3 foram incorporados em lipossomas catiônicos introduzidos in vitro em células dendríticas (DCs). A vacina de DCs tem a função de auxiliar o sistema imunológico a identificar antígenos tumorais para que as células cancerígenas sejam eliminadas. Porém uma das etapas críticas é a introdução (transfecção) de RNA nas DCs. Lipossomas catiônicos é uma alternativa promissora, pois além de ativarem as DCs, é capaz mediar a transfecção de ácidos nucléicos para células. A experiência prévia do grupo de pesquisa na área de lipossomas catiônicos mostrou a possibilidade da obtenção de lipossomas em larga escala para o desenvolvimento de vacina de DNA contra a tuberculose. Neste contexto, este trabalho avaliou os lipossomas catiônicos com a composição lipídica de fosfatidilcolina natural de ovo (EPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOTAP) e 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano (DOPE), na respectiva proporção molar de 50/25/25%. Metodologicamente, o trabalho foi dividido em quatro partes: na primeira parte foi apresentada uma visão geral do trabalho desenvolvido, demonstrando o potencial dos lipossomas catiônicos complexados com RNA na imunoterapia do câncer. Na segunda parte do trabalho investigaram-se os efeitos dos lipossomas produzidos através do processo laboratorial na diferenciação/maturação das DCs in vitro e as DCs estimuladas por estes lipossomas, na indução da proliferação de linfócitos T, resultando em lipossomas catiônicos incorporados pelas DCs, com a capacidade de ativar as DCs in vitro e de induzir proliferação de linfócitos T. A terceira parte do trabalho teve como finalidade a otimização da produção dos lipossomas catiônicos obtidos através do método de injeção de etanol utilizando a ferramentas estatísticas, obtendo lipossomas com menor polidispersidade e tamanho, que demonstraram in vitro serem incorporadas e ativarem as DCs e induzirem a proliferação de linfócitos T. A última etapa refere-se ao estudo da incorporação do RNA nos lipossomas catiônicos produzidos através do processo escalonado otimizado e comparado com o laboratorial no intuito de serem internalizados pelas DCs, transfectar o RNA e induzir a proliferação de linfócitos T através das DCs. Os resultados demonstraram que os complexos foram internalizados pelas DCs e que estas são capazes de induzir a proliferação de linfócitos T, porém há necessidade de se obter a condição ótima de transfecção. Dessa forma, conclui-se que os lipossomas catiônicos em questão têm potencial para serem usados como ferramenta em futuras estratégias na imunoterapia do câncer Abstract: This research aimed at the technological development of a liposomal vaccine containing tumor RNA for cancer immunotherapy. In this strategy, total RNA encoding the Her-2/neu tumor antigen extracted from cell line of human breast adenocarcinoma SK-BR-3 were incorporated into cationic liposomes, which were introduced in vitro into dendritic cells (DCs). DCs vaccine has the function of helping the immune system to identify tumor antigens in order to eliminate cancerous cells. However, one of the critical steps is the introduction (transfection) of RNA in DCs. Cationic liposomes are a promising alternative, because besides activating DCs, they are able to mediate transfection of nucleic acids into cells. Previous work of our research group in the cationic liposomes field developed a liposomal nanostructure obtained by a scale up process containing DNA vaccine against tuberculosis. In this context, this work evaluated the cationic liposomes composed by egg phosphatidylcholine (EPC), 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP) and 1,2-dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), at 50/25/25% molar proportion respectively. Methodologically, the present work was carried out in four mean steps: in the first step, it was carried out an overview of all work, showing the relevancy of cationic liposomes complexed with RNA for cancer immunotherapy. The second part of this work investigated the effects of liposomes produced via laboratory process upon DCs differentiation/maturation in vitro and induction of T lymphocytes proliferation by DCs stimulated with these liposomes, resulting in cationic liposomes incorporated by DCs, capable to activate DCs in vitro and to induce proliferation of T lymphocytes. The third part of the work aimed at optimizing the production of cationic liposomes obtained via the ethanol injection method using statistical tools, obtaining liposomes with smaller size and polydispersity, which demonstrated to be incorporated and activate DCs in vitro and to induce T lymphocytes proliferation. The last step refers to the study of RNA incorporation in the cationic liposomes produced via optimized scalable process compared to the laboratory process in order to be internalized by DCs, transfected RNA and to induce T lymphocytes proliferation by DCs. The results showed that the complexes were internalized by DCs and they are able to induce T lymphocytes proliferation, however we still have to obtain the optimal transfection condition. In sum, we conclude that the cited cationic liposomes can be used as a potential tool in further strategies in cancer immunotherapy Mestrado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Mestra em Engenharia Química

Orientadores: Patrícia da Silva Melo, Priscyla Daniely Marcato Gaspari Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Queimaduras representam um problema de saúde pública, gerando um gasto anual de cerca de R$ 55 milhões ao Sistema Único de Saúde (SUS). Os produtos destinados ao tratamento de queimaduras são em sua grande maioria importados, tornando relevantes estudos que visem ao desenvolvimento de materiais com características adequadas ao tratamento e produzidos a partir de matérias-primas de baixo custo e fácil obtenção. O objetivo deste trabalho foi avaliar os possíveis efeitos tóxicos e o potencial de cicatrização de S-Nitrosoglutationa (GSNO) encapsulado em nanopartículas poliméricas (alginato-quitosana e poli (?-caprolactona) (PCL) recobertas por quitosana) e de nanopartículas de prata (AgNPs). O GSNO foi sintetizado através de reação de S-Nitrosação direta de glutationa e caracterizado por espectrofotometria. As nanopartículas de alginato-quitosana (AG/CS) contendo GSNO foram preparadas através do método de gelificação iônica. As nanopartículas de PCL recobertas por quitosana (PCL/CS) e contendo GSNO foram preparadas através do método de dupla emulsão (água/óleo/água) e evaporação do solvente. Ambas as nanopartículas foram caracterizadas por espectroscopia de correlação de fótons (ECF) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). As AgNPs foram produzidas extracelularmente por método biotecnológico utilizando-se o fungo Fusarium oxysporum e caracterizadas por ECF e microscopia eletrônica de transmissão (MET). A toxicidade in vitro das nanopartículas foi avaliada através de ensaios de citotoxicidade utilizando-se cultura de células de linhagens pré-estabelecidas e o potencial de cicatrização foi avaliado através de indução de queimadura térmica em ratos Wistar machos, os quais foram posteriormente eutanaziados para avaliação da toxicidade in vivo das nanopartículas. As AG/CS contendo GSNO apresentaram diâmetro médio de 321,0 ± 12,2 nm e potencial Zeta de +37,6 ± 0,6 mV. As PCL/CS contendo GSNO apresentaram-se esféricas, com diâmetro médio de 448,6 ± 35,38 nm e potencial Zeta de +23,11 ± 4,75 mV. As AgNPs apresentaram-se esféricas e altamente estáveis, com diâmetro médio de 7,3 ± 3,0 nm e potencial Zeta de -31,1 ± 2,09 mV. As nanopartículas apresentaram-se pouco tóxicas in vitro e in vivo. O tratamento das lesões com as nanopartículas reduziu a área lesionada em praticamente 100% após 35 dias, diminuindo o tempo necessário para a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos, e revertendo o processo inflamatório mais rapidamente. Nossos resultados indicam que os sistemas nanoparticulados estudados podem fornecer uma nova e eficaz direção terapêutica para o tratamento de queimaduras Abstract: Burn injuries represent a public health problem, generating an annual cost of about R$ 55 million to the Brazilian Unified Health System. The products for the treatment of burns are mostly imported, so studies aimed at developing materials with appropriate characteristics to the treatment and produced from cheap raw materials and easily obtained are relevant. The aim of this study was to evaluate the possible toxic effects and healing potential of S-Nitrosoglutathione (GSNO) encapsulated in polymeric nanoparticles (alginate-chitosan and chitosan-coated poly (?-caprolactone) (PCL)) and silver nanoparticles (AgNPs). GSNO was synthesized by direct S-Nitrosation reaction of glutathione (GSH) and characterized by spectroscopic analysis. Alginate-chitosan nanoparticles (AG/CS) loaded with GSNO were prepared through ionic gelation method. Chitosan-coated PCL nanoparticles (PCL/CS) loaded with GSNO were prepared by the double emulsion method (water/oil/water) and solvent evaporation. Both of the nanoparticles were characterized by dynamic light scattering (DLS) and scanning electron microscopy (SEM). AgNPs were produced extracellularly by a biotechnological method using the fungus Fusarium oxysporum and characterized by DLS and transmission electron microscopy (TEM). The in vitro toxicity of the nanoparticles was assessed through cytotoxic assays using cell culture of predetermined strains and healing potential was evaluated through thermal burn induced in male Wistar rats, which were subsequently euthanized for evaluation of the in vivo toxicity of the nanoparticles. AG/CS loaded with GSNO had an average diameter of 321.0 ± 12.2 nm and Zeta potential of +37.6 ± 0.6 mV. PCL/CS loaded with GSNO were spherical, with an average diameter of 448.6 ± 35.38 nm and Zeta potential of +23.11 ± 4.75 mV. AgNPs were spherical and highly stable, with an average diameter of 7.3 ± 3.0 nm and Zeta potential of -31.1 ± 2.09 mV. The nanoparticles were slightly toxic in vitro and in vivo. The treatment of the burns with the nanoparticles reduced the burned area in almost 100% after 35 days, decreasing the required time for fibroblasts differentiation into myofibroblasts, and reversing the inflammatory process faster. Our results showed that the studied nanoparticulated systems may provide a novel and effective therapeutic direction for the treatment of burn injuries Mestrado Bioquímica Mestra em Biologia Funcional e Molecular