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The current European agri-food and forestry (AFF) systems are perceived to be moving too slowly towards more sustainable agriculture, forestry, food and bio-based value chains. The European Green Deal and Farm to Fork (FtF) Strategy stress the importance of the sustainable transition of food systems that emphasize resilience and justice along food chains. In this direction, education and training (ET) are given a major role, constituting one of the pillars of the Agricultural Knowledge and Innovation Systems (AKIS) framework. This study aims to propose an extended version of the AKIS framework to focus on the transition of policies concerning the ET pillar and to use this framework as a conceptual background with which to identify strategies for the improvement of ET policies in the AFF sectors. Data collection was undertaken through a round of workshops, and the data were analyzed using a thematic analysis approach. The results revealed that the need for a high-quality educational policy and the need to enhance collaboration, entrepreneurship and innovative learning methods were among the most important for the sector, where urgent changes in pace and an approach in ET are necessary for the entire value chain, from farm to fork. These results emphasize that pivoting the transition of ET systems toward achieving the Green Deal, FtF and new CAP objectives requires the development of policies that support student-centered and interdisciplinary education, while also being flexible and supported by non-formal and lifelong learning approaches. © 2024 by the authors., Educating the Next Generation of Professionals in the Agri-food and Forestry System (NEXTFOOD)

Poultry farms are hotspots for the development and spread of antibiotic resistance genes (ARGs), due to high stocking densities and extensive use of antibiotics, posing a threat of spread and contagion to workers and the external environment. Here, we applied shotgun metagenome sequencing to characterize the gut microbiome and resistome of poultry, workers and their households - also including microbiomes from the internal and external farm environment - in three different farms in Italy during a complete rearing cycle. Our results highlighted a relevant overlap among the microbiomes of poultry, workers, and their families (gut and skin), with clinically relevant ARGs and associated mobile elements shared in both poultry and human samples. On a finer scale, the reconstruction of species-level genome bins (SGBs) allowed us to delineate the dynamics of microorganism and ARGs dispersion from farm systems. We found the associations with worker microbiomes representing the main route of ARGs dispersion from poultry to human populations. Collectively, our findings clearly demonstrate the urgent need to implement more effective procedures to counteract ARGs dispersion from poultry food systems and the relevance of metagenomics-based metacommunity approaches to monitor the ARGs dispersion process for the safety of the working environment on farms.

The artisanal food chain is enriched by a wide diversity of local food productions with delightful organoleptic characteristics and valuable nutritional properties. Despite their increasing worldwide popularity and appeal, several food safety challenges are addressed in artisanal facilities context suffering from less standardized processing conditions. In such scenario, recent advances in molecular typing and genomic surveillance (e.g., Whole Genome Sequencing [WGS]) represent an unprecedent solution capable of inferring sources of contamination as well as contributing to food safety along the artisanal food continuum. The overall objective of this PhD thesis was to explore potential microbial hazards among different artisanal food productions of animal origins (dairy and meat-derived) typical of the food culture and heritage landscape belonging to Mediterranean countries. Three different studies were then carried out, specifically focussing on: 1) compare the seasonal variability of microbiological quality and potential occurrence of microbial hazards in two batches of Italian artisanal fermented dairy and meat productions; 2) Investigate genetic relationships as well as virulome and resistome of foodborne pathogens isolated within dairy and meat-derived productions located in Italy, Spain, Portugal and Morocco; 3) investigate the population structure, virulome, resistome and mobilome of Klebsiella spp. isolates collected from study 1, including an extended range of public sequences.

To ensure food safety and to prevent food-borne illnesses, rapid and accurate detection of pathogenic agents is essential. It has already been demonstrated that shotgun metagenomic sequencing can be used to detect pathogens and their antibiotic resistance genes in food. In the studies presented in this thesis, the application shotgun metagenomic sequencing has been applied to investigate both the microbiome and resistome of foods of animal origin in order to assess advantages and disadvantages of shotgun metagenomic sequencing in comparison to the cultural methods. In the first study, it has been shown that shotgun metagenomics can be applied to detect microorganisms experimentally spiked in cold-smoked salmon. Nevertheless, a direct correlation between cell concentration of each spiked microorganism and number of corresponding reads cannot be established yet. In the second and third studies, the microbiomes and resistomes characterizing caeca and the corresponding carcasses of the birds reared in the conventional and antibiotic free farms were compared. The results highlighted the need to reduce sources of microbial contamination and antimicrobial resistance not only at the farm level but also at the post-harvest one. In the fourth study, it has been demonstrated that testing a single aliquot of a food homogenate is representative of the whole homogenate because biological replicates displayed overlapping taxonomic and functional composition. All in all, the results obtained confirmed that the application of shotgun metagenomic sequencing represents a powerful tool that can be used in the identification of both spoilage and pathogenic microorganism, and their resistome in foods of animal origin. However, a robust relationship between sequence read abundance and concentration of colony-forming unit must be still established.

An inter-laboratory proficiency test was organized to assess the ability of participants to perform shotgun metagenomic sequencing of cold smoked salmon, experimentally spiked with a mock community composed of six bacteria, one parasite, one yeast, one DNA, and two RNA viruses. Each participant applied its in-house wet-lab workflow(s) to obtain the metagenomic dataset(s), which were then collected and analyzed using MG-RAST. A total of 27 datasets were analyzed. Sample pre-processing, DNA extraction protocol, library preparation kit, and sequencing platform, influenced the abundance of specific microorganisms of the mock community. Our results highlight that despite differences in wet-lab protocols, the reads corresponding to the mock community members spiked in the cold smoked salmon, were both detected and quantified in terms of relative abundance, in the metagenomic datasets, proving the suitability of shotgun metagenomic sequencing as a genomic tool to detect microorganisms belonging to different domains in the same food matrix. The implementation of standardized wet-lab protocols would highly facilitate the comparability of shotgun metagenomic sequencing dataset across laboratories and sectors. Moreover, there is a need for clearly defining a sequencing reads threshold, to consider pathogens as detected or undetected in a food sample.

An inter-laboratory proficiency test was organized to assess the ability of participants to perform shotgun metagenomic sequencing of cold smoked salmon, experimentally spiked with a mock community composed of six bacteria, one parasite, one yeast, one DNA, and two RNA viruses. Each participant applied its in-house wet-lab workflow(s) to obtain the metagenomic dataset(s), which were then collected and analyzed using MG-RAST. A total of 27 datasets were analyzed. Sample pre-processing, DNA extraction protocol, library preparation kit, and sequencing platform, influenced the abundance of specific microorganisms of the mock community. Our results highlight that despite differences in wet-lab protocols, the reads corresponding to the mock community members spiked in the cold smoked salmon, were both detected and quantified in terms of relative abundance, in the metagenomic datasets, proving the suitability of shotgun metagenomic sequencing as a genomic tool to detect microorganisms belonging to different domains in the same food matrix. The implementation of standardized wet-lab protocols would highly facilitate the comparability of shotgun metagenomic sequencing dataset across laboratories and sectors. Moreover, there is a need for clearly defining a sequencing reads threshold, to consider pathogens as detected or undetected in a food sample.

An inter-laboratory proficiency test was organized to assess the ability of participants to perform shotgun metagenomic sequencing of cold smoked salmon, experimentally spiked with a mock community composed of six bacteria, one parasite, one yeast, one DNA, and two RNA viruses. Each participant applied its in-house wet-lab workflow(s) to obtain the metagenomic dataset(s), which were then collected and analyzed using MG-RAST. A total of 27 datasets were analyzed. Sample pre-processing, DNA extraction protocol, library preparation kit, and sequencing platform, influenced the abundance of specific microorganisms of the mock community. Our results highlight that despite differences in wet-lab protocols, the reads corresponding to the mock community members spiked in the cold smoked salmon, were both detected and quantified in terms of relative abundance, in the metagenomic datasets, proving the suitability of shotgun metagenomic sequencing as a genomic tool to detect microorganisms belonging to different domains in the same food matrix. The implementation of standardized wet-lab protocols would highly facilitate the comparability of shotgun metagenomic sequencing dataset across laboratories and sectors. Moreover, there is a need for clearly defining a sequencing reads threshold, to consider pathogens as detected or undetected in a food sample.

An inter-laboratory proficiency test was organized to assess the ability of participants to perform shotgun metagenomic sequencing of cold smoked salmon, experimentally spiked with a mock community composed of six bacteria, one parasite, one yeast, one DNA, and two RNA viruses. Each participant applied its in-house wet-lab workflow(s) to obtain the metagenomic dataset(s), which were then collected and analyzed using MG-RAST. A total of 27 datasets were analyzed. Sample pre-processing, DNA extraction protocol, library preparation kit, and sequencing platform, influenced the abundance of specific microorganisms of the mock community. Our results highlight that despite differences in wet-lab protocols, the reads corresponding to the mock community members spiked in the cold smoked salmon, were both detected and quantified in terms of relative abundance, in the metagenomic datasets, proving the suitability of shotgun metagenomic sequencing as a genomic tool to detect microorganisms belonging to different domains in the same food matrix. The implementation of standardized wet-lab protocols would highly facilitate the comparability of shotgun metagenomic sequencing dataset across laboratories and sectors. Moreover, there is a need for clearly defining a sequencing reads threshold, to consider pathogens as detected or undetected in a food sample.

An inter-laboratory proficiency test was organized to assess the ability of participants to perform shotgun metagenomic sequencing of cold smoked salmon, experimentally spiked with a mock community composed of six bacteria, one parasite, one yeast, one DNA, and two RNA viruses. Each participant applied its in-house wet-lab workflow(s) to obtain the metagenomic dataset(s), which were then collected and analyzed using MG-RAST. A total of 27 datasets were analyzed. Sample pre-processing, DNA extraction protocol, library preparation kit, and sequencing platform, influenced the abundance of specific microorganisms of the mock community. Our results highlight that despite differences in wet-lab protocols, the reads corresponding to the mock community members spiked in the cold smoked salmon, were both detected and quantified in terms of relative abundance, in the metagenomic datasets, proving the suitability of shotgun metagenomic sequencing as a genomic tool to detect microorganisms belonging to different domains in the same food matrix. The implementation of standardized wet-lab protocols would highly facilitate the comparability of shotgun metagenomic sequencing dataset across laboratories and sectors. Moreover, there is a need for clearly defining a sequencing reads threshold, to consider pathogens as detected or undetected in a food sample.

Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium and its monophasic variant are among the most common Salmonella serovars associated with human salmonellosis each year. Related infections are often due to consumption of contaminated meat of pig, cattle, and poultry origin. In order to evaluate novel microbial subtyping methods for source attribution, an approach based on weighted networks was applied on 141 human and 210 food and animal isolates of pigs, broilers, layers, ducks, and cattle collected in Denmark from 2013 to 2014. A whole-genome SNP calling was performed along with cgMLST and wgMLST. Based on these genomic input data, pairwise distance matrices were built and used as input for construction of a weighted network where nodes represent genomes and links to distances. Analyzing food and animal Typhimurium genomes, the coherence of source clustering ranged from 89 to 90% for animal source, from 84 to 85% for country, and from 63 to 65% for year of isolation and was equal to 82% for serotype, suggesting animal source as the first driver of clustering formation. Adding human isolate genomes to the network, a percentage between 93.6 and 97.2% clustered with the existing component and only a percentage between 2.8 and 6.4% appeared as not attributed to any animal sources. The majority of human genomes were attributed to pigs with probabilities ranging from 83.9 to 84.5%, followed by broilers, ducks, cattle, and layers in descending order. In conclusion, a weighted network approach based on pairwise SNPs, cgMLST, and wgMLST matrices showed promising results for source attribution studies.

The authors would like to correct the authorship in this publication, for the below-mentioned reason. Four co-authors (Johanna Pamp Sünje, Hanne Mordhorst, Claudia Wylezich, Casper Poulsen) have not been listed in the original version of the paper, due to an underestimation of the time needed to publish the results of PT as a whole, for which the dataset selected as described in the manuscript has been sub-mitted. As a consequence, part of the mock community used in the PT has been described in the paper published in Italian Journal of Food Safety for the first time. Therefore, these authors involved in the design and preparation of the mock community, as well as spiking of the samples, should be added. Their contribution is detailed below:-Pamp Sünje Johanna, designed mock community, contribution to design of ring trial.-Mordhorst Hanne, preparation of the spiked samples, shipping ring trial samples.-Wylezich Claudia, conceptualization and addition of the virus in the mock community.-Poulsen Casper, preparation of the mock community.

The globalized food supply chain became a vast and complex network leading to an increased risk of spread of known and emerging foodborne pathogens, Listeria monocytogenes and Salmonella enterica serovar Typhimurium variant 4,[5],12:i:-. Based on a previous study of persistence of L. monocytogenes, 27 ST14 and 6 ST121 newly sequenced genomes collected over one year on the same rabbit meat processing plant were investigated in comparison to a selection of public genomes. cgMLST analysis of sequenced genomes showed higher discriminatory power in comparison to conventional typing methods. wgSNPs phylogeny inferred on 273 newly sequenced and publicly available ST121 and ST14 genomes confirmed that a persistent clone was circulating in the Italian rabbit-meat plant along with not persistent strains. Mass screening of a novel dataset of genes involved in physiological adaptation to food-processing environment showed a significant enrichment in ST121 genomes concerned genetic features related to sanitizing procedures adaptation, whereas genes related to biofilm forming enhanced ability and cadmium resistance was associated to ST14, as confirmed by phenotypic tests. Genomic data of 148 Salmonella enterica ser. Typhimurium monophasic variant 4,[5],12:i:- (MVSTm) isolates circulating in human and swine in Italy have been investigated in comparison to publicly available S. Typhimurium/ MVSTm strains collected in Italy and worldwide. The innovative genome-wide approach applied in this study allowed to mine population structure of a large Salmonella serovars dataset (~4,000 genomes) including Italian MVST strains belonging to a large population of ~1,300 clonal S. Typhimurium/ MVSTm isolates (2.5% of allele differences) isolated from a wide-range of countries in last two decades. cgSNPs phylogeny revealed and Genome-Wide Association Study suggested that discrete geographical segregation has had a strong impact on the accessory gene content with particular significance for a larg

The globalized food supply chain became a vast and complex network leading to an increased risk of spread of known and emerging foodborne pathogens, Listeria monocytogenes and Salmonella enterica serovar Typhimurium variant 4,[5],12:i:-. Based on a previous study of persistence of L. monocytogenes, 27 ST14 and 6 ST121 newly sequenced genomes collected over one year on the same rabbit meat processing plant were investigated in comparison to a selection of public genomes. cgMLST analysis of sequenced genomes showed higher discriminatory power in comparison to conventional typing methods. wgSNPs phylogeny inferred on 273 newly sequenced and publicly available ST121 and ST14 genomes confirmed that a persistent clone was circulating in the Italian rabbit-meat plant along with not persistent strains. Mass screening of a novel dataset of genes involved in physiological adaptation to food-processing environment showed a significant enrichment in ST121 genomes concerned genetic features related to sanitizing procedures adaptation, whereas genes related to biofilm forming enhanced ability and cadmium resistance was associated to ST14, as confirmed by phenotypic tests. Genomic data of 148 Salmonella enterica ser. Typhimurium monophasic variant 4,[5],12:i:- (MVSTm) isolates circulating in human and swine in Italy have been investigated in comparison to publicly available S. Typhimurium/ MVSTm strains collected in Italy and worldwide. The innovative genome-wide approach applied in this study allowed to mine population structure of a large Salmonella serovars dataset (~4,000 genomes) including Italian MVST strains belonging to a large population of ~1,300 clonal S. Typhimurium/ MVSTm isolates (2.5% of allele differences) isolated from a wide-range of countries in last two decades. cgSNPs phylogeny revealed and Genome-Wide Association Study suggested that discrete geographical segregation has had a strong impact on the accessory gene content with particular significance for a larg

The objective of my study was to characterize the impact of the administration of different feed additives on gut and skin microbiome of commercial chickens in order to find nutritional strategies able to fight foodborne pathogens colonization in these animals, improving safety of poultry meat and avoiding the use of antibiotics. The administration of Lactobacillus acidophilus D2/CSL in the feed showed to positively affect species belonging to Clostridium clusters IV (Faecalibacterium prausnitzzi, Subdonigranulum variabile) and XIVa (Roseburia intestinalis) producing butyric acid involved in the protection against pathogens. Furthermore, R. torques, which degrade gut mucin potentially exposing the gut cells to pathogens, was significantly lowered by the probiotic administration. The chicken fed with the probiotic showed a significantly higher level of β-glucosidase contributing to the hydrolysis of glucose monomers from non-starch polysaccharides, playing an important role in the fermentation of undigested carbohydrates. The administration of serine protease in the feed decreased abundance of Lactobacillaceae at 14 days even if they increased over time. Faecalibacterium praustnizii, as well as Sudoligranum variabile decreased in the caeca of chickens fed with serine protease in comparison to the control at 42 days. All signature species of the caeca of chickens fed with serine protease at 14 days belonged to Bacteroidetes. In the caeca of chickens fed with phytase, the abundance of Erysipelotrichaceae, a family associated to butyryl-CoA production enzymes, significantly decreased along with Lactobacillaceae family which is involved in the stimulation of immune responses and in the improvement of digestive health and growth performance in poultry. The effect of phytase on chicken skin microbiota lead to mostly the reduction of spoilage genera and species in the treated groups compared to the control. The reduction of these genera and species, responsible of the spoil

[EN] The objective of this research was to analyze the impact of different cooking procedures (i.e., gas hob and traditional static oven) and levels of cooking (i.e., rare, medium, and well-done) on inactivation of Listeria monocytogenes and Salmonella in pork loin chops. Moreover, the consumer's exposure to both microorganisms after simulation of meat leftover storage at home was assessed. The results showed that well-done cooking in a static oven was the only treatment able to inactivate the tested pathogens. The other cooking combinations allowed to reach in the product temperatures always 73.6 degrees C, decreasing both pathogens between 6 log(10) cfu/g and 7 log(10) cfu/g. However, according to simulation results, the few cells surviving cooking treatments can multiply during storage by consumers up to 1 log(10) cfu/g, with probabilities of 0.059 (gas hob) and 0.035 (static oven) for L. monocytogenes and 0.049 (gas hob) and 0.031 (static oven) for Salmonella. The key factors affecting consumer exposure in relation to storage practices were probability of pathogen occurrence after cooking, doneness degree, time of storage, and time of storage at room temperature. The results of this study can be combined with prevalence data and dose-response models in risk assessment models and included in guidelines for consumers on practices to be followed to manage cooking of pork meat at home.

[EN] The objective of this research was to analyze the impact of different cooking procedures (i.e., gas hob and traditional static oven) and levels of cooking (i.e., rare, medium, and well-done) on inactivation of Listeria monocytogenes and Salmonella in pork loin chops. Moreover, the consumer's exposure to both microorganisms after simulation of meat leftover storage at home was assessed. The results showed that well-done cooking in a static oven was the only treatment able to inactivate the tested pathogens. The other cooking combinations allowed to reach in the product temperatures always 73.6 degrees C, decreasing both pathogens between 6 log(10) cfu/g and 7 log(10) cfu/g. However, according to simulation results, the few cells surviving cooking treatments can multiply during storage by consumers up to 1 log(10) cfu/g, with probabilities of 0.059 (gas hob) and 0.035 (static oven) for L. monocytogenes and 0.049 (gas hob) and 0.031 (static oven) for Salmonella. The key factors affecting consumer exposure in relation to storage practices were probability of pathogen occurrence after cooking, doneness degree, time of storage, and time of storage at room temperature. The results of this study can be combined with prevalence data and dose-response models in risk assessment models and included in guidelines for consumers on practices to be followed to manage cooking of pork meat at home.

[EN] The objective of this research was to analyze the impact of different cooking procedures (i.e., gas hob and traditional static oven) and levels of cooking (i.e., rare, medium, and well-done) on inactivation of Listeria monocytogenes and Salmonella in pork loin chops. Moreover, the consumer's exposure to both microorganisms after simulation of meat leftover storage at home was assessed. The results showed that well-done cooking in a static oven was the only treatment able to inactivate the tested pathogens. The other cooking combinations allowed to reach in the product temperatures always 73.6 degrees C, decreasing both pathogens between 6 log(10) cfu/g and 7 log(10) cfu/g. However, according to simulation results, the few cells surviving cooking treatments can multiply during storage by consumers up to 1 log(10) cfu/g, with probabilities of 0.059 (gas hob) and 0.035 (static oven) for L. monocytogenes and 0.049 (gas hob) and 0.031 (static oven) for Salmonella. The key factors affecting consumer exposure in relation to storage practices were probability of pathogen occurrence after cooking, doneness degree, time of storage, and time of storage at room temperature. The results of this study can be combined with prevalence data and dose-response models in risk assessment models and included in guidelines for consumers on practices to be followed to manage cooking of pork meat at home.

The aims of this research study is to explore the opportunity to set up Performance Objectives (POs) parameters for specific risks in RTE products to propose for food industries and food authorities. In fact, even if microbiological criteria for Salmonella and Listeria monocytogenes Ready-to-Eat (RTE) products are included in the European Regulation, these parameters are not risk based and no microbiological criteria for Bacillus cereus in RTE products is present. For these reasons the behaviour of Salmonella enterica in RTE mixed salad, the microbiological characteristics in RTE spelt salad, and the definition of POs for Bacillus cereus and Listeria monocytogenes in RTE spelt salad has been assessed. Based on the data produced can be drawn the following conclusions: 1. A rapid growth of Salmonella enterica may occurr in mixed ingredient salads, and strict temperature control during the production chain of the product is critical. 2. Spelt salad is characterized by the presence of high number of Lactic Acid Bacteria. Listeria spp. and Enterobacteriaceae, on the contrary, did not grow during the shlef life, probably due to the relevant metabolic activity of LAB. 3. The use of spelt and cheese compliant with the suggested POs might significantly reduce the incidence of foodborne intoxications due to Bacillus cereus and Listeria monocytogenes and the proportions of recalls, causing huge economic losses for food companies commercializing RTE products. 4. The approach to calculate the POs values and reported in my work can be easily adapted to different food/risk combination as well as to any changes in the formulation of the same food products. 5. The optimized sampling plans in term of number of samples to collect can be derive in order to verify the compliance to POs values selected.

The aims of this research study is to explore the opportunity to set up Performance Objectives (POs) parameters for specific risks in RTE products to propose for food industries and food authorities. In fact, even if microbiological criteria for Salmonella and Listeria monocytogenes Ready-to-Eat (RTE) products are included in the European Regulation, these parameters are not risk based and no microbiological criteria for Bacillus cereus in RTE products is present. For these reasons the behaviour of Salmonella enterica in RTE mixed salad, the microbiological characteristics in RTE spelt salad, and the definition of POs for Bacillus cereus and Listeria monocytogenes in RTE spelt salad has been assessed. Based on the data produced can be drawn the following conclusions: 1. A rapid growth of Salmonella enterica may occurr in mixed ingredient salads, and strict temperature control during the production chain of the product is critical. 2. Spelt salad is characterized by the presence of high number of Lactic Acid Bacteria. Listeria spp. and Enterobacteriaceae, on the contrary, did not grow during the shlef life, probably due to the relevant metabolic activity of LAB. 3. The use of spelt and cheese compliant with the suggested POs might significantly reduce the incidence of foodborne intoxications due to Bacillus cereus and Listeria monocytogenes and the proportions of recalls, causing huge economic losses for food companies commercializing RTE products. 4. The approach to calculate the POs values and reported in my work can be easily adapted to different food/risk combination as well as to any changes in the formulation of the same food products. 5. The optimized sampling plans in term of number of samples to collect can be derive in order to verify the compliance to POs values selected.

Eggs and egg products have been described as the most critical food vehicles of salmonellosis. The prevalence and level of contamination of Salmonella on table eggs are low, which severely affects the sensitivity of sampling plans applied voluntarily in some European countries, where one to five pools of 10 eggs are tested by the culture based reference method ISO 6579:2004. In the current study we have compared the testing-sensitivity of the reference culture method ISO 6579:2004 and an alternative real-time PCR method on Salmonella contaminated egg-pool of different sizes (4-9 uninfected eggs mixed with one contaminated egg) and contamination levels (10°-10(1), 10(1)-10(2), 10(2)-10(3)CFU/eggshell). Two hundred and seventy samples corresponding to 15 replicates per pool size and inoculum level were tested. At the lowest contamination level real-time PCR detected Salmonella in 40% of contaminated pools vs 12% using ISO 6579. The results were used to estimate the lowest number of sample units needed to be tested in order to have a 95% certainty not falsely to accept a contaminated lot by Monte Carlo simulation. According to this simulation, at least 16 pools of 10 eggs each are needed to be tested by ISO 6579 in order to obtain this confidence level, while the minimum number of pools to be tested was reduced to 8 pools of 9 eggs each, when real-time PCR was applied as analytical method. This result underlines the importance of including analytical methods with higher sensitivity in order to improve the efficiency of sampling and reduce the number of samples to be tested.

Eggs and egg products have been described as the most critical food vehicles of salmonellosis. The prevalence and level of contamination of Salmonella on table eggs are low, which severely affects the sensitivity of sampling plans applied voluntarily in some European countries, where one to five pools of 10 eggs are tested by the culture based reference method ISO 6579:2004. In the current study we have compared the testing-sensitivity of the reference culture method ISO 6579:2004 and an alternative real-time PCR method on Salmonella contaminated egg-pool of different sizes (4-9 uninfected eggs mixed with one contaminated egg) and contamination levels (10°-10(1), 10(1)-10(2), 10(2)-10(3)CFU/eggshell). Two hundred and seventy samples corresponding to 15 replicates per pool size and inoculum level were tested. At the lowest contamination level real-time PCR detected Salmonella in 40% of contaminated pools vs 12% using ISO 6579. The results were used to estimate the lowest number of sample units needed to be tested in order to have a 95% certainty not falsely to accept a contaminated lot by Monte Carlo simulation. According to this simulation, at least 16 pools of 10 eggs each are needed to be tested by ISO 6579 in order to obtain this confidence level, while the minimum number of pools to be tested was reduced to 8 pools of 9 eggs each, when real-time PCR was applied as analytical method. This result underlines the importance of including analytical methods with higher sensitivity in order to improve the efficiency of sampling and reduce the number of samples to be tested.

L’elaborato illustra come il cambiamento delle abitudini quotidiane, nel corso degli anni, ha portato alla nascita di un tipo di ristorazione capace di conciliare i bisogni di tipo nutrizionale e relazionale con l’aspetto qualitativo fondato sulla salubrità degli alimenti. Il settore della ristorazione collettiva è disciplinato dai Reg. CE 178\02 e 852\04, i quali stabiliscono rispettivamente i principi ed i requisiti generali della legislazione alimentare e le linee guida sull'igiene dei prodotti alimentari. Le principali categorie di ristorazione collettiva sono quella aziendale, scolastica e sociosanitaria che soddisfano le esigenze di un numero ampio di persone accomunate dall’esigenza di usufruire dei pasti, al di fuori della propria abitazione (lavoratori-studenti- degenti di un ospedale). Le fasi principali da affrontare nell’analisi della ristorazione sono la preparazione e la distribuzione dei pasti con attenzione alla prevenzione delle tossinfezioni alimentari e la salubrità degli alimenti prodotti, trasformati e somministrati. La qualità non deve rappresentare un costo bensì un investimento: le aziende che operano nel settore alimentare hanno necessità di certificare ufficialmente il proprio adeguamento alla Normativa HACCP,al fine di aumentare la trasparenza, fornire sicurezza al consumatore e diminuirne l’incertezza, nel rispetto di quanto previsto dalle Leggi. I centri di produzione durante l’intero ciclo di lavorazione dei pasti, dalla preparazione alla commercializzazione, si affidano all’autocontrollo igienico fondato sui principi del modello HACCP che racchiude tute le misure da adottare per garantire la sicurezza igienico sanitaria e l’integrità degli alimenti. L’adempimento dei principi dell’HACCP nelle catene ristorative viene garantito dai controlli ufficiali svolti dalle autorità sanitarie con programmi ed interventi di vigilanza atti a ridurre i pericoli fisici-biologici che possono rendere dannoso un alimento per il consumatore.

Dato l’enorme sviluppo dei prodotti ready-to-eat (RTE), prodotti il cui consumo continua a crescere, in particolare a seguito della pandemia di SARS-CoV-2, l'obiettivo del mio elaborato è quello di illustrare le motivazioni di questo incremento e di valutare i principali rischi riguardanti gli alimenti ready-to-eat di origine animale. Nel mio elaborato descrivo le diverse tipologie di prodotti ready-to-eat e analizzo le motivazioni che possono spingere il consumatore all'acquisto di questa categoria di prodotti. Inoltre vengono illustrate le principali problematiche sanitarie di origine biologico e chimico associate al consumo di prodotti RTE, analizzando i dati epidemiologici pubblicati nell'ultimo rapporto EFSA sulle zoonosi del 2019. Infine, sono illustrati i principali interventi di prevenzione da applicare in ambito industriale e domestico al fine di ridurre tossinfezioni alimentari in campo umano.

L'obiettivo del seguente elaborato è stato quello di analizzare il rischio di contaminanti chimici nella filiera di uova e ovoprodotti. In particolare, è stata analizzata la contaminazione da diossine e PCB evidenziando le diverse fonti di contaminazione e i loro effetti tossici sull'organismo. Sono stati inoltre descritti i principali metodi analitici impiegati per la loro quantificazione, sia da uova intere che da tuorlo d'uovo e grasso di origine animale. La valutazione dei dati disponibili a livello internazionale e nazionale confermano che le vie di contaminazione principali nella filiera delle uova e ovoprodotti sono rappresentate da suolo, erba e lombrichi contaminati mentre il consumo di mangime contaminato risulta meno rilevante. Queste evidenze rendono indispensabile la necessità di implementare il controllo degli inquinanti ambientali nel piano nazionale del controllo dei residui, al fine di consentirne un'efficace riduzione per poter garantire una maggiore sicurezza alimentare per il consumatore.

L’evoluzione della normativa è la necessaria risposta alle naturali mutazioni della filiera agroalimentare, legate a sempre nuovi rischi, nei confronti dei quali si è dovuto modellare l’approccio, come emerge dal regolamento 625/2017 che tratto in questo mio elaborato. Gli aspetti più rilevanti di questo nuovo strumento legislativo si possono riassumere nei seguenti punti: A. Garantire maggiore trasparenza nei confronti del consumatore senza tralasciare gli aspetti legati alla correttezza sia etica che pratica del produttore; B. Integrare e rafforzare una rete di comunicazione tra gli Stati Membri nella gestione di informazioni e dati relativi; C. Attuare una importante riduzione del corpo legislativo comunitario in merito agli aspetti burocratici-amministrativi nonché una facilitazione delle attività per tutti gli operatori della filiera: allevatori, produttori, trasformatori, trasportatori e dettaglianti. In sostanza il nuovo regolamento, attraverso l’inclusione di nuovi settori della filiera agroalimentare, pone l’attenzione al tema della sostenibilità della filiera agroalimentare e la proposizione di un sistema sinergico di controlli, introduce disposizioni la cui attuazione consente la piena applicazione del principio One Health per il benessere e sanità animale e per la sicurezza ambientale ed alimentare.

Le tossinfezioni alimentari causate dal consumo di alimenti di origine animale sono un fenomeno piuttosto diffuso tra i quali la carne di pollo è una delle principali fonti, in quanto presenta diverse contaminazioni con potenziale zoonotico. Infatti, il pollame può presentare diverse malattie infettive di origine batterica che sono in grado di provocare patologie anche a carattere setticemico. È il caso delle infezioni da Escherichia coli: un microrganismo Gram-negativo normalmente presente nell’intestino degli animali e dell’uomo. In tali casi il trattamento farmacologico risulta indispensabile ma purtroppo questo approccio è frequentemente associato alla crescente capacità di acquisizione, da parte del microrganismo, di determinati genetici di resistenza antibiotica portando conseguentemente al fallimento delle terapie. Questo fenomeno in continuo aumento provoca una crescente preoccupazione delle autorità sanitarie in tutto il mondo tanto da consigliare il divieto di utilizzo degli antibiotici negli allevamenti animali. Nel presente studio, isolati di E. coli raccolti da due aziende di broiler allevati senza l’impiego di antibiotici sono stati analizzati al fine di comparare la suscettibilità antimicrobica a quattordici antibiotici (fenotipo di resistenza) con il genotipo di resistenza ottenuto mediante sequenziamento dell’intero genoma, che ha permesso di identificare i determinanti genetici di antibiotico-resistenza e virulenza. Lo studio ha messo in evidenza come il WGS sia in grado di predire il fenotipo di resistenza ma non quello di suscettibilità. L’analisi del viruloma ha indicato la presenza di geni interessanti per la valutazione della patogenicità degli isolati. La caratterizzazione genetica ha messo in luce una certa diversità tra gli isolati intra ed inter-allevamento tranne per alcuni campioni. Infine, l’analisi MLST ha confermato precedenti evidenze scientifiche riguardo ad alcuni ST-tipo indicati come resistenti ad antibiotici beta-lattamici.

Le continue allerte sanitarie relative agli alimenti potenzialmente responsabili di malattie a trasmissione alimentare ribadiscono la necessità di garantire la sicurezza alimentare dei prodotti commercializzati. A tale fine la responsabilizzazione dell’operatore del settore alimentare è un punto cardine infatti l’attuale legislazione alimentare rovescia, rispetto all'assetto precedente, l’onere primario di garanzia della sicurezza alimentare come riportato nel Regolamento (CE) N.178/02. Sulla base di tali considerazioni qualunque operatore alimentare dovrà sviluppare un appropriato piano HACCP sulla base del quale definire i potenziali rischi e le misure per eliminarli o mitigarli. In questo elaborato si è voluto analizzare il settore della gelateria artigianale strutturalmente molto complesso e ricco di opportunità interessanti, soprattutto per quanto riguarda il mercato estero il cui fine è quello di preservare tradizione e qualità di un prodotto "Made in Italy". Il presente elaborato mira ad evidenziare i principali aspetti della produzione del gelato artigianale finalizzati alla salvaguardia dei requisiti di qualità e salubrità igienico-sanitari e al rispetto delle norme legislative. Verranno inoltre illustrati i principali rischi sanitari riconducibili al consumo di gelato in quanto tale e delle materie prime utilizzate per la sua produzione al fine di identificare i possibili interventi correttivi con i quali garantire la sicurezza al consumatore finale.

In questo lavoro di tesi il sequenziamento targettato del 16S rRNA è stato applicato per analizzare il microbiota associato a 30 campioni di pelle di collo e 30 di acque di lavaggio di carcasse da allevamenti convenzionali (n=15) ed antibiotic free (n=15). Il microbiota associato alle due tipologie di carcasse presenta differenze significative. Il phylum Firmicutes era prevalente in entrambe le tipologie di campioni e di carcasse. Le specie più abbondanti nei campioni di pelle da carcasse convenzionali sono risultate Bacillus thermoamylovorans, Ureibacillus thermosphaericus e Lactobacillus salivarius mentre Lactobacillus kitasatonis nelle carcasse antibiotic free. Sia nei campioni di pelle che nei campioni di acque di lavaggio il phylum Bacteroidetes ha mostrato abundance significativamente maggiore nelle carcasse da allevamenti antibiotic free e le specie più abbondanti sono risultate Chryseobacterium proteolyticum, Chryseobacterium formosense, Chryseobacterium indologenes, Chryseobacterium shigense. Il secondo phylum significativamente maggiore nei campioni di pelle da carcasse antibiotic free è risultato quello degli Actinobacteria con le specie Rothia mucilaginosa, Micrococcus lylae, Microbacterium oxydans e Clavibacter michiganensis. L’ unico phylum significativamente maggiore nei campioni di pelle da carcasse convenzionali è stato quello dei Proteobacteria, classe Gammaproteobacteria. Le specie significativamente più abbondanti sulla pelle sono risultate Pseudomonas fluorescens e Psychrobacter glacincola, mentre Psychrobacter pulmonis nelle acque di lavaggio. In tutti i campioni non è stata rilevata Salmonella enterica e Campylobacter ha mostrato valori di abundance < 0.4%. I risultati hanno dimostrato che il sequenziamento targettato sul 16S rRNA è una metodica efficace per valutare il microbiota delle carcasse di pollo e permette di valutare sia i microrganismi patogeni inclusi nel Regolamento EU 2073 che tutti gli altri gruppi batterici.

In questo lavoro di tesi è stata analizzata la capacità di quantificazione e identificazione di sequenze metagenomiche appartenenti a microrganismi inoculati sperimentalmente in due matrici alimentari sottoposte a metagenomica shotgun e target utilizzando quattro tools bioinformatici, valutando in modo indipendente le prestazioni in termini di assegnazione tassonomica dei microrganismi e la loro eventuale quantificazione. Le due matrici alimentari analizzate sono rappresentate da bocconcini di petto di pollo antibiotic free e filetti di salmone affumicato, inoculati con proporzioni conosciute di una mock community. I software bioinformatici valutati sono stati MG-RAST, MGmapper, CosmosID e One codex, tutti disponibili online ad eccezione di MGmapper. Complessivamente, i risultati delle analisi condotte su matrici alimentari inoculate sperimentalmente mostrano che tutti e quattro i tools bioinformatici utilizzati hanno ottenuto buoni risultati in termini di identificazione di batteri e parassiti, sebbene CosmosID e One codex siano stati in grado di identificare anche i virus. MG-RAST con il database RefSeq, seguito da MGmapper (database Silva), sono i software di analisi più affidabili nell'identificazione di specie batteriche. Al contrario, MG-RAST e MGmapper hanno mostrato una capacità molto limitata di identificare i virus, mentre CosmosID e One codex li hanno rilevati. Infine, MG-RAST e CosmosID sono stati in grado di identificare il protozoa Cryptosporidium parvum mentre il lievito Saccharomyces cerevisiae non ha superato il valore soglia di identificazione con nessuno dei software bioinformatici utilizzati. A livello quantitativo non è stato possibile identificare una correlazione diretta tra concentrazione di una specie inoculata e abundance delle reads per quella specie anche se in termini relativi la specie Propionibacterium freudenreichii inoculata alle concentrazioni più alte ha mostrato un’abundance delle read maggiore con tutti i software utilizzati.

In questo studio si è applicata la metagenomica shotgun per valutare le popolazioni microbiche ed i geni presenti su carcasse di polli da carne. Le carcasse sono state ottenute da animali alimentati con una dieta di controllo, una dieta addizionata con 1500 unità di fitasi/kg di mangime ed una dieta con fitasi e 3 g/kg di inositolo. I metagenomi ottenuti hanno mostrato un numero medio di reads pari a 6816563, associate sia a geni per la classificazione tassonomica che a geni funzionali. La classe dei Gammaproteobacteria, principalmente rappresentata da Moraxellaceae, Enterobacteriaceae e Aeromonadaceae, è risultata la più abbondante in tutti i gruppi testati. La famiglia delle Moraxelaceae è risultata significativamente più elevata nel controllo rispetto ai gruppi trattati con fitasi. All’interno di questa famiglia, la specie Enhydrobacter aerosaccus è risultata significativamente più elevata nei gruppi trattati rispetto al controllo. Al contrario, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter lwoffii e Acinetobacter calcoaceticus sono risultate significativamente inferiori nelle carcasse ottenute da polli alimentati con fitasi rispetto al gruppo di controllo. In relazione alla famiglia delle Enterobatteriacea, Salmonella enterica è risultata significativamente maggiore nei gruppi trattati con fitasi rispetto al controllo, mentre Enterobacter cloacae e Klebsiella oxytoca sono diminuite significativamente nei gruppi trattati. Nella famiglia delle Aeromonadaceae le specie Aeromonas hydrophila e Aeromonas salmonicida sono aumentate significativamente nei gruppi trattati con fitasi. In relazione all’analisi dei geni funzionali, effettuata con MG-RAST, si sono evidenziate differenze significative tra le carcasse analizzate con particolare riferimento ad alcuni geni associati a trasporto e metabolismo lipidico con abundance significativamente inferiore nei gruppi trattati rispetto al gruppo di controllo.

Nel corso del 2016 sono stati analizzati tutti i lotti di oliva all’ascolana prodotti dall’azienda GELA. La raccolta dei campioni è stata effettuata sulla base delle specifiche previste dal Regolamento 2073: per ciascun lotto si sono raccolte 5 unità campionarie che poi sono analizzate (pastella ed oliva farcita). L’obiettivo è stato quello di raccogliere dati sui livelli di contaminazione batterica dell’oliva farcita prendendo in esame i principali gruppi microbici quali Staphylococcus aureus, E. coli, Listeria Monocytogenes, Salmonella, Campylobactyer e Yersinia. Inoltre si sono valutati i diversi aspetti produttivi per verificare il corretto adempimento alle leggi nazionali e comunitarie vigenti. Dai valori ottenuti si può affermare che la carica batterica totale risulta più elevata nel prodotto finito rispetto alla pastella utilizzata prima della fase di cottura. Tale valore comunque risulta inferiore a quello riportato nel Manuale di Autocontrollo aziendale corrispondente a 6,477 Log10/UFC. Dall’analisi dei lotti è possibile notare sia la presenza di Staphylococcus aureus, che è risultata sempre inferiore al limite di 50 UFC/g ad eccezione del lotto del mese di Aprile il cui valore è risultato più elevato: circa 540 UFC/g. Per quanto riguarda la Listeria monocytogenes, invece, tutti i lotti ad eccezione di quello del mese di maggio hanno presentato valori inferiori al limite minimo di 10 MPN/g mentre il lotto del mese di maggio, pur presentando un valore superiore al limite minimo, comunque è risultato ampiamente al di sotto del limite massimo di 110 MPN/g. Essendo un prodotto ready to cook bisogna tener conto della potenziale riduzione microbica determinata dalla cottura anche se la manipolazione di un alimento contaminato potrebbe generare contaminazioni crociate. Perciò sarebbe opportuno estendere il monitoraggio ad altri lotti di produzione ed avere un valido programma di campionamento nell’ottica di una garanzia assoluta per il consumatore finale.

In questo lavoro di tesi sono stati affrontati argomenti relativi ai due principali sistemi di allevamento avicolo nel territorio nazionale; l’allevamento effettuato con sistema intensivo e quello attuato con sistema alternativo. Questi due tipi di sistemi sono stati messi a confronto. Inizialmente sono state riportate informazioni sulle attuali normative comunitarie che regolano il commercio e la produzione della carne avicola; di seguito sono stati riportati dati statistici riguardanti la produzione e la commercializzazione di questo prodotto sia a livello nazionale, che a livello globale. Per ognuno dei due tipi di allevamento sono stati approfonditi aspetti riguardanti le caratteristiche qualitative della carne avicola, in particolare riferimenti sulla composizione chimica, sul valore nutritivo e sugli indici di qualità. Sono state prese in esame anche le caratteristiche proprie di ogni tipo di allevamento, come la tecnica e la gestione d’allevamento, e per ognuno di essi sono state riportate le principali differenze che caratterizzano questi due diversi sistemi di allevamento. Successivamente per ognuno dei due sistemi, sono state riportate le principali problematiche igienico-sanitarie, fra cui diverse patologie, tecnopatie, e parassitosi riscontrate sia in fase di allevamento, che in fase di macellazione e commercializzazione. Infine è stata fatta un’analisi comparativa nella quale sono stati messi a confronto i due sistemi di allevamento e nella quale sono stati riportati i metodi e i suggerimenti di riduzione del rischio microbiologico e sanitario in fase di allevamento e di macellazione.

Il cambiamento climatico è una sfida complessa che rappresenta una grave minaccia per il nostro pianeta e la vita, come la conosciamo. Si attestano cambiamenti a lungo termine del clima quali: aumento della temperatura media, alterazione della stagionalità, stress combinato da calore e siccità, forti piogge, stress idrico, cambiamenti nel manifestarsi di parassiti e malattie, aumento del livello del mare e acidificazione degli oceani. Tutti questi fattori avranno un impatto sui settori agricoli e sulle relative catene alimentari, sui mezzi di sussistenza e sugli ecosistemi. La sensibilità ai fattori climatici degli agenti patogeni (compresi batteri, virus e parassiti), dei microrganismi potenzialmente tossigeni, dei vari parassiti suggerisce che il cambiamento climatico ha il potenziale di causare, e/o modificare l'insorgenza e l'intensità di alcune malattie di origine alimentare e l'insediamento di specie aliene invasive dannose per la salute delle piante e degli animali. Le malattie zoonotiche stanno diventando una minaccia importante a causa dei cambiamenti drastici negli ecosistemi e dell’estrema vicinanza delle persone con le altre specie. Si è dedicato un capitolo al progetto CLEFSA che mira a sviluppare e testare nuove metodologie per l’identificazione e la caratterizzazione dei rischi emergenti e a produrre un elenco di problematiche/rischi emergenti potenzialmente interessati dai cambiamenti climatici. Si rivolge a un vasto pubblico, compresi tutti gli attori interessati nel campo della sicurezza alimentare, dai valutatori del rischio, ai responsabili della gestione del rischio, ai ricercatori. La metodologia applicata contribuisce alla costruzione di un approccio più sistemico, complessivo e globale sulla sicurezza alimentare, considerando il sistema alimentare in un contesto più ampio in cui i vari fattori ambientali, sociali, economici e tecnologici e le loro interazioni possono determinare una pletora di cambiamenti potenziali.

La crescente richiesta di sicurezza negli alimenti di origine animale, inclusa la filiera lattiero casearia ha spinto gli operatori del settore a porre maggiore attenzione ad un sempre più elevato numero di batteri patogeni. Negli ultimi si è posta l’attenzione, in modo crescente, sul monitoraggio del Bacillus cereus, per il quale lo stesso Reg. 2073/2005 ha definito criteri igienici di processo nel latte in polvere. Il presente studio si è pertanto focalizzato sul monitoraggio delle caratteristiche igienico sanitarie di diverse tipologie di latte crudo (BIO, BIO Fieno, Tracciato, Alta Qualità e Alta Qualità NO OGM), includendo il controllo del Bacillus cereus. In particolare oltre alla detection ed identificazione del Bacillus cereus si sono valutati diversi parametri quali pH, cellule somatiche, Conta Batterica Totale (CBT), Enterobacteriaceae, E. coli, Staphylococchi coagulasi positivi, Salmonella e Listeria monocytogenes. I risultati ottenuti hanno confermato ottimali condizioni igieniche in tutte le tipologie di latte con una media geometrica della Carica batterica totale pari a 13553 ufc/ml valore nettamente inferiore rispetto al limite stabilito dal Reg. 853/2004). L’assenza di Salmonella in tutti i campioni testati ed una positività solo alla detection per Listeria moncytogenes in 2/46 campioni testati dimostrano ottimali garanzie di sicurezza alimentare. Relativamente alla positività per Bacillus cereus il 23.9% dei campioni analizzati sono risultati positivi (dopo conferma in PCR). In conclusione si può affermare che l’azienda fornitrice dei campioni di latte alimentare applichi buone pratiche di igiene e di processo nelle fasi antecedenti la trasformazione del latte, nel rispetto delle normative di riferimento sia in ambito igienico che di sicurezza alimentare.

La seguente tesi è stata redatta con l’obbiettivo di implementare il piano di controllo della qualità dello stabilimento dell’azienda INALCA S.p.A, creando un HACCP specifico per il nuovo sistema di congelamento automatico della carne. In particolare, dopo un cenno storico al problema HACCP, si sono affrontati i principali aspetti del sistema HACCP, e dei regolamenti che ne conseguono per la sua creazione, attuazione e validazione. Obiettivo dell’azienda e del mio elaborato era quello di valutare la possibilità di congelare e raggiungere i -18°C al cuore in un tempo inferiore alle 24 ore, puntando alle 16 ore, per ottimizzare la fase di congelamento e velocizzare il processo per la futura vendita dei pallets di carne. A tal fine si è elaborato e successivamente validato il sistema di controllo che tiene conto di tutti gli aspetti generali, dall’entrata della materia prima e dalle sue caratteristiche intrinseche ed estrinseche, all’uscita del prodotto finito confezionato in pallet e trasferito in celle, congelato per il mantenimento della catena del freddo per poi essere spedite ai clienti. Si sono effettuate analisi di conferma per il corretto funzionamento e ottimizzazione dell’impianto medesimo, confrontando le tempistiche di congelamento nei diversi piani dell’impianto di congelamento automatico per il raggiungimento dei -18°C al cuore delle cassette contenenti polpa industriale, valore standard definito dall’azienda per la vendita e spedizione dei prodotti congelati.

Dato l’enorme sviluppo dei prodotti ready-to-eat (RTE), prodotti il cui consumo continua a crescere, in particolare a seguito della pandemia di SARS-CoV-2, l'obiettivo del mio elaborato è quello di illustrare le motivazioni di questo incremento e di valutare i principali rischi riguardanti gli alimenti ready-to-eat di origine animale. Nel mio elaborato descrivo le diverse tipologie di prodotti ready-to-eat e analizzo le motivazioni che possono spingere il consumatore all'acquisto di questa categoria di prodotti. Inoltre vengono illustrate le principali problematiche sanitarie di origine biologico e chimico associate al consumo di prodotti RTE, analizzando i dati epidemiologici pubblicati nell'ultimo rapporto EFSA sulle zoonosi del 2019. Infine, sono illustrati i principali interventi di prevenzione da applicare in ambito industriale e domestico al fine di ridurre tossinfezioni alimentari in campo umano.

L'obiettivo del seguente elaborato è stato quello di analizzare il rischio di contaminanti chimici nella filiera di uova e ovoprodotti. In particolare, è stata analizzata la contaminazione da diossine e PCB evidenziando le diverse fonti di contaminazione e i loro effetti tossici sull'organismo. Sono stati inoltre descritti i principali metodi analitici impiegati per la loro quantificazione, sia da uova intere che da tuorlo d'uovo e grasso di origine animale. La valutazione dei dati disponibili a livello internazionale e nazionale confermano che le vie di contaminazione principali nella filiera delle uova e ovoprodotti sono rappresentate da suolo, erba e lombrichi contaminati mentre il consumo di mangime contaminato risulta meno rilevante. Queste evidenze rendono indispensabile la necessità di implementare il controllo degli inquinanti ambientali nel piano nazionale del controllo dei residui, al fine di consentirne un'efficace riduzione per poter garantire una maggiore sicurezza alimentare per il consumatore.

L’evoluzione della normativa è la necessaria risposta alle naturali mutazioni della filiera agroalimentare, legate a sempre nuovi rischi, nei confronti dei quali si è dovuto modellare l’approccio, come emerge dal regolamento 625/2017 che tratto in questo mio elaborato. Gli aspetti più rilevanti di questo nuovo strumento legislativo si possono riassumere nei seguenti punti: A. Garantire maggiore trasparenza nei confronti del consumatore senza tralasciare gli aspetti legati alla correttezza sia etica che pratica del produttore; B. Integrare e rafforzare una rete di comunicazione tra gli Stati Membri nella gestione di informazioni e dati relativi; C. Attuare una importante riduzione del corpo legislativo comunitario in merito agli aspetti burocratici-amministrativi nonché una facilitazione delle attività per tutti gli operatori della filiera: allevatori, produttori, trasformatori, trasportatori e dettaglianti. In sostanza il nuovo regolamento, attraverso l’inclusione di nuovi settori della filiera agroalimentare, pone l’attenzione al tema della sostenibilità della filiera agroalimentare e la proposizione di un sistema sinergico di controlli, introduce disposizioni la cui attuazione consente la piena applicazione del principio One Health per il benessere e sanità animale e per la sicurezza ambientale ed alimentare.

Le tossinfezioni alimentari causate dal consumo di alimenti di origine animale sono un fenomeno piuttosto diffuso tra i quali la carne di pollo è una delle principali fonti, in quanto presenta diverse contaminazioni con potenziale zoonotico. Infatti, il pollame può presentare diverse malattie infettive di origine batterica che sono in grado di provocare patologie anche a carattere setticemico. È il caso delle infezioni da Escherichia coli: un microrganismo Gram-negativo normalmente presente nell’intestino degli animali e dell’uomo. In tali casi il trattamento farmacologico risulta indispensabile ma purtroppo questo approccio è frequentemente associato alla crescente capacità di acquisizione, da parte del microrganismo, di determinati genetici di resistenza antibiotica portando conseguentemente al fallimento delle terapie. Questo fenomeno in continuo aumento provoca una crescente preoccupazione delle autorità sanitarie in tutto il mondo tanto da consigliare il divieto di utilizzo degli antibiotici negli allevamenti animali. Nel presente studio, isolati di E. coli raccolti da due aziende di broiler allevati senza l’impiego di antibiotici sono stati analizzati al fine di comparare la suscettibilità antimicrobica a quattordici antibiotici (fenotipo di resistenza) con il genotipo di resistenza ottenuto mediante sequenziamento dell’intero genoma, che ha permesso di identificare i determinanti genetici di antibiotico-resistenza e virulenza. Lo studio ha messo in evidenza come il WGS sia in grado di predire il fenotipo di resistenza ma non quello di suscettibilità. L’analisi del viruloma ha indicato la presenza di geni interessanti per la valutazione della patogenicità degli isolati. La caratterizzazione genetica ha messo in luce una certa diversità tra gli isolati intra ed inter-allevamento tranne per alcuni campioni. Infine, l’analisi MLST ha confermato precedenti evidenze scientifiche riguardo ad alcuni ST-tipo indicati come resistenti ad antibiotici beta-lattamici.

Le continue allerte sanitarie relative agli alimenti potenzialmente responsabili di malattie a trasmissione alimentare ribadiscono la necessità di garantire la sicurezza alimentare dei prodotti commercializzati. A tale fine la responsabilizzazione dell’operatore del settore alimentare è un punto cardine infatti l’attuale legislazione alimentare rovescia, rispetto all'assetto precedente, l’onere primario di garanzia della sicurezza alimentare come riportato nel Regolamento (CE) N.178/02. Sulla base di tali considerazioni qualunque operatore alimentare dovrà sviluppare un appropriato piano HACCP sulla base del quale definire i potenziali rischi e le misure per eliminarli o mitigarli. In questo elaborato si è voluto analizzare il settore della gelateria artigianale strutturalmente molto complesso e ricco di opportunità interessanti, soprattutto per quanto riguarda il mercato estero il cui fine è quello di preservare tradizione e qualità di un prodotto "Made in Italy". Il presente elaborato mira ad evidenziare i principali aspetti della produzione del gelato artigianale finalizzati alla salvaguardia dei requisiti di qualità e salubrità igienico-sanitari e al rispetto delle norme legislative. Verranno inoltre illustrati i principali rischi sanitari riconducibili al consumo di gelato in quanto tale e delle materie prime utilizzate per la sua produzione al fine di identificare i possibili interventi correttivi con i quali garantire la sicurezza al consumatore finale.

In questo lavoro di tesi è stata analizzata la capacità di quantificazione e identificazione di sequenze metagenomiche appartenenti a microrganismi inoculati sperimentalmente in due matrici alimentari sottoposte a metagenomica shotgun e target utilizzando quattro tools bioinformatici, valutando in modo indipendente le prestazioni in termini di assegnazione tassonomica dei microrganismi e la loro eventuale quantificazione. Le due matrici alimentari analizzate sono rappresentate da bocconcini di petto di pollo antibiotic free e filetti di salmone affumicato, inoculati con proporzioni conosciute di una mock community. I software bioinformatici valutati sono stati MG-RAST, MGmapper, CosmosID e One codex, tutti disponibili online ad eccezione di MGmapper. Complessivamente, i risultati delle analisi condotte su matrici alimentari inoculate sperimentalmente mostrano che tutti e quattro i tools bioinformatici utilizzati hanno ottenuto buoni risultati in termini di identificazione di batteri e parassiti, sebbene CosmosID e One codex siano stati in grado di identificare anche i virus. MG-RAST con il database RefSeq, seguito da MGmapper (database Silva), sono i software di analisi più affidabili nell'identificazione di specie batteriche. Al contrario, MG-RAST e MGmapper hanno mostrato una capacità molto limitata di identificare i virus, mentre CosmosID e One codex li hanno rilevati. Infine, MG-RAST e CosmosID sono stati in grado di identificare il protozoa Cryptosporidium parvum mentre il lievito Saccharomyces cerevisiae non ha superato il valore soglia di identificazione con nessuno dei software bioinformatici utilizzati. A livello quantitativo non è stato possibile identificare una correlazione diretta tra concentrazione di una specie inoculata e abundance delle reads per quella specie anche se in termini relativi la specie Propionibacterium freudenreichii inoculata alle concentrazioni più alte ha mostrato un’abundance delle read maggiore con tutti i software utilizzati.

In questo lavoro di tesi il sequenziamento targettato del 16S rRNA è stato applicato per analizzare il microbiota associato a 30 campioni di pelle di collo e 30 di acque di lavaggio di carcasse da allevamenti convenzionali (n=15) ed antibiotic free (n=15). Il microbiota associato alle due tipologie di carcasse presenta differenze significative. Il phylum Firmicutes era prevalente in entrambe le tipologie di campioni e di carcasse. Le specie più abbondanti nei campioni di pelle da carcasse convenzionali sono risultate Bacillus thermoamylovorans, Ureibacillus thermosphaericus e Lactobacillus salivarius mentre Lactobacillus kitasatonis nelle carcasse antibiotic free. Sia nei campioni di pelle che nei campioni di acque di lavaggio il phylum Bacteroidetes ha mostrato abundance significativamente maggiore nelle carcasse da allevamenti antibiotic free e le specie più abbondanti sono risultate Chryseobacterium proteolyticum, Chryseobacterium formosense, Chryseobacterium indologenes, Chryseobacterium shigense. Il secondo phylum significativamente maggiore nei campioni di pelle da carcasse antibiotic free è risultato quello degli Actinobacteria con le specie Rothia mucilaginosa, Micrococcus lylae, Microbacterium oxydans e Clavibacter michiganensis. L’ unico phylum significativamente maggiore nei campioni di pelle da carcasse convenzionali è stato quello dei Proteobacteria, classe Gammaproteobacteria. Le specie significativamente più abbondanti sulla pelle sono risultate Pseudomonas fluorescens e Psychrobacter glacincola, mentre Psychrobacter pulmonis nelle acque di lavaggio. In tutti i campioni non è stata rilevata Salmonella enterica e Campylobacter ha mostrato valori di abundance < 0.4%. I risultati hanno dimostrato che il sequenziamento targettato sul 16S rRNA è una metodica efficace per valutare il microbiota delle carcasse di pollo e permette di valutare sia i microrganismi patogeni inclusi nel Regolamento EU 2073 che tutti gli altri gruppi batterici.

In questo studio si è applicata la metagenomica shotgun per valutare le popolazioni microbiche ed i geni presenti su carcasse di polli da carne. Le carcasse sono state ottenute da animali alimentati con una dieta di controllo, una dieta addizionata con 1500 unità di fitasi/kg di mangime ed una dieta con fitasi e 3 g/kg di inositolo. I metagenomi ottenuti hanno mostrato un numero medio di reads pari a 6816563, associate sia a geni per la classificazione tassonomica che a geni funzionali. La classe dei Gammaproteobacteria, principalmente rappresentata da Moraxellaceae, Enterobacteriaceae e Aeromonadaceae, è risultata la più abbondante in tutti i gruppi testati. La famiglia delle Moraxelaceae è risultata significativamente più elevata nel controllo rispetto ai gruppi trattati con fitasi. All’interno di questa famiglia, la specie Enhydrobacter aerosaccus è risultata significativamente più elevata nei gruppi trattati rispetto al controllo. Al contrario, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter lwoffii e Acinetobacter calcoaceticus sono risultate significativamente inferiori nelle carcasse ottenute da polli alimentati con fitasi rispetto al gruppo di controllo. In relazione alla famiglia delle Enterobatteriacea, Salmonella enterica è risultata significativamente maggiore nei gruppi trattati con fitasi rispetto al controllo, mentre Enterobacter cloacae e Klebsiella oxytoca sono diminuite significativamente nei gruppi trattati. Nella famiglia delle Aeromonadaceae le specie Aeromonas hydrophila e Aeromonas salmonicida sono aumentate significativamente nei gruppi trattati con fitasi. In relazione all’analisi dei geni funzionali, effettuata con MG-RAST, si sono evidenziate differenze significative tra le carcasse analizzate con particolare riferimento ad alcuni geni associati a trasporto e metabolismo lipidico con abundance significativamente inferiore nei gruppi trattati rispetto al gruppo di controllo.

Nel corso del 2016 sono stati analizzati tutti i lotti di oliva all’ascolana prodotti dall’azienda GELA. La raccolta dei campioni è stata effettuata sulla base delle specifiche previste dal Regolamento 2073: per ciascun lotto si sono raccolte 5 unità campionarie che poi sono analizzate (pastella ed oliva farcita). L’obiettivo è stato quello di raccogliere dati sui livelli di contaminazione batterica dell’oliva farcita prendendo in esame i principali gruppi microbici quali Staphylococcus aureus, E. coli, Listeria Monocytogenes, Salmonella, Campylobactyer e Yersinia. Inoltre si sono valutati i diversi aspetti produttivi per verificare il corretto adempimento alle leggi nazionali e comunitarie vigenti. Dai valori ottenuti si può affermare che la carica batterica totale risulta più elevata nel prodotto finito rispetto alla pastella utilizzata prima della fase di cottura. Tale valore comunque risulta inferiore a quello riportato nel Manuale di Autocontrollo aziendale corrispondente a 6,477 Log10/UFC. Dall’analisi dei lotti è possibile notare sia la presenza di Staphylococcus aureus, che è risultata sempre inferiore al limite di 50 UFC/g ad eccezione del lotto del mese di Aprile il cui valore è risultato più elevato: circa 540 UFC/g. Per quanto riguarda la Listeria monocytogenes, invece, tutti i lotti ad eccezione di quello del mese di maggio hanno presentato valori inferiori al limite minimo di 10 MPN/g mentre il lotto del mese di maggio, pur presentando un valore superiore al limite minimo, comunque è risultato ampiamente al di sotto del limite massimo di 110 MPN/g. Essendo un prodotto ready to cook bisogna tener conto della potenziale riduzione microbica determinata dalla cottura anche se la manipolazione di un alimento contaminato potrebbe generare contaminazioni crociate. Perciò sarebbe opportuno estendere il monitoraggio ad altri lotti di produzione ed avere un valido programma di campionamento nell’ottica di una garanzia assoluta per il consumatore finale.

In questo mio elaborato vengono analizzate le principali problematiche igienico sanitarie della filiera di produzione delle uova e ovoprodotti, In particolare dopo un’analisi economica del settore di produzione delle uova e ovoprodotti vengono illustrati i principali metodi di allevamento delle galline ovaiole anche alla luce delle recenti tendenze a favorire allevamenti con sistemi alternativi a quelli delle gabbie tradizionali. Sono state inoltre illustrate le diverse fasi lavorazione delle uova in guscio (dalla raccolta alla selezione e confezionamento) e degli ovoprodotti includendo la descrizione delle diverse tipologie di prodotti d’uovo disponibili sul mercato. Accanto alla descrizione dei processi produttivi si sono illustrati anche i riferimenti normativi che disciplinano tali prodotti con particolare riferimento ai regolamenti relativi in materia di igiene, produzione e commercializzazione delle uova di categoria A. In relazione al focus principale della mia tesi sono stati inoltre descritti i principali rischi sanitari per l’uomo derivanti dal consumo di uova e ovoprodotti contaminati, accanto alle principali anomalie fisiche ed alle più comuni frodi alimentari. Più in particolare sono stati illustrati i dati raccolti a livello europeo sui focolai tossinfettivi nei quali sono state coinvolte le uova e ovoprodotti facendo particolare attenzione alle infezioni da S.enteritidis, principale microrganismo contaminante questi prodotti alimentari. Infine sono stati illustrati i principali interventi di gestione del rischio sanitario per le uova e ovoprodotti, partendo dalla fase di produzione fino ad arrivare ad interventi del consumatore, con i quali limitare la diffusione delle malattie a trasmissione alimentare.

In questo lavoro di tesi sono stati affrontati argomenti relativi ai due principali sistemi di allevamento avicolo nel territorio nazionale; l’allevamento effettuato con sistema intensivo e quello attuato con sistema alternativo. Questi due tipi di sistemi sono stati messi a confronto. Inizialmente sono state riportate informazioni sulle attuali normative comunitarie che regolano il commercio e la produzione della carne avicola; di seguito sono stati riportati dati statistici riguardanti la produzione e la commercializzazione di questo prodotto sia a livello nazionale, che a livello globale. Per ognuno dei due tipi di allevamento sono stati approfonditi aspetti riguardanti le caratteristiche qualitative della carne avicola, in particolare riferimenti sulla composizione chimica, sul valore nutritivo e sugli indici di qualità. Sono state prese in esame anche le caratteristiche proprie di ogni tipo di allevamento, come la tecnica e la gestione d’allevamento, e per ognuno di essi sono state riportate le principali differenze che caratterizzano questi due diversi sistemi di allevamento. Successivamente per ognuno dei due sistemi, sono state riportate le principali problematiche igienico-sanitarie, fra cui diverse patologie, tecnopatie, e parassitosi riscontrate sia in fase di allevamento, che in fase di macellazione e commercializzazione. Infine è stata fatta un’analisi comparativa nella quale sono stati messi a confronto i due sistemi di allevamento e nella quale sono stati riportati i metodi e i suggerimenti di riduzione del rischio microbiologico e sanitario in fase di allevamento e di macellazione.

L’elaborato illustra come il cambiamento delle abitudini quotidiane, nel corso degli anni, ha portato alla nascita di un tipo di ristorazione capace di conciliare i bisogni di tipo nutrizionale e relazionale con l’aspetto qualitativo fondato sulla salubrità degli alimenti. Il settore della ristorazione collettiva è disciplinato dai Reg. CE 178\02 e 852\04, i quali stabiliscono rispettivamente i principi ed i requisiti generali della legislazione alimentare e le linee guida sull'igiene dei prodotti alimentari. Le principali categorie di ristorazione collettiva sono quella aziendale, scolastica e sociosanitaria che soddisfano le esigenze di un numero ampio di persone accomunate dall’esigenza di usufruire dei pasti, al di fuori della propria abitazione (lavoratori-studenti- degenti di un ospedale). Le fasi principali da affrontare nell’analisi della ristorazione sono la preparazione e la distribuzione dei pasti con attenzione alla prevenzione delle tossinfezioni alimentari e la salubrità degli alimenti prodotti, trasformati e somministrati. La qualità non deve rappresentare un costo bensì un investimento: le aziende che operano nel settore alimentare hanno necessità di certificare ufficialmente il proprio adeguamento alla Normativa HACCP,al fine di aumentare la trasparenza, fornire sicurezza al consumatore e diminuirne l’incertezza, nel rispetto di quanto previsto dalle Leggi. I centri di produzione durante l’intero ciclo di lavorazione dei pasti, dalla preparazione alla commercializzazione, si affidano all’autocontrollo igienico fondato sui principi del modello HACCP che racchiude tute le misure da adottare per garantire la sicurezza igienico sanitaria e l’integrità degli alimenti. L’adempimento dei principi dell’HACCP nelle catene ristorative viene garantito dai controlli ufficiali svolti dalle autorità sanitarie con programmi ed interventi di vigilanza atti a ridurre i pericoli fisici-biologici che possono rendere dannoso un alimento per il consumatore.

Questa tesi ha valutato la shelf life di un prodotto REPFED’s (lasagna alla bolognese), sviluppato come prodotto da commercializzare fresco decongelato. Sono stati progettati tre diversi campioni: A, B e C, che presentavano differenze in relazione a ricettazione, tecnica di pastorizzazione e di confezionamento, sui quali si sono valutati l’andamento dei parametri indicatori di shelf life durante un periodo di conservabilità prolungata. Il piano analitico ha previsto la misurazione dei parametri microbiologici, chimico-fisici e organolettici nell’arco di 7 momenti della conservazione selezionati in un periodo di 33 giorni. Sono stati determinati CBT, LAB, enterobatteri, E. coli, lieviti, muffe, S. coagulasi positivi, B. cereus, Salmonella spp e L. monocytogenes, pH, Aw, Saggio di Kreiss, perossidi, atmosfera all’interno delle confezioni, e caratteri organolettici. I risultati hanno dimostrato l’effetto della pastorizzazione post packaging sulla conservabilità dei prodotti fresh from frozen. Tuttavia, i prodotti pastorizzati a 95°C in assenza di vapore hanno mostrato parametri microbiologici non appropriati per un extended shelf life fino a 60 giorni. Al contrario, i campioni pastorizzati a 98°C in autoclave, con saturazione di vapore e contropressione, sono risultati presentare valori compatibili con un’extended shelf life. I risultati delle analisi chimico-fisiche hanno evidenziato come ricettazione e confezionamento incidano sui parametri chimico-fisici e organolettici. In conclusione, questo studio preliminare ha confermato l’efficacia di trattamenti di pastorizzazione post packaging finalizzati ad estendere la conservabilità del prodotto, aiutando l’azienda alimentare ad occupare nicchie di mercato anche molto distanti dalle sedi produttive. Sono tuttavia necessari ulteriori studi riguardanti modifiche di ricetta e di confezionamento, finalizzati ad eliminare o ridurre quelle criticità che sono state evidenziate in questo elaborato di tesi.