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Alzheimer's disease is a devastating condition characterized by a progressive and slow brain decay in elders. Here, we developed a paper-based lateral flow immunoassay for simultaneous and fast determination of Alzheimer's blood biomarkers, fetuin B and clusterin. Selective antibodies to targeted biomarkers were immobilized on gold nanoparticles (AuNPs) and deposited on paper pads. After adding the sample on the paper-based device, the biofluid laterally flows toward the selective antibody, permitting AuNP-Ab accumulation on the test zone, which causes a color change from white to pink. Image analysis was performed using a customized algorithm for the automatic recognition of the area of analysis and color clustering. Colorimetric detection was compared to electrochemical methods for the precise quantification of biomarkers. The best performance was found for the color parameter "L*". Good linearity (R2 = 0.988 and 0.998) and reproducibility (%RSD = 2.79% and 1.82%, N = 3) were demonstrated for the quantification of fetuin B and clusterin, respectively. Furthermore, the specificity of the immunosensor was tested on mixtures of proteins, showing negligible cross-reactivity and good performance in complex environments. We believe that our biosensor has a potential for early-stage diagnosis of Alzheimer's disease and toward a better understanding of Alzheimer's developing mechanisms.

Preterm birth remains the main contributor to early childhood mortality. The vaginal environment, including microbiota composition, might contribute to the risk of preterm delivery. Alterations in the vaginal microbial community structure might represent a risk factor for preterm birth. Here, we aimed to (a) investigate the association between preterm birth and the vaginal microbial community and (b) identify microbial biomarkers for risk of preterm birth. Microbial DNA was isolated from vaginal swabs in a cohort of 69 women enrolled at hospital admission for their delivery. Microbiota was analyzed by high-throughput 16S rRNA sequencing. While no differences in microbial diversity measures appeared associated with the spontaneous preterm and full-term outcomes, the microbial composition was distinct for these groups. Differential abundance analysis showed Lactobacillus species to be associated with full-term birth whereas an unknown Prevotella species was more abundant in the spontaneous preterm group. Although we studied a very miscegenated population from Brazil, our findings were similar to evidence pointed by other studies in different countries. The role of Lactobacillus species as a protector in the vaginal microbiome is demonstrated to be also a protector of spontaneous preterm outcome whereas the presence of pathogenic species, such as Prevotella spp., is endorsed as a factor of risk for spontaneous preterm delivery.

[Background]: Selenium (Se) is a trace element with a narrow safety margin., [Objectives]: To evaluate the cross-sectional and longitudinal dose-response association between Se exposure and measures of impaired physical function and disability in older adults., [Design]: NHANES 2011–2014 cross-sectional (US, n = 1733, age ≥60 years) and Seniors-ENRICA-2 2017–2019 cross-sectional and longitudinal (Spain, n = 2548 and 1741, respectively, age ≥65 years) data were analyzed. Whole blood and serum Se levels were measured using inductively coupled plasma-mass spectrometry. Lower-extremity performance was assessed with the Short Physical Performance Battery, and muscle weakness with a dynamometer. Incident mobility and agility limitations, and disability in instrumental activities of daily living (IADL) were ascertained with standardized questionnaires. Analyses were adjusted for relevant confounders, including physical activity. Results across studies were pooled using random-effects meta-analysis., [Results]: Meta-analyzed odds ratios (95% confidence interval) per log2 increase in whole blood Se were 0.54 (0.32; 0.76) for weakness, 0.59 (0.34; 0.83) for impaired lower-extremity performance, 0.48 (0.31; 0.68) for mobility limitations, 0.71 (0.45; 0.97) for agility limitations, and 0.34 (0.12; 0.56) for disability in at least one IADL. Analyses for serum Se in NHANES showed similar results. Findings suggest the inverse association with grip strength is progressive below 140 μg/L (p-value for non-linear trend in the Seniors-ENRICA-2 study = 0.13), and above 140 μg/L (p-value for non-linear trend in NHANES = 0.11). In the Seniors-ENRICA-2 cohort, with a 2.2 year follow-up period, a doubling in baseline Se levels were associated with a lower incidence of weakness [odds ratio (95% confidence interval): 0.45 (0.22; 0.91)], impaired lower-extremity performance [0.63 (0.32; 1.23)], mobility [0.43 (0.21; 0.91)] and agility [0.38 (0.18; 0.78)] limitations., [Discussion]: In US and Spanish older adults, Se concentrations were inversely associated with physical function limitations. Further studies are needed to elucidate underlying mechanisms., This work has been supported by grants PI18/287 and 16/609 from the Instituto de Salud Carlos III, State Secretary of R + D + I, and FEDER/FSE; and by PID2019-108973RB-C21/C22 from the State Secretary of R + D + I.

Aim of the study Hepatic changes have been described during the refeeding syndrome due to increase in enzymes and hepatomegaly; however, they have not been properly described. Thus, the objective of this study was to investigate the hepatic histological characteristics and biochemical markers of hepatic steatosis in Wistar rats with refeeding syndrome. Material and methods Thirty male Wistar rats were allocated to one of three groups: C, F or R. The animals from group C received an AIN-93 diet for 96 hours, and were then sacrificed. Animals allocated to group F were fasted for 48 hours and sacrificed. Animals from group R were also fasted for 48 hours, but were refed for another 48 hours, with AIN-93. The liver, blood and epididymal and retroperitoneal fats were collected. Results Data obtained in groups F and R show the changes observed in refeeding syndrome, during starvation and refeeding. The serum glucose, magnesium, potassium and phosphorus, in group F, decreased. There was no evidence of hepatic steatosis. Hypophosphatemia, hypomagnesemia and hypokalemia were also observed in group R, confirming refeeding syndrome. The main histological characteristic, in this group, was the extensive presence of ballooning degeneration. This is the first article that has detected such change in liver structure, due to refeeding syndrome. The possible causes are: retention of sodium, causing whole body edema; and/or dysfunction of the sodium/potassium pump of the hepatocytes, as a result of hypophosphatemia. Conclusions This is the first description of an animal model of hepatic severe ballooning degeneration induced due to refeeding syndrome.

// Eliana Vanina Elias 1, * , Nadia Pereira de Castro 1, * , Paulo Henrique Baldan Pineda 1, * , Carolina Sens Abuazar 1 , Cynthia Aparecida Bueno de Toledo Osorio 3 , Mabel Gigliola Pinilla 1 , Sabrina Daniela da Silva 1 , Anamaria Aranha Camargo 4, 5 , Wilson Araujo Silva Jr 6 , Elisa Napolitano e Ferreira 1 , Helena Paula Brentani 7 , Dirce Maria Carraro 1, 2 1 Laboratory of Genomics and Molecular Biology, CIPE-International Research Center, A.C. Camargo Cancer Center, Sao Paulo, SP, Brazil 2 National Institute of Science and Technology in Oncogenomics (INCITO), Sao Paulo, SP, Brazil 3 Department of Anatomical Pathology, A.C. Camargo Cancer Center, Sao Paulo, SP, Brazil 4 Ludwig Institute for Cancer Research, Sao Paulo, SP, Brazil 5 Molecular Oncology Center, Sirio-Libanese Hospital, Sao Paulo, SP, Brazil 6 Department of Genetics, Ribeirao Preto Medical School, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, Sao Paulo, SP, Brazil 7 Institute of Psychiatry-Medical School, University of Sao Paulo (FMUSP), Sao Paulo, SP, Brazil * These authors have contributed equally to this work Correspondence to: Dirce Maria Carraro, email: dirce.carraro@accamargo.org.br Keywords: breast cancer, ductal carcinoma in situ progression, gene signature, cellular-based analysis, molecular markers Received: January 21, 2016 Accepted: September 20, 2016 Published: September 30, 2016 ABSTRACT Breast cancer biomarkers that can precisely predict the risk of progression of non-invasive ductal carcinoma in situ (DCIS) lesions to invasive disease are lacking. The identification of molecular alterations that occur during the invasion process is crucial for the discovery of drivers of transition to invasive disease and, consequently, biomarkers with clinical utility. In this study, we explored differences in gene expression in mammary epithelial cells before and after the morphological manifestation of invasion, i.e., early and late stages, respectively. In the early stage, epithelial cells were captured from both pre-invasive lesions with distinct malignant potential [pure DCIS as well as the in situ component that co-exists with invasive breast carcinoma lesions (DCIS-IBC)]; in the late stage, epithelial cells were captured from the two distinct morphological components of the same sample ( in situ and invasive components). Candidate genes were identified using cDNA microarray and rapid subtractive hybridization (RaSH) cDNA libraries and validated by RT-qPCR assay using new samples from each group. These analyses revealed 26 genes, including 20 from the early and 6 from the late stage. The expression profile based on the 20 genes, marked by a preferential decrease in expression level towards invasive phenotype, discriminated the majority of DCIS samples. Thus, this study revealed a gene expression signature with the potential to predict DCIS progression and, consequently, provides opportunities to tailor treatments for DCIS patients.

[ES] La presente tesis doctoral, titulada "papel del miR-99a-5p en cáncer de mama: transformando hallazgos moleculares en herramientas clínicas" está centrada en el estudio del microRNA miR-99a-5p en cáncer de mama y en la determinación de su potencial como diana terapéutica y biomarcador para el diagnóstico de dicha enfermedad. En el primer capítulo, se lleva a cabo una revisión general del cáncer de mama y los microRNAs. A continuación, en el segundo capítulo se presentan los objetivos. En el tercer capítulo se compararon los perfiles de expresión de microRNAs de una línea celular de cáncer de mama resistente a doxorrubicina frente a la línea celular parental, dando lugar a la identificación del microRNA miR-99a-5p como el más desregulado entre ambas. A continuación, se confirmó que el miR-99a-5p aumenta la sensibilidad a doxorrubicina mediante la inhibición directa de la expresión de COX-2, que conlleva la inhibición de la expresión de la proteína ABCG2, ampliamente descrita por su papel en resistencia a fármacos. En base a los resultados obtenidos, se diseñaron nanodispositivos basados en nanopartículas mesoporosas de sílice para la liberación de miR-99a-5p y doxorrubicina en los tumores. Se confirmó la eficacia de las nanopartículas para reducir el crecimiento tumoral así como los efectos adversos asociados a la doxorrubicina libre en un modelo ortotópico murino de cáncer de mama. En el cuarto capítulo, se evaluó el potencial del miR-99a-5p como biomarcador para el diagnóstico del cáncer de mama. Se determinó la expresión del microRNA en tumores primarios de cáncer de mama y en tejidos sanos. Los resultados mostraron que el miR-99a-5p se encuentra infraexpresado en los tejidos cancerosos. A continuación, con el objeto de determinar el potencial del miR-99a-5p como biomarcador mínimamente invasivo, se determinaron los niveles de expresión en plasma de pacientes de cáncer de mama y de donantes sanos. Se encontró que el miR-99a-5p se encuentra a mayor concentración en el plasma de pacientes con cáncer de mama. Estos resultados se validaron en una cohorte independiente. Mediante el análisis en base a curvas ROC se confirmó que el miR-99a-5p es útil como biomarcador no invasivo para el diagnóstico del cáncer de mama incluso en estadíos tempranos de la enfermedad. El quinto capítulo se centra el diseño y validación de un biosensor basado en soportes de alúmina mesoporosa para la detección del miR-99a-5p en plasma. Los poros de una placa de alúmina mesoporosa se cargaron con el fluoróforo rodamina B, y se utilizaron oligonucleótidos complementarios a la secuencia del miR-99a-5p como puertas moleculares capaces de retener los fluoróforos en el interior de los poros. En presencia del miR-99a-5p, se produce liberación de rodamina B, que es posteriormente detectada ópticamente. Se confirmó la especificidad del biosensor, así como su alta sensibilidad. Además, utilizando muestras de plasma de pacientes de cáncer de mama y controles sanos, se confirmó la eficiencia del dispositivo para detectar cáncer de mama incluso en estadíos tempranos. Por último, en los capítulos cinco y seis se presentan la discusión general y las conclusiones principales extraídas. En conclusión, esta tesis doctoral demuestra que el miR-99a-5p tiene potencial como diana terapéutica y biomarcador para el cáncer de mama, y podría ser útil para mejorar el pronóstico de los pacientes con dicha enfermedad. Se ha elucidado que uno de los mecanismos por los que el miR-99a-5p está involucrado en sensibilidad a doxorrubicina es mediante la regulación del eje COX-2/ABCG2. Además, las nanopartículas diseñadas para la administración combinada de miR-99a-5p y doxorrubicina se presentan como una herramienta con gran potencial para el tratamiento oncológico. Por último, aprovechando el potencial del miR-99a-5p como biomarcador diagnóstico, se ha desarrollado un sistema de detección que podría ser una herramienta útil para mejorar la detección temprana del cáncer de mama., [CA] La present tesis doctoral, titulada "paper del miR-99a-5p en càncer de mama: transformant descobriments moleculars en eines clíniques" està centrada en l'estudi del microRNA miR-99a-5p en càncer de mama i en la determinació del seu potencial com a diana terapèutica i biomarcador per al diagnòstic d'aquesta malaltia. En el primer capítol, es du a terme una revisió general del càncer de mama i els microRNAs. A continuació, en el segon capítol es presenten els objectius. En el tercer capítol es van comparar els perfils d'expressió de microRNAs d'una línia cel·lular de càncer de mama resistent a doxorrubicina amb la seua línia parental, donant lloc a la identificació del microRNA miR-99a-5p com el més desregulat entre ambdues. A continuació, es va confirmar que el miR-99a-5p augmenta la sensibilitat al fàrmac mijançant la inhibició directa de l'expressió de COX-2 de forma directa, que comporta la inhibició de l'expressió de la proteïna ABCG2 que està àmpliament descrita pel seu paper en resistència a fàrmacs. Basant-se en els resultats obtinguts, es van dissenyar nanodispositius basats en nanopartícules mesoporoses de sílice per a l'alliberament d'una combinació de miR-99a-5p i doxorrubicina en els tumors. L'eficacia dels sistemes per a reduir el creixement tumoral així com els efectes adversos associats a la doxorrubicina lliure es va confirmar en un model ortotòpic murí de càncer de mama. En el quart capítol, es va avaluar el potencial del miR-99a-5p com a biomarcador per al diagnòstic del càncer de mama. Es va determinar l'expressió del microRNA en tumors primaris de càncer de mama i en teixits sans. Els resultats van mostrar que el miR-99a-5p es troba infraexpressat en els teixits cancerosos. A continuació, amb l'objectiu de determinar el potencial del miR-99a-5p com a biomarcador mínimament invasiu, es van determinar els nivells d'expressió en plasma de pacients de càncer de mama i de donants sans. Es va trobar que el miR-99a-5p es troba a major concentració en el plasma de pacients amb càncer de mama. Aquestos resultats es van validar en una cohort independent. Per mitjà de l'anàlisi basant-se en corbes ROC es va confirmar que el miR-99a-5p és útil com a biomarcador no invasiu per al diagnòstic del càncer de mama inclús en estadis primerencs de la malaltia. El quint capítol es centra en el disseny i validació d'un biosensor basat en suports d'alúmina nanoporosa per la detecció del miR-99a-5p en plasma. Els porus d'una placa d'alúmina es van carregar amb l'indicador fluorescent rodamina B, i es van utilitzar oligonucleòtids complementaris a la seqüència del miR-99a-5p com a portes moleculars amb la capacitat de retindre els fluoròfors a l'interior dels porus. En presència del miR-99a-5p, es produeix l'alliberament de rodamina B, que serà posteriorment detectada òpticament. Es va confirmar l'especificitat del biosensor, així com la seua alta sensibilitat. A més, utilitzant mostres de plasma de pacients de càncer de mama i controls sans, es va confirmar l'eficiència del dispositiu per a detectar càncer de mama inclús en estadis primerencs. Finalment, en els capítols sis i set es presenten la discussió general i les conclusions principals. En conclusió, aquesta tesi doctoral demostra que el miR-99a-5p té potencial com a diana terapèutica i biomarcador per al càncer de mama, i podria ser útil per a millorar el pronòstic dels pacients amb dita malaltia. S'ha elucidat que un dels mecanismes pels quals el miR-99a-5p està involucrat en sensibilitat a doxorrubicina és per mitjà de la regulació de l'eix COX-2/ABCG2. A més, les nanopartícules dissenyades per a l'administració combinada de miR-99a-5p i doxorrubicina es presenta com una ferramenta amb gran potencial per al tractament oncològic. Finalment, aprofitant el potencial del miR-99a-5p com a biomarcador diagnòstic, s'ha desenvolupat un sistema de detecció que podria ser una ferramenta útil per a millorar la detecció primerenca del càncer de mama., [EN] This PhD thesis, entitled "Role of miR-99a-5p in breast cancer: translating molecular findings into clinical tools" is focused on the study of the microRNA miR-99a-5p in breast cancer and in determining its potential as a therapeutic target and biomarker for the diagnosis of this disease. In the first chapter, a general review of breast cancer is carried out and microRNAs are also introduced. Next, in the second chapter, the objectives are detailed. In the third chapter, the microRNA expression profile of a doxorubicin-resistant breast cancer cell line was compared with its parental cell line, leading to the identification of the microRNA miR-99a-5p as the most deregulated between the two of them. Subsequently, it was confirmed that miR-99a-5p increases drug sensitivity through directly targeting COX-2, which leads to the inhibition of the expression of the ABCG2 protein, widely described to be involved in drug resistance. Based on the obtained results, nanodevices based on mesoporous silica nanoparticles were designed for the combined release of miR-99a-5p and doxorubicin in tumors. The ability of the systems to specifically target the CD44 receptor, which is overexpressed in breast cancer tumors, as well as to release the cargo specifically after internalization, were tested in vitro. Furthermore, the efficacy of the nanoparticles to reduce tumor growth and the adverse effects associated with free doxorubicin was confirmed in a murine orthotopic model of breast cancer. In the fourth chapter, the potential of miR-99a-5p as a biomarker for the diagnosis of breast cancer was evaluated. First, microRNA expression was determined in primary breast cancer tumors and compared with healthy tissues. The results showed that miR-99a-5p is downregulated in breast cancer tissues. Next, to determine the potential of the microRNA as a minimally invasive biomarker, the expression levels of miR-99a-5p in plasma of breast cancer patients and healthy donors were determined. In this case, it was found that miR-99a-5p is at higher concentrations in the plasma of breast cancer patients. These results were validated in an independent cohort. Through the ROC curve analysis, it was confirmed that miR-99a-5p is useful as a non-invasive biomarker for the diagnosis of breast cancer even at early stages. The fifth chapter focus on the design and validation of a biosensor based on nanoporous alumina supports for the detection of miR-99a-5p in plasma. The pores of the alumina plate were loaded with the fluorescent indicator rhodamine B, and oligonucleotides with a sequence complementary to the miR-99a-5p were used as molecular gates able to maintain fluorophores inside the pores. In the presence of miR-99a-5p, the capping oligonucleotide is displaced, leading to the opening of the pores and the release of rhodamine B, which is subsequently optically detected. The specificity and high sensitivity of the biosensor were confirmed. Furthermore, the efficiency of the device to detect breast cancer even at early stages was confirmed using plasma samples from breast cancer patients and healthy controls. Finally, chapters five and six present the general discussion and conclusions. In conclusion, this PhD thesis demonstrates that miR-99a-5p is a molecule with potential as a therapeutic target and biomarker for breast cancer, and it could be useful to improve the prognosis of patients. It has been elucidated that one of the mechanisms by which miR-99a-5p is involved in doxorubicin sensitivity is through the regulation of the COX-2/ABCG2 axis. Furthermore, nanoparticles designed for the combined administration of miR-99a-5p and doxorubicin are presented as a tool with great potential for cancer treatment and could be useful for the administration of microRNAs as therapy. Finally, taking advantage of the potential of miR-99a-5p as a diagnostic biomarker, a detection system has been developed and could be a useful tool to improve early detection of breast cancer., This work was supported by, CIBERONC (CB16/12/00481), CIBER-BBN (CB07/01/2012), Spanish Government PI18/01219 (ISCIII), project RTI2018- 100910-B-C41 (MCUI/AEI/FEDER, UE) and the Generalitat Valenciana (PROMETEO/2018/024) for support. IG-C was funded by Generalitat Valenciana (ACIF/2016/030). LP was funded by Ministerio de Economia, Industria y Competitividad (FPI grant). SS was funded by Instituto de Salud Carlos III and the European Social Fund for the financial support “Sara Borrell” (CD16/000237). JMC was funded by Sociedad Española de Oncología Médica (Río Hortega-SEOM. The authors would like to thank the INCLIVA Biobank (PT17/0015/0049; B.000768 ISCIII) and the Valencian Biobanking Network integrated into the Spanish National Biobanks Network for providing the human biological samples. We would also like to thank the plasma donors and the nursing staff that accepted to participate in this study.

[ES] El consumo de altas cantidades de etanol durante en un corto período de tiempo, conocido también como consumo en atracón, causa importantes alteraciones en el sistema nervioso central del adolescente, activando la respuesta innata inflamatoria, que puede causar muerte neuronal y alteraciones a nivel estructural y de la conducta. Esta respuesta se produce mediante la activación de los receptores de membrana Toll-like, y específicamente por los receptores TLR4, localizados en células gliales. Cuando dicho receptor se une a su ligando y dimeriza, desencadena una cascada de señalización que finaliza con la translocación al núcleo del factor de transcripción NF-κB, donde se promueve la síntesis y liberación de citoquinas y quimioquinas pro-inflamatorias al medio extracelular. Entre los mecanismos que podrían participar en la amplificación de la respuesta neuroinflamatoria se encontrarían un tipo de vesículas extracelulares (VEs), denominadas exosomas. Los exosomas son micropartículas de 30-150 nm de tamaño con un contenido de carácter bioactivo, formado por proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, y que cumplen un papel importante en la comunicación intercelular. Por tanto, la hipótesis que planteamos en esta tesis doctoral es que las VEs ejercen un papel en el mantenimiento y propagación de la neuroinflamación causada por el consumo de alcohol en forma de atracón. Utilizando VEs de cultivos primarios de astrocitos demostramos que el etanol induce una mayor secreción de VEs y altera los niveles de determinadas proteínas y microARNs (miARNs) asociados con la neuroinflamacion. Además, demostramos que cuando las neuronas corticales en cultivo se incuban con VEs procedentes de los astrocitos WT tratados con etanol, se inducen marcadores inflamatorios en las neuronas y presentan mayores niveles de apoptosis. Durante el proceso de biogénesis exosomal, se ha demostrado la participación de una familia de enzimas, llamadas esfingomielinasas, que estarían relacionadas con la biogénesis y secreción de las VEs. Estudios previos de este laboratorio han demostrado que el etanol es capaz de activar las esfingomielinasas, aunque el mecanismo por el cual esto ocurre se desconoce. En este proyecto de tesis proponemos a las membranas asociadas a mitocondrias (MAM) como mecanismo regulador de la secreción de VEs mediada por esfingomielinasas. Mediante el análisis de la actividad de transferencia de fosfolípidos, marcador de actividad de MAM, observamos que el etanol, tanto a nivel tisular como en cultivo, es capaz de activar MAM. Además, demostramos que, inhibiendo la actividad tanto de MAM como de las esfingomielinasas, se revierte el aumento en secreción de VEs causado por el tratamiento con etanol. Estos resultados sugieren que el etanol promueve una mayor liberación de VEs mediante la activación de las enzimas esfingomielinasas a través de MAM. Además, puesto que las VEs tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) y tener estabilidad en la circulación, se han considerado como posibles candidatos a biomarcadores de situaciones patológicas. Uno de los elementos presentes en las VEs, que se ha utilizado recientemente como biomarcador en diversos estudios, son los miARNs, moléculas de ARN no codificante de cadena corta implicados en la regulación génica. Se ha descrito que, en pacientes con enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson u otras, se detectan patrones de expresión diferencial de miARNs en las VEs circulantes, en comparación con pacientes control. En este estudio demostramos que el etanol es capaz de alterar los perfiles de miARNs relacionados con la inflamación presentes en VEs circulantes de jóvenes con intoxicación etílica aguda (IEA). Estos efectos presentan diferencias de género, siendo las mujeres/hembras más vulnerables a los efectos del alcohol, ya que la expresión de marcadores inflamatorios en cerebro y en VEs circulantes son más elevadas en mujeres/hembras que en hombres/machos. Estos resultados ponen de manifiesto que las VEs circulantes y sus perfiles de miARNs son posibles candidatos a biomarcadores de la neuroinflamación asociadas con el abuso de alcohol., [CA] El consum d'elevades quantitats d'alcohol durant un curt període de temps, conegut també com a consum en afartament, causa importants alteracions en el sistema nerviós central de l'adolescent, activant la resposta innata inflamatòria, que pot causar mort neuronal i alteracions a nivell estructural i de conducta. Aquesta resposta es produeix mitjançant l'activació dels receptors de membrana Toll-like, i específicament pels receptors TLR4, localitzats en cèl·lules glials. Quan aquest receptor s'uneix al seu lligant i dimeritza, desencadena una cascada de senyalització que finalitza amb la translocació al nucli del factor de transcripció NF-κB, on es promou la síntesi i alliberament de citoquines i quimioquines pro-inflamatòries al medi extracel·lular. Dins dels mecanismes que podrien participar en l'amplificació de la resposta neuroinflamatòria es trobarien un tipus de vesícules extracel·lulars (VEs), denominades exosomes. Els exosomes són micropartícules de 30-150 nm de grandària amb un contingut de caràcter bioactiu, format per proteïnes, lípids i àcids nucleics, i que compleixen un paper important en la comunicació intercel·lular. Per tant, la hipòtesi que plantegem en aquesta tesi doctoral és que les VEs exerceixen un paper en el manteniment i propagació de la neuroinflamació causada pel consum d'alcohol en forma d'afartament. Utilitzant VEs de cultius primaris d'astròcits demostràrem que l'etanol indueix una major secreció de VEs i una alteració dels nivells de determinades proteïnes i microARNs (miARNs) associats amb la neuroinflamació. A més a més, també observàrem que quan les neurones corticals en cultiu s'incubaben amb VEs procedents dels astròcits WT tractats amb etanol, s'induïen marcadors inflamatoris en les neurones i aquestes presentaven majors nivells d'apoptosi. Durant el procés de biogènesi exosomal, s'ha demostrat la participació d'una família d'enzims, anomenats esfingomielinases, que estarien relacionats amb la biogènesi i secreció de les VEs. Estudis previs d'aquest laboratori han demostrat que l'etanol és capaç d'activar les esfingomielinases, encara que el mecanisme pel qual això passa es desconeix. En aquest projecte de tesi proposem a les membranes associades a mitocòndries (MAM), juntament amb les esfingomielinases com el mecanisme regulador de la secreció de VEs induïda pel consum d'alcohol. Mitjançant l'anàlisi de l'activitat de transferència de fosfolípids, marcador d'activitat de MAM, observàrem que l'etanol, tant a nivell tissular com en cultiu, era capaç d'activar MAM. A més, demostràrem que inhibint l'activitat tant de MAM com de les esfingomielinases, revertiem l'augment en la secreció de VEs causat pel tractament amb etanol. Aquests resultats suggereixen, que l'etanol promou una major alliberament de VEs mitjançant l'activació dels enzims esfingomielinases a través de MAM. A més, ja que les VEs tenen la capacitat de creuar la barrera hematoencefàlica (BBB) i ser estables en circulació, s'han considerat bons candidats a biomarcadors de situacions patològiques. Un dels elements presents en les VEs que s'ha utilitzat recentment com a biomarcador en diversos estudis, són els miARNs, molècules d'ARN no codificant de cadena curta implicats en la regulació gènica. S'ha descrit que, en pacients amb malalties neurodegeneratives, com l'Alzheimer o Parkinson, es detecten patrons d'expressió diferencial de miARNs a les VEs circulants, en comparació amb pacients control. A aquest estudi demostrem que l'etanol és capaç d'alterar els perfils de miARNs relacionats amb la inflamació presents en VEs circulants de joves amb intoxicació etílica aguda (IEA). Aquests efectes presenten diferències de gènere, sent les dones / noies més vulnerables als efectes de l'alcohol, ja que l'expressió de marcadors inflamatoris en cervell i en VEs circulants són més elevades en noies que en nois., [EN] Heavy alcohol intake during a short period of time, also known as binge drinking, has been proved to produce negative effects on the individual's central nervous system by activating an inflammatory response that can lead to neuronal death and structural and behavioral alterations. This response is produced by glial cells, the main component of the neuroimmune system, through the activation of TLR4, a transmembrane receptor of the TLR family. When TLR4 binds to its ligand and dimerizes, it triggers a signaling cascade that ends up with the translocation of NF-κB to the nucleus, acting as a transcription factor, where it promotes the synthesis and release of pro-inflammatory cytokines and chemokines to the extracellular milieu. Among the mechanisms responsible for the transmission and amplification of this neuroinflammatory response, one candidate could be a kind of extracellular vesicles (VEs) called exosomes. Exosomes are microparticles of 30-150 nm in size, with a bioactive content, composed mostly by proteins, lipids and nucleic acids, which play an important role in intercellular communication. Therefore, the hypothesis of this thesis is that VEs play an important role in the transmission of the neuroinflammatory response caused by ethanol binge drinking. Using VEs from primary cultures of astrocytes, we show that ethanol is able to induce a higher secretion of VEs and alters their composition of inflammatory related protein and microRNAs (miARNs). Furthermore, incubation of these VEs in primary cultures of neurons lead to the development of inflammatory protein and gene markers, and higher apoptosis levels. Exosomal release has been shown to be partly regulated by a family of enzymes called sphingomyelinases, since inhibition of these enzymes resulted in a reduction of secreted VEs. Previous studies from this laboratory have shown that ethanol is able to activate sphingomyelinases, but the mechanism involved in the process is currently unknown. We propose membrane-associated mitochondria (MAM), along with sphingomyelinases, as the responsible for the increased VEs release after ethanol intake. We show that ethanol is capable of increasing phospholipid transfer activity, a marker of MAM activity. Moreover, MAM and sphingomyelinase inhibition resulted in depleted VEs secretion. These results suggest that ethanol promotes increased release of VEs by activating sphingomyelinase enzymes through MAM. VEs display certain biological characteristics, like the ability to cross the blood-brain barrier (BBB) or their high stability in serum, which make them good candidates for biomarkers of pathological situations. One of the elements present in VEs that has recently been used as a biomarker in various studies are miARNs, which are short-chain non-coding RNA molecules involved in gene regulation. It has been described that differential expression patterns of miARNs in circulating VEs can be detected in patients with neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's, Parkinson's or others, when compared to healthy patients. In this study we demonstrate that ethanol is able to alter the inflammatory-related miARNs expression patterns in circulating VEs of young people with acute alcohol intoxication (IEA). Notably, the alterations in miARNs are dependent on the patient's gender, being women/females more affected by alcohol than men/males, since women/females showed lower presence of anti-inflammatory miARNs and a higher expression of inflammatory markers in brain tissue than men/males.

During the last years, the prevalence of type 2 diabetes mellitus (T2DM) has steadily increased; it has been estimated that the current number of T2DM patients worldwide will double over the next two decades, and similar trends have been reported for obesity. In addition, T2DM frequently goes undiagnosed for many years because hyperglycemia develops gradually, and, in its earlier stages, is not severe enough for the patient to note any of the classic symptoms of diabetes. It is, therefore, critical that there be early identification of individuals at high risk for developing diabetes in order to devise prevention strategies aimed at controlling the factors related to the development of the disease. The traditional biomarkers used to identify patients at risk of developing the disease, including fasting glucose, glucose after 2 hours of OGTT, HbA1c, glucose-homeostasisrelated parameters, lipid types and scores such as the Finnish Diabetes Risk Score (FINDRISC), have limitations leading to low accuracy and efficiency. Therefore, it is necessary to research into new biomarkers to improve sensitivity and specificity and increase the predictive value. Insulin resistance (IR) and impaired beta-cell function are key determinants of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Previous studies have demonstrated the role of endotoxemia in the develop of IR. Intestinal absorption of bacterial components such us endotoxin lipopolysaccharides (LPS) activates the toll-like receptors inducing inflammation, and this in turn, leads to IR. However, this sequence of events is not well-established, and it is still unclear whether IR precedes the changes in the microbiota or vice-versa. Recently, an association between endotoxemia and the risk of developing diabetes was demonstrated; although, this study was subject to severe, uncontrolled confounding factors. In addition, microRNAs (miRNAs) are recognized as important regulators of gene expression and central players in the control of several biological and pathological processes, including insulin signaling and beta cell dysfunction. Previous studies suggest the use of miRNAs as biomarkers of T2DM, and they may be a more sensitive way to predict development of the disease than the tools currently used. However, longterm follow-up studies in larger populations with incident cases of T2DM are necessary to identify the role of miRNAs during the development of the disease and to use that information to help identify new T2DM predictive biomarkers. Hypothesis Our hypothesis is that plasma levels of different biological markers, such as miRNAs, LPS and metabolite profile, could become highly valuable and useful as predictive biomarkers to identify normoglycemic and prediabetic patients with a higher risk of developing T2DM., Objectives To identify new biomarkers with the potential to evaluate the probability and predict the develop of type 2 diabetes mellitus in high-risk patients with coronary heart disease. Subjects, design and methodology of the publications Paper 1: We included in the present work the 462 patients who had not been clinically diagnosed with T2DM at baseline in the CORonary Diet Intervention with Olive oil and cardiovascular PREVention study (CORDIOPREV)(NTC00924937). Of these, 107 patients developed T2DM according to the American Diabetes Association (ADA) diagnosis criteria after a median follow-up of 60 months (Incident-DIAB group), whereas 355 patients did not develop the disease during this period (Non-DIAB group). Two metabolic challenges, a fat overload and an oral glucose tolerance test, were performed on consecutive days at the beginning of the study and after 3 years of follow-up. Plasma levels of LPS were measured in the whole population and lipopolysaccharide binding protein (LBP), IL-6, MCP1 and TNF-a were determined in a subpopulation of 226 patients. Cox proportional hazards regression analyses were performed in order to determine the potential use of LPS postprandial levels as a predictor of T2DM development. Paper 2: The study was conducted in the 462 non-diabetic patients at baseline of the CORDIOPREV study. The plasma levels of 24 miRNAs were measured at baseline by qRT-PCR, and other strong biomarkers to predict diabetes were also measured. Orthogonal Partial Least Squares Discriminant (OPLS-DA), Receiver Operating Characteristic (ROC) and Cox regression analysis were used to evaluate the potential predictive value of the circulating miRNAs in the development of T2DM. Paper 3: This study included the 462 patients without disease at baseline from the CORDIOPREV study. After a median follow-up of 60 months, 107 of the subjects developed the disease, 30 developed prediabetes, 223 maintained prediabetes and 78 remained disease-free. The plasma levels of four miRNAs linked to insulin signaling and beta-cell function were measured by RT-PCR. We analyzed the relationship between the miRNAs levels and insulin signaling and release indexes at baseline and after the follow-up period. The risk of developing the disease was evaluated through a Cox analysis based on tertiles (T1-T2-T3) of baseline miRNAs levels. Other approach: A group of 52 patients from the CORDIOPREV study without T2DM at baseline was selected, 26 of whom developed the disease after 3 years of follow-up. We studied the differences in the metabolomic profile between groups in plasma samples in the fasting and postprandial states at baseline. Principal component analysis (PLS-DA and OPLS-DA) and ROC analysis were carried out with the plasma levels of the metabolites identified to evaluate the predictive value of T2DM development. Results Paper 1: We observed a postprandial increase in lipopolysaccharide (LPS) levels in the Incident-DIAB at baseline (P < 0.001), whereas LPS levels were not modified in the Non-DIAB. The COX regression analysis based on the LPS postprandial fold change improved the T2DM risk assessment as compared with the previously described FINDRISC score (hazard ratio of 2.076, 95% CI 1.149-3.750 vs. 1.384, 95% CI 0.740- 2.589). Moreover, a COX regression analysis merging the LPS postprandial fold change and FINDRISC score together showed a hazard ratio of 3.835 (95% CI 1.323-11.114), linked to high values of both parameters. Paper 2: The ROC analysis identified 9 miRNAs, which, added to HbA1c, have a greater predictive value in the early diagnosis of type 2 diabetes (AUC = 0.8342) tan HbA1c alone (AUC = 0.6950). The miRNA and HbA1c-based model did not improve when the FINDRISC was included (AUC = 0.8293). The COX regression analyses showed that patients with low miR-103, miR-28-3p, miR-29a, and miR-9 and high miR- 30a-5p and miR-150 circulating levels have a higher risk of disease (HR = 11.27; 95% CI = 2.61–48.65). Paper 3: We observed higher miR-150 and miR-30a-5p and lower miR-15a and miR-375 baseline levels in type 2 diabetes than disease-free subjects. Patients with high miR-150 and miR-30a-5p baseline levels had lower disposition index (p=0.047 and p= 0.007, respectively). A higher risk of disease was associated with high levels (T3) of miR-150 and miR-30a-5p (HRT3-T1 = 4.218 and HRT3-T1 = 2.527, respectively), and low levels (T1) of miR-15a and miR-375 (HRT1-T3 = 3.269 and HRT1-T3 = 1.604, respectively). Other approach: Our study suggests that in both the fasting and postprandial state, the metabolomic profile allows us to differentiate between subjects who develop (new- T2DM) or do not develop (non-T2DM) type 2 diabetes mellitus after 3 years of followup. In fact, the ROC analysis showed that the plasma levels of specific metabolites could potentially be used as biomarkers to predict the development of the disease. Our results show an AUC of 0.794 (sensibility = 0,808, specificity= 0.731 and accuracy= 72.8%) in a model designed with the metabolites identified in the fasting analysis and a VIP score>1.5, which belongs mostly to the glycerophosphocholines family. In addition, we obtained an AUC of 0.849 (sensibility = 0,814, specificity= 0.727 and accuracy= 74.1%) with the metabolites identified in the postprandial analysis, which belong mostly to the fatty acids family. Conclusion The plasma levels of certain miRNAs, LPS and metabolite profile could have a valuable potential as biomarkers to evaluate the probability and predict the develop of type 2 diabetes mellitus in high-risk patients with coronary heart disease. Introducción. En los últimos años, la prevalencia de diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) ha aumentado considerablemente. De hecho, se estima que el número actual de pacientes con DMT2 se duplicará en las próximas dos décadas con cifras similares para la obesidad. Por otra parte, la DMT2 puede permanecer sin diagnosticar durante muchos años porque la hiperglucemia se desarrolla de forma gradual, y, en etapas tempranas, no es lo suficientemente severa como ser detectada. Por tanto, es crucial la identificación temprana de aquellos pacientes con alto riesgo de desarrollar DMT2 para poder diseñar estrategias de prevención y controlar los factores de riesgo de la enfermedad. Los biomarcadores tradicionales usados para identificar pacientes en riesgo de desarrollo de la enfermedad, entre los que se encuentran la glucosa plasmática en ayunas, la glucosa tras 2 horas del OGTT, hemoglobina glicada (HbA1c), parámetros relacionados con la homeostasis de glucosa, especies lipídicas y test como el Finnish Diabetes Risk Score (FINDRISC), muestran ciertas limitaciones y no son lo suficientemente eficientes y precisos. Por ello, es necesaria la búsqueda de nuevos biomarcadores que mejoren la sensibilidad, la especificidad y aumenten el valor predictivo. La resistencia a la insulina (IR) y el deterioro de la función de las células beta son factores determinantes del desarrollo de DMT2. Estudios previos han demostrado el papel de la endotoxemia en el desarrollo de resistencia a la insulina. La absorción intestinal de componentes bacterianos, como el lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram negativas, activa los receptores tipo toll induciendo inflamación, y esto a su vez IR. Sin embargo, esta secuencia de eventos no está bien establecida, y aún no está claro si la IR precede a los cambios en la microbiota o viceversa. Recientemente, se ha sugerido la asociación entre la endotoxemia y el riesgo de desarrollar DMT2, no obstante, los resultados obtenidos se vieron afectados por diversos parámetros no controlados. Adicionalmente, los microARNs (miRNAs) son reconocidos como importantes reguladores de la expresión génica y actores centrales en el control de varios procesos biológicos y patológicos, entre los que se incluyen la señalización de la insulina y la funcionalidad de la célula beta. Estudios previos sugieren el uso de los miRNAs como biomarcadores de DMT2, los cuales podrían tener una mayor sensibilidad y eficiencia para predecir el desarrollo de la enfermedad que las herramientas utilizadas actualmente. Sin embargo, son necesarios estudios longitudinales en poblaciones grandes de casos incidentes de DMT2 para conocer el papel de los miRNAs durante el desarrollo de la enfermedad y utilizar esa información en la búsqueda de nuevos biomarcadores predictivos. Hipótesis Nuestra hipótesis es que los niveles plasmáticos de ciertos marcadores biológicos, tales como los miRNAs, LPS y perfil de metabolitos pueden ser altamente valiosos y útiles como biomarcadores predictivos para identificar a los sujetos normoglucémicos y prediabéticos con mayor riesgo de desarrollar DMT2. Objetivo general Identificar nuevos biomarcadores con potencial para evaluar la probabilidad y predecir el desarrollo DMT2 en pacientes con enfermedad coronaria de alto riesgo. Sujetos, diseño y metodología de las publicaciones Artículo 1: En este trabajo se incluyeron todos los pacientes no diagnosticados con diabetes al inicio del estudio CORDIOPREV (NTC00924937). De ellos, 107 pacientes desarrollaron DMT2 de acuerdo con los criterios de diagnóstico de la Sociedad Americada de Diabetes (ADA) tras una mediana de seguimiento de 60 meses (grupo Incident-DIAB). Se llevó a cabo una sobrecarga grasa y una sobrecarga oral de glucosa (OGTT) en días consecutivos al inicio del estudio y tras 3 años de seguimiento. Seguidamente, se determinaron los niveles plasmáticos de LPS, LBP (proteína de unión a lipopolisacárido), IL-6, MCP1 y TNF-alpha. Por último, se realizaron análisis de regresión de COX para evaluar el potencial de los niveles postprandiales de LPS como predictor del desarrollo de DMT2. Artículo 2: Este trabajo se llevó a cabo en la misma población no diabética al inicio del estudio CORDIOPREV. Los niveles plasmáticos de 24 miRNAs se determinaron en la situación basal mediante qRT-PCR. Además se realizaron análisis de componentes principales (OPLS-DA), curvas ROC y de regresión de COX para evaluar el poder predictivo de los miRNAs circulantes en el desarrollo de DMT2. Artículo 3: Se incluyeron los 462 pacientes sin diabetes al inicio del estudio CORDIOPREV. Tras una mediana de seguimiento de 60 meses, 107 de ellos desarrollaron DMT2, 30 desarrollaron prediabetes, 223 mantuvieron la prediabetes y 78 estaban libres de enfermedad. Los niveles plasmáticos de cuatro miRNAs relacionados con la señalización de la insulina y la funcionalidad de la célula beta se determinaron mediante qRT-PCR. Adicionalmente, analizamos la relación entre los niveles de miRNAs y los índices relacionados con la señalización de la insulina en la situación basal y después del periodo de seguimiento. El riesgo de desarrollar la enfermedad fue evaluado mediante análisis de regresión de COX en función de los niveles de miRNAs en la situación basal categorizados por tertiles. Otra aproximación: Seleccionamos un grupo de 52 pacientes sin diabetes al inicio del estudio CORDIOPREV, 26 de los cuales desarrollaron la enfermedad tras 3 años de seguimiento y otros 26 que no la desarrollaron. Estudiamos las diferencias en el perfil metabolómico entre ambos grupos en muestras de plasma tomadas en la situación basal, tanto en el estado de ayuno como en el postprandial. Se llevaron a cabo análisis de componentes principales (PLS-DA y OPLS-DA) y de curvas ROC con los niveles plasmáticos de los metabolites identificados para evaluar el poder predictivo del desarrollo de DMT2. Resultados Artículo 1: Observamos un aumento en los niveles de LPS postprandiales en la situación basal en los pacientes que desarrollan diabetes (P < 0.001), mientras que no se encontraron cambios en el grupo de no-diabéticos. El análisis de regresión de COX, basado en los cambios postprandiales de LPS, mejoró el poder predictivo del desarrollo de DMT2 en comparación con el FINDRISC (hazard ratio de 2.076, 95% CI 1.149- 3.750 vs. 1.384, 95% CI 0.740-2.589). Además, el análisis de regresión de COX combinando ambos parámetros mostró que los pacientes con niveles postprandiales elevados de LPS y alto FINDRISC tienen un mayor riesgo de desarrollo de diabetes (hazard ratio de 3.835 (95% CI 1.323-11.114)). Artículo 2: El análisis de ROC identificó 9 miRNAs, los cuales, añadidos a la HbA1c, tienen un mayor valor predictico en el diagnóstico temprano de la DMT2 (AUC = 0.8342), en comparación con la HbA1c (AUC = 0.6950). Este modelo de miRNAs y HbA1c no mejoró cuando se incluyó el FINDRISC (AUC = 0.8293). El análisis de regresión de COX mostró que los pacientes con bajos niveles circulantes de miR-103, miR-28-3p, miR-29a, y miR-9, y, altos de miR-30a-5p y miR-150 en la situación basal tienen mayor riesgo de desarrollar la enfermedad (HR = 11.27; 95% CI = 2.61–48.65). Artículo 3: Observamos mayores niveles de miR-150 y miR-30a-5p y menores niveles de miR-15a y miR-375 en la situacion basal en los pacientes que desarrollan DMT2 que en los que no la desarrollan. Además, los pacientes con niveles altos de miR- 150 y miR-30a-5p mostraron una peor funcionalidad de la célula beta (menor disposition index) (p=0.047 y p= 0.007, respectivamente). Por último, un mayor riesgo de desarrollar DMT2 también se asoció con altos niveles (T3) de miR-150 y miR-30a-5p (HRT3-T1 = 4.218 y HRT3-T1 = 2.527, respectivamente), y bajos niveles (T1) de miR-15a y miR-375 (HRT1-T3 = 3.269 and HRT1-T3 = 1.604, respectivamente) en la situación basal. Otra aproximación: Nuestro estudio sugiere que el perfil de metabolitos en la situación basal, tanto en el estado de ayunas como en el postprandio, permite diferenciar entre sujetos que desarrollan DMT2 y aquellos que no la desarrollan tras tres años de seguimiento. De hecho, el análisis de curvas ROC mostró que los niveles plasmáticos de metabolitos específicos podrían tener potencial como biomarcadores predictivos del desarrollo de la enfermedad. Nuestros resultados mostraron un AUC de 0.794 (sensibilidad = 0,808, especificidad= 0.731 y precisión= 72.8%) en un modelo construido con los metabolitos identificados en el estado de ayunas y con VIP>1.5, lo cuales pertenecen principalmente a la famila de las glicerofosfocholinas. Además, obtuvimos un AUC de 0.849 (sensibilidad = 0,814, especificidad= 0.727 y precisión= 74.1%) con los metabolitos identificados en el análisis postprandial, los cuales pertenecen en su mayoría a la familia de ácidos grasos. Conclusión Los niveles plasmáticos de ciertos miRNAs, LPS y perfil de metabolitos podrían tener potencial como biomarcadores para evaluar la probabilidad y predecir el desarrollo DMT2 en pacientes de alto riesgo con enfermedad coronaria.

L’ictus isquèmic és una de les principals causes de mort i discapacitat arreu. Actualment, l’únic tractament efectiu és la teràpia de reperfusió, ja sigui a través del tractament intravenós amb l’activador tissular del plasminogen (rt-PA) o la retirada del clot mitjançant trombectomia mecànica intra-arterial. No obstant, només un percentatge reduït dels pacients poden beneficiar-se d’aquestes teràpies, doncs presenten una finestra terapèutica molt estreta, així com nombroses contraindicacions mèdiques i efectes secundaris adversos. És per això que hi ha una necessitat urgent de trobar noves estratègies terapèutiques complementàries capaces de bloquejar la progressió de la lesió i neuroprotegir el cervell isquèmic en els estadis inicials de la malaltia. L’ús de biomarcadors sanguinis per al diagnòstic i el pronòstic de l’ictus isquèmic acceleraria la presa de decisions mèdiques i l’administració de tractaments als pacients afectats. Malgrat nombroses biomolècules hagin estat proposades per a tals finalitats, actualment cap d’elles ha aconseguit mostrar una millora significativa respecte les proves de neuroimatge i els paràmetres clínics que s’utilitzen avui en dia, de manera que descobrir nous biomarcadors sanguinis d’ictus també és una necessitat vigent. En aquesta Tesi Doctoral s’explora el paper de nous biomarcadors d’ictus en els estadis inicials de la malaltia, de manera que a banda de bons indicadors, pensem que la seva modulació terapèutica pot esdevenir també interessant com a possible tractament neuroprotector. Així, els treballs que la integren pretenen contribuir a la identificació de noves biomolècules que puguin servir com a biomarcadors, dianes terapèutiques o ambdues aplicacions que avui en dia encara manquen de resolució. D’una banda, hem aprofundit en l’estudi del paper dual de certs mediadors inflamatoris com a biomarcadors i dianes terapèutiques alhora. Amb aquest propòsit, hem demostrat que la inhibició d’un biomarcador de transformacions hemorràgiques, la VAP-1/SSAO, és una estratègia prometedora per tal d’evitar l’aparició d’aquestes complicacions associades a l’administració de l’rt-PA. També hem identificat per primer cop la quimiocina CCL23 com un bon biomarcador de pronòstic de l’ictus isquèmic, l’administració exògena de la qual ha mostrat indicis de millorar l’estat neurològic dels animals afectats per la isquèmia. Amb l’objectiu de descobrir nous candidats, s’han dut a terme dos estudis emprant diferents tècniques –òmiques en models experimentals d’isquèmia cerebral. S’han estudiat els canvis al proteoma del líquid cefaloraquidi de rata, així com les alteracions a nivell del transcriptoma i del proteoma del cervell isquèmic de ratolí, ambdós durant la fase aguda de la malaltia. Ambdós estudis han permès identificar i explorar en detall una sèrie de gens i proteïnes rellevants en la fisiopatologia de la isquèmia cerebral, alguns dels quals han estat avaluats pel seu possible ús com a biomarcadors de diagnòstic i pronòstic de l’ictus isquèmic. Els resultats obtinguts en ambdós estudis fan atractiva una futura exploració de les molècules destacades com a nous biomarcadors o dianes terapèutiques per l’ictus. Finalment, donada la manca d’èxit dels agents neuroprotectors proposats fins al moment, en aquesta Tesi hem optat per una aproximació innovadora basada en el reposicionament de fàrmacs per identificar, a través d’una simulació matemàtica de l’ictus isquèmic, combinacions de fàrmacs amb efecte terapèutic sinèrgic. Dues de les combinacions de fàrmacs testades in vivo han demostrat una capacitat significativa per reduir l’extensió de la lesió cerebral d’animals isquèmics, obrint la porta a nous tractaments neuroprotectors per l’ictus. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi doctoral contribueixen a millorar el coneixement de la fisiopatologia de la isquèmia cerebral, així com al descobriment de futurs biomarcadors i dianes terapèutiques de l’ictus, sent ambdues necessitats urgents per reduir l’impacte devastador d’aquesta malaltia arreu del món. Ischemic stroke is one of the leading causes of death and disability worldwide. Currently, the only effective treatments are reperfusion therapies, via the intravenous administration of recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) or the mechanical removal of the thrombus with stent-retriever or aspiration devices. However, only a small percentage of patients can benefit from these therapies due to their short therapeutic window and their severe side effects. Thus, there is an urgent need to find complementary therapeutic strategies to mitigate the stroke progression and rescue the brain tissue from ischemic injury. The use of blood biomarkers for the diagnosis and prognosis of ischemic stroke would accelerate decision-making processes and treatments of the affected patients. Although numerous molecules have been proposed for these purposes, none of them have shown a significant improvement over the neuroimaging and clinical parameters that are currently used, so new blood biomarkers for stroke are also sought. This Doctoral Thesis explores the role of new stroke biomarkers in the initial stages of the disease, since it is hypothesized that beyond its role as indicators of stroke, their therapeutic modulation can also be interesting as a neuroprotective strategy to treat ischemic stroke. Thus, the studies comprised in this Thesis aim to contribute to the identification of new molecules that can serve as blood biomarkers, therapeutic targets or both applications at once. On the one hand, we studied the dual role of certain inflammatory mediators as blood biomarkers and therapeutic targets. We have shown that the inhibition of VAP-1/SSAO, a biomarker of rt-PA-associated hemorrhagic transformation, is a promising strategy to avoid the appearance of these complications. Moreover, we have also identified for the first time the CCL23 chemokine as an interesting biomarker of ischemic stroke prognosis, whose exogenous administration has also shown potential to improve the neurological status of animals after cerebral ischemia. Furthermore, two –omics studies have been conducted to discover new candidates in experimental models of stroke. Specifically, the proteome changes in the rat cerebrospinal fluid and the transcriptome and proteome alterations in the mouse brain have been deeply evaluated during the acute phase of cerebral ischemia. Both studies highlighted key molecular factors in the stroke pathophysiology, some of which have been tested for their role as biomarkers for stroke diagnosis and prognosis. Moreover, the results from both studies envision a future exploration of these outstanding molecules as new biomarkers or therapeutic targets for ischemic stroke. Finally, since all neuroprotective agents proposed so far have systematically failed to succeed, in this Thesis we aimed for an innovative drug repositioning approach based on a mathematical simulation of ischemic stroke disease. This in silico model has been used to identify combinations of drugs with a synergistic therapeutic effect on neuroprotection. Two of the resulting drug combinations have demonstrated in vivo promising neuroprotective actions by reducing the extension of the brain lesion, which suggests their efficacy as new treatments for ischemic stroke. Overall, the results of this Doctoral Thesis contribute to our understanding of the stroke pathophysiology, as well as to the discovery of future blood biomarkers and therapeutic targets for stroke, being two urgent clinical needs to reduce the devastating impact of this disease worldwide.

Introduction: The changes in brain structure caused by a sports-related concussion may initially be indistinguishable, however, the irreversible deleterious effects are noted in the long term. An early diagnosis may provide the patient with a better recovery chance and increased survival. For this purpose, this paper studies the feasibility of a diagnosis for concussion by microRNA (mi-RNA) biomarkers contained in the saliva of athletes. Objective: Verify whether salivary miRNAs could be considered good biomarkers for sports concussion. Methodology: Salivary mi-RNA levels were determined from 120 saliva samples of 120 players. There were 43 with a diagnosis of concussion and 77 without a diagnosis of concussion. Samples from players with a concussion were collected 30 minutes prior to activity, samples from individuals who did not engage in physical activity were also compared. Results: On the evaluation of 30 miRNA from individuals with a concussion between contact and non-contact sports there was high detection reliability(P

In this paper we report on a modular design that allows one to fabricate electrochemical sensors upon combining 3D printing and screen printing. The usefulness of the design is showcased with graphene paste electrodes (GPE) coated with magnetic microspheres used to detect the drug nimesulide (NIM), biomarkers dopamine (DOP) and uric acid (UA). Under optimized conditions, the limit of detection was 0.0023 μmol L−1 in the range from 0.5 to 9 μmol L−1, 0.01 μmol L−1 within the range from 0.8 to 6 μmol L−1, and 0.0034 μmol L−1 from 0.7 to 10 μmol L−1 for dopamine, nimesulide, and uric acid, respectively. The three analytes could also be detected in blood serum and artificial urine samples within approximately 20 s, which is promising for clinical applications. With the modular design, the paste can be prepared with a variety of nanomaterials, functionalized with biomolecules and magnetic particles, and then stored for later use. The working electrode may also be polished to allow for reuse. Furthermore, in contrast to standard sensors made with carbon pastes, the electrochemical sensor proposed here requires small volumes (20–200 μL), which is crucial for drug monitoring and other biomedical applications.

L’ictus isquèmic és una causa de mort i discapacitat majoritària al món. Una millor comprensió de la seva fisiopatologia és fonamental per millorar aquestes dades devastadores. Més enllà de les teràpies trombolítiques aprovades no hi ha cap tractament efectiu per mitigar-ne la progressió. A més, aquestes teràpies tenen una finestra terapèutica curta i efectes secundaris greus, reduint el nombre de pacients que se’n poden beneficiar. Per tant, hi ha una necessitat de trobar noves estratègies terapèutiques complementàries per atenuar la progressió de l’ictus. A més, identificar els pacients amb més risc de presentar mal pronòstic (discapacitat o mort) després d’un ictus és essencial per facilitar els processos de presa de decisions i optimitzar la gestió dels pacients. En aquest sentit, és necessària la identificació de biomarcadors sanguinis que ajudin a predir el pronòstic de l’ictus. Aquesta Tesi Doctoral pretén contribuir a una millor comprensió de la fisiopatologia de l’ictus identificant noves molècules clau que poden servir com a dianes terapèutiques i/o com a biomarcadors pronòstic de l’ictus. En primer lloc, hem descrit els canvis del proteoma i transcriptoma que es produeixen en el cervell humà després de la isquèmia cerebral mitjançant tècniques –òmiques. A més, hem integrat aquesta informació mitjançant eines bioestadístiques per destacar molècules clau en la fisiopatologia de l’ictus. Alguns dels candidats proposats mostren potencial com a biomarcadors i/o dianes terapèutiques per l’ictus isquèmic. A més, s’ha explorat la influència del sexe, l’edat i les comorbiditats en la fisiopatologia de l’ictus mitjançant eines bioestadístiques d’integració explorant similituds i diferències en el proteoma i el transcriptoma cerebral en un model d’isquèmia cerebral en ratolins (a) mascles joves, (b) femelles joves, (c) mascles joves diabètics i (d) mascles vells. Curiosament, hem trobat que la resposta a la isquèmia cerebral és diferent entre els grups estudiats, posant de manifest la importància d’incorporar animals amb fenotips diferents en futurs estudis pre-clínics. A més, s’han realitzat tres estudis per explorar el paper de candidats seleccionats com a biomarcadors pronòstics de l’ictus. Curiosament, hem trobat que el nivell circulant d’Aquaporin-4 mesurat de manera aguda després d’un ictus isquèmic prediu la millora neurològica a les 48 hores i a l’alta hospitalària. En la mateixa línia, el nivell circulant d’alfa-1 antitripsina (A1AT) mesurat en la fase hiperaguda de l’ictus prediu un mal pronòstic funcional a l’hospital i a mig termini. Cal destacar que l’A1AT es va trobar sobre-expressada al cervell després de la isquèmia cerebral en el primer estudi d’aquesta Tesi. A més, hem identificat que l’endostatina, el receptor del factor de necrosi tumoral-1 i la interleucina-6 són predictors independents de la mortalitat a llarg termini després d’un ictus en una cohort de gairebé 1000 pacients. En tots els casos, els biomarcadors afegien valor predictiu a les variables clíniques. Finalment, com que tots els agents neuroprotectors proposats fins ara han fracassat a les clínica, en aquesta Tesi hem identificat diverses combinacions de dos fàrmacs amb efectes neuroprotectors sinèrgics. Per fer-ho, hem utilitzat un enfocament basat en la biologia de sistemes per desenvolupar un model matemàtic que simula la patologia de l’ictus isquèmic in silico. Notablement, l’eficàcia de la combinació de fàrmacs formada per Ceruletide+A1AT s’ha demostrat en un model d’isquèmia cerebral en ratolí i s’han descartat les possibles interaccions amb l’activador tissular del plasminogen recombinant (rt-PA). En conjunt, els resultats d’aquesta Tesi Doctoral contribueixen a aprofundir en el coneixement de la fisiopatologia de l’ictus, revelant molècules clau amb possibles funcions com a dianes terapèutiques, biomarcadors pronòstics o ambdues. De fet, hem descrit com l’A1AT es podria utilitzar tant com a biomarcador de mal pronòstic com a diana terapèutica quan es combina amb Ceruletide. El ictus isquémico es una causa de muerte y discapacidad mayoritaria en el mundo. Una mejor comprensión de su fisiopatología es fundamental para mejorar estos datos devastadores. Más allá de las terapias trombolíticas aprobadas no existe ningún tratamiento efectivo para mitigar su progresión. Además, estas terapias tienen una ventana terapéutica corta y efectos secundarios graves, reduciendo el número de pacientes que pueden beneficiarse. Por tanto, hay una necesidad de encontrar nuevas estrategias terapéuticas complementarias para atenuar la progresión del ictus. Además, identificar a los pacientes con mayor riesgo de presentar mal pronóstico (discapacidad o muerte) después de un ictus es esencial para facilitar los procesos de toma de decisiones y optimizar la gestión de los pacientes. En este sentido, es necesaria la identificación de biomarcadores sanguíneos que ayuden a predecir el pronóstico del ictus. Esta Tesis Doctoral pretende contribuir a una mejor comprensión de la fisiopatología del ictus identificando nuevas moléculas clave que pueden servir como dianas terapéuticas y/o biomarcadores pronóstico del ictus. En primer lugar, hemos descrito los cambios del proteoma y transcriptoma que se producen en el cerebro humano después de la isquemia cerebral mediante técnicas –ómicas. Además, hemos integrado esta información mediante herramientas bioestadísticas para destacar moléculas clave en la fisiopatología del ictus. Algunos de los candidatos propuestos muestran potencial como biomarcadores y/o dianas terapéuticas para el ictus. Además, se ha explorado la influencia del sexo, la edad y las comorbilidades en la fisiopatología del ictus mediante herramientas bioestadísticas de integración explorando similitudes y diferencias en el proteoma y el transcriptoma cerebral en un modelo de isquemia cerebral en ratones (a) machos jóvenes, (b) hembras jóvenes, (c) machos jóvenes diabéticos y (d) machos viejos. Hemos encontrado que la respuesta a la isquemia cerebral es diferente entre los grupos estudiados, poniendo de manifiesto la importancia de incorporar animales con distintos fenotipos en futuros estudios pre-clínicos. Además, se han realizado tres estudios para explorar el papel como biomarcadores pronósticos del ictus de candidatos seleccionados. Hemos encontrado que el nivel circulante de Aquaporin-4 medido de forma aguda después de un ictus isquémico predice la mejora neurológica a las 48 horas y al alta hospitalaria. También, el nivel circulante de alfa-1 antitripsina (A1AT) medido en la fase hiperaguda del ictus predice un mal pronóstico funcional en el hospital y a medio plazo. Cabe destacar que A1AT se encontró sobre-expresada en el cerebro después de la isquemia cerebral en el primer estudio de esta Tesis. Además, hemos identificado que la endostatina, el receptor del factor de necrosis tumoral-1 y la interleucina-6 son predictores independientes de la mortalidad a largo plazo después de un ictus en una cohorte de casi 1000 pacientes. En todos los casos, los biomarcadores añadían valor predictivo a las variables clínicas. Por último, dado que todos los agentes neuroprotectores propuestos hasta ahora han fracasado en la clínica, en esta Tesis hemos identificado diversas combinaciones de dos fármacos con efectos neuroprotectores sinérgicos. Para ello, hemos utilizado un enfoque basado en la biología de sistemas para desarrollar un modelo matemático que simula la patología del ictus isquémico in silico. La eficacia de la combinación de fármacos formada por Ceruletide+A1AT se ha validado en un modelo de isquemia cerebral en ratón y se han descartado las posibles interacciones con el activador tisular del plasminógeno recombinante (rt-PA). En conjunto, los resultados de esta Tesis Doctoral contribuyen a profundizar en el conocimiento de la fisiopatología del ictus, revelando moléculas clave con posibles funciones como dianas terapéuticas, biomarcadores pronósticos o ambas. De hecho, hemos descrito cómo el A1AT se podría utilizar tanto como biomarcador de mal pronóstico como diana terapéutica cuando se combina con Ceruletide. Ischemic stroke is a leading cause of death and disability worldwide. A better comprehension of stroke pathophysiology is fundamental to improve its dramatic outcome. Beyond the approved thrombolytic therapies, there is no effective treatment to mitigate its progression. Besides, these reperfusion therapies have a short therapeutic window and severe side effects, reducing the number of patients that can benefit from them. Thus, there is an urgent need to find new complementary therapeutic strategies to attenuate or even reverse stroke progression. Moreover, identifying the patients at higher risk of presenting poor outcome (disability or death) after stroke is essential to facilitate decision-making processes, ultimately optimizing patients’ management. In this regard, the identification of blood biomarkers that aid in the prediction of stroke prognosis is highly needed. This Doctoral Thesis aims to contribute to the better understanding of stroke pathophysiology identifying new key molecules that can serve as therapeutic targets and/or as biomarkers of stroke prognosis. First, we have described proteomic and transcriptomic changes in the human brain triggered after cerebral ischemia using –omic techniques and integrating this information through biostatistical tools to highlight key molecular factors in the stroke pathophysiology. In this regard, some of the proposed candidates show potential as stroke biomarkers and/or therapeutic targets. Moreover, the influence of sex, age and comorbidities in stroke pathophysiology has been explored through integrative biostatistical tools by exploring similarities and differences in the brain proteome and transcriptome in a mice model of cerebral ischemia in (a) young males, (b) young females, (c) diabetic young males and (d) aged males. Interestingly, we found that the response to cerebral ischemia differed among the studied groups, highlighting the importance of incorporating animals with different phenotypes in future stroke research pre-clinical studies. Furthermore, three studies have been conducted to explore the role of selected candidates as blood biomarkers to predict stroke outcome. Interestingly, we found that Aquaporin-4 circulating level measured acutely after ischemic stroke predicts neurological improvement at 48 hours and at hospital discharge. In the same line, Alpha-1 antitrypsin (A1AT) circulating level measured in the hyperacute phase after stroke predicts poor functional outcome in-hospital and at mid-term. Of note, A1AT was a molecule found to be dysregulated in the brain after cerebral ischemia in the first study of this Doctoral Thesis. Moreover, we have identified that Endostatin, tumor necrosis factor receptor-1 and interleukin-6 are independent predictors of long-term mortality after stroke in a cohort of nearly 1000 patients. In all cases, the studied biomarkers added predictive value on top of clinical variables. Finally, since all neuroprotective agents proposed to date have systematically failed to succeed in clinics, in this Thesis we have identified various two-by-two combinations of drugs with theoretical synergistic neuroprotective effects. To do so, we have used a systems biology-based approach to develop a mathematical model that simulates in silico ischemic stroke pathology. Remarkably, the efficacy of the drug combination formed by Ceruletide + A1AT has been demonstrated in a mouse model of transient cerebral ischemia and its potential interactions with recombinant tissue-plasminogen activator (rt-PA) have been discarded. Overall, the results of this Doctoral Thesis contribute to advancing our knowledge of stroke pathophysiology, disclosing key molecules with plausible roles as therapeutic targets, prognostic biomarkers or both. In fact, we have described how A1AT, a serine proteinase inhibitor found to be upregulated in ischemic stroke, could be used both as a biomarker of in-hospital and mid-term poor functional outcome and as a therapeutic target when combined with Ceruletide. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurociències

Point-of-Care (POC) testing for biomarker detection demands techniques that are easy to use, readily available, low-cost, and with rapid response times. This paper describes the development of a fully open-source, modular, wireless, battery-powered, smartphone-controlled, low-cost potentiostat capable of conducting electrochemical impedance spectroscopy for the electrochemical detection of the S100B protein captured in an ANTI-S100B functionalized thin-film gold interdigitated electrode platform to support traumatic brain injury diagnosis and treatment. EIS results from the developed potentiostat were validated with a commercial benchtop potentiostat by comparing impedance magnitude and phase values along the EIS frequency range. In addition, an experimental design was performed for detecting S100B in spiked human plasma samples with S100B concentrations of clinical utility, and a calibration curve was found for quantifying S100B detection. No statistically significant differences were found between EIS results from the developed potentiostat and the commercial potentiostat. Statistically significant differences in the changes in charge transfer resistance signal between each tested S100B concentration (p < 0.05) were found, with a limit of detection of 35.73 pg/mL. The modularity of the proposed potentiostat allows easier component changes according to the application demands in power, frequency excitation ranges, wireless communication protocol, signal amplification and transduction, precision, and sampling frequency of ADC, among others, when compared to state-of-the-art open-source EIS potentiostats. In addition, the use of minimal, easy acquirable open-source hardware and software, high-level filtering, accurate ADC, Fast Fourier Transform with low spectral leakage, wireless communication, and the simple user interface provides a framework for facilitating EIS analysis and developing new affordable instrumentation for POC biosensors integrated systems.

Al desembre del 2019 van aparèixer a China els primers pacients infectats per un nou coronavirus anomenat SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2), per la seva similitud amb el SARS-CoV previ. Aquesta malaltia s’anomenà COVID-19, constituint la primera pandèmia del segle XXI amb més de 6 milions de morts. La COVID-19 pot cursar amb símptomes lleus/asimptomàtica, fins a causar pneumònia i distrés respiratori agut que requereixi l’ingrés del pacient en una Unitat de Cures Intensives (UCI). Els primers estudis reportaven una afectació multisistèmica similar a la dels altres coronavirus, implicant el sistema respiratori, el ronyó, el fetge i el sistema cardiovascular. A l’inici del nostre primer treball, les dades sobre la prevalença de l’afectació cardíaca i la seva implicació pronòstica en la COVID-19 eren escasses i es basaven en estudis xinesos de petit tamany mostral. Shi et al. i Huang et al. van observar una prevalença de dany cardíac, entès com elevació en sang de troponines ultrasensibles (Tn-us) per sobre del percentil 99, del 20% i 12% respectivament. També suggerien una associació del dany miocàrdic amb major gravetat de la malaltia. Per analitzar el paper del dany miocàrdic en la fase aguda de la COVID-19, vam dissenyar un estudi observacional, prospectiu i unicèntric incloent consecutivament als pacients que ingressaven amb COVID-19 a l’Hospital del Mar i en els que es va determinar durant les primeres 48h, les TnT-us i la fracció aminoterminal del propèptid natriurètic cerebral tipus B (NT-proBNP). El nostre treball era una de les majors cohorts que analitzava la prevalença de dany miocàrdic i vam observar una prevalença del 35%, major que la de Shi et al. (20%). Estudis posteriors han confirmat prevalences similars a les nostres i actualment, s’assumeix que un 20-30% dels pacients hospitalitzats per COVID-19 presenten dany cardíac associat. A 30 dies de seguiment, els pacients amb dany miocàrdic van presentar major mortalitat intrahospitalària (29,3% vs 3,29%, p

Al desembre del 2019 van aparèixer a China els primers pacients infectats per un nou coronavirus anomenat SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2), per la seva similitud amb el SARS-CoV previ. Aquesta malaltia s'anomenà COVID-19, constituint la primera pandèmia del segle XXI amb més de 6 milions de morts. La COVID-19 pot cursar amb símptomes lleus/asimptomàtica, fins a causar pneumònia i distrés respiratori agut que requereixi l'ingrés del pacient en una Unitat de Cures Intensives (UCI). Els primers estudis reportaven una afectació multisistèmica similar a la dels altres coronavirus, implicant el sistema respiratori, el ronyó, el fetge i el sistema cardiovascular. A l'inici del nostre primer treball, les dades sobre la prevalença de l'afectació cardíaca i la seva implicació pronòstica en la COVID-19 eren escasses i es basaven en estudis xinesos de petit tamany mostral. Shi et al. i Huang et al. van observar una prevalença de dany cardíac, entès com elevació en sang de troponines ultrasensibles (Tn-us) per sobre del percentil 99, del 20% i 12% respectivament. També suggerien una associació del dany miocàrdic amb major gravetat de la malaltia. Per analitzar el paper del dany miocàrdic en la fase aguda de la COVID-19, vam dissenyar un estudi observacional, prospectiu i unicèntric incloent consecutivament als pacients que ingressaven amb COVID-19 a l'Hospital del Mar i en els que es va determinar durant les primeres 48h, les TnT-us i la fracció aminoterminal del propèptid natriurètic cerebral tipus B (NT-proBNP). El nostre treball era una de les majors cohorts que analitzava la prevalença de dany miocàrdic i vam observar una prevalença del 35%, major que la de Shi et al. (20%). Estudis posteriors han confirmat prevalences similars a les nostres i actualment, s'assumeix que un 20-30% dels pacients hospitalitzats per COVID-19 presenten dany cardíac associat. A 30 dies de seguiment, els pacients amb dany miocàrdic van presentar major mortalitat intrahospitalària (29,3% vs 3,29%, p

The Adverse Outcome Pathway (AOP) framework has been considered the most innovative tool to collect, organize, and evaluate relevant information on the toxicological effects of chemicals, facilitating the establishment of links between molecular events and adverse outcomes at the critical level of biological organization. Considering the combination of the high volume of toxicological and ecotoxicological data produced and the application of artificial intelligence algorithms from the last few years, not only can higher mechanistic interpretability be reached with new in silico models, but also a potential increase in predictivity in hazard assessments and the identification of new potential biomarkers can be achieved. The current paper aims to discuss some potential challenges and ways of integrating in silico models and AOPs to predict toxicological effects and to set and relate new biomarkers for defined purposes. With the use of the AOP framework to organize the ecotoxicological, toxicological, and structural data generated from in chemico, in vitro, ex vivo, in vivo, and population studies, it is expected that the generated biological and chemical construct will improve its application, establishing a knowledge platform to set and relate new biomarkers by key event relationships (KERs).

SUMMARY OBJECTIVE A previous study has reported that miR-1204 exerted oncogenic effects in breast cancer (BC). The purpose of our paper was to evaluate the expressions of tissue and serum miR-1204 in patients with BC and further investigate its biomarker potential. METHODS The expressions of tissue and serum miR-1204 were investigated by qRT-PCR in 144 BC patients and 38 healthy controls. Chi-square tests were conducted to examine the associations between miR-1204 expressions and clinicopathological factors. Then, the associations of miR-1204s level with the survival of BC patients were determined by performing the Kaplan-Meier and multivariate analysis. The receiver operating characteristics (ROC) and area under the OC curve (AUC) were obtained to validate the diagnostic values of miR-1204. RESULTS We found that the expressions of miR-1204 were increased in both tissue and serum samples from BC patients. Multivariate assays identified tissue and serum miR-1204 overexpression as an independent poor prognostic factor. In addition, ROC curve assays indicated that tissue and serum miR-1204 are potential diagnostic markers of BC. CONCLUSIONS Detection of tissue and serum miR-1204 levels could have clinical potential as a novel prognostic/diagnostic biomarker for BC patients. RESUMO OBJETIVO Um estudo anterior indicou que o miR-1204 exerce efeitos oncogênicos no Câncer de Mama (CM). O objetivo deste trabalho foi avaliar as expressões de miR-1204 sérico e em tecidos em pacientes com CM e investigar o seu potencial biomarcador. METODOLOGIA As expressões de miR-1204 sérico e em tecidos foram investigadas por qRT-PCR em 144 pacientes com CM e 38 controles saudáveis. Testes qui-quadrados foram realizados para examinar as associações entre as expressões de miR-1204 e os fatores clinicopatológicos. Em seguida, as associações entre nível de miR-1204s e sobrevida de pacientes de CM foram determinadas através de análises de Kaplan-Meier e multivariadas. A Curva Característica de Operação do Receptor (ROC) e área sob a curva (AUC) foram obtidas para validar o valor diagnóstico do MIR-1204. RESULTADOS Descobrimos que as expressões do MIR-1204 estavam aumentadas em amostras de tecido e séricas de pacientes com CM. Análises multivariadas identificaram a superexpressão de miR-1204 sérico e em tecidos como um fator independente de prognóstico ruim. Além disso, as curvas ROC indicaram que o miR-1204 sérico e em tecidos é um possível marcador de diagnóstico de CM. CONCLUSÃO A detecção dos níveis MIR-1204 em tecidos e séricos pode ter potencial clínico como um novo biomarcador de prognóstico/diagnóstico para pacientes de CM.

En els darrers anys s’ha produït un gran avenç en el desenvolupament de teràpies cel•lulars inductores de tolerància per al tractament de malalties autoimmunitàries tals com l’esclerosi múltiple (EM) i altres patologies immunomediades. Concretament, l’ús de cèl•lules dendrítiques tolerogèniques (tolDC) s’ha convertit en una alternativa terapèutica prometedora en assaigs clínics arreu de tot el món, a causa de la seva potencial capacitat de restablir la tolerància immunitària sense posar en risc la immunitat protectora dels pacients, a diferència dels tractaments convencionals disponibles actualment. Però, l’àmplia varietat de protocols existents per a la generació in vitro d’aquestes tolDC, així com la seva gran heterogeneïtat fenotípica i funcional, han posat de manifest la necessitat de trobar biomarcadors robusts com a un pas fonamental per a l’aplicació d’aquestes cèl•lules dins de l’àmbit clínic, així com per a entendre millor els mecanismes involucrats en la inducció de tolerància immunitària. En aquest sentit, el principal objectiu d’aquesta tesi ha consistit a identificar i validar biomarcadors comuns de la generació i la funcionalitat de tres dels protocols més freqüents per a la generació de tolDC, utilitzant ja sigui rapamicina (rapa-tolDC), dexametasona (dexa-tolDC) o vitamina D3 (vitD3-tolDC). Però, després de realitzar un estudi mitjançant microarray utilitzant cèl•lules diferenciades de donants sans, no vam ser capaços d’identificar cap gen diferencialment expressat en comparació amb cèl•lules dendrítiques madures (mDC) i immadures (iDC), que fos comú per a aquests tres protocols de diferenciació de tolDC. Tot i això, els nostres resultats van revelar que les dexa-tolDC i les vitD3-tolDC, però no les rapa-tolDC, compartien la modulació de vàries rutes immunoreguladores i antiinflamatòries per a la inducció de tolerància. A continuació, a causa de les seves potents propietats reguladores, ens vam centrar en l’estudi de les vitD3-tolDC. Així doncs, vam poder validar que l’expressió dels gens CYP24A1, MAP7 i MUCL1 estava fortament induïda en aquestes cèl•lules, tant en mostres de donants sans com de pacients amb EM. En conseqüència, aquests gens poden ser utilitzats com a biomarcadors robusts de la correcta generació de vitD3-tolDC i, per tant, poden ser provats com a controls de qualitat en assaigs clínics per l’EM abans de l’administració d’aquestes cèl•lules als pacients. A més, vam elaborar una xarxa funcional d’interaccions proteiques que va evidenciar que els gens MAP7 i MUCL1 —però no CYP24A1— estaven involucrats en la modulació de vàries rutes rellevants relacionades amb el sistema immunitari, tals com la presentació via HLA de classe II o respostes antiinflamatòries i, consegüentment, podrien tenir un paper crucial en les propietats tolerogèniques de les vitD3-tolDC. Finalment, amb l’objectiu d’entendre millor els mecanismes desencadenats per les vitD3-tolDC per a la inducció de tolerància immunitària, vam desenvolupar un protocol per a generar i, a continuació, estudiar el perfil transcriptòmic de cèl•lules T CD4+ després de la seva interacció antigen-específica amb vitD3-tolDC mitjançant una anàlisi de RNA-seq. En aquest sentit, els nostres resultats van posar de manifest una important repressió de l’expressió de diversos gens involucrats en el cicle cel•lular i la resposta cel•lular davant de, principalment, estímuls proinflamatoris. Però, només el gen JUNB va poder ser identificat com a un potencial biomarcador de la funcionalitat de les vitD3-tolDC, ja que la seva expressió estava lleugerament induïda a aquelles cèl•lules T CD4+ que van interactuar amb aquestes. En resum, els resultats presentats en aquesta tesi descriuen el procediment complet de cribratge, selecció i validació de biomarcadors transcriptòmics de la generació —i de la funcionalitat— de vitD3-tolDC, enfocats a la seva translació final a l’àmbit clínic i, per tant, fent de pont entre el laboratori i els pacients. En los últimos años se ha producido un gran avance en el desarrollo de terapias celulares inductoras de tolerancia para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como la esclerosis múltiple (EM) y otras patologías inmunomediadas. En concreto, el uso de células dendríticas tolerogénicas (tolDC) se ha convertido en una alternativa terapéutica prometedora en ensayos clínicos de todo el mundo, debido a su potencial capacidad de restablecer la tolerancia inmunitaria sin poner en riesgo la inmunidad protectora de los pacientes, a diferencia de los tratamientos convencionales disponibles actualmente. Sin embargo, la amplia variedad de protocolos existentes para la generación in vitro de estas tolDC, así como su gran heterogeneidad fenotípica y funcional, han puesto de manifiesto la necesidad de encontrar biomarcadores robustos como un paso fundamental para la aplicación de estas células en el ámbito clínico, así como para entender mejor los mecanismos involucrados en la inducción de tolerancia inmunitaria. En este sentido, el principal objetivo de esta tesis consistió en identificar y validar biomarcadores comunes de la generación y la funcionalidad de tres de los protocolos más habituales para la generación de tolDC, utilizando ya sea rapamicina (rapa-tolDC), dexametasona (dexa-tolDC) o vitamina D3 (vitD3-tolDC). Sin embargo, después de realizar un estudio mediante microarray utilizando células diferenciadas de donantes sanos, no fuimos capaces de identificar ningún gen diferencialmente expresado, en comparación con células dendríticas maduras (mDC) e inmaduras (iDC), que fuera común para estos tres protocolos de diferenciación de tolDC. No obstante, nuestros resultados revelaron que las dexa-tolDC y las vitD3-tolDC, pero no las rapa-tolDC, compartían la modulación varias rutas inmunoreguladoras y antiinflamatorias para la inducción de tolerancia. Posteriormente, debido a sus potentes propiedades reguladoras, nos centramos en el estudio de las vitD3-tolDC. Así, pudimos validar que la expresión de los genes CYP24A1, MAP7 y MUCL1 estaba fuertemente inducida en estas células, tanto en muestras de donantes sanos como de pacientes con EM. Consecuentemente, dichos genes pueden ser utilizados como biomarcadores robustos de la correcta generación de vitD3-tolDC y, por lo tanto, pueden ser probados como controles de calidad en ensayos clínicos para la EM antes de la administración de estas células a los pacientes. Además, elaboramos una red funcional de interacciones proteicas que evidenció que los genes MAP7 y MUCL1 —pero no CYP24A1— estaban involucrados en la modulación de varias rutas relevantes relacionadas con el sistema inmunitario, tales como la presentación vía HLA de clase II o respuestas antiinflamatorias y, consiguientemente, podrían tener un papel crucial en las propiedades tolerogénicas de las vitD3-tolDC. Finalmente, con el objetivo de entender mejor los mecanismos desencadenados por las vitD3-tolDC para la inducción de tolerancia inmunitaria, desarrollamos un protocolo para generar y a continuación estudiar el perfil transcriptómico de células T CD4+ tras su interacción antígeno-específica con vitD3-tolDC mediante un análisis de RNA-seq. En este sentido, nuestros resultados pusieron de manifiesto una importante represión de la expresión de varios genes involucrados en el ciclo celular y en la respuesta celular ante, principalmente, estímulos proinflamatorios. Sin embargo, tan solo el gen JUNB pudo ser identificado como un potencial biomarcador de la funcionalidad de las vitD3-tolDC, dado que su expresión estaba ligeramente inducida en aquellas células T CD4+ que habían interactuado con las éstas. En resumen, los resultados presentados en esta tesis describen el procedimiento completo de cribado, selección y validación de biomarcadores transcriptómicos de la generación —y de la funcionalidad— de vitD3-tolDC, enfocados a su traslación final al ámbito clínico y sirviendo, por tanto, como un puente entre el laboratorio y los pacientes. The last years have witnessed a breakthrough in the development of tolerance-inducing cell therapies for the treatment of autoimmune diseases, such as multiple sclerosis (MS), as well as other immune-mediated pathologies. In particular, tolerogenic dendritic cell (tolDC)-based therapies have become a promising approach in clinical trials worldwide due to their potential ability to restore immune tolerance without compromising the protective immunity of the patients, contrary to conventional and currently available treatments. However, the broad variety of protocols used to generate tolDC in vitro and their functional and phenotypical heterogeneity are evidencing the need to find robust biomarkers as a key point towards their translation into the clinic, as well as better understanding the mechanisms involved in the induction of immune tolerance. In this regard, the main goal of this thesis was to identify and validate common transcriptomic biomarkers of the generation and functionality of three of the most common tolDC-inducing protocols, using either rapamycin (rapa-tolDC), dexamethasone (dexa-tolDC) or vitamin D3 (vitD3-tolDC) to generate them. However, after performing a microarray study using with cells differentiated from healthy donors, we could not identify any differentially expressed gene in common for these three different tolDC protocols compared to both mature (mDC) and immature dendritic cell (iDC) control conditions. Nevertheless, our results revealed that dexa tolDC and vitD3 tolDC, but not rapa-tolDC, do actually share several immune regulatory and anti-inflammatory pathways towards tolerance induction. Afterwards, and due to their potent regulatory properties, we focused on the study of vitD3-tolDC. We could validate that CYP24A1, MAP7 and MUCL1 genes were strongly up-regulated in these cells, in samples from healthy donors and MS patients. Therefore, these genes constitute robust biomarkers of the adequate generation of vitD3-tolDC, and thus can be tested as a quality control in clinical trials for MS before the administration of these cells into the patients. Furthermore, we constructed a functional network of protein interactions which evidenced that MAP7 and MUCL1 —but not CYP24A1— were involved in the modulation of many relevant immune-related pathways, such as HLA class II presentation and anti-inflammatory responses, and could have a crucial role in the tolerogenic properties of vitD3-tolDC. Finally, in order to better understand the mechanisms triggered by vitD3-tolDC for the induction of immune tolerance, we developed a protocol to generate and study the transcriptomic profile of T CD4+ cells upon their antigen-specific interaction with vitD3-tolDC, using an RNA-seq analysis. In this regard, our results evidenced an important down-modulation of several genes involved in cell cycle and in cell responses to, mainly, pro-inflammatory immune-related stimuli. However, only JUNB gene could be identified as a potential biomarker of the functionality of vitD3-tolDC, since its expression was slightly induced in those T CD4+ cells that interacted with them. Altogether, the results presented in this thesis describe the whole process of screening, selection and validation of transcriptomic biomarkers of the generation —and functionality— of vitD3-tolDC towards their final translation into the clinic, serving as a bridge from the bench to the bedside.

Revisiones [ES] Introducción: El cadmio (Cd) es un metal cuyo principal efecto es la nefrotoxicidad. Su carácter irreversible alerta sobre la importancia en la prevención de la exposición laboral y el diagnóstico precoz de daño renal. Este trabajo resume la evidencia científica entre la exposición a Cd y la alteración de los biomarcadores de exposición y de daño renal. Material y métodos: se realizó una revisión sistemática de la literatura científica publicada entre 2005 y 2015, en 7 base de datos utilizando ecuaciones de búsqueda con términos MESH. Se filtraron las referencias en base a los objetivos excluyéndose artículos no originales. La lectura crítica se realizó en base a una matriz de síntesis de la evidencia, empleándose los criterios SIGN para su determinación. Resultados: Se recuperaron 968 referencias y se incluyeron en la revisión 8; el 90% de diseño transversal. Se encuentra asociación entre la exposición a Cd y los niveles del metal en sangre y orina. Los marcadores de daño renal que se correlacionan con exposición son la beta2-microglobulina, albúmina, enzimas y marcadores de estrés oxidativo. El principal factor modificador del efecto es el tabaco. Conclusiones: A pesar de la limitación por el diseño de los estudios analizados, existen evidencias científicas sin discrepancias en la asociación entre la exposición a Cd y la alteración de biomarcadores de exposición y de daño renal, inclusive ante niveles bajos de exposición a Cd (< 2 µg/g Cr en orina). Se necesitan estudios prospectivos para identificar la pertinencia de plantear una reducción del VLB. [EN] Introduction: Cadmium (Cd) is a metal which main effect is nephrotoxicity. Its irreversibility alerts of the importance in preventing occupational exposure and early diagnosis of kidney damage. This paper summarizes the scientific evidence between exposure to Cd and alteration of biomarkers of exposure and kidney damage.Material and methods: a systematic review of the scientific literature, published between 2005 and 2015, was conducted in 7 database using equations search with MeSH terms. References were filtered based on the objectives excluding non-original articles. Critical reading is performed based on an array of evidence synthesis, using the SIGN criteria for determination. Results: 968 references were retrieved and included in the review number 8, 90% of cross-sectional design. Association between exposure to Cd and metal levels in blood and urine were found. Kidney damage markers that correlate with exposure are beta2-microglobulin, albumin, enzymes and markers of oxidative stress. The main modifier effect factor is the tobacco. Conclusions: Although it is limited by the design of the analyzed studies, it is without discrepancies scientific evidence in the association between exposure to Cd and alteration of biomarkers a exposure and kidney damage, even at a low levels of exposure to Cd (

Purpose: There is a critical need for population-based prospective cohort studies because they follow individuals before the onset of disease, allowing for studies that can identify biomarkers and disease-modifying effects, and thereby contributing to systems epidemiology.Participants: This paper describes the design and baseline characteristics of an intensively examined subpopulation of the LifeLines cohort in the Netherlands. In this unique subcohort, LifeLines DEEP, we included 1539 participants aged 18 years and older.Findings to date: We collected additional blood (n= 1387), exhaled air (n= 1425) and faecal samples (n= 1248), and elicited responses to gastrointestinal health questionnaires (n= 1176) for analysis of the genome, epigenome, transcriptome, microbiome, metabolome and other biological levels. Here, we provide an overview of the different data layers in LifeLines DEEP and present baseline characteristics of the study population including food intake and quality of life. We also describe how the LifeLines DEEP cohort allows for the detailed investigation of genetic, genomic and metabolic variation for a wide range of phenotypic outcomes. Finally, we examine the determinants of gastrointestinal health, an area of particular interest to us that can be addressed by LifeLines DEEP.Future plans: We have established a cohort of which multiple data levels allow for the integrative analysis of populations for translation of this information into biomarkers for disease, and which will offer new insights into disease mechanisms and prevention.