Search

In the process of proteases immobilization, their conformation, affinity of enzymes to the substrate, as well as other properties, may change. Therefore, their comprehensive study, including the reaction rates, affinity to the substrate and the determination of the mechanism of action using kinetic studies of free and immobilized peptidases, is an important task. This work aimed to determine the kinetic parameters of casein hydrolysis catalyzed by free and released from PVA/chitosan films peptidase from B. thuringiensis var. israelensis IMB B-7465. The kinetics of casein hydrolysis of free and released from PVA/chitosan films peptidase from Bacillus thuringiensis var. israelensis IMB B-7465 was studied. It is shown, that only the modified Anson method is applicable for determining the caseinolytic activity of peptidase, released from the matrix. It was revealed, that at relatively low substrate concentrations, the reaction rate of casein hydrolysis catalysed by free and released from PVA/chitosan films peptidase increased proportionally. When substrate concentration increased, the rate value approached its limit, and then began to decrease. That is, in the certain casein concentration range, the enzyme is inhibited by the substrate. The kinetic constants were measured within the ascending part of the curve relating the initial reaction rate and the substrate concentration. It was determined that the entrapment of the enzyme in the PVA/chitosan film does not significantly affect Vmax. of hydrolysis, while Km is increased 1.3-fold. It is associated with decreasing of the affinity of the enzyme to the substrate as a result of conformational changes in the protein globule, or due to the viscosity limitations, caused by polymers of the matrix. Substrate inhibition of free and released from films peptidase was studied. It was shown that the last Kis is 2.3-fold higher, than that of the free enzyme, which allows to hydrolyze higher concentrations of the substrate., Досліджено кінетику гідролізу казеїну вільною і вивільненою з плівок ПВС/хітозан пептидазою з Bacillus thuringiensis var. israelensis ІМВ В-7465. Показано, що тільки модифікований метод Ансона може бути застосований для визначення казеїнолітичної активності вивільненої з матриці пептидази. Визначено, що включення ензиму в плівку ПВС/хітозан істотно не впливає на Vмакс. гідролізу, тоді як Км збільшується в 1,3 рази. Виявлено інгібування вільної і вивільненої з плівок пептидази субстратом. Показано, що Кis останньої у 2,3 рази перевищує таку вільного ензиму, що дозволяє гідролізувати більші концентрації субстрату.

Мета. Вивчення субстратної специфічності очищеної пептидази 2 Вacillus thuringiensis IМВ В-7324. Методи. Для вивчення субстратної специфічності пептидази 2 використовували білки: еластин, фібрин, фібриноген, колаген і казеїн. Визначення оптимальних співвідношень ензим-субстрат проводили за допомогою повного двофакторного досліду. Спорідненість (константу Міхаеліса, Km) до субстратів пептидази 2 B. thuringiensis IMB B-7324 визначали за методом подвійних обернених величин в координатах Лайнуївера-Берка (1/ν0–1/[S]). Для обчислення та графічного представлення результатів повного двофакторного експерименту використовували метод стрімкого сходження (метод Бокса-Уілсона) та комп’ютерну систему аналізу даних STATISTICA 8.0. Результати. Дослідження гідролізу нативних білкових субстратів пептидазою 2 В. thuringiensis IМВ В-7324 показало, що ензим здатний розщеплювати фібрин, фібриноген, казеїн і колаген. Для ефективного гідролізу білків за результатами повного двофакторного досліду було встановлено оптимальні співвідношення концентрацій ензиму і субстратів: 1 мг пептидази 2 здатен розщеплювати 54 мг фібрину, 67 мг фібриногену, 25 мг казеїну і 49 мг колагену. Показано, що досліджуваний ензим виявляє вищу спорідненість дофібрину і казеїну, для яких значення константи Міхаеліса Km становить 1,1 і 1,2 мг, відповідно. Висновки. Пептидаза 2 B. thuringiensis IМВ В-7324 характеризується вищою специфічністю щодо фібрину і фібриногену, ніж до казеїну і колагену, проте більшою спорідненістю до фібрину і казеїну., Цель. Исследование субстратной специфичности очищенной пептидазы 2 Вacillus thuringiensis ИМ В В-7324. Методы. Для изучения субстратной специфичности пептидазы 2 использовали белки: эластин, фибрин, фибриноген, коллаген и казеин. Определение оптимальных соотношений фермент-субстрат проводили с помощью полного двухфакторного опыта (ПФО). Сродство (константу Михаэлиса, Km) к субстратам пептидазы 2 B. thuringiensis ИMB B-7324 определяли по методу двойных обратных величин в координатах Лайнуивера-Бэрка (1/ν0 – 1/[S]). Для вычисления и графического представления результатов полного двухфакторного опыта использовали метод стремительного восхождения (метод Бокса-Уилсона) и компьютерную систему анализа данных STATISTICA 8.0. Результаты. Исследование гидролиза нативных белковых субстратов пептидазой 2 В. thuringiensis ИМ В В-7324 показало, что фермент расщепляет фибрин, фибриноген, казеин и коллаген. Для эффективного гидролиза белков по результатам полного двухфакторного опыта (ПФО) были установлены оптимальные соотношения концентраций фермента и субстратов: 1 мг пептидазы 2 может расщепить 54 мг фибрина, 67 мг фибриногена, 25 мг казеина и 49 мг коллагена. Показано, что исследуемый фермент проявляет большее сродство к фибрину и казеину, для которых значения константы Михаэлиса Km составляет 1,1 и 1,2 мг, соответственно. Выводы. Пептидаза 2 B. thuringiensis ИМ В В-7324 характеризуется более высокой специфичностью к фибрину и фибриногену, чем к казеину и коллагену, но большим сродством к фибрину и казеину., Ai m. Investigation of substrate specificity of the purified peptidase 2 from Вacillus thuringiensis IМV В-7324. Methods. To study the substrate specificity of the peptidase 2 we used protein: elastin, fibrin, fibrinogen, collagen and casein. Determination of the optimal ratio of the enzymesubstrate was carried out a two-level factorial design. Substrate affinity (Michaelis constant, Km) of enzyme was established by the double reciprocal coordinates in the Lineweaver-Burk (1/ν0 - 1 / [S]). For calculation and graphic presentation of the results obtained by two factorial experiments there were used Box-Wilson method and computer program STATISTICA 8.0. Results. The study of hydrolysis of native protein substrates by В. thuringiensis IМV В-7324 peptidase 2 showed that the enzyme is able to cleave the fibrin, fibrinogen, casein and collagen. For effective hydrolysis of proteins according to the results of full two-way experience (CFE) was determined the optimal correlation of enzyme concentration and substrates concentration. So 1 mg of peptidase 2 is able to cleave 54 mg of fibrin, 67 mg of fibrinogen, 25 mg of casein and 49 mg of collagen. It was shown that the examine enzyme is more affinity to the fibrin and casein for that the Michaelis constant Km is 1.1 and 1.2 mg, respectively. Conclusions. The peptidase 2 of B. thuringiensis IМV В-7324 is characterized by higher specificity to the fibrin and fibrinogen than to casein and collagen, but more affinity to fibrin and casein.