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To prevent health risks associated with the consumption of shellfish contaminated with BTXs in France, a working group was set up by the French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety (Anses). One of the aims of this working group was to propose a guidance level for the presence of BTXs in shellfish.; International audience; Brevetoxins (BTXs) are marine biotoxins responsible for neurotoxic shellfish poisoning (NSP) after ingestion of contaminated shellfish. NSP is characterized by neurological, gastrointestinal and/or cardiovascular symptoms. The main known producer of BTXs is the dinoflagellate Karenia brevis, but other microalgae are also suspected to synthesize BTX-like compounds. BTXs are currently not regulated in France and in Europe. In November 2018, they have been detected for the first time in France in mussels from a lagoon in the Corsica Island (Mediterranean Sea), as part of the network for monitoring the emergence of marine biotoxins in shellfish. To prevent health risks associated with the consumption of shellfish contaminated with BTXs in France, a working group was set up by the French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety (Anses). One of the aims of this working group was to propose a guidance level for the presence of BTXs in shellfish. Toxicological data were too limited to derive an acute oral reference dose (ARfD). Based on human case reports, we identified two lowest-observed-adverse-effect levels (LOAELs). A guidance level of 180 µg BTX-3 eq./kg shellfish meat is proposed, considering a protective default portion size of 400 g shellfish meat.

L’Anses a été saisie le 04 avril 2017 par la Direction générale de la concurrence, de la consommation et de la répression des fraudes pour la réalisation de l’expertise suivante : demande d’avis relatif à la teneur maximale en cadmium pour les algues destinées à l’alimentation humaine.CONTEXTE ET OBJET DE LA SAISINELa consommation d’algues alimentaires est un phénomène émergent en France et en Europe notamment en raison du succès de la restauration japonaise et de la consommation de sushis.Actuellement, la réglementation de l’Union européenne ne fixe pas de teneur maximale en cadmium dans les algues alimentaires destinées à la consommation humaine directe ou utilisées comme ingrédients de denrées alimentaires.Le règlement (CE) n°1881/20062 prévoit une teneur maximale en cadmium de 3,0 mg.kg-1 dans les compléments alimentaires tels que vendus, composés exclusivement ou principalement d’algues marines séchées ou de produits issus d’algues marines.Par ailleurs, le Conseil supérieur d’hygiène publique de France (CSHPF) avait émis suite à ses réunions du 14 juin 1988, du 13 décembre 1988 et du 9 janvier 1990 une liste d’algues alimentaires autorisées en alimentation humaine, assortie de recommandations liées à des teneurs maximales en éléments traces métalliques. Le CSHPF préconise une concentration en cadmium dans les algues alimentaires inférieure à 0,5 mg.kg-1 de poids sec.Des dépassements fréquents de cette concentration en cadmium recommandée par le CSHPF sont constatés par la Direction générale de la concurrence, de la consommation et de la répression des fraudes (DGCCRF) à la suite de prélèvements et d’analyse des algues alimentaires.Les informations fournies par les tutelles dans le courrier de saisine indiquent que « les résultats des analyses, disponibles dans la base de données « CONTAMINE », mettent en évidence des dépassements très fréquents de la concentration maximale en cadmium recommandée par le CSHPF (0,5 mg.kg-1 poids sec).En 2013 : 6 échantillons d’algues sur les 13 analysés contenaient une concentration en cadmium supérieure à 0,5 mg.kg-1 de poids sec, avec:- 1 algue nori d’Argentine : 9,4 mg.kg-1;- 2 algues wakamé de Chine : 1,7 et 2,2 mg.kg-1;- 3 algues séchées de Chine : 2,6, 3 et 3,1 mg.kg-1.En 2014 : 2 échantillons d’algues sur les 9 analysés contenaient une concentration en cadmium supérieure à 0,5 mg.kg-1 de poids sec, avec :- 1 algue nori d’origine inconnue : 2,1 mg.kg-1;- 1 algue wakamé du Japon : 2,9 mg.kg-1.En 2015 : 4 échantillons d’algues sur les 6 analysés contenaient une concentration en cadmium supérieure à 0,5 mg.kg-1 de poids sec, avec :- 1 algue nori de Chine : 2,8 mg.kg-1;- 1 échantillon d’algues marines grillées de Chine : 1,9 mg.kg-1;- 1 échantillon d’algues séchées de Chine : 1,7 mg.kg-1;- 1 échantillon de mélanges d’algues séchées françaises : 1 mg.kg-1.Ces constatations sont confirmées par les résultats d’analyses transmis par le Centre d’Etude et de Valorisation des Algues (CEVA) joints à la saisine. Parmi les 343 échantillons d’algues analysés, 108 (soit 31 %) contenaient une concentration en cadmium supérieure à 0,5 mg.kg-1 de poids sec. Les services de la DGCCRF rencontrent des difficultés pour gérer les dépassements constatés et définir les suites à donner. En effet, il est délicat de conclure à un risque potentiel pour la sécurité des consommateurs sur la base du seul dépassement de la valeur recommandée par le CSHPF qui est particulièrement ancienne (1990) et qui n’a peut-être pas été établie selon une évaluation des risques rigoureuse. Par ailleurs, cette valeur est contestée par les opérateurs qui rencontrent des difficultés pour la respecter. »L’Anses est saisie pour un avis relatif à la teneur maximale en cadmium mis à la lumière de la valeur recommandée en 1990 par le CSHPF pour les algues destinées à l’alimentation humaine.L’avis de l’Anses est notamment sollicité :- Sur l’opportunité de maintenir les conclusions du Conseil Supérieur d’Hygiène Publique de France, émises lors de ses séances des 14 juin 1988 et 9 janvier 1990, préconisant une concentration maximale en cadmium dans les algues alimentaires de 0,5 mg.kg-1 de poids sec ;- Sur la définition d’une concentration en cadmium au-delà de laquelle les algues ne devraient pas être mises sur le marché. Les modalités de consommation des algues pourraient être, le cas échéant, prises en compte pour déterminer des teneurs différentiées ;- Sur l’opportunité de définir des recommandations de consommation des algues.

Les cyanobactéries sont des bactéries photosynthétiques à Gram négatif dont la pigmentation varie du bleu-vert au rouge. Elles sont encore parfois désignées, à tort du point de vue biologique, sous le terme d’algues bleues. Les cyanobactéries se développent dans les milieux terrestres et aquatiques, qu’ils soient saumâtres, marins ou dulçaquicoles. Lorsque les conditions environnementales (température, nutriments) leur sont favorables, elles peuvent alors proliférer de manière massive et rapide (en quelques jours), on parle alors d’efflorescence (ou « bloom » en anglais). Dans certains cas, ces proliférations entraînent un changement de couleur de l’eau, une odeur nauséabonde et/ou leur accumulation à la surface de l’eau. Certaines espèces de cyanobactéries produisent des toxines appelées cyanotoxines qui peuvent présenter des effets néfastes pour la santé humaine et animale. La présence de cyanobactéries est observée de plus en plus fréquemment, sur tous les continents, expliquant la préoccupation internationale croissante au regard des conséquences écologiques, sanitaires et économiques associées.En 1998, le programme EFFLOCYA, initié par les ministères en charge de la santé et de l’environnement, a mis en évidence le fait que la prolifération de cyanobactéries capables de libérer des toxines dans les eaux brutes utilisées pour la production d’eau destinée à la consommation humaine (EDCH) et les eaux de baignades constitue un risque sanitaire émergent.Suite à ces travaux, le ministère chargé de la santé a saisi en 2001 l’Agence française de la sécurité sanitaire des aliments (Afssa) afin d’effectuer une évaluation des risques liés à la présence de cyanobactéries dans les EDCH. Cette demande a été complétée en mars 2004 par une saisine de l’Agence française de sécurité sanitaire de l’environnement et du travail (Afsset) par les ministères chargés de l’environnement et de la santé. L’Afsset devait évaluer les risques sanitaires encourus par les baigneurs et les autres usagers des plans et cours d’eau et proposer des valeurs limites de qualité relatives à la concentration de cellules et/ou toxines dans les eaux de baignade. En juillet 2006, les deux agences ont publié un rapport commun (Afssa – Afsset, 2006) en réponse à ces deux saisines.L’Agence recommandait alors d’acquérir des connaissances sur les toxines et les ressources dans le but de pouvoir évaluer les risques liés aux cyanotoxines. C’est ainsi que depuis la parution de ce rapport, de nombreux résultats d’analyses de cyanotoxines et cyanobactéries dans les ressources utilisées pour produire de l’EDCH, dans les EDCH elles-mêmes et les eaux récréatives ont été colligés par les Agences régionales de santé (ARS).Ces données ont entre autres choses révélé la présence de cyanobactéries susceptibles de produire des cyanotoxines - pour lesquelles il n’existe aucune valeur sanitaire acceptable dans des retenues d’eau destinées à produire de l’EDCH - que ce soit en métropole ou dans les territoires ultramarins, où peu de données sont cependant disponibles. Par ailleurs, malgré les recommandations formulées en 2006, il existe toujours des difficultés et une grande disparité dans la gestion des risques des eaux de baignade contaminées par des cyanobactéries. Pour ces différentes raisons, la Direction Générale de la Santé (DGS) a sollicité l’Anses afin qu’elle actualise son expertise de 2006 à la lumière des nouvelles connaissances disponibles.[Saisine liée n°2015-SA-0206]

International audience

Dans un rapport de 2012, l'Institut français de recherche pour l'exploitation de la mer (Ifremer) mettait en évidence la présence de pinnatoxines (PnTX), produites par le dinoflagellé Vulcanodinium rugosum, dans des moules de l’étang d’Ingril (Hérault). Les concentrations variaient fortement selon les années (2010, 2011 et 2012), avec un maximum de 1244 μg de PnTX G par kg de coquillages en poids frais en 2010 (rapport Ifremer, septembre 2012, Pinnatoxines en lien avec l’espèce Vulcanodinium rugosum). En juillet 2015, une concentration de 1143 μg de PnTX G par kg de coquillages a été rapportée par l’Ifremer.La présence de ces toxines pourrait expliquer des cas de discordance entre les résultats obtenus par le bioessai sur souris et ceux obtenus par analyse chimique (LC-MS/MS) observés dans les moules de l’étang d’Ingril dans le cadre du dispositif de vigilance pour les biotoxines marines lipophiles dans les coquillages, piloté par la DGAL. Par ailleurs, des travaux de l’Université de Trieste, menés en collaboration avec le CNRS (Gif-sur-Yvette) et l’Anses (Fougères), ont établi une dose létale à 50% (DL50) d’environ 200 μg/kg pc chez la souris par gavage (rapport Anses-Université de Trieste-CNRS 2014).

Dans un rapport de 2012, l'Institut français de recherche pour l'exploitation de la mer (Ifremer) mettait en évidence la présence de pinnatoxines (PnTX), produites par le dinoflagellé Vulcanodinium rugosum, dans des moules de l’étang d’Ingril (Hérault). Les concentrations variaient fortement selon les années (2010, 2011 et 2012), avec un maximum de 1244 μg de PnTX G par kg de coquillages en poids frais en 2010 (rapport Ifremer, septembre 2012, Pinnatoxines en lien avec l’espèce Vulcanodinium rugosum). En juillet 2015, une concentration de 1143 μg de PnTX G par kg de coquillages a été rapportée par l’Ifremer.La présence de ces toxines pourrait expliquer des cas de discordance entre les résultats obtenus par le bioessai sur souris et ceux obtenus par analyse chimique (LC-MS/MS) observés dans les moules de l’étang d’Ingril dans le cadre du dispositif de vigilance pour les biotoxines marines lipophiles dans les coquillages, piloté par la DGAL. Par ailleurs, des travaux de l’Université de Trieste, menés en collaboration avec le CNRS (Gif-sur-Yvette) et l’Anses (Fougères), ont établi une dose létale à 50% (DL50) d’environ 200 μg/kg pc chez la souris par gavage (rapport Anses-Université de Trieste-CNRS 2014).

Voltage-gated sodium channels (Nav) are molecular targets of clinically used drugs for treatments of various diseases (epilepsy, chronic pain, cardiac arrhythmia…) and also of numerous animal and plant neurotoxins. The development of easy-to-use screening assays for searching new ligands from chemicals libraries, animal venoms or plant extracts represents a challenge of a great interest to generate therapeutic hits. Here, we used the mammalian GH3B6 pituitary cell line, which constitutively expresses three different neuronal Nav channel isoforms (Nav1.2, Nav1.3 and Nav1.6), to identify novel compounds of pharmacological interest from a library of in-house vegetal alkaloids. The screening is based on a method using Voltage-Sensor Probes (VSPs) that we adapted to detect both activators and blockers of Nav channels. Over the 84 pure alkaloids or plant extracts that were screened, 17 increased the VSP signal. They operated as gating modifier, showing an action mechanism similar to that of batrachotoxin (BTX), known to strongly inhibit Nav channel inactivation. The remaining 67 plant products were assessed for their potency to inhibit BTX-induced VSP signal. We further selected 11 alkaloids as efficient Nav channels inhibitors. We focused our attention on two structural analogs belonging to the aporphine family, liriodenine and oxostephanine, which differ only by a methoxy group. Whereas liriodenine has been already described as a Nav channels blocker, oxostephanine has not been yet documented as an ion channel modulator. In conclusion, the novel VSPs-based screening assay we developed is a suitable method to challenge the discovery and to assess the activity of novel ligands on Nav channels.

International audience; and the United States of America, attended this meeting organized by the French Society of Toxinology (SFET, www.sfet.asso.fr). Should a reminder be appropriate, please note that the SFET missions aim at (i) promoting research in all domains concerning the venoms and toxins from animal, vegetal or microbial origins, i.e. the chemical, immunological, environmental, pharmacological, physiological domains, along with mode of action, structure-function relationships, drug-design and applicability questionings; (ii) favouring the meeting of colleagues in the field, communication to other scientists, education and training at all levels, and dissemination to more general audiences; (iii) improving fundamental research on toxinology and enhance its relevance and applications. We warmly thank all those who made this meeting achievable, and we particularly acknowledge the cogent contribution of Professor Alan Harvey, Editor-in-chief of Toxicon, who made the publication of the RT21 proceedings possible as a Special Issue focused on Freshwater and Marine toxins. This Special Issue gathers 16 original peer-reviewed articles and reviews, and 48 abstracts, all reflecting those works and data that were presented during the SFET meeting. For decades, scientists have been working on terrestrial toxins. The main reason is that the accessibility to the producers-venomous animals, pathogenic bacteria or poisonous plants-and the related human health issues in endemic areas have motivated pharmacologists and physiologists to study the mode of action of natural toxic molecules found just outside of laboratories. Moreover, natural products have long been used in traditional medicine as drugs to treat a variety of human diseases. A well-known example is morphine, which keeps being the most widely used molecule to alleviate pain. However, the exploration of shorelines and deep oceans with modern equipment, the recreational use of seas and the emergence of eutrophication of freshwaters (a process where water bodies receive excess nutrients that stimulate excessive phytoplankton and bacteria growth) in occidental and developing countries have contributed to the molecular identification of toxic cocktails from aquatic producers. The human colonization of coastal waters and the growing activity along the rivers have increased the probability of human interactions with toxin producers. Nowadays, sea snakes, cone snails, cnidarians, toxic microalgae, parasitic bacteria are common features of the global concern in modern toxicology. Moreover, should one take into account the recent approval of marine toxins as chemical templates to design new therapeutic agents directed toward major human pathologies-i.e. pain and cancer (Prialt and Yondelis, respectively)-one would be convinced that pharmacological active molecules found underwater may represent an endless pipeline for the next generation of natural drugs.

Voltage-gated sodium channels (Nav) constitute the molecular targets of clinically used drugs for treatments of various diseases (epilepsies, chronic pain, cardiac arrythmies…) and also of numerous toxins from animals and plants. The development of useful screening assay for the discovery of new ligands in/ from chemicals libraries or animal venoms and either plant extract still represents a challenge of great interest. Here, we used a mammalian GH3 cells that constitutively express at least three different brain Nav channels isoforms (Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3 and Nav1.6) in order to identify in a library of in-house natural alkaloids, novel compounds of therapeutical interest. For this screening, we developed a method based on the use of Voltage Sensor Probes (VSPs) that we adapted to detect both activators and blockers of Nav channels. Among 62 compounds tested, 5 isoquinolines appeared as potent Nav channels inhibitors. Other compounds were characterized as specific gating modifier of Nav channels. While most of these alkaloids have been already described in the literature, their abilities to act on Nav channels were unknown. In conclusion, we demonstrated the potency of this novel screening method using VSPs to identify novel ligands of Nav channels of therapeutical interests.References:1. Salat, K. et al. (2014) EOID 23:1093-11042. Yu, F.H. et al (2003) Genome Biol. 4