Search

This study was carried to improve an influential and cost-effective shoot proliferation and rooting protocol for oil rose (Rosa damascena) having great importance of its economic value as well as its prestige plant for our country. In this study, single nodal pieces belonging to oil rose plants were used as explant sources. It was determined that the effects of liquid modified Murashige and Skoog (MS) media containing 6 different combinations of benzyladenine (BA) (1.0, 1.5 and 2.0 mg/l) and naphthalene acetic acid (NAA) (0 and 0.1 mg/l) on the development of shoots obtained from nodal explants. After three subculture cycles, to evaluate rooting performance of shoots, they were cultured in ½ MS medium containing 2 mg/l indole butyric acid (IBA), 30 g/l sucrose and 162 mg/l phloroglucinol (PG) for 7 days in the dark and then transferred to liquid ½ MS and liquid ½ modified MS medium. At the end of the study, the most successful results for shoot proliferation were obtained from the liquid modified MS medium containing 2 mg/l BA. The best treatment for rooting of shoots was MS medium supplemented with 2mg/l indole butyric acid (IBA), 30 g/l sucrose and 162 mg/l PG for 7 days and then transferring the explants to liquid ½ MS medium added only 30 g/l sucrose. In the study, it was also determined that liquid media had significant potential for the propagation of Rosa damascena with low cost and high success., Bu araştırma, ekonomik değerinin yanı sıra ülkemiz açısından bir prestij bitkisi olması nedeniyle de büyük önem taşıyan yağ gülü (Rosa damascena) için in vitro koşullarda etkili ve uygun maliyetli sürgün çoğaltma ve köklenme protokolü geliştirmek amacıyla gerçekleştirilmiştir. Bu araştırmada eksplant kaynağı olarak yağ gülü bitkilerine ait tek gözlü boğum parçaları kullanılmıştır. Sıvı modifiye MS ortamına ilave edilen benziladenin (BA) (1.0, 1.5 ve 2.0 mg/l)’nin 0 ve 0.1 mg/l konsantrasyonlarındaki naftalin asetik asit (NAA) ile yapmış olduğu 6 farklı kombinasyonunun, boğum eksplantlarından elde edilen in vitro sürgünlerin gelişimi üzerine olan etkileri belirlenmiştir. Yapılan üç alt kültür sonrasında elde edilen sürgünler, 2 mg/l indol bütirik asit (IBA), 30 g/l sakkaroz ve 162 mg/l floroglusinol (FG) içeren ½ MS ortamında 7 gün karanlıkta kültüre alınmalarının ardından, köklenme performanslarını değerlendirmek üzere, sıvı ½ MS ve sıvı ½ modifiye MS ortamlarında kültüre alınmışlardır. Araştırma sonucunda, sürgün çoğalması ve büyümesi için 2 mg/l BA içeren sıvı modifiye MS ortamının; sürgünlerin köklendirilmesi için de 7 gün süreyle 2 mg/l indol bütirik asit (IBA), 30 g/l sakkaroz ve 162 mg/l FG içeren MS ortamında tutulmalarının ardından, sadece 30 g/l sakkaroz içeren sıvı ½ MS ortamlarına transfer edilmeleri ile en başarılı sonuçların elde edildiği belirlenmiştir. Araştırmada ayrıca düşük maliyet ve yüksek başarı ile Rosa damascena türü için sıvı ortamların etkin bir şekilde kullanılabileceği de belirlenmiştir.

Bu araştırma, ekonomik değerinin yanı sıra ülkemiz açısından bir prestij bitkisi olması nedeniyle de büyük önem taşıyan yağ gülü (Rosa damascena) için in vitro koşullarda etkili ve uygun maliyetli sürgün çoğaltma ve köklenme protokolü geliştirmek amacıyla gerçekleştirilmiştir. Eksplant kaynağı olarak yağ gülü bitkilerine ait tek gözlü boğum parçalarının kullanıldığı bu tez çalışmasında, katı Murashige ve Skoog (MS) ortamında elde edilen in vitro sürgünler, sıvı modifiye MS ortamına ilave edilen benziladenin (BA) (1.0, 1.5 ve 2.0 mg l-1)'nın 0 ve 0.1 mg l-1 konsantrasyonlarındaki naftalen asetik asit (NAA) ile yapmış olduğu 6 farklı kombinasyonu içeren ortamlarda kültüre alınarak, sürgün gelişimi üzerindeki etkileri incelenmiştir. Yapılan üç alt kültür sonrasında elde edilen sürgünler, 2 g l-1 IBA, 30 g l-1 sakkaroz ve 162 mg l-1 floroglusinol (FG) içeren ½ MS ortamında 7 gün karanlıkta kültüre alınmalarının ardından, köklenme performanslarını değerlendirmek üzere, sıvı ½ MS ve sıvı ½ modifiye MS ortamlarında kültüre alınmışlardır. Araştırma sonucunda, sürgün çoğalması ve büyümesi için 2 mg l-1 BA içeren sıvı modifiye MS ortamının; sürgünlerin köklendirilmesi için de 7 gün süreyle 2 mg l-1 indol bütirik asit (IBA), 30 g l-1 sakkaroz ve 162 mg l-1 FG içeren MS ortamında tutulmalarının ardından, sadece 30 g l-1 sakkaroz içeren sıvı ½ MS ortamlarına transfer edilmeleri ile en başarılı sonuçların elde edildiği belirlenmiştir. Araştırmada ayrıca düşük maliyet ve yüksek başarı ile Rosa damascena türü için sıvı ortamların etkin bir şekilde kullanılabileceği de belirlenmiştir. This study was carried to improve an influential and cost-effective shoot proliferation and rooting protocol for oil rose (Rosa damascena) having great importance of its economic value as well as its prestige plant for our country. In this study, single nodal pieces belonging to oil rose plants were used as explant source. It was determined that the effects of liquid modified Murashige and Skoog (MS) media containing 6 different combinations of benzyladenine (BA) (1.0, 1.5 and 2.0 mg/l) and naphthalene acetic acid (NAA) (0 and 0.1 mg/l) on the development of shoots obtained from solid MS medium. After three subculture cycles, the shoots were cultured in ½ MS medium containing 2 g l-1 IBA, 30 g l-1 l sucrose and 162 mg l-1 phloroglucinol (PG) for 7 days in the dark and than the shoots were transferred to liquid ½ MS and liquid ½ modified MS medium to evaluate their rooting performance. At the end of the study, the most successful results for shoot proliferation were obtained from the liquid modified MS medium containing 2 mg l-1 BA. The best treatment for rooting of shoots was MS medium supplemented with 2mg l-1 indole butyric acid (IBA), 30 g l-1 sucrose and 162 mg l-1 PG for 7 days and then transferring the explants to liquid ½ MS medium added only 30 g l-1 sucrose. In the study, it was also determined that liquid media had a significant potential for the propagation of Rosa damascena with low cost and high success. 44

This thesis is summarized as botanical, phytochemical, analytical and biological activity titles. The morphological and anatomical characteristics of Rosa damascena Mill. (Rosaceae) petals have been described in the botanical section of the study. Biomarker compounds, kaempferol 3-O-galactoside and kaempferol 3-O- glucoside, were isolated using chromatographic techniques for analytical studies carried out within the scope of pharmacopoeia standard studies. In this context, TLC, HPTLC and HPLC method optimizations and HPLC method validation for methanolic extracts prepared from 10 different R. damascena samples, were performed. The inhibitory effects of extracts, volatile oil, rose water and pulp water on collagenase class MMP-1, MMP-8, MMP-13, gelatinase class MMP-2, MMP-9 and stromelysin class MMP-3 enzymes were investigated. The antioxidant capacities of the extracts were determined by β-carotene-linoleic acid, CUPRAC, FRAP and phosphomolybdate methods; radical scavenging capacities were determined by DPPH, ABTS and NO methods. Sun protection factors (SPF) of extracts were measured spectrophotometrically. As a result of the studies, it was found that R. damascena petals has skin anti-aging effect and can be an alternative for osteoarthritis treatment, has significant antioxidant and radical scavenging capacity and effective sun protection factor. Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi (Proje No: THD-2017-15631) İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI....................................................................................................iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI................................iv ETİK BEYAN..........................................................................................................v TEŞEKKÜR............................................................................................................ vi ÖZET ..................................................................................................................... vii ABSTRACT..........................................................................................................viii İÇİNDEKİLER .......................................................................................................ix SİMGELER VE KISALTMALAR........................................................................xiii ŞEKİLLER........................................................................................................... xvii TABLOLAR ....................................................................................................... xxiv 1. GİRİŞ.................................................................................................................. 1 2. GENEL BİLGİLER ...........................................................................................7 2.1. Botanik Bilgiler..............................................................................................7 2.1.1. Rosaceae Familyası .................................................................................7 2.1.2. Rosa L. Cinsinin Taksonomideki Yeri .....................................................7 2.1.3. Türkiye Florasındaki Rosa L. Taksonları ................................................. 7 2.1.4. Rosa damascena Mill............................................................................... 8 2.2. Rosa damascena Üzerinde Yapılan Fitokimyasal Çalışmalar..........................9 2.2.1. Fenolik Bileşikler .................................................................................... 9 2.2.2. Kumarinler ............................................................................................ 14 2.2.3. Terpenik ve Uçucu Bileşikler................................................................. 15 2.2.4. Fenil propanoitler .................................................................................. 20 2.2.5. Bitki asitleri ........................................................................................... 21 2.3. Rosa damascena’nın Kullanılışı ve Biyolojik Aktiviteleri ............................ 22 2.3.1. Rosa damascena’nın Geleneksel Kullanılışı........................................... 22 2.3.2. Rosa damascena’nın in vitro Biyolojik Etkileri......................................23 2.3.3. Rosa damascena’nın in vivo Biyolojik Etkileri....................................... 30 2.3.4. Rosa damascena’nın ex vivo Biyolojik Etkileri ...................................... 42 2.3.5. Rosa damascena ile Yapılan Klinik Çalışmalar......................................43 3. GEREÇ VE YÖNTEM..................................................................................... 46 3.1. Rosa damascena Mill., Rosae oleum, Rosae aqua Temini............................. 46 3.2. Anatomik ve Morfolojik Çalışmalar ............................................................. 47 3.3. Kimyasal Malzemeler .................................................................................. 47 3.4. Kullanılan Alet ve Gereçler .......................................................................... 48 3.5. Ekstraksiyon ................................................................................................ 49 3.5.1. İzolasyon çalışmaları için ekstraksiyon .................................................. 49 3.5.2. İTK, HPTLC ve HPLC çalışmaları için ekstraksiyon ............................. 50 3.5.3. Biyolojik etki çalışmaları için ekstraksiyon............................................50 3.6. Fitokimyasal ve Analitik Çalışmalar............................................................. 51 3.6.1. İşaretleyici (Biomarker) Bileşiklerin İzolasyonu .................................... 51 3.6.2. İTK Yöntem Optimizasyonu..................................................................53 3.6.3. HPTLC Yöntem Optimizasyonu ............................................................ 54 3.6.4. HPLC Çalışmaları.................................................................................. 55 3.7. Uçucu yağ elde edilmesi ve analizi...............................................................61 3.7.1. Mikrodistilasyon.................................................................................... 61 3.7.2. Hidrodistilasyon .................................................................................... 62 3.7.3. Katı Faz Mikroekstraksiyon Yöntemi (SPME).......................................63 3.7.4. Gaz Kromatografisi (GC) ve Gaz Kromatografisi/Kütle Spektrometrisi (GC/MS) ile uçucu yağınların kimyasal analizi.......................................63 3.8. Matriks Metalloproteinaz İnhibitör Etki Çalışmaları.....................................64 3.8.1. MMP-1 İnhibitör Etki Tayini ................................................................. 65 3.8.2. MMP-2 İnhibitör Etki Tayini ................................................................. 66 3.8.3. MMP-3 İnhibitör Etki Tayini ................................................................. 68 3.8.4. MMP-8 İnhibitör Etki Tayini ................................................................. 69 3.8.5. MMP-9 İnhibitör Etki Tayini ................................................................. 71 3.8.6. MMP-13 İnhibitör Etki Tayini ............................................................... 72 3.9. Antioksidan Kapasite Çalışmaları................................................................. 74 3.9.1. β-karoten Linoleik Asit Yöntemi............................................................ 74 3.9.2. Demir Redükleyici Antioksidan Kapasite (FRAP) Yöntemi ................... 75 3.9.3. Bakır İndirgeyici Antioksidan Kapasite (CUPRAC) Yöntemi ................ 76 3.9.4. Fosfomolibdat Antioksidan Kapasite Tayini .......................................... 76 3.10. Radikal süpürücü Kapasite Çalışmaları ...................................................... 77 3.10.1. DPPH Radikalini Süpürücü Kapasite Tayini ........................................ 77 3.10.2. ABTS Radikalini Süpürücü Etki Tayini ............................................... 78 3.10.3. Nitrik Oksit Radikalini Süpürücü Etki Tayini....................................... 79 3.11. Güneşten Koruyucu Faktör Çalışmaları ...................................................... 79 4. BULGULAR ..................................................................................................... 81 4.1. Botanik Çalışmalara Ait Bulgular................................................................. 81 4.1.1. Rosa damascena Mill............................................................................. 81 4.2. Fitokimyasal ve Analitik Çalışmalara Ait Bulgular.......................................83 4.2.1. İşaretleyici Olarak Belirlenen Bileşiklerin İzolasyonu ve Yapı Tayini....83 4.2.2. İTK Yöntem Optimizasyonu..................................................................87 4.2.3. HPTLC Yöntem Optimizasyonu ............................................................ 89 4.2.4. HPLC Çalışmaları.................................................................................. 92 4.3. Uçucu Yağ Analizi..................................................................................... 112 4.3.1. Gaz Kromatografisi – Kütle Spektrometresi (GC-MS) ......................... 112 4.4. Matriks Metalloproteinaz İnhibitör Aktivite Çalışmalarına Ait Bulgular..... 125 4.4.1. MMP-1 İnhibitör Aktivite Tayini......................................................... 125 4.4.2. MMP-2 İnhibitör Aktivite Tayini......................................................... 128 4.4.3. MMP-3 İnhibitör Aktivite tayini .......................................................... 132 4.4.4. MMP-8 İnhibitör Aktivite tayini .......................................................... 136 4.4.5. MMP-9 İnhibitör Aktivite tayini .......................................................... 140 4.4.6. MMP-13 İnhibitör Aktivite tayini ........................................................ 144 4.5. Antioksidan Kapasite Çalışmalarına Ait Bulgular....................................... 148 4.5.1. β-karoten linoleik asit yöntemi............................................................. 148 4.5.2. Demir Redükleyici Antioksidan Kapasite (FRAP) ............................... 156 4.5.3. Bakır Redükleyici Antioksidan Kapasite (CUPRAC) ........................... 159 4.5.4. Fosfomolibdat Antioksidan Kapasite Tayini ........................................ 161 4.6. Radikal Süpürücü Kapasite Çalışmalarına Ait Bulgular .............................. 164 4.6.1. DPPH Radikalini Süpürücü Kapasite ................................................... 164 4.6.2. ABTS Radikalini Süpürücü Kapasite Tayini ........................................ 171 4.6.3. Nitrik Oksit Radikalini Süpürücü Kapasite .......................................... 178 4.7. Güneşten Koruyucu Faktör (SPF) Çalışmaları için Bulgular ....................... 185 5. TARTIŞMA .................................................................................................... 194 6. SONUÇ VE ÖNERİLER................................................................................ 213 7. KAYNAKLAR................................................................................................ 215 8. ÖZGEÇMİŞ.......................................................................................................... Bu tez botanik, fitokimyasal, analitik ve biyolojik aktivite başlıkları altında toplanmıştır. Çalışmanın botanik kısmında Rosa damascena Mill. (Rosaceae) petallerinin morfolojik ve anatomik karakteristikleri aydınlatılmıştır. Farmakope standartlarını belirleme çalışmaları kapsamında gerçekleştirilen analitik çalışmalarda yararlanılmak üzere işaretleyici bileşikler kemferol 3-O-galaktozit ve kemferol 3-O-glukozit kromatografik yöntemler kullanılarak izole edilmiştir. Yine bu kapsamda, 10 farklı R. damascena numunesinden hazırlanan metanollü ekstre için İTK, HPTLC ve HPLC yöntem optimizasyonları ve HPLC metot validasyonu gerçekleştirilmiştir. Farklı kaynaklardan temin edilen R. damascena numunelerinden hazırlanan ekstre, uçucu yağ ve yağ altı suları ile posa suyunun Matriks metalloproteinaz enzim ailesi (MMPs) üyelerinden kollojenazlar grubundan MMP-1, MMP-8, MMP-13, jelatinazlar grubundan MMP-2, MMP-9 ve stromelisinler grubundan MMP-3 enzimleri üzerindeki inhibitör etkileri araştırılmıştır. Ekstrelerin β- Karoten-linoleik asit, CUPRAC, FRAP ve fosfomolibdat yöntemleri ile antioksidan kapasiteleri; DPPH, ABTS ve NO yöntemleri ile radikal süpürücü kapasiteleri tayin edilmiştir. Ekstrelerin güneşten koruyucu faktörleri (SPF) spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Yapılan çalışmalar sonucunda R. damascena bitkisinin cilt yaşlanmasını geciktirici etkiye sahip olduğu, osteoartrit tedavisi için alternatif olabileceği, kuvvetli antioksidan ve radikal süpürücü kapasiteye ve etkin bir güneşten koruyucu faktöre sahip olduğu bulunmuştur.

Pilosebasöz foliküllerin inflamatuvar bir hastalığı olan akne vulgaris, özellikle gençler ve genç erişkinler arasında sık görülen, en fazla yüz, boyun ve gövdenin üst kısmını tutan dermatolojik bir problemdir. Kişinin dış görünüşünü etkileyebilen ve skar bırakabilen akne, depresyon, kaygı ve sosyal inhibisyon gibi psikolojik sorunlara da neden olabilmektedir. Akne vulgaris oluşumunda önemli bir role sahip mikroorganizmalardan Propionibacterium acnes derinin normal florasında bulunmaktadır. Akne vulgaris tedavisinde uzun yıllardır topikal ve sistemik olarak antibiyotikler kullanılmaktadır. Propionibacterium acnes enfeksiyonlarının patogenezinde biyofilm üretiminin rolü son birkaç yıldır üzerinde durulan konulardan biridir. Biyofilm oluşumunun antibiyotiklere geçirgenlikte azalmayla ilişkili olduğu savunulmaktadır. Topikal ilaçlara direnç gelişmesi durumunda sistemik antibiyotik tedavisi gerekli olmakta, bu da hem ilaca bağlı yan etkileri arttırmakta hem de direnç gelişimini hızlandırmaktadır. Bu durum tedavi seçeneklerini hızla azaltmakta ve yeni arayışlara yönlenilmektedir.Çalışmamızda akne vulgaris hastalarından (n:7) ve kontrollerden (n:7) izole edilen Propionibacterium acnes kökenlerinde biyofilm, proteaz, beta hemoliz ve DNA' az gibi virulans faktörleri araştırılmıştır. Tüm kökenler biyofilm üretmiş, üç hasta kökeni hariç, tüm kökenler beta hemoliz ve proteaz aktivitesi göstermiştir. Kökenlerin hiçbirinde DNA' az aktivitesi saptanmamıştır. Bu sonuçlar araştırdığımız virulans faktörlerinin normal flora kökenleri ile akne yapan kökenler arasında bir farklılık göstermediğini ortaya koymuştur. Ülkemizde Isparta ve yöresinde yetişen Rosa damascena Mill' den elde edilen esansiyel yağ ve absolut türevinin çalışma kökenleri üzerindeki antibakteriyel etkinliğin saptanması için disk difüzyon yöntemi ve Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MİK) yöntemi kullanılmıştır. Absolut türevi %4'lük konsantrasyonda antibakteriyel etkinlik göstermesine rağmen, antibiyofilm etkinlik saptanmamıştır. Esansiyel gül yağında ise MİK değeri %2 iken, antibiyofilm etkinlik için MİK değeri %0.25 olarak saptamıştır. Sonuç olarak, bu dozda esansiyel gül yağının topikal uygulanması tek başına tedavi edici olabilir ve düşük dozda antibiyotiklerle kombine edilerek direnç gelişimi ve yan etkilerin açığa çıkması engellenebilir. Acne vulgaris, an inflamatuar disease of pilosebaceous follicules, is a dermatological problem which is especially seen in young adults and effect face, cervical and upper side of trunk mostly. Acne formation may leave a scar, and cause psychological problems like depression, anxiety and social inhibition. Propionibacterium acnes as one of the microorganisms play a significant role in the pathogenesis of acne vulgaris is a member of normal skin flora. Antibiotics have been used systemically and topically for many years for acne vulgaris treatment. The role of biofilm production in the pathogenesis of P.acnes infections is one of the hot topics in the last few years. It is suggested that biofilm production is associated with decrease of permeability to antibiotics. In case of resistance to topical antibiotics, systemic antibiotic therapy is required causing increased side effects and the development of resistance to antibiotics. As a result the choices for antimicrobial treatment is being steadily decreased and there is a need for new options.In our study, virulence factors like biofilm, protease, beta hemolysis and DNase have been analysed in P.acnes strains isolated from acne vulgaris patients (n:7), and healthy controls (n:7). All strains produced biofilm, all strains showed beta hemolysis and protease activity except three strains isolated from patients. DNase activity was not detected in any of the strain. Our results suggest that there is no difference of searched virulence factors between strains isolated from healthy controls and patients. In order to detect antibacterial activity of essential oil and absolute derivatives obtained from Rosa damascena Mill which is cultivated in Isparta, disc diffusion method and Minimum Inhibitory Concentration (MIC) method were used to. We detected antibacterial activity for absolute derivative at 4% concentration but there was no antibiofilm activity. MIC value for essential rose oil was 2% at it also shows antibiofilm activity in 0.25% concentration. In conclusion, we may suggest that topical administration of essential rose oil may be therapeutic by itself or could be combined with antimicrobial in order to prevent resistance and adverse side effects. 62