El Gammaherpesvirus bovino 4 (BoHV-4) es un miembro del género Rhadinovirus, de la subfamilia Gammaherpesvirinae, dentro de la familia Herpesviridae. Al igual que los demás agentes virales de esta subfamilia, se caracteriza por su capacidad linfotrópica, pudiendo establecer latencia en linfocitos y monocitos, además de infecciones citolíticas en células epiteliales y o fibroblásticas. El BoHV-4 posee genes homólogos a los celulares, como el gen de la 2β-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa, con un 81.1% de similitud con la enzima producida por células de humano. Esta enzima tiene un rol crucial en la síntesis de glucanos. Asimismo, codifica una proteína esencial para el establecimiento de latencia, las proteínas v-Bcl2 y v-Flip (productos asociados a procesos de muerte celular), y la glucoproteína gp180 que tiene un rol importante en la provisión de un escudo de O-glucanos que enmascararía los epitopes en las glucoproteínas virales, contribuyendo a la evasión de los anticuerpos neutralizantes. En contraste con la mayoría de los gammaherpesvirus, el BoHV-4 presenta la capacidad de replicar en un amplio rango de especies domésticas y silvestres, así como en una gran variedad de cultivos celulares, incluyendo líneas celulares de humanos. Además, puede producir distintos tipos de síndromes, y si bien se lo asocia con enfermedad uterina posparto en bovinos, aún no se ha podido esclarecer el rol que desempeña en esta patología. El primer aislamiento del BoHV-4 fue realizado por Bartha en Hungría, en 1963; posteriormente fue aislado en Estados Unidos. Desde entonces, más de 40 cepas diferentes han sido aisladas en todo el mundo. A partir de estas cepas se establecieron tres grandes grupos basados en su análisis genómico: el tipo Movar 33/63, que comprende las cepas europeas; el tipo DN599, conformado por las cepas americanas, y un tercer grupo que incluye cepas de búfalo africano. La capacidad del BoHV-4 de presentar variaciones genómicas ha sido demostrada en estudios genéticos de cepas de referencia. Esta variabilidad sería el resultado de eventos de recombinación entre cepas y dentro de una misma cepa. En Argentina, el BoHV-4 fue aislado y caracterizado molecularmente por Verna et al. en el año 2007 a partir de muestras de vacas abortadas. El estudio de filogenia de las cepas locales aisladas demostró un importante grado de variabilidad genómica entre las cepas circulantes, revelando la existencia de tres grupos diferentes, designados como genotipos 1, 2 y 3. Las cepas de los genotipos 1 y 2 presentaron mayor similitud con los tipos europeo y americano, respectivamente; las del genotipo 3 constituyen un nuevo grupo filogenético. Actualmente hay más de 50 aislamientos de BoHV-4 en nuestro país; el 85 % de estos se obtuvieron de muestras de mucus cérvico-vaginal de vacas que presentaron abortos. Sobre la base de la información que aporta la bibliografía internacional y los antecedentes locales se puede inferir que existen amplias diferencias en las propiedades biológicas y en el potencial patogénico del BoHV-4. Las variadas manifestaciones clínicas asociadas a las infecciones por el BoHV-4 y la heterogeneidad en los patrones de restricción del genoma viral, sugieren que las variantes genómicas podrían asociarse a variaciones en la actividad biológica de este virus. Por lo mencionado precedentemente, considerando la importancia de la presencia del BoHV-4 en Argentina en función a su relación con pérdidas reproductivas y potencialidad de este virus para infectar células humanas, el objetivo de este trabajo de tesis fue realizar un estudio de cepas virales filogenéticamente diferentes, aisladas en nuestro país, a los efectos de conocer si la diferencias genéticas están asociadas a características biológicas particulares. Para cumplir con los objetivos propuestos se desarrollaron experimentos in vitro para estudiar la actividad biológica de seis cepas argentinas pertenecientes a los tres grupos genéticos mencionados, sobre líneas celulares de diferente origen. Se analizaron la cinética de replicación viral, la manifestación de efecto citopático, la capacidad lítica, la producción de placas de infección y la capacidad de infección de células de origen humano. Luego se estudiaron los efectos de las diferentes cepas sobre su capacidad de inducir apoptosis, para lo cual se procedió a identificar cambios nucleares compatibles con esta, detectar la fragmentación del ADN y detección y análisis de los genes v-Flip y v-Bcl2. Para complementar estos estudios se realizó un experimento in vivo, mediante la infección experimental de bovinos, con el objetivo de realizar un estudio descriptivo de la distribución tisular de las cepas locales del BoHV-4 genéticamente diferentes. El estudio de cinética de replicación se realizó con las seis cepas de BoHV-4 pertenecientes a los tres grupos genéticos en las líneas celulares de origen humano (HeLa y Hep2), la línea de origen bovino MDBK y la línea Vero de riñón de mono. La cepa (08/330), correspondiente al genotipo 2, alcanzó títulos de 5 a 9 logaritmos, significativamente más altos (p < 0.05) que el resto de las cepas. La cinética de replicación de las cinco cepas restante presentó mayor variabilidad en los cultivos de HeLa y Hep2 en comparación con las líneas celulares MDBK y Vero, con títulos que variaron de 2 a 4.5 logaritmos. La cepa 12/365 (genotipo 2), no manifestó actividad viral en la fracción extracelular a las 24 horas posinfección (hpi) en ninguno de los cultivos celulares, además esta cepa mostró mayor variabilidad en la cinética en las cuatro líneas celulares. Este ensayo permitió, además, comprobar que las líneas de origen humano y de mono son susceptibles y permisivas a la infección por estas cepas locales de BoHV-4. En los distintos ensayos, para confirmar la presencia del genoma viral se modificó y optimizó una nested PCR, descripta por Fábián y Egyed (2004), para amplificar un fragmento de 271 pares de bases (pb) del ORF25, el cual codifica la proteína mayor de la cápside. La mayoría de las cepas produjo efecto citopático entre las 24 y 48 hpi en células MDBK y Hep2. En las líneas celulares HeLa y Vero, la producción de efecto se evidenció más tardíamente (72 hpi). La presentación del efecto citopático fue variable entre las cepas y entre los cultivos celulares. En el ensayo de placa de lisis, se observó una amplia variabilidad en los tamaños de las placas, principalmente entre las líneas celulares. Las cepas 09/227, 08/263 y 07/435 produjeron placas de tamaño medio (1 a 3 mm) en células MDBK, el tamaño de estas placas fue significativamente mayor (p < 0.05) con respecto a las placas producidas por las cepas 08/330 y 12/365. Por el contrario, en las células HeLa, estas cepas produjeron placas significativamente mayores (p < 0.05) que las cuatro cepas restantes. En las células Hep2 y Vero, todas las cepas produjeron placas mínimas (< 1mm). No se produjeron placas grandes (> 3mm) en ninguno de los tipos de células. Como resultado de la inmunofluorescencia directa utilizada en el ensayo de placas de infección, se observó una marcada disparidad entre las distintas cepas para ser reconocidas por los anticuerpos disponibles. Posiblemente, el uso de reactivos elaborados con anticuerpos dirigidos contra determinantes antigénicos de cepas foráneas no resultan de utilidad para la identificación efectiva de aislamientos locales. En el estudio de los efectos de las cepas de BoHV-4 sobre la inducción de apoptosis se identificaron cambios nucleares indicativos de apoptosis mediante tinción con DAPI. El mayor número de células con cambios nucleares, representado como índice relativo de apoptosis (IRA) y la mayor variabilidad entre cepas se registraron en la línea celular MDBK. En los cultivos de células Hep2 y HeLa no se evidenciaron variaciones significativas (p > 0.05) entre las cepas, al igual que en la línea Vero, en la cual se registró el IRA más bajo. Para evaluar si las cepas de BoHV-4 analizadas inducen la fragmentación del ADN se utilizaron las técnicas de electroforesis en gel de agarosa y TUNEL sobre las líneas celulares MDBK y HeLa. Solamente en las células HeLa se observó fragmentación del ADN, a las 24 hpi, en las células inoculadas con las cepas 09/508 y 08/330. Utilizando la técnica de TUNEL, los IRAs más elevados se registraron, en las células MDBK a las 24 hpi, aunque sin detectarse diferencias entre el control positivo y las seis cepas de BoHV-4 (p > 0.05). A las 48 hpi solamente las cepas 08/263 y 09/227 mostraron IRAs significativamente más elevados (p < 0.05) que ambos controles. En las células HeLa, sólo la cepa 12/365 evidenció un IRA significativamente mayor (p < 0.05) que los controles a las 48 hpi. También se analizaron los genes v-Flip y v-Bcl2 en los seis aislamientos. En las cepas 08/263 y 08/330, correspondientes al genotipo 2, no fue posible amplificar la secuencia de ninguno de estos genes. Las variaciones halladas en las cuatro cepas restantes, ocasionadas por sustituciones nucleotídicas en ambos genes, se tradujeron en cambios en las respectivas proteínas y en mayor grado en la proteína v-Flip, por lo que se podría inferir que la actividad de esta proteína presentaría variaciones dependiendo de la cepa. Si bien sólo se utilizaron cuatro cultivos celulares de distinto origen, la evaluación general de los resultados revela que las cepas de BoHV-4 analizadas no inducen elevados niveles de apoptosis. Por último, se realizó un estudio in vivo en un modelo bovino para analizar la distribución tisular, presencia, tipo y severidad de lesiones y respuesta inmune humoral. Se seleccionaron tres cepas de BoHV-4 de diferente genotipo. Se utilizaron 4 terneros de 6 meses de edad, inoculados por vía intranasal mediante aerosolización, de la siguiente manera: ternero 1 (T1) cepa 09/508 (genotipo 1), ternero 2 (T2) cepa 08/330 (genotipo 2), ternero 3 (T3) cepa 07/435 (genotipo 3) y ternero 4 (T4) control inoculado con medio de cultivo como placebo. Se extrajeron muestras de secreciones nasales, oculares y sangre con y sin anticoagulante a los 0, 7, 14 y 21 días posinfección (dpi) para la detección de genoma viral, aislamiento viral y para la búsqueda y determinación de los títulos de anticuerpos neutralizantes. La eutanasia de los animales se realizó a los 21 dpi y se extrajeron muestras de diferentes tejidos para aislamiento viral, detección de genoma viral e histopatología. No se observaron signos clínicos en ninguno de los animales. El ADN viral se detectó en leucocitos de sangre periférica (LSP) del T1 a los 21 dpi y del T2 a los 14 y 21 dpi. En las muestras de tejidos, se detectó el genoma viral en bazo, médula, ganglio trigeminal, tráquea y lóbulo piriforme del T1 (cepa 09/508); bazo, tráquea, riñón, linfonódulo retrofaríngeo y lóbulo frontal del T2 (cepa 08/330), y linfonódulo pulmonar, lóbulos frontal y piriforme del T3 (cepa 07/435). Las muestras de secreciones, tejidos y LSP del ternero control (T4) resultaron negativas. La cepa 08/330 se aisló en las secreciones oculares y nasales del T2 a los 7 dpi y la cepa 07/435 de secreciones nasales del T3. A los 14 dpi se aislaron las cepas 09/508 (genotipo 1), 08/330 (genotipo 2) y 07/435 (genotipo 3) en las secreciones nasales de T1, T2 y T3, respectivamente. Todos los aislamientos se identificaron por nested PCR. Ninguna de las cepas se aisló de los tejidos y LSP de los tres animales inoculados, y las muestras del ternero control también resultaron negativas. Durante la necropsia no se observaron lesiones macroscópicas en ninguno de los animales. Microscópicamente se observó una leve respuesta inflamatoria con infiltrado mononuclear en tejidos respiratorios y linfáticos del T1 (cepa 09/508) y T3 (cepa 07/435). En el tejido nervioso de estos animales se observó gliosis leve, neuronas colapsadas con núcleos picnóticos, citoplasma eosinofílico y cromatolisis, hipercromatosis neuronal y satelitosis leve. No se hallaron lesiones histológicas en las muestras de T2 (cepa 08/330) y T4 (control). En los sueros de los cuatro animales se observó actividad neutralizante para la cepa 08/330, al igual que para la cepa 07/435 en los T1, T2 y T3. Solamente se detectó seroconversión en T1, a los 21 dpi, cuando los sueros se enfrentaron con la cepa homóloga (09/508). Cuando se analizaron los sueros con las tres cepas no utilizadas en el ensayo in vivo (08/263, 12/365 [genotipo 2] y 09/227 [genotipo 3]) sólo se evidenció efecto neutralizante para la cepa 08/263 en T1, T3 y T4, en bajos títulos. Los hallazgos de este estudio sugieren que, aunque leves, hay diferencias en la actividad biológica de las cepas utilizadas en este trabajo, además de comprobarse que estos aislamientos locales de BoHV-4 pueden infectar células de origen humano. No obstante, a pesar de las diferencias observadas en la actividad de estas cepas de BoHV-4 in vitro, no fue posible establecer una asociación entre los grupos filogenéticos y los patrones de comportamiento biológico de cada cepa en los experimentos in vitro y en el modelo experimental in vivo. Fil: Morán, Pedro Edgardo. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Verna, Andrea E. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Pérez, Sandra E. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Bovine Gammaherpesvirus 4 (BoHV-4) belongs to the Herpesviridae family, Gammaherpesvirinae subfamily and Rhadinovirus genus. Like the other members in this subfamily, BoHV-4 is characterized by its lymphotropism, and for establishing latency in lymphocytes and monocytes. It also produces cytolytic infections in epithelial and fibroblastic cells. This virus encodes cell-homologous genes, such as the 2β-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase gene, with 81.1% similarity to the enzyme produced by human cells. This enzyme plays a crucial role in the synthesis of glucans. BoHV-4 also encodes essential proteins for the establishment of latency, the v-Bcl2 and v-Flip proteins (associated with cell death), and the gp180 glycoprotein that plays an important role in the provision of O-glucans shields, which would mask epitopes on viral glycoproteins, contributing to the evasion of neutralizing antibodies. In contrast to most gammaherpesviruses, BoHV-4 has the ability to replicate in a wide range of domestic and wild species, as well as in a wide variety of cell cultures, including human cell lines. In addition, it can produce different syndromes, and although it is associated with uterine postpartum disease in cattle, doubts persist about the role that BoHV-4 plays in this pathology. The first isolation of BoHV-4 was carried out by Bartha, in Hungary, in 1963; later, it was isolated in the United States. Since then, more than 40 different strains have been isolated around the world. Based in the genomic analysis of these strains, three large groups were established: the Movar 33/63 type, which comprises the European strains; the DN599 type, comprising the American strains, and the group that includes the African buffalo strains. The presence of genomic variations in BoHV-4 has been demonstrated in genetic studies of reference strains. This variability would be the result of recombination events among strains and within the same strain. In Argentina, BoHV-4 was isolated and molecularly characterized, by Verna et al., in 2007 from samples of aborted cows. The phylogenetic study of the isolated local strains showed an important degree of genomic variability, revealing the existence of three different groups, designated as genotypes 1, 2 and 3. The strains of genotypes 1 and 2 have greater similarity to the European and American types, respectively; and those of genotype 3 constitute a new phylogenetic group. Currently, more than 50 BoHV-4 strains have been isolated in our country; 85% of these isolates were obtained from samples of cervical-vaginal mucus from aborted cows. On the basis of the information provided by the international literature and local background, it can be inferred that there is a wide range of differences in the biological properties and the pathogenic potential of BoHV-4. The different clinical manifestations of BoHV-4 infections and the heterogeneity in the restriction patterns of the viral genome, suggest that the genomic variants could be associated to variations in the biological activity of this virus. Considering the aforementioned, the importance of BoHV-4 in Argentina, particularly in relation with reproductive losses and the potential of this virus to infect human cells, the objective of this thesis was to study phylogenetically different Argentinean BoHV-4 strains to determine whether genetic diversity is associated with their particular biological characteristics. To fulfill the proposed objectives, in vitro experiments to study the biological activity of phylogenetically divergent Argentinean strains, on cell lines from different origin, were carried out. The kinetics of viral replication, the manifestation of cytopathic effect, the lytic capacity, the production of infection plaques and the capability of the virus to infect human cell cultures were analyzed. Furthermore, the effects of the different strains on apoptosis were studied. For this purpose, nuclear changes compatible with apoptosis and DNA fragmentation were evaluated. In addition, detection and genomic analysis of the v-Flip and v-Bcl2 genes were performed. To complement these studies, a descriptive evaluation of the tissue distribution of these local BoHV-4 strains was carried out using an in vivo model of experimental infection of cattle. The study of replication kinetics was performed with six strains of BoHV-4 from different genetic groups in two human (HeLa and Hep2), one bovine (MDBK) and one simian (Vero) cell lines. The strain 08/330, corresponding to genotype 2, reached titers from 5 to 9 logarithms, significantly higher (p < 0.05) than the rest of the strains. The replication kinetics of the five remaining strains showed greater variability in HeLa and Hep2 cultures compared to the replication dynamics in the MDBK and Vero cells, with titers that ranged from 2 to 4.5 logarithms. Viral activity was not detected for strain 12/365 (genotype 2), in the extracellular fraction at 24 hpi in any of the cell cultures. Furthermore, this strain showed the greatest variability in the kinetics in the four cell lines. By this assay it was verified that the human and simian cell lines are susceptible and permissive to the infection by these BoHV-4 local strains. The presence of BoHV-4 genome in the different assays was confirmed by a nested PCR modified and optimized from that described by Fábián and Egyed (2004). This PCR amplifies a 271 bases pairs (bp) fragment of ORF25, which encodes the major protein of the capsid. Most of the strains produced cytopathic effect between 24 and 48 hours post infection (hpi) in MDBK and Hep2 cells. In HeLa and Vero cell lines, the effect was evidenced later (72 hpi). The cytopathic effects were variable among the strains and among cell cultures. In the lysis plaque assay, a wide variability in the sizes of the plaques was observed, mainly among the cell lines. Strains 09/227, 08/263 and 07/435 produced medium-sized plaques (1-3 mm) in MDBK cells, and the size of these plaques was significantly greater (p < 0.05) with respect to the plaques produced by 08/330 and 12/365 strains. On the contrary, these strains produced significantly greater plaques (p < 0.05) than the remaining four strains in HeLa cells. In Hep2 and Vero cells, all the strains produced minimum plaques (< 1 mm). Large plaques (> 3 mm) were not evident in any of the cell types. As a result of the direct immunofluorescence technique used in the fluorescent plaques assay, an evident variation was observed among the different strains to be recognized by the available antibodies. Possibly, the use antibodies directed against antigenic determinants of foreign strains is not useful for the effective identification of local isolates. Regarding the effects of BoHV-4 strains on apoptosis, nuclear changes indicative of apoptosis were identified by DAPI staining. The highest number of cells presenting nuclear changes, represented as a relative index of apoptosis (RIA) and the greater variability among strains were registered in MDBK cells. In cultures of Hep2, HeLa and Vero cells, no significant variations (p > 0.05) were observed among the strains. To evaluate whether the analyzed BoHV-4 strains induce DNA fragmentation, electrophoresis on agarose gel and TUNEL assays were used on MDBK and HeLa cells. DNA fragmentation was only observed in HeLa cells at 24 hpi in cells inoculated with strains 09/508 and 08/330. By TUNEL, the highest RIAs were recorded, in MDBK cells at 24 hpi, although differences were not detected among the positive control and the six strains of BoHV-4 (p > 0.05). At 48 hpi, only strains 08/263 and 09/227 showed significantly higher RIAs (p < 0.05) when compared with both controls. In HeLa cells, only the strain 12/365 showed a significantly higher RIA (p < 0.05) than the controls at 48 hpi. The v-Flip and v-Bcl2 genes were also analyzed in the six isolates. It was not possible to amplify the sequence of these genes in the strains 08/263 and 08/330, belonging to genotype 2. The variations found in the four remaining strains, caused by nucleotide substitutions in both genes, resulted in changes in the respective proteins, mainly in v-Flip. Thus, it can be inferred that the activity of this protein might present variations depending on the strain. Although only four cell cultures of different origin were used, the results reveal that these analyzed strains of BoHV-4 do not induce high levels of apoptosis. Finally, an in vivo study was carried out in a bovine model to analyze the tissue distribution, type and severity of lesions and humoral immune response. Three strains of BoHV-4 belonging to different genotypes were selected. Four 6 month-old calves were intranasally inoculated by aerosolization, as follows: calf 1 (C1) strain 09/508 (genotype 1), calf 2 (C2) strain 08/330 (genotype 2), calf 3 (C3) strain 07/435 (genotype 3) and calf 4 (C4) control, inoculated with culture medium as placebo. Nasal and ocular secretions, leukocytes from peripheral blood and serum samples were collected at 0, 7, 14 and 21 days post-infection (dpi) for viral genome detection, virus isolation and determination of neutralizing antibody titres. Euthanasia was performed at 21 dpi and samples were taken from different tissues for viral isolation, viral genome detection and histopathology. No clinical signs were observed in any of the animals. Viral DNA was detected in peripheral blood leukocytes (PBL) of C1 at 21 dpi and C2 at 14 and 21 dpi. In the tissue samples, the viral genome was detected in spleen, medulla, trigeminal ganglion, trachea and piriform lobe of C1 (strain 09/508); spleen, trachea, kidney, retropharyngeal lymph node and frontal lobe of C2 (strain 08/330), and pulmonary lymph node, frontal and piriform lobes of C3 (strain 07/435). Samples of secretions, tissues and PBL from the mock-infected calf (C4) were negative. Strain 08/330 was isolated in the ocular and nasal secretions of C2 at 7 dpi, and strain 07/435 from nasal secretions of C3. At 14 dpi, strains 09/508 (genotype 1), 08/330 (genotype 2) and 07/435 (genotype 3) were isolated in the nasal secretions of C1, C2 and C3, respectively. All isolates were identified by nested PCR. None of the strains was isolated from the tissues and PBLs from the three inoculated animals, and the samples from the uninfected control (C4) were also negative. No macroscopic lesions were observed in any of the animals at necropsy. The microscopical examination revealed slight inflammatory response with mononuclear infiltrate in respiratory and lymphatic tissues of C1 (strain 09/508) and C3 (strain 07/435). In the nervous tissue of these animals, mild gliosis, collapsed neurons with pyknotic nuclei, eosinophilic cytoplasm and chromatolysis, neuronal hyperchromatosis and mild satellitosis were observed. No histological lesions were found in the samples of C2 (strain 08/330) and C4 (negative control). Neutralizing activity was observed for strain 08/330 in the sera from the four animals. Similar results were obtained for strain 07/435 in the sera from C1, C2 and C3. Seroconversion was only detected in C1, at 21 dpi, when the sera were confronted with the homologous strain (09/508). Low neutralizing titers were observed only for strain 08/263 in C1, C3 and C4, when the sera were analyzed with the three strains not used in the in vivo assay (08/263, 12/365 [genotype 2] and 09/227 [genotype 3]). The findings of this study suggest that, although slight, there are differences in the biological activity of the strains used in this work; in addition, it was confirmed that these local isolates of BoHV-4 infect cells of human origin. However, in spite of the observed differences in the activity of these BoHV-4 strains in vitro, it is not possible to establish an association between the phylogenetic groups and the biological patterns of behavior of each strain in the in vitro experiments and in the in vivo experimental model.