Cepas de Streptomyces SP. Resistentes a metales pesados

CEPAS DE Streptomyces sp. RESISTENTES A METALES PESADOS Campo técnico. La presente invención pertenece al campo de la biotecnología, orientado a la biorremediación de suelos contaminados con metales pesados. Específicamente el invento está relacionado a procesos de regeneración de suelos contaminados con mercurio utilizando al menos una de cuatro cepas del género Streptomyces aisladas de minerales y concentrados de minas. Estado de la técnica La minería informal de oro usualmente produce una fuerte polución con mercurio debido al proceso de amalgación usado. Cuando la sustancias tóxicas producto de la minería informal son liberadas en el medioambiente ocasiona la infertilidad de los suelos contaminados como consecuencia de la toxicidad del mercurio. Uno de las soluciones utilizadas para recuperar los suelos contaminados es el uso de microorganismos, los cuales pueden concentrar, remover y recuperar metales de zonas contaminadas. A este proceso se le denomina biorremediación. Adicionalmente, se conoce que algunos microorganismos tienen la capacidad de biofertilizar, produciendo un efecto beneficioso para el desarrollo de las plantas. De lo ya mencionado surge la necesidad de contar con microorganismos capaces de crecer en ambientes contaminados con mercurio y otros metales pesados que puedan ser útiles en un proceso de rehabilitación de suelos. En el 2012, Koushalshahi et al. aislaron Streptomyces de sedimentos marinos en diferentes regiones del mar caspio, logrando así aislar las cepas C9, Dll y E16 con una resistencia a mercurio de 20 mg/L (20 ppm), y la cepa C2 con una resistencia a 40 mg/L (40 ppm). Los autores mencionaron que estas bacterias resistentes a metales pesados podrían ser usadas como agentes para la biorremediación. A pesar de que las cepas mencionadas del género Streptomyces aisladas por Koushalshahi et al. (2012) representan una mejora en el estado de la técnica hasta entonces conocida, se hace necesario contar con microorganismos con mayor capacidad de resistencia para que puedan sobrevivir a ambiente con mayores concentraciones de metales pesados, para que así pueda ser posible procesos de biorremediación más eficaces. Descripción de la Invención La presente invención se refiere a cuatro cepas de bacterias aisladas de minerales y concentrados de minas de los andes peruanos, y un método para la recuperación de la capacidad de germinación de semillas en ambientes contaminados con mercurio y otros metales mediante el uso de al menos una de estas bacterias. Las cepas de esta invención fueron depositadas el 30 de marzo de 2017 en el banco de Recursos Genéticos Microbianos ante la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), la cual es Autoridad Internacional de Depósito bajo el tratado de Budapest y está ubicado en Avenida Vicente Méndez. Las cepas fueron depositadas bajo número de acceso asignados son RGM2371, RGM 2372, RGM 2373, RGM 2374 a las cepas streptomyces variabilis (AB5), streptomyces sp. (C2), streptomyces variabilis (F) y Streptomyces variabilis (K1A) respectivamente. Identificación fenotípica y Caracterización Bioquímica. Las cuatro cepas (AB5, F, K1A y C2) muestran características correspondientes a Streptomyces sp. Todas crecieron en un rango de pH de 2.5 a 7, ya que fueron aisladas de cultivos ácidos. Muchos de los aislados crecieron entre 8°C y 45°C. Todos los aislados crecieron en medio con 1.5% de NaCI y mostraron una disminución en el crecimiento cuando la concentración de NaCL era incrementada, sin embargo, a 10% de NaCI siguieron creciendo (Tabla 1). Las cepas K1A y F fueron capaces de crecer en medio con 50 ppm, AB5 con 100 ppm, y C2 con 200 ppm de mercurio (Tabla 1). La tolerancia al mercurio sería debido a la bioacumulación de metales pesados o a la transformación de metales pesados. Todas las cepas fueron sensibles a 400 ppm. Secuenciación del 16S ADN ribosómico de las bacterias de acuerdo a la invención. Las secuencias 16S del ADN ribosómico de las bacterias aisladas se analizaron mediante métodos conocidos por una persona entendida en la materia. Para ello se cultivó las bacterias en un medio de cultivo líquido (por ejemplo, Glicerol-Extracto de Levadura, GYE por sus siglas en inglés), luego una muestra del cultivo se usó para extraer el ADN genómico y se amplificó selectivamente la secuencia de ADNr mediante el uso de los primers 16S 8F (5'AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG3') y el 16S 1492R (5'GGT TAC CTT GTT ACG ACT T3'). El tamaño del producto amplificado fue secuenciado en tres fragmentos que se sobreponen usando seis primers. Las secuencias de los forward primers fueron: 16S 8F, 16S 337F (5'GAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG3') Y 16S 785F (5'GGA TTA GAT ACC CTG GTA3'). Los reverse primers fueron: 16S 1492R, 16S 518R (5'GTA TTA CCG CGG CTG CTG G3'), y 16S 907R (5'CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT3'). Luego las secuencias fueron ensambladas, y se obtuvieron secuencias, que identificaban a tres cepas de Streptomyces variabilis (AB5, F y K1A) y una cepa de Streptomyces sp. (C2), con más 99% de identidad. Descripción de las secuencias: Secuencia 1: Las secuencias de AB5 es 100% homologa con la secuencia SEQ ID NOl con certificado de depósito RGM 2371, la cual se describe a continuación (GeneBank: KY608897 - Streptomyces variabilis) : 1 CCGGCCACAC TGGGACTGAG ACACGGCCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA GTGGGGAATA 61 TTGCACAATG GGCGAAAGCC TGATGCAGCG ACGCCGCGTG AGGGATGACG GCCTTCGGGT 121 TGTAAACCTC TTTCAGCAGG GAAGAAGCGA AAGTGACGGT ACCTGCAGAA GAAGCGCCGG 181 CTAACTACGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GTAGGGCGCG AGCGTTGTCC GGAATTATTG 241 GGCGTAAAGA GCTCGTAGGC GGCTTGTCAC GTCGGTTGTG AAAGCCCGGG GCTTAACCCC 301 GGGTCTGCAG TCGATACGGG CAGGCTAGAG TTCGGTAGGG GAGATCGGAA TTCCTGGTGT 361 AGCGGTGAAA TGCGCAGATA TCAGGAGGAA CACCGGTGGC GAAGGCGGAT CTCTGGGCCG 421 ATACTGACGC TGAGGAGCGA AAGCGTGGGG AGCGAACAGG ATTAGATACC CTGGTAGTCC 481 ACGCCGTAAA CGGTGGGCAC TAGGTGTGGG CGACATTCCA CGTCGTCCGT GCCGCAGCTA 541 ACGCATTAAG TGCCCCGCCT GGGGAGTACG GCCGCAAGGC TAAAACTCAA AGGAATTGAC 601 GGGGGCCCGC ACAAGCGGCG GAGCATGTGG CTTAATTCGA CGCAACGCGA AGAACCTTAC 661 CAAGGCTTGA CATACACCGG AAAGCATCAG AGATGGTGCC CCCCTTGTGG TCGGTGTACA 721 GGTGGTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTC GTGAGATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG 781 CGCAACCCTT GTCCCGTGTT GCCAGCAGGC CCTTGTGGTG CTGGGGACTC ACGGGAGACC 841 GCCGGGGTCA ACTCGGAGGA AGGTGGGGAC GACGTCAAGT CATCATGCCC CTTATGTCTT 901 GGGCTGCACA CGTGCTACAA TGGCCGGTAC AA Secuencia 2; Las secuencias de F es 100% homologa con la secuencia SEQ ID con certificado de depósito RGM 2373, la cual se describe a continuación (GeneBank: KY608897 - Streptomyces variabilis): 1 CCTTCGGGAG GGGATTAGTG GCGAACGGGT GAGTAACACG TGGGCAATCT GCCCTGCACT 61 CTGGGACAAG CCCTGGAAAC GGGGTCTAAT ACCGGATACT GACCCGCTTG GGCATCCAAG 121 CGGTTCGAAA GCTCCGGCGG TGCAGGATGA GCCCGCGGCC TATCAGCTTG TTGGTGAGGT 181 AATGGCTCAC CAAGGCGACG ACGGGTAGCC GGCCTGAGAG GGCGACCGGC CACACTGGGA 241 CTGAGACACG GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATATTGCA CAATGGGCGA 301 AAGCCTGATG CAGCGACGCC GCGTGAGGGA TGACGGCCTT CGGGTTGTAA ACCTCTTTCA 361 GCAGGGAAGA AGCGAAAGTG ACGGTACCTG CAGAAGAAGC GCCGGCTAAC TACGTGCCAG 421 CAGCCGCGGT AATACGTAGG GCGCGAGCGT TGTCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGAGCTCG 81 TAGGCGGCTT GTCACGTCGG TTGTGAAAGC CCGGGGCTTA ACCCCGGGTC TGCAGTCGAT 541 ACGGGCAGGC TAGAGTTCGG TAGGGGAGAT CGGAATTCCT GGTGTAGCGG TGAAATGCGC 601 AGATATCAGG AGGAACACCG GTGGCGAAGG CGGATCTCTG GGCCGATACT GACGCTGAGG 661 AGCGAAAGCG TGGGGAGCGA ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC GTAAACGGTG 721 GGCACTAGGT GTGGGCGACA TTCCACGTCG TCCGTGCCGC AGCTAACGCA TTAAGTGCCC 781 CGCCTGGGGA GTACGGCCGC AAGGCTAAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG 841 CGGCGGAGCA TGTGGCTTAA TTCGACGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAAGG CTTGACATAC 901 ACCGGAAAGC ATCAGAGATG GTGCCCCCCT TGTGGTCGGT GTACAGGTGG TGCATGGCTG 961 TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA CCCTTGTCCC 1021 GTGTTGCCAG CAGGCCCTTG TGGTGCTGGG GACTCACGGG AGACCGCCGG GGTCAACTCG 1081 GAGGAAGGTG GGGACGACGT CAAGTCATCA TGCCCCTTAT GTCTTGGGCT GCACACGTGC 1141 TACAATGGCC GGTACAATGA GCTGCGATAC CGCGAGGTGG AGCGAATCTC AAAAAGCCGG 1201 TCTCAGTTCG GATTGGGGTC TGCAACTCGA CCCCATGAAG TCGGAGTCGC TAGTAATCGC 1261 AGATCAGCAT TGCTGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACGTCA 1321 CGAAAGTCGG Secuencia 3 : Las secuencias de KlA es 100% homologa con la secuencia SEQ ID N03 con certificado de depósito RGM 2374, la cual se describe a continuación (GeneBank: KY608897 - Streptomyces variabilis) : 1 TGCAGGATGA GCCCGCGGCC TATCAGCTTG TTGGTGAGGT AATGGCTCAC CAAGGCGACG 61 ACGGGTAGCC GGCCTGAGAG GGCGACCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG GCCCAGACTC 121 CTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATATTGCA CAATGGGCGA AAGCCTGATG CAGCGACGCC 181 GCGTGAGGGA TGACGGCCTT CGGGTTGTAA ACCTCTTTCA GCAGGGAAGA AGCGAAAGTG 241 ACGGTACCTG CAGAAGAAGC GCCGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG 301 GCGCGAGCGT TGTCCGGAAT TATTGGGCGT AAAGAGCTCG TAGGCGGCTT GTCACGTCGG 361 TTGTGAAAGC CCGGGGCTTA ACCCCGGGTC TGCAGTCGAT ACGGGCAGGC TAGAGTTCGG 421 TAGGGGAGAT CGGAATTCCT GGTGTAGCGG TGAAATGCGC AGATATCAGG AGGAACACCG 481 GTGGCGAAGG CGGATCTCTG GGCCGATACT GACGCTGAGG AGCGAAAGCG TGGGGAGCGA 541 ACAGGATTAG ATACCCTGGT AGTCCACGCC GTAAACGGTG GGCACTAGGT GTGGGCGACA 601 TTCCACGTCG TCCGTGCCGC AGCTAACGCA TTAAGTGCCC CGCCTGGGGA GTACGGCCGC 661 AAGGCTAAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGCGGAGCA TGTGGCTTTA 721 TTCGACGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAAGG CTTGACATAC ACCGGAAAGC ATCAGAGATG 781 GTGCCCCCCT TGTGGTGGGT GTACAGGTGG TGCATGGCTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG 841 ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA CCCTTGTCCC GTGTTGCCAG CAGGCCCTTG 901 TGGTGCTGGG GACTCACGGG AGACCGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG GGGACGACGC 961 CAAGTCATCA TGCCCCTTAT GTCTTGGGCT GCACACGTGC TACAATGGCC GGTACAATGA 1021 GCTGCGATAC CGCGAGGTGG AGCGAATCTC AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGGGGTC 1081 TGCAACTCGA CCCCATGAAG TCGGAGTCGC TAGTAATCGC Secuencia 4: Las secuencias de C2 es 100% homologa con la secuencia SEQ ID N04 con certificado depósito RGM 2372, la cual se describe a continuación (GeneBank KY608968 - Streptomyces sp.) 1 AGCCCTGGAA ACGGGGTCTA ATACCGGATA CTGAACCGCT TGGGCATCCA GGCGGTTCGA 61 AAGCTCCGGC GGTGCAGGAT GAGCCCGCGG CCTATCAGCT TGTTGGTGAG GTAACGGCTC 121 ACCAAGGCGA CGACGGGTAG CCGGCCTGAG AGGGCGACCG GCCACACTGG GACTGAGACA 181 CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATATTG CACAATGGGC GAAAGCCTGA 241 TGCAGCGACG CCGCGTGAGG GATGACGGCC TTCGGGTTGT AAACCTCTTT CAGCAGGGAA 301 GAAGCGAAAG TGACGGTACC TGCAGAAGAA GCGCCGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG 361 GTAATACGTA GGGCGCGAGC GTTGTCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGAGCT CGTAGGCGGC 421 TTGTCGCGTC GGTTGTGAAA GCCCGGGGCT TAACCCCGGG TCTGCAGTCG ATACGGGCAG 481 GCTAGAGTTC GGTAGGGGAG ATCGGAATTC CTGGTGTAGC GGTGAAATGC GCAGATATCA 541 GGAGGAACAC CGGTGGCGAA GGCGGATCTC TGGGCCGATA CTGACGCTGA GGAGCGAAAG 601 CGTG;GGGAGC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCACG CCGTAAACGG TGGGCACTAG 661 GTGTGGGCGA CATTCCACGT CGTCCGTGCC GCAGCTAACG CATTAAGTGC CCCGCCTGGG 721 GAGTACGGCC GCAAGGCTAA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGCGGAG 781 CATGTGGCTT AATTCGACGC AACGCGAAGA ACCTTACCAA GGCTTGACAT ACACCGGAAA 841 ACCCTGGAGA CAGGGTCCCC GTGTGGTCG GTGTACAGGT GGTGCATGGC TGTCGTCAGC 901 TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGTC CCGTGTTGCC 961 AGCAGGCCCT TGTGGTGCTG Descripción de las figuras Figura 1: Porcentaje del incremento de LC50 de mercurio basado en la germinación de semillas de L. sativa, M. sativa y P. vulgaris usando inoculación de Streptomyces en comparación con el control (sin bacteria). Figura 2: Efecto de las cepas de Streptomyces en la longitud de las raíces de L sativa a diferentes concentraciones de mercurio. Figura 3: Resumen general de longitud (cm) de raíz de medicago sativa (alfalfa) en presencia de agua, metales pesados Figura 4: Resumen general de longitud (cm) de raíz de Lactuca sativa (lechuga) en presencia de agua, de metales pesados y de metales pesados actlnomicetos. Test de germinación. Se probó la habilidad de las cepas de inducir germinación en semillas indicadoras, como son la lechuga (Lactuca sativa), alfalfa (Medicago sativa) y frijol (Phaseolus vulgaris), expuestas a diferentes concentraciones de mercurio. Las semillas fueron previamente desinfectadas con alcohol y agua estéril destilada. Luego, las semillas de L. sativa, M. sativa y P. vulgaris fueron embebidas en cada cultivo bacteriano por 30 a 45 minutos. Seguidamente de este paso, estas semillas fueron retiradas del cultivo y colocadas en una placa Petri con papel filtro estéril (cada tipo de semilla en una placa Petri estéril independientemente). Las semillas, en primer lugar, fueron expuestas a diferentes concentraciones de cobre, hierro, zinc y cadmio, y en seguida a los diferentes cultivos bacteria nos. Las concentraciones de 10, 50, 100, 200 y 400 ppm de mercurio y los cultivos de AB5, F, K1A y C2 (los cuales estuvieron en crecimiento en un caldo de cultivo, el cual puede ser como ejemplo, un caldo de cultivo GYE 1/10) se añadieron a las semillas mediante sumergimiento. Las semillas control fueron sumergidas en agua y caldo de cultivo estéril, y a las diferentes concentraciones de mercurio antes mencionadas. La habilidad para inducir la germinación fue evaluada mediante el número de semillas germinadas, longitud de las raíces y el número de hojas. Adicionalmente, se utilizó el programa Probit 5.1 para calcular la Concentración Letal 50 (LC 50, por sus siglas en inglés). Los resultados del test de germinación mostraron que las cuatro cepas incrementaron la cantidad de semillas germinadas. Los LC50 incrementaron de 17 a 42 ppm de mercurio en lechuga, y de 311 a 340 ppm de mercurio en el fréjol (Fig. 1). De la misma manera, el desarrollo de las raíces se vio favorecido por el efecto de inoculación de las bacterias, el cual está directamente relacionado al número de hojas. La longitud de las raíces también fue medida debido a que las raíces son los primeros colonizantes del suelo y ellos tienen importancia en la asimilación de nutrientes, influenciando así el consiguiente desarrollo de la planta. En las semillas de L. sativa se observó que las cepas aplicadas mejoraron significativamente la longitud de las raíces y el número de hojas (C2>K1A>AB5>F) a 50 ppm de mercurio (comparado al control) (Fig. 2). Además, se realizaron ensayos para evaluar la capacidad de las mismas cepas de promover la germinación en dos tipos de semillas indicadoras, como la lechuga (Lactuca sativa) y la alfalfa ( Medicago sativa), ambas expuestas a diferentes concentraciones de cobre, hierro, zinc y cadmio. Las semillas fueron previamente desinfectadas con alcohol, hipoclorito de sodio comercial y agua estéril destilada. Luego, las semillas de L. sativa y M. sativa fueron embebidas en cada cultivo bacteriano por 30 a 45 minutos. Seguidamente de este paso, estas semillas fueron retiradas y colocadas en una placa Petri con papel filtro estéril (cada tipo de semilla en una placa Petri estéril independientemente). Las semillas, en primer lugar, fueron expuestas a diferentes concentraciones de cobre, hierro, zinc y cadmio, y en seguida a los diferentes cultivos bacterianos. Las concentraciones de 10, 50, 100 y 200 ppm de cobre, hierro, zinc y cadmio, y los cultivos de AB5 y C2 (los cuales estuvieron en crecimiento en un caldo de cultivo, el cual puede ser como ejemplo, un caldo de cultivo TSB) se añadieron a las semillas mediante sumergimiento. Las semillas control fueron sumergidas en agua y a las diferentes concentraciones de cobre, hierro, zinc y cadmio antes mencionadas. La capacidad para promover la germinación fue evaluada mediante el número de semillas germinadas, longitud de las raíces y el número de hojas. Adicionalmente, se utilizó el programa Stata versión 14 para realizar el análisis estadísticos de los resultados donde se aplicó un nivel de significancia (a) de 0.05. Con los resultados del test de germinación, obtenidos y analizados, se determinó que el efecto de las dos cepas (AB5 y C2) en las semillas de L. sativa y M. sativa expuestas a diferentes concentraciones de cobre, hierro, zinc y cadmio fue significativamente beneficiosa. Analizadas estadísticamente, el número de semillas germinadas y número de hojas tanto de L. sativa como de M. sativa expuestas a diferentes concentraciones de cobre, hierro, zinc y cadmio no representaron variación en estos ensayos; por el contrario, la longitud de las raíces fue la más representativa en los dos tipos de semillas por su variación en los resultados obtenidos, siendo un indicador del efecto de estas cepas en las semillas expuestas a metales pesados y esto se debe a que las raíces son los primeros colonizantes del suelo y cumplen un papel importancia en la captación de agua y de nutrientes, contribuyendo así con el óptimo desarrollo de la planta; por ende, la raíz es considerada el órgano principal de esta. Con los cuatro metales estudiados (cobre, hierro, zinc y cadmio), se encontró que tanto en L. sativa como en M. sativa, el promedio de la longitud de la raíz tratada con las dos cepas expuestas (AB5 y C2) a las diferentes concentraciones de cobre, hierro, zinc y cadmio presentaron diferencias significativas con los controles -cobre, - hierro, -zinc y -cadmio (p