Search

Otozomal resesif osteopetrozis (ORO) genellikle infant veya çocukluk çağında ölüme yol açan ciddi bir hastalıktır. TNFSF11 geni tarafından kodlanan RANKL ve TNFRSF11A geni tarafından kodlanan RANK proteinleri osteoklast olgunlaşması için önemli olup bu genlerdeki mutasyonların ORO gelişiminde rol oynadığı gösterilmiştir. Bu yazıda aralarında akrabalık bulunan eşlerin 2 çocuğunda da TNFRSF11A geninde c.508 A→G homozigot mutasyonu (pArg170Gly) saptanmış. Bir sonraki gebelik sırasında CVS materyali üzerinde yapılan mutasyon analizinde, fetusta heterozigot mutasyon saptandı. Gebelik terme kadar devam etti ve sağlıklı bir erkek çocuk doğdu. Prenatal mutasyon analizi, mutasyonu bilinen hastalıklarda ebeveynin anksiyetesini rahatlatmak ve aileye genetik danışma vermek için önemlidir. Autosomal recessive osteoporosis (ARO) is a severe disease causing death usually at infancy or childhood. RANKL coded by TNFSF11 gene and RANK coded by TNFRSF11A gene are important proteins for osteoclast maturation and it is indicated that mutation on these genes plays an important role for ARO development. It is reported in this article that c.508 A→G homozygote mutation (pArg170Gly) is observed in TNFRSF11A gene of 2 children of consanguineous couple. Mutation analysis performed on CVS material during the next pregnancy revealed heterozygous mutation in the fetus. The pregnancy was continued to term and a healthy boy was delivered. Prenatal mutation analysis is important for diseases with known mutations to relieve parental anxiety and provide genetic counselling for the family.

In the novel approach suggested here, we examined the use of polypeptide probes selected from artificial peptide libraries for the identification of the differences in dsDNA sequences which are potential targets for the genetic diseases. As a model system two target DNAs which are the polymerase chain reaction (PCR) products of the two hage-display vector multiple cloning sites (MCS) differing at 18 base pair long has been used. In the production of the target sequences biotinylated primers were used in PCR. The polypeptide probes obtained from artificial peptide library by the selection of phage-display techniques. Identified clones bearing the candidate polypeptide probe specific to the target sequences was tested by phage-ELISA. For the comparison and selection assays, magnetic separation technique was used. One clone selected from artificial peptide library specifically recognized the 18 nucleotide difference, which encodes (His)6 , in between two model PCR products and showed no cross reaction determined by phage-ELISA. These findings may be interpreted to the usage of the polypeptides for the detection of the anomalies at specific target DNA sequences and be used for the manipulation of the gene expression in different disease models.

AMAÇ: Human Immunodeficiency Virus (HIV) infeksiyonu, antiretroviral ilaçların uygun kombinasyonlarda (highly active antiretroviral therapy-HAART) kullanılmasıyla ölümcül bir hastalıktan kontrol altına alınabilen kronik bir hastalığa dönüşmüştür. Uzun ve etkili HIV enfeksiyonu tedavisinin önündeki en büyük engellerden biri antiretroviral ilaç direncidir. En uygun tedavi rejiminin belirlenmesi için tanıdan sonra mümkün olan en kısa zamanda ilaç duyarlılık testinin yapılması önerilir. Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu HIV ilaç direnç mutasyonlarının saptanmasında altın standarttır. Ama %20'nın altında bulunan direnç mutasyonlarını saptayamaması dezavantajıdır. Ayrıca Sanger temelli ticari kitler esasolarak proteaz ve revers transkriptaz gen bölge mutasyonlarını tespit etmektedir. Yeni nesil dizileme (YND) ile >%1 mutasyonların saptanması mümkün hale gelmiştir. İntegrazinhibitörlerinin ilk tedavi seçeneği olarak artan kullanımı ile bu ilaçlara karşı gelişen direnç mutasyonlarının da izlenmesi gerekliliği gündeme gelmiştir. Çalışmamızda YND ile proteaz,revers transkriptaz ile birlikte integraz bölge direnç mutasyonlarını tek bir amplikon kullanılarak saptanması amaçlanmıştır.GEREÇ ve YÖNTEM: Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbı Mikrobiyoloji Anabilim DalıMoleküler Viroloji Laboratuvarı'nda HIV pozitif hasta örneklerinden 2008 yılı itibariyleSanger zincir sonlandırma reaksiyonu temelli Viroseq (Abbott, ABD) ile proteaz, reverstranskriptaz inhibitörlerine karşı gelişen ilaç dirençleri rutin olarak çalışılmaktadır.Çalışmamıza arşivlenmiş olan örneklerden farklı direnç profiline sahip 40 HIV pozitif hastaörneği dahil edilmiştir. HIV pol gen bölgesinin dizilenmesi ve subtiplerin belirlenmesi için hasta örneklerinden viral RNA ekstraksiyonu, tek basamak RT (Reverse-Transcription)polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve nested PCR sonrası elde edilen ürünler YND teknolojisiile dizilendi. Sekans verileri, HXB2 referans sekansı (GenBank accession # NC_001802) CLCGenomics Workbench versiyon 8.1 ile %1 ve %5 cut off kullanılarak analiz edildi. Mutasyonbelirlenmesi ve subtiplendirme Stanford Üniversitesi HIV-1 ilaç Direnci Veri Bankası versiyon 8.4 (http://hivdb.stanford.edu) kullanılarak yapıldı.BULGULAR: 40 hastanın 27'si alttip B (%67,5), altısı B+CRF 02_AG (%15), üçü alttip A(%7,5), ikisi G+J (%5), biri CRF07_BC (%2,5) ve biri B+F (%2,5) şeklinde saptanmıştır.Örneklerin yedisinde (%17,5) en az bir antiretroviral ilaca olası düşük seviyeden yüksekseviyeye kadar değişen direnç tespit edilmiştir; nükleotid revers transkriptaz inhibitörleri(NRTI) ve non-nükleozid revers transkriptaz inhibitörleri (NNRTI) direnç mutasyonları oranı sırasıyla %5, %12,5 olarak bulunmuştur. Proteaz inhibitörü (PI) ve integraz inhibitörü (INSTI)direnç mutasyonu ise saptanmamıştır.Bir örnekte K103N majör NNRTI mutasyonu, iki örnekte M41L ve T215D/S mutasyonu, iki örnekte E138A mutasyonu, iki örnekte E138G mutasyonu tespitedilmiştir.Proteaz ve revers transkriptaz inhibitörlerine karşı gelişen direnç ve genotip açıdan 40 örneğin sonuçları Sanger zincir sonlandırma reaksiyonu ile uyumlu (%100) bulunmuştur.%1 ve %5 cut off arasında fark saptanmamıştır.SONUÇ:Çalışmamızda 40 hasta örneğinin YND ile PI, NRTI, NNRTI İle birlikte INSTI'ne karşıgelişen ilaç dirençleri tek bir amplikon kullanılarak tespit edilmiştir. Bu yöntemle hemintegraz gen bölgesi dizi analizi yapılmış hem de örneklerin havuzlanması ve`multiplekslenmesi` (tek seferde birçok testin birlikte çalışılması) ile ̴%90 oranında maliyet düşmüştür. Ayrıca >%1 ilaç dirençli mutasyonların tespit edilmesi hastaların tedavisininin yönlendirilmesinde yol gösterici olacaktır OBJECTIVE: HIV (Human Immunodeficiency Virus) infection has transformed, byusing antiretroviral drugs in appropriate combinations (highly active antiretroviral therapy HAART);from a fatal disease to a chronic disease that can be controlled. One of the biggest patient management problem is antiretroviral drug resistance. To determine the mostappropriate treatment regimen, it is recommended that the drug susceptibility test beperformed as soon as possible after diagnosis. The Sanger chain termination reaction is thegold standard for HIV drug resistance mutation detection. But the disadvantage is that itcan not detect resistance mutations below 20%. In addition, Sanger-based commercial kitsmainly detect protease and reverse transcriptase gene region mutations. It has becomepossible to detect >1% mutations with the new generation sequencing (NGS). Increasinguse of integrase inhibitors as an initial treatment option has necessitated the monitoring of resistance mutations against these drugs. In our study, it was aimed to detect the protease,reverse transcriptase and integrase resistance mutations with NGS using a single amplicon.MATERIALS AND METHODS: In the Department of Medical Microbiology Laboratory of Ege University; drug resistance to protease, reverse transcriptase inhibitorshas been routinely studied in HIV positive patient samples with Viroseq (Abbott, USA)based on the Sanger chain termination reaction since 2008. Forty samples of HIV positivepatients with different resistance profiles were included from the archived samples. Afterviral RNA extraction, one step reverse transcription and nested PCR were performed. HIVpol gene region were sequenced by NGS technology. Sequence data were analyzed using1% and 5% cut off with the CLC Genomics Workbench version 8.1 with the HXB2 referencesequence (GenBank accession # NC_001802). Mutation detection and subtyping wasperformed using Stanford University HIV-1 Drug Resistance Data Bank version 8.4(http://hivdb.stanford.edu).RESULTS: Of the 40 patients, 27 were subtype B (67.5%), six were B + CRF 02_AG(15%), three were subtype A (7.5%), two were G + J (5%), one was CRF07_BC (%2,5) andone was B + F (2.5%). Seven of the samples (17.5%) had a resistance to at least oneantiretroviral drug, ranging from a possible low to high level of resistance; the rate ofresistance mutations of nucleotide reverse transcriptase inhibitors (NRTI) and nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTI) were found to be 5%, 12.5%respectively. Protease inhibitor (PI) and integrase inhibitor (INSTI) resistance mutationswere not detected. In one sample major K103N NNRTI mutation, in two samples M41L andT215D / S NRTI mutations, in two samples E138A NNRTI mutation, in two samples E138GNNRTI mutation were detected. Forty sample results in terms of genotype and resistance to protease and reverse transcriptase inhibitors were found to be concordant with the Sangerchain termination reaction (100%). There was no difference between 1% and 5% cut off.CONCLUSION: In our study, drug resistances to INSTI in addition to PI, NRTI, andNNRTI were detected using a single amplicon in 40 patients with NGS. In this method,integrase gene region sequence analysis has been made and 90% cost reduction wasachieved by pooling and `multiplexing` of samples. Furthermore, detection of >1% drugresistant mutations will guide the treatment of patients. 61

GİRİŞ: Otoinflamatuar Hastalıklar(OİH) enfeksiyon olmaksızın tekrarlayan ateş, inflamasyon ataklarıyla karakterize hastalıklardır [Ailevi Akdeniz Ateşi(AAA), Tümör Nekroz Faktör Alfa Reseptör İlişkili Periyodik Ateş Sendromu(TRAPS), Hiper-IgD/MevalonatKinaz Yetmezlik sendromu (HIDS/MKD), Kriyopirin ilişkili periyodik ateş sendromu(CAPS)]. Bu hastalıklarla ilişkili genler sırası ile MEFV, TNFRSF1A, MVK ve NLRP3'tür.Materyal-Metod: Çalışma retrospektif dosya taraması yöntemiyle yapıldı. Hastaların epidemiyolojik, klinik bulguları ve tedaviye yanıtları, hastane dosya arşiv kayıtlarından elde edildi. OİH ön tanısıyla başvuran 286 çocuk hastada MEFV, NLRP3, TNFRSF1A ve MVK gen mutasyonları dizi analizi gerçekleştirilmişti. Çalışmamızda, 194 hasta OİH grubunu ve 92 hasta MEFV geninde mutasyon saptanmayan (AAA-WT) grubunu oluşturmaktaydı. Bulgular: 286 olguda MVK geni 10 ekzonunun (2-11) dizi analizinde: 6'sı (%2) patolojik olmak üzere 68 hastada mutasyon saptandı(%24). 5'i V377I mutasyonu heterozigottu; birinde ise N205S c.614A>G yeni bir mutasyon gözlendi. 62 hastada S52N varyantı gözlendi (%22). CAPS hastalarında, NLRP3 geni 3. Ekzonu sekanslandı. 38 hastada mutasyon (%13) gözlendi; 2 hastada I313V mutasyonu saptandı. Düşük penetranslı mutasyonlardan olan V198M 6 hastada, Q703K 30 hastada saptandı. TRAPS ilişkili TNFRFS1A geni 6 ekzon(2-7) sekanslandı. 12 mutasyon (%4) (11'i R92Q, 1'i N116S) saptandı. 194 hastada ekzon 2, 3, 5 ve 10 taranarak MEFV gen mutasyonlarına bakıldı. 62 hastada (%32) (M694V, E148Q, V726A, M680I, A744S, K695R, R761H, L649V, P369S, R408Q, T267I, Q778Sf*4, 761_764 dup CCGC) mutasyon saptandı.FMF, MVK, CAPS, TRAPS birlikte bakılan OİH grubunda, olguların 62'sinde MEFV, 20'sinde NLRP3, biri patolojik olmak üzere 12'sinde TNFRFS1A, 5'i patolojik olmak üzere 41'inde MVK gen mutasyonları saptandı. OİH 'de tüm panelin mutasyon belirleme oran %69 idi. MEFV geni dışlandığında ise bu oran %38 olarak belirlendi. Patolojik mutasyonlarda ise bu oran %3 idi. AAA-WT grupta ise olguların 2'si patolojik olmak üzere 18'inde NLRP3 ve biri patolojik olmak üzere 27'sinde MVK mutasyonları vardı. Bu grupta mutasyon saptama oranı % 41 idi. Patolojik mutasyon oranı ise %3 idi. İki grup arasında fark yoktu.TARTIŞMA:OİH grubu örtüşen klinik bulguları nedeni ile zor tanı konulan bir hastalık grubudur. MVK, NLRP3, TNFRFS1A ve MEFV gen mutasyon analizleri, son yıllarda ilgili hastalıkların ayırıcı tanısında önemli rol almaktadır. Mutasyonların dağılımı etnik gruplarda farklılıklar göstermektedir. Ülkemizdeki oranlar henüz bilinmemektedir. Çalışmamızın verileri diğer benzer literatür çalışmaları ile polmorfik varyantların dağılımı açısından örtüşmekteydi; patolojik mutasyon temelinde ise özellikle NLRP3, TNFRSF1A ve MVK gen mutasyon sonuçlarımız literatürdeki çalışmalardan düşük bir mutasyon oranı yansıtmıştı. Bizim çalışmada mutasyon yelpazesi de dardı. Çalışmamız ülkemizde pediatrik OİH popülasyonu MEFV, NLRP3, MVK ve TNFRSF1A gen mutasyon dağılımı ilişkili ilk sonuçları yansıtmaktadır. INTRODUCTION: Autoinflammatory diseases (AID) are characterised by recurrent fever and inflammation without an apparent infectious cause [ Familial Meditteranean Fever (FMF), Tumour Necrosis Factor Receptor-Associated Periodic Syndrome (TRAPS), Hyper-IgD/ Mevalonate Kinase Deficiency Syndrome (HIDS/MKD), Cryopyrin-Associated Periodic Syndromes (CAPS)]. The genes associated with these diseases are MEFV, TNFRSF1A, MVK and NLRP3 respectively.MATERIAL-METHOD: A retrospective study was performed which included analysis of patients epidemiology, clinical findings and treatment responses. MEFV, TNFRSF1A, MVK and NLRP3 genes mutations sequence analysis were performed of 286 pediatric patient prediagnosed with AID. In our study, AID group consisted out of 194 patients and the group without MEFV gene mutation(FMF-WT) consisted out of 92 patients.RESULTS: Sequence analysis of 10 exons (2-11) of the MVK gene in the total population of 286 patients, revealed 68 mutations (%24) of which 6 (%2) were pathological. Five were V377I heterozygous mutation, 1 was N205S c.614A>G a novel mutation. In 62 patients the S52N variant was detected. In CAPS patients, exon 3 of the NLRP3 gene was sequenced. In 38 patients (%13) a mutation was detected and 2 patients had the pathological I313V mutation. Low penetrance mutations V198M and Q703K, were detected in 6 and 30 patients respectively. Six exons (2-7) of the TRAPS related TNFRSF1A gene were sequenced. In 12 patients, TNFRSF1A mutations (%4) were detected (11 were R92Q, 1 was N116S). In 194 patients, MEFV gene mutations were screened by sequencing exons 2, 3, 5 and 10. MEFV gene mutations were detected in 62 (%32) patients.We analysed the gene mutations associated with FMF, MVK, CAPS, TRAPS in the AID group. We found MEFV mutations in 62 patients, NLRP3 in 20 patients, TNFRFS1A mutations in 12 patients (of which 1 was pathological), and MVK IVmutations in 41 patients (of which 5 were pathological). In AID, mutation detection rate was determined to be %38 and the pathological mutation rate was %3. In the FMF-WT group, 18 NLRP3 mutations were found (of which 2 were pathological), 27 MVK mutations were found (of 1 was pathological). In the FMF-WT group mutation detection rate was determined to be %41 and the pathological mutation rate was %3 and not significantly different from the AID group. DISCUSSION: Autoinflammatory diseases are a group of diseases that are hard to be differentially diagnosed due to overlapping clinical features. In the recent years, the analysis of MVK, NLRP3, TNFRFS1A and MEFV gene mutations got an important role in the differential diagnosis. The distribution of mutations vary according to the ethnicity of the patient groups. The distribution and mutation rates in our country are unknown. The results of this study are consistent with similar studies that were performed in other countries, in terms of distribution of mutations. With respect to pathological mutations we found lower mutation rates in this study than that has been reported in the literature. The mutation spectrum was also limited in this study.This study is the first study to describe the distributions of mutations in the MEFV, NLRP3, MVK and TNFRFS1A genes in the pediatric AID population in Turkey. 104

Bu çalışmada, bölgemizde beta talasemi majör tanısı almış hasta ve ebeveynlerinde; tanıyı kesinleştirmek için, hematolojik analiz ve hemoglobin varyant analizi yapıldı. Altın standart DNA dizi analizi yöntemi ile de mutasyon çeşitliliği saptandı. Hastanemizin Pediatrik Hematoloji Bölümünde takip ve tedavisi yapılan 30 beta talasemi majör hasta ve ebeveynlerden (30 anne ve 30 baba) olmak üzere toplam 90 kişi çalışmaya dahil edildi. EDTA’ lı tüplere kan örnekleri alındı. Hematolojik analiz flow sitometrik yöntemle, hemoglobin varyant düzeyi HPLC ile aynı gün çalışıldı. Mutasyon çeşitliğini saptamak için DNA dizi analizi yapıldı. Sıklık sırasına göre: IVS-I-110 (G->A) % 46.67, Kodon 8 (-AA) % 16.67, IVS-II-1 (G->A) % 11.67, Kodon 44 (-C) % 10.00, IVS-II-745 (C->G) % 5.00, IVS-I-1 (G->A) % 3.33, IVS-I-5 (G->T) % 3.33 ve -30 (T->A) % 3.33 olmak üzere 8 çeşit mutasyon tespit edildi. Bunlara ek olarak önceden tanımlanmış dört sessiz nokta mutasyon görüldü. Hastalar düzenli olarak transfüzyon tedavisi aldıkları için hemoglobin konsantrasyonu 9.20±1.32 g/dL düzeyi ile beklenen düşüklükte değildi. HbA 86.32 ±12.09, HbF 10.95±11.94 olarak saptandı. Ebeveynlerde ise taşıyıcılarda olması baklenen hemogram sayımı ve Hb varyant düzeyleri görüldü. Beta talasemi mutasyon çeşitliliği açısından Türkiye geneline benzer bir dağılım tespit edildi. 9.20±1.32 g/dL olarak saptanan Hb düzeyi ise hastaların takip-tedavilerinin etkin sürdürüldüğünü düşündürmektedir. Bu çalışma, DNA dizi analizi yönteminin kullanımına bağlı olarak Diyarbakır’da saptanamayan mutasyonların belirlenmesine imkan tanımıştır. Bundan sonra daha geniş çaplı taramaların yapılarak mutasyonların saptanması gerçek bölgesel verilerin elde edilmesini sağlayacaktır. Taşıyıcı sıklığının yaygın olduğu bölgemizde bilinmeyen mutasyonların saptanması, prenatal tanı ile hasta çocuk doğumunun önlenmesine önemli katkı sunacaktır. Anahtar Sözcükler: Talasemi, beta talasemi, dizi analizi, mutasyon, HPLC, SNP In this study, patients diagnosed with beta thalassemia and their parents were subjected to hematological and hemoglobin variant analysis. Mutation diversity had been determined with the gold standart method DNA sequencing. A total of 90 people, 30 of them beta thalassemia major patients that have been followed-up and treated in Hematology Clinics of Dicle Üniversity Medical School Hospital and 60 of them were their parents, included in the study. Blood samples of both of patients and their parents into two EDTA containing tubes for all analyses. Hematological analysis had been performed with flowcytometric method and mutations with DNA sequencing. 8 different mutations were determined. By frequency: IVS-I-110 (G->A) % 46.67, Codon 8 (-AA) % 16.67, IVS-II-1 (G->A) % 11.67, Codon 44 (-C) % 10.00, IVS-II-745 (C->G) % 5.00, IVS-I-1 (G->A) % 3.33, IVS-I-5 (G->T) % 3.33 ve -30 (T->A) % 3.33. In addition to these mutations, four missense single nucleotide polymorphisms were determined. Due to the transfusion therapy, diversity was noticed in hemoglobin concentration (9.20±1.32 g/dL) and Hb variants levels (HbA 86.32 ±12.09, HbF 10.95±11.94). Typical carrier hemogram count and Hb variants levels were seen in parents. In our study, a similar distribution was identified throughout Turkey in terms of mutations. Mutations were classified in all the studied people. Average Hb level of 9.20±1.32 g/dL shows a sufficient follow-up and treatment of the disease. This study increased the resolution of mutation detection in Diyarbakır due to the use of DNA sequencing. Thereafter large scale mutation detection studies will help to screen realistic regional data in terms of mutation diversity of beta thallasemia. Determination of unknown mutations in our region, where carier frequency is realtively high, will help to prevent birth of diseased children via prenatal diagnosis. Key Words: Thalassemia, beta thalassemia, sequence analysis, mutation, HPLC, SNP

Nokta mutasyonu olan MYD88 L265P ∼%90 Lenfoplazmasitik Lenfoma (LpL) / Waldenström Makroglobulinemi (WM) ve / veya tanı olarak belirsiz immünoglobulin M (IgM) monoklonal gamopati vakalarda (MGUS) bildirilmiştir. Bu mutasyon LPL / WM için spesifik olmamakla birlikte diğer laboratuar ve klinik verilerle rutin uygulamalarda ayırıcı tanıda kullanılabilir. Bir sorun olarak mevcut numune içinde neoplastik hücrelerin miktarı hassasiyet etkilemektedir. Başka bir sorun DNA parçalanması veya kalitesidir etkileyen dokuların formalin fiksasyonudur. Farklı yöntemler mutasyon analizi için gerçekleştirilebilir. DNA dizileme metodu allel yükü % 20-30 daha az ise mutasyonu kaçırma olasılığı mümkündür. RT-PCR yöntemi daha duyarlı ve % 1 sınırı içinde hedef nokta mutasyonları tarama özelliği vardır. Bu çalışmada amacımız, plazma hücre farklılaşması gösteren B hücreli lenfomalarda MYD88 mutasyon dağılımı, mutasyona tespiti için kullanılan arşiv preparatlarda DNA kalitesi ve doku tespit işlemlerin etkisini incelenmiştir. RT-PCR ve dizi analizleri sonuçlarını karşılaştırarak, %70 oranda RT-PCR pozitif vakalarda dizi analizi yöntemiyle yakalamak mümkün olmamıştır. MYD88 (L265P) mutasyonu (% 91) 11/12 WM, (% 27) 3/11 NMZL ve (% 20) 2/10MZL NOS ve (% 10) 2/19 SMZL hastada ile saptandı. İki yöntem arasındaki mutasyon tespit farkı bulunmasının en önemli faktörleri DNA konsantrasyonu (p = 0.034) ve kullanılan materyal türü (FFP/Yayma) (p = 0.008) bulunmuştur. Bu çalişmada mutasyon tespiti başarısı için bağımsız bir faktör olarak tümör yükü bulunmadı. Yapılan çalışmanın sonuçlarını kullanarak güvenilir mutasyon sonuçları için daha hassas yöntemler ve korumalı patolojik materyal en önemli faktörler olduğunu onaylanmış. MYD88 L265P single amino-acid mutation has been reported in ∼90% of Lymphoplasmacytic lymphoma /Waldenström's Macroglobulinemia (LPL/WM) and /or immunoglobulin M (IgM) monoclonal gammapathies of uncertain significance (MGUS). Although this mutation is not specific for LPL/WM, it can be used for differential diagnosis with the other laboratory and clinical data on routine practice considering the sensitivity of detection methods. One problem effects the sensitivity is the amount of the neoplastic cells within the available sample. The other problem is the DNA fragmentation or quality which is effected by the formalin fixation of the tissues. Different methods can be performed for mutation analysis. Sanger sequencing could miss the mutation if the allele burden status is less than 20-30%. Allele specific real time PCR is more sensitive and can target safely point mutations within the limit of 1%. Our aim in this study is to see the distribution of MYD88 mutation in indolent B cell lymphoma with plasma cell diferentiation in our series and also the effect of fixation and DNA quality for detecting the mutation in our archives material. We perfemed to compare the resuls of RT-PCR and DNA sequence analysis. MYD88 mutation detection was not possible by DNA sequence analysis for 70% of RT-PCR positive cases. MYD88 (L265P) was detected in (91%) 11/12 patients with WM, (27%) 3/11 NMZL and (20%) 2/10 MZL NOS and (10%) 2/19 SMZL. The most significent factors effect the diffirence of mutation detection between two methods are DNA concentration (p=0.034) and type of material (FFP/Aspiration)(p=0.008). we could not demonstrate the tumor burden status as an independent factor for the succes in mutation detection. Our results confirmed that using more sensitive methods and protected pathological matheryal are the most importent factors for reliable mutation results. 89

Bu çalışmada, indikatörsüz DNA dizi algılama yöntemi dayalı bir elektrokimyasal genosensör tasarımı yapıldı. Yapılan genosensörün klinik olarak uygulanabileceği gerçek hasta örnekleri kullanılarak gösterildi.Çalışmada indikatörsüz DNA dizi algılama yöntemine dayalı Mycobacterium tuberculosis bakterisinin tedavi sırasında rifampin (RIF) antibiyotiğine karşı geliştiridiği direnç mutasyonlarının tayinine yönelik elektrokimyasal bir genosensör tasarımı gerçekleştirildi. Kullanılan prob diziler, bakterinin RIF'e karşı en sık direnç gösterdiği rpoB geninin 507-533. kodonlarını içeren 81 baz uzunluğundaki ?hot-spot? (sıcak bölge)'sine karşılık gelen 5 farklı bölgeden seçildi. Bu prob diziler guanin yerine analoğu olan inozin ile modifiye olarak sentezlendi.Çalışamada tek kullanımlık grafit elektrotlar kullanıldı. 5' ucunda amino-hekzil işaretli prob diziler elektrot yüzeyine kovalent olarak bağlandı. Prob dizi ile kaplı elektrotlar, 81 baz uzunluğundaki sentetik hot ?spot hedef dizi ve tüm bazları hedeften farklı rasgele dizi ile hibridizasyona tabi tutularak alınan guanin yükseltgenme sinyalleri değerlendirildi. Bu iki diziden alınan yanıtlar arasındaki farklılıklar, tasarlanan genosensörün seçimliliğini gösterdi. Genosensörün seçiciliğinin tayinine yönelik olarak, en uygun hibridizasyon koşulları (prob ve hedef derişimi, hibridizasyon, yıkama zamanları, vs..) çalışmaları yapıldı.Genosensör seçimliliğinin saptanmasının ardından, gerçek örnekler ile çalışmalara başlandı. Bunun için ilk etapta mutasyon ayırımının en iyi gözlendiği koşulların tayini yapıldı. Burada tüm probların kaplı olduğu elektrot yüzeylerinde belirli bir prob dizi bölgesinde direnç mutasyonu içen bir PCR ürünü değişen koşullarda hibridizasyona uğratıldı. Alınan yanıtlara göre, mutasyonun bulunduğu prob dizi bölgesinden en düşük diğer bölgelerden en yüksek sinyalin gözlendiği koşullar tayin edildi. Bunların sonucunda tüm PCR ürünü örnekleri kullanılarak mutasyon analizleri gerçekleştirildi.Böylece Mycobacterium tuberculosis'in rifampin antibiyotiğine karşı geliştirdiği direnç mutasyonlarının bir EVET / HAYIR sisemine dayalı tasarlanan elektrokimyasal genosensör ile tayini yapılarak, günümüzde bu amaçla kullanılan rutin yöntemlere alternatif bir yöntem olduğu ve klinik tanıya uygulanabilirliği, ayrıca sahip olduğu tek kullanımlık elektrot sistemi ile bir mikrçip tasarmının temeli olduğu kanıtlandı. In this study, an electrochemical genosensor based on indicator-free DNA detection method was developed. The applicability of this method on detection of genetic and inherited diseases was showed by using real samples from patients.An electrochemical genosensor was designed based on indicator-fee DNA detection technology for the detection of Mycobacterium tuberculosis resistance mutations to rifampin treatment. Probe sequences represent 5 different parts of the 81 base hot-spot region of the rpoB gene which contains the resistance mutations to rifampin. These probe sequences are inosine modified (guanine ?free).Disposable pencil graphite electrodes (PGE) were used as working electrode. 5? aminohexyl labeled probe sequences were covalently immobilized on to PGE surfaces. Guanine oxidation signals obtained from probe sequences coated PGE surfaces after hybridization with 81 mer synthetic hot-spot and noncomplementary targets. The differences between responses obtained after hybridization with synthetic targets (hot-spot and noncomplementary) proved the selectivity of the genosensor. Optimization ofthe genosensor selectivity was performed by the detection of optimum hybridization conditions (optimum prob and target concentrations, washing buffers, washing and hybridization times).After the optimization of hybridization conditions and genosensor selectivity optimum mutation detection conditions were performed. S probes coated electrode surfaces were hybridized with PCR products which had a resistance mutation at one of the S probe?s region, in different hybridization and washing conditions. Optimum mutation detection conditions were observed, due to the diferences between responses obtained after hybridization with PCR products.Mycobacterium tuberculosis?, rpoB gene mutations to rifampin resistance were detected by using electrochemical genosensor technology. Observed results based on a YES / NO system are showed the applicability of this study on clinical diagnosis, alternative to conventinal methods. Dispoable electrode system technique proved applicability of the system to microchip technology. 169

Giriş ve amaç: Ateroskleroz strok için en önemli risk bir faktörü, apolipoprotein E (apo E) polimorfizmide ateroskleroz patogenezinde rol oynayan genetik fakt.orierdendir.Apo E genotipi ile strok arasındaki ilişki tam olarak bilinmemektedir. Bu çalışmanın amadan; a) apo E genotipi ile akut serebral infarktüs ve intraserebral hemoraji arasındaki ilişkiyi araştırmak, b)serebrovasküler hastalığın risk faktörleri ile apo E genotipini ilişkilendirmek, c) akut inmeyi takibeden mortalite ile apo E genotipinin ilişkisini incelemek, d) apo E genotipini primer koruyucu tedavi ile ilişkilendirmek. Metod: Akut İskemik ve Hemorojik Strok tanısı ile yatırılan ve radyolojik olarak tanısı kesinleşen 100 hasta ile aynı yaşla uyumlu 30 sağlıklı birey alındı. İnme fenotipini serebral enfarktüs ya da intrakranial hemoraji, belirlemek için, akut olaydan sonra 10 gün içinde Beyin Bilgisayarlı Tomografi veya Manyetik Rezonans Görüntüleme çekilmiştir. Serebral infarktüslü hastalar, Oxfordshire Toplumda İnme Projesi Sınıflandırmasına (OCSP) göre alt tiplere ayrılmışlardır, intrakranial hemoraji lezyon yerine sınıflandınldı. "High Pure PCR Template Preparation Kit", 'Light Cycler-Apo E Mutation Detection Kit (codon 112 and 158) ",. Light Cycler-Red 640 işaretli prob ve Light Cycler-Red 705 işaretli prob kullanılarak allel analizi yapıldı ve hastaların allel tipleri ortaya çıkarıldı. Çalışmaya alınan tüm hastalan n ayrıntılı nörolojik ve sistemik muayeneleri, rutin laboratuar tetkikleri (kan sayımı, elektrolitler, kan şekeri, lipit değerleri ve diğer parametreler), total apo E, elektrokardiyografi (EKG), göğüs radyografisi, ekokardiyografi yapıldı. Bulgular: Çalışmaya katılan stroklu hastaların ve kontrollerini karşılaştırılması sonuçlan incelendiğinde, LDL-Kolesterol, total kolesterol, LVH değişkenleri arasında önemli fark olduğu bulundu (p0.05) Sonuç; 1- Iskemik ve hemorojik strok ile apo E genotipinin polimorüzmi arasında risk faktörü olarak bir ilişki saptanamamıştır. 2-Akut inmeyi takip eden tüm nedenlere bağlı mortalitenin patogenezi ile apo E genotipinin polimorfizmini ilişkilendiren bir bulgu elde edilmemiştir. Anahtar kelimeler Apolipoprotein E; serebrovasküler hastalık; Apo E genotipi; risk faktörleri; mortalite Introduction and Objectives: Atherosclerosis is an important risk factor for stroke and apolipoprotein E (apo E) polimorphism is one of the genetic factors that plays a role in the pathogenesis of atherosclerosis. Currently, the exact relationship between Apo E genotype and stroke is unknown. The objectives of this study are to; a) investigate the relationship between apo E genotype, acute cerebral infarction and intracerebral hemorrhage, b) establish a relationship between apo E genotype and risk factors for cerebrovascular disease, c) investigate the relationship betweeen acute stroke mortality and apo E genotype, d) establish a relationship between apo E genotype and primary preventive therapy. Method: 100 hospitalized patients who were diagnosed clinically and radiologically as acute ischemic or hemorrhagic stroke and 30 healthy subjects in the same age group were chosen for this study. Cranial CT or MRI was performed to determine the stroke phenotype (cerebral infarction, CI or intracranial hemorrhage, ICH) in the first 10 days after the acute event The patients with cerebral infarction were classified according to the Oxfordshire Community Stroke Project (OCSP) Classification (OCSP). Intracranial hemorrhages were classified according to the location of the lesions. Allel analysis was performed to determine the allel type of the patients by using the '"High Pure PCR Template Preparation Kit", "Light Cycler-Apo E Mutation Detection Kit (codon 112 and 158)", "Light Cycler-Red 640 and Light Cycler-Red 705 marked probes". Detailed neurologic and systemic examinations of all the patients and the healthy subjects under the study were performed as well as routine laboratuary examinations (complete blood count, electrolytes, blood glucose, lipids and other parameters), total apo E, electrocardiography (ECG), chest radiography, and echocardiography. 75 Results: There was a statistically significant difference in LDL-Cholesterol, Total Cholesterol and LVH variables between the stroke patients and the healthy control group (p0.05). Conlusion: 1- There was no statistically significant relation between ischemic and hemorrhogic stroke and apo E genotype polimorphism as a risk factor. 2-There was no significant finding to establish a relationship between pathogenesis of all kinds of mortalities after acute stroke and apo E genotype polimorphism. Key Words: Apolipoprotein E; cerebrovascular disease; Apo E genotype; risk factors; mortality.

THE ROLE OF CYP2C9 GENE POLYMORPHISMS AFTER HEART VALVEREPLACEMENT WITH ANTICOAGULANT THERAPYValve replacement with valvular heart disease inevitable in certainconditions. Because of early calcific degeneration biological heart valves have ashort life time. Despite the mechanical valves have a long life time, anticoagulantmust be used because of tromboembolic complications. Coumadin is ananticoagulant agent used for the prevention of thromboembolic complications afterheart valve replacement. Bleeding is major adverse effect of coumadin. For thisreason, coumadin dose must be adjusted very well. Presently, the InternationalNormalized Ratio (INR) is used for coumadin dose adjustment. Coumadin ismetabolized by cytochrome P450 CYP2C9. In addition to the wild-type allele(CYP2C9*1), two allelic variants CYP2C9*2 and CYP2C9*3 have been identified.CYP2C9*2 is the result of cysteine substitution at arginine codon 144 andCYP2C9*3 is the result of a leucine substitution at isoleucine codon 359. Genepolymorphisms of CYP2C9 decrease coumadin metabolism so would increase thebleeding risk.The aim of the present study was to investigate the role of CYP2C9 genepolymorphisms after heart valve replacement in group of patients who are takingcoumadin. The study subjects were consisted of 74 patient with heart valcereplacement. DNA was extracted from blood samples. CYPC9*2, CYP2C9*3alleles were detected by using LightCycler-CYP2C9 mutation detection kit by realtime PCR method with LightCycler instrument.The results of our show that CYP2C9 genotype is associated with the meanmaintenance dose of warfarin. In our study, we found that patients havingCYP2C9*2 and CYP2C9*3 genotype have lower dose of coumadin according topatients having wild type genotype (CYP2C9*2 p=0.0296, CYP2C9*3 p=0.022). Inaddition to combine association of CYP2C9*2 and CYP2C9*3 genotype coumadindose and INR levels were investigated and we found that patients having bothforms of CYP2C9*2 and CYP2C9*3 heterozygous (CYP2C9*2/*3) require lowercoumadin dose than patients having wild type genotype (p=0.001).Our results showed that CYP2C9 genotyping before anticoagulant therapycan be a guideline in the patients with valve replacement for coumadin therapyand it may be useful for devoloping dosing protocols particularly at the onset oftherapy.Key Words: Valve replacement, mechanic heart valve, CYP2C9, coumadin. ABSTRACTTHE ROLE OF CYP2C9 GENE POLYMORPHISMS AFTER HEART VALVEREPLACEMENT WITH ANTICOAGULANT THERAPYValve replacement with valvular heart disease inevitable in certainconditions. Because of early calcific degeneration biological heart valves have ashort life time. Despite the mechanical valves have a long life time, anticoagulantmust be used because of tromboembolic complications. Coumadin is ananticoagulant agent used for the prevention of thromboembolic complications afterheart valve replacement. Bleeding is major adverse effect of coumadin. For thisreason, coumadin dose must be adjusted very well. Presently, the InternationalNormalized Ratio (INR) is used for coumadin dose adjustment. Coumadin ismetabolized by cytochrome P450 CYP2C9. In addition to the wild-type allele(CYP2C9*1), two allelic variants CYP2C9*2 and CYP2C9*3 have been identified.CYP2C9*2 is the result of cysteine substitution at arginine codon 144 andCYP2C9*3 is the result of a leucine substitution at isoleucine codon 359. Genepolymorphisms of CYP2C9 decrease coumadin metabolism so would increase thebleeding risk.The aim of the present study was to investigate the role of CYP2C9 genepolymorphisms after heart valve replacement in group of patients who are takingcoumadin. The study subjects were consisted of 74 patient with heart valcereplacement. DNA was extracted from blood samples. CYPC9*2, CYP2C9*3alleles were detected by using LightCycler-CYP2C9 mutation detection kit by realtime PCR method with LightCycler instrument.The results of our show that CYP2C9 genotype is associated with the meanmaintenance dose of warfarin. In our study, we found that patients havingCYP2C9*2 and CYP2C9*3 genotype have lower dose of coumadin according topatients having wild type genotype (CYP2C9*2 p=0.0296, CYP2C9*3 p=0.022). Inaddition to combine association of CYP2C9*2 and CYP2C9*3 genotype coumadindose and INR levels were investigated and we found that patients having bothforms of CYP2C9*2 and CYP2C9*3 heterozygous (CYP2C9*2/*3) require lowercoumadin dose than patients having wild type genotype (p=0.001).Our results showed that CYP2C9 genotyping before anticoagulant therapycan be a guideline in the patients with valve replacement for coumadin therapyand it may be useful for devoloping dosing protocols particularly at the onset oftherapy.Key Words: Valve replacement, mechanic heart valve, CYP2C9, coumadin. 75

7- ÖZET Giriş ve amaç: Ateroskleroz strok için en önemli risk bir faktörü, apolipoprotein E (apo E) polimorfizmide ateroskleroz patogenezinde rol oynayan genetik fakt.orierdendir.Apo E genotipi ile strok arasındaki ilişki tam olarak bilinmemektedir. Bu çalışmanın amadan; a) apo E genotipi ile akut serebral infarktüs ve intraserebral hemoraji arasındaki ilişkiyi araştırmak, b)serebrovasküler hastalığın risk faktörleri ile apo E genotipini ilişkilendirmek, c) akut inmeyi takibeden mortalite ile apo E genotipinin ilişkisini incelemek, d) apo E genotipini primer koruyucu tedavi ile ilişkilendirmek. Metod: Akut İskemik ve Hemorojik Strok tanısı ile yatırılan ve radyolojik olarak tanısı kesinleşen 100 hasta ile aynı yaşla uyumlu 30 sağlıklı birey alındı. İnme fenotipini serebral enfarktüs ya da intrakranial hemoraji, belirlemek için, akut olaydan sonra 10 gün içinde Beyin Bilgisayarlı Tomografi veya Manyetik Rezonans Görüntüleme çekilmiştir. Serebral infarktüslü hastalar, Oxfordshire Toplumda İnme Projesi Sınıflandırmasına (OCSP) göre alt tiplere ayrılmışlardır, intrakranial hemoraji lezyon yerine sınıflandınldı. `High Pure PCR Template Preparation Kit`, 'Light Cycler-Apo E Mutation Detection Kit (codon 112 and 158) `,. Light Cycler-Red 640 işaretli prob ve Light Cycler-Red 705 işaretli prob kullanılarak allel analizi yapıldı ve hastaların allel tipleri ortaya çıkarıldı. Çalışmaya alınan tüm hastalan n ayrıntılı nörolojik ve sistemik muayeneleri, rutin laboratuar tetkikleri (kan sayımı, elektrolitler, kan şekeri, lipit değerleri ve diğer parametreler), total apo E, elektrokardiyografi (EKG), göğüs radyografisi, ekokardiyografi yapıldı. Bulgular: Çalışmaya katılan stroklu hastaların ve kontrollerini karşılaştırılması sonuçlan incelendiğinde, LDL-Kolesterol, total kolesterol, LVH değişkenleri arasında önemli fark olduğu bulundu (p0.05) Sonuç; 1- Iskemik ve hemorojik strok ile apo E genotipinin polimorüzmi arasında risk faktörü olarak bir ilişki saptanamamıştır. 2-Akut inmeyi takip eden tüm nedenlere bağlı mortalitenin patogenezi ile apo E genotipinin polimorfizmini ilişkilendiren bir bulgu elde edilmemiştir. Anahtar kelimeler Apolipoprotein E; serebrovasküler hastalık; Apo E genotipi; risk faktörleri; mortalite 74 7- SUMMARY Introduction and Objectives: Atherosclerosis is an important risk factor for stroke and apolipoprotein E (apo E) polimorphism is one of the genetic factors that plays a role in the pathogenesis of atherosclerosis. Currently, the exact relationship between Apo E genotype and stroke is unknown. The objectives of this study are to; a) investigate the relationship between apo E genotype, acute cerebral infarction and intracerebral hemorrhage, b) establish a relationship between apo E genotype and risk factors for cerebrovascular disease, c) investigate the relationship betweeen acute stroke mortality and apo E genotype, d) establish a relationship between apo E genotype and primary preventive therapy. Method: 100 hospitalized patients who were diagnosed clinically and radiologically as acute ischemic or hemorrhagic stroke and 30 healthy subjects in the same age group were chosen for this study. Cranial CT or MRI was performed to determine the stroke phenotype (cerebral infarction, CI or intracranial hemorrhage, ICH) in the first 10 days after the acute event The patients with cerebral infarction were classified according to the Oxfordshire Community Stroke Project (OCSP) Classification (OCSP). Intracranial hemorrhages were classified according to the location of the lesions. Allel analysis was performed to determine the allel type of the patients by using the '`High Pure PCR Template Preparation Kit`, `Light Cycler-Apo E Mutation Detection Kit (codon 112 and 158)`, `Light Cycler-Red 640 and Light Cycler-Red 705 marked probes`. Detailed neurologic and systemic examinations of all the patients and the healthy subjects under the study were performed as well as routine laboratuary examinations (complete blood count, electrolytes, blood glucose, lipids and other parameters), total apo E, electrocardiography (ECG), chest radiography, and echocardiography. 75Results: There was a statistically significant difference in LDL-Cholesterol, Total Cholesterol and LVH variables between the stroke patients and the healthy control group (p0.05). Conlusion: 1- There was no statistically significant relation between ischemic and hemorrhogic stroke and apo E genotype polimorphism as a risk factor. 2-There was no significant finding to establish a relationship between pathogenesis of all kinds of mortalities after acute stroke and apo E genotype polimorphism. Key Words: Apolipoprotein E; cerebrovascular disease; Apo E genotype; risk factors; mortality. 76 92

GİRİŞ- Kromozom 11' in q kolunun 13. bölgesinde yerleşmiş olan yüksek affiniteli immunglobulin E geni (FceRI-P) allerjik astım ve atopi ile ilişkili bulunmuştur ancak bu bölgede yer alan belli mutasyonlarla astım ilişkisinin bazı çalışmalarda gösterilememiştir. Çalışmamızda FceRI-P geninin atopik Türk astım hastalarındaki FceRI-P gen polimorfizmini araştırmayı amaçladık. YÖNTEM- Çalışmaya Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı'na başvuran 134 ( 67 astım, 67 kontrol) hasta alındı. Tüm hastalara DNA analizleri yapıldı. FceRI-P gen polimorfizmi için tüm hastalarda FceRI-P geninde sekanslama yapıldı. DNA örnekleri polimeraz zincir reaksiyonu (PZR), Artificial Refractory Mutation Detection System (ARMS), Single Strand Confirmation Analysis (SSCP) yöntemleriyle analiz edildi. SONUÇLAR- Çalışmamıza alınan tüm hastalarda ( astım, kontrol) çalışılan FceRI-P genine ait 3 polimorfizm bölgesine ait herhangi bir patoloji saptanmadı. Çalışmaya alınan hastalarda çalışılan I1811/Vall831 ve I183L polimorfizmlerinin olmadığını ve tüm Türk hastalarında wild-tip( doğal tip) bir FceRI-P geninin varlığının olduğu bulundu. TARTIŞMA- Yapılan çalışma ile astım, atopi ve çalışılan gen bölgesi arasında her hangi bir ilişki olmadığı saptandı. Bu gen bölgesine yakın genlerin ve onlara ait mutasyonların incelenmesiyle daha önce saptanan sonuçların desteklenebileceği düşünüldü. Anahtar sözcükler : astım; genetik; FceRI-P geni 61 BACKGROUND-The gene for the Psubunit of the high affinity receptor for immunoglobulin E (FceRI-P) on chromosome llql3 is linked with clinical asthma and certain mutations have been identified in some studies while some other studies are not supporting this linkage. Our aim was to find out whether a Turkish allergic asthmatic population sample has this polymorphism in the FceRI-P gene or not. METHODS-DNA samples from 67 subjects with atopic asthma and 67 subjects without asthma were analysed in Department of Pulmonary Medicine of Marmara University. The complete coding region of the FceRI-P gene were sequenced. DNA samples were studied with polimerase chain reaction (PCR), Artificial Refractory Mutation Detection System (ARMS), Single Strand Confirmation Analysis (SSCP) methods. RESULTS- The three previously reported mutations (Ilel81L/Vall83L and I181L) were not detected in the subjects studied. We found wild type FceRI-P genes in all of our study population CONCLUSIONS-ThesQ results suggest that, in the population studied, linkage of asthma and atopy to 1 lql3 is not shown by mutations in the FceRI-p gene. Other mutations in the non-coding region of this gene or in adjacent genes may be studied in further studies in large populations. Keywords: asthma; genetics; FceRI-P gene 62 85

Akciğer kanseri günümüzde en yüksek mortaliteye sahip kanser tipidir. Küçük hücreli akciğer kanseri (KHAK) ve küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) olmak üzere iki tipi vardır. KHDAK’nin yaklaşık yarısını adenokarsinom alt tipi oluşturmaktadır. Klasik tedavide cerrahi müdahele, kemoterapi ve radyoterapi uygulanırken immünoterapi ve hedefe yönelik tedavi önemini her geçen gün artırmaktadır. Adenokarsinomların yaklaşık yarısında gözlemlenen onkogen mutasyonlarının varlığı hedefe yönelik tedavi ve prognoz tayini açısından önemlidir. Onkogen mutasyonlarının tespiti tümör biyopsisi ile gerçekleştirilmektedir. Tümör biyopsisinin hastaların tümünde uygulanamaması, uzmanlık gerektiren, zaman alıcı ve invaziv bir işlem olması önemli dezavantajlardır. Ayrıca tümör biyopsisi sadece biyopsi alınan bölgeyi yansıtmakta intra ve inter tümör heterojenitesini yansıtamamaktadır. Tedavi sürecinde tümörün takibi açısından tekrarlanma şansı yok denecek kadar azdır. Son yıllarda likit biyopsi olarak tanımlanan, vücut sıvılarına yayılmış tümör serbest DNA’sının (cfDNA) toplanmasıyla tümöre ait onkogenlerin tespit edilebilmesi mümkün olmuştur. Likit biyopsi örneğinin tümör yükünü ve heterojenitesini yansıtması, minimal invaziv olması tüm hastalarda istenilen zaman ve sıklıkta tekrarlanabilmesi önemli avantajlar sağlamaktadır. Gelecekte likit biyopsi ile tümör monitörizasyonunun mümkün olabileceğini, tespiti muhtemel çok sayıdaki moleküler değişikliğin ortaya çıkış sırasının ve interaksiyonlarının tümörün moleküler evrimine ışık tutacağını böylece tedavi başarısının artacağını düşünmekteyiz. Bu projede, birinci basamak tedavi öncesi ve sonrası tespit edilebilen onkogen değişimleri, mutasyon değişimleri, mutasyon yükü değişimleri ve mutasyon birlikteliklerinin tümörün akciğer içi pozisyonu ve yerleşimi, yeni oluşumlarla olan ilişkisi, metastaz ilişkileri, tedavi yanıtıyla karşılaştırarak tedavi ve prognoza katkı sağlayabilecek bilgiler elde etmeyi amaçladık. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Uygulama ve Araştırma Hastanesi Tıbbi Onkoloji Bilimdalı’na başvurmuş ve akciğer adenokarsinomu tanısı almış 52 olgu araştırmaya dahil edilmiştir. Tedavi öncesi ve sonrası örnekleri temin edilen olgulardan EGFR, KRAS, BRAF, NRAS ve PIK3CA onkogenlerinde sık gözlemlenen 123 mutasyon Allel Spesifik PCR (AS-PCR) yöntemiyle araştırılmıştır. Olguların 29’unda tedavi öncesi ve sonrası hiçbir mutasyona rastlanmazken 23’ünde en az bir mutasyon olmak üzere toplam 39 mutasyon tespit edilmiştir. Bir olguda 3 ayrı mutasyon, 4 olguda 2 ayrı mutasyon ve 18 olguda tek mutasyon saptanmıştır. Tedavi öncesi mutasyon tespit edilmeyen 3 olguda tedavi sonrası mutasyon tespit edilirken tedavi öncesi mutasyonu mevcut 5 olguda tedavi sonrası mutasyon tespit edilememiştir. Mutasyon tespit edilen 15 olguda tedavi öncesi ve sonrası mutasyon yükü değişimleri tespit edilmiştir. NRAS mutasyonu bulunan bir olguda tedavi sonrası KRAS mutasyonları tespit edilmiştir. EGFR mutasyonu mevcut olan olgular tedaviye iyi yanıt vermiş tedavi sonrası tümörün gerilemesiyle EGFR mutasyonları tespit edilemeyecek seviyeye düşmüştür. Literatürde nadir gözlemlenen KRAS kodon 59, 117, 146 mutasyonları çalışmamızda %7,5 gibi yüksek bir oranda tespit edilmiştir. Bu mutasyonların çoklu mutasyon birliktelikleri göstermesi tümör merkezlerinin nekroze olması ve özellikle sağ akciğer üst lobda konumlandıkları gözlenmiştir. KRAS kodon 12 mutasyonu içeren olguların KRAS kodon 13 mutasyonu içeren olgulara göre daha iyi tedavi yanıtı sergiledikleri, mutasyon birliktelikleri göstermedikleri ve sağ akciğer üst lob dışında konumlandıkları gözlenmiştir. Primer tümörü merkezi yerleşimli olguların uzak metastaz göstermeyip akciğer içi yayılımla kötü prognoza sebep oldukları tespit edilmiştir. Kemik metastazı gösteren olguların sağ akciğerde yoğunlaştıkları, primer tümörü sağ akciğerde olan olguların sağ sürrenal beze, solda olanların sol sürrenal beze metastaz eğiliminde oldukları gözlemlenmiştir. Bulguların daha fazla olgu içeren çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir., Nowaday, lung cancer has the highest mortality rate among cancer types. There are two types of lung cancer that small cell lung cancer (SCLC), and non-small cell lung cancer (NSCLC). Approximately half of NSCLC is composed of adenocarcinoma subtype. Surgery, chemotherapy and radiotherapy are applied in classical treatment, while the importance of immunotherapy and targeted therapy are increasing day by day. The presence of oncogene mutations observed in about half of adenocarcinomas is important in terms of targeted treatment and prognosis. Oncogenic mutation detection is based on samples of tumor tissue taken by biopsy. Tumor biopsy cannot be performed in all patients and it is a time consuming and invasive procedure that requires expertise. In addition, tumor biopsy reflects only the biopsy site and does not reflect intra and inter tumor heterogeneity. There is little chance of repeat the followup of the tumor during the treatment process. In recent years, it has been possible to detect oncogene mutations by collecting cell-free DNA (cfDNA) called liquid biopsy. Liquid biopsy specimen reflects tumor burden and heterogeneity, is minimally invasive and can be repeated at any time and frequency in all patients. We think that tumor monitoring by liquid biopsy may be possible in the future, and that the sequence and interactions of many possible molecular changes will shed light into the molecular evolution of the tumor, thus improving treatment success. In this thesis, we aimed to obtain information that can contribute to treatment and prognosis by comparing oncogene changes, mutation changes, mutation burden changes, the mutation associated with tumor before and after first-line therapy, relation of tumor with new formations, metastasis relationships, and treatment response. Fifty-two cases with adenocarcinoma of lung admitted to Aydın Adnan Menderes University Practice and Research Hospital Medical Oncology Department were included in the study. 123 mutations observed in EGFR, KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA oncogenes were investigated by Allel Specific PCR (AS-PCR) method. In 29 of the cases, no mutations were detected before and after the treatment, while 39 mutations were detected, of which 23 had at least one mutation. There were 3 different mutations in one case, 2 mutations in 4 cases and one mutation in 18 cases. In 3 cases where no mutation was detected before treatment, post-treatment mutation was detected in 5 cases, whereas in 5 cases there was no post-treatment mutation. In 15 cases with mutation, mutation burden changes were detected before and after treatment. One patient with NRAS mutation had KRAS mutations after treatment. The cases with EGFR mutation responded well to the treatment and the EGFR mutations decreased to an undetectable level after tumor regression. KRAS codon 59, 117, 146 mutations, which are rarely observed in the literature, were detected as high as 7.5% in our study. It was observed that these mutations showed multiple mutation associations, tumor centers were necrosis and they were located especially in the upper lobe of the right lung. It was observed that patients with KRAS codon 12 mutation having better treatment response than patients with KRAS codon 13 mutation, did not show mutation associations, and were located outside the upper lobe of the right lung. It was found that the primary tumor of the central location did not show distant metastasis, and caused a poor prognosis with intra-pulmonary spread. It was observed that the cases with bone metastasis were concentrated in the right lung, the cases with primary tumor in the right lung were tend to metastasize to the right adrenal gland, and the left ones to the left adrenal gland. The findings were supported by studies involving more cases.

Hemoglobinopathies,inherited as autosomal recessive are the most common monogenic disorder. Theyare characterized by mutations in the genes encoding the alpha (α) and beta (β)globin chains of the human hemoglobin (Hb) molecule and are broadly classifiedas abnormal hemoglobin and thalassemia. Several methods are now available fordetection of abnormal hemoglobin and thalassemia mutations. Despite thetechnological advances in mutation detection, hematological and moleculartechniques must be used together to achieve accurate diagnosis in the screeningof mutations. In this review, we have inform the current standard hematologicaltechniques and diagnostic methods as well as more novel molecular techniquesthat have become., Hemoglobinopati, otozomal resesif geçişlimonogenik bozuklukların en sık görülen grubudur. Hemoglobin (Hb) molekülünün alfa (α) ve beta (β) globin zincirlerinikodlayan genlerde mutasyonlar veya delesyonlar ile karakterizedir ve genelolarak anormal hemoglobin ve talasemi olarak sınıflandırılır. Günümüzde,anormal hemoglobin ve talasemi mutasyonların tespiti için çeşitli yöntemlerkullanılmaktadır. Mutasyon tespitindeki teknolojik ilerlemelere rağmen,mutasyonların taranmasında doğru tanıya ulaşabilmek için hematolojik vemoleküler tekniklerin birlikte kullanılması gerekir. Bu derlemede, mevcutstandart hematolojik teknikler ve tanı yöntemleri ile yeni moleküler tekniklerhakkında bilgi verdik.

AMAÇ: Bu çalışmada KML hastalarında TKİ'ne direnç sıklığını, ABL kinaz bölge mutasyonlarının ve BCR-ABL FISH paternlerinin dağılımı ve direnç üzerine etkileri değerlendirildi. Özellikle dirençli KML hastalarında genetik çalışmaların etkisi ve bulguların klinik ve hematolojik parametrelerle korelasyonu çalışıldı. MATERYAL VE METOD: Hastaların karaciğer ve dalak büyüklüğü, hemogram değerleri, LDH ve β2-mikroglobulin düzeyleri ile sitogenetik, FISH BCR-ABL füzyon paternleri, RT-PCR BCR-ABL sonuçları ve TKİ'ne dirençli hastalarda ABL kinaz bölge mutasyonları değerlendirildi. Bilgiler hasta dosyaları ve bölümümüzün arşiv kayıtlarından elde edildi. BULGULAR: 144 erkek, 143 kadın 287 KML hastası mevcuttu. Tanı yaşları ortalaması 52.5±17.3 yıldı. Tüm hastaların excitus oranı %17.2 idi. Verilerine ulaşılabilen 261 hastanın 110 (%42.2)'u dirençliydi. Dirençli hastalar yanıtlı hastalarla kıyaslandığında excitus oranı anlamlı biçimde yüksek (%28.1 vs %9.3), sağkalım süresi anlamlı biçimde düşüktü (139.5 ay vs 206.6). FISH ile BCR-ABL analizleri yapılan 224 hastanın 178 (%79.5)'inde klasik füzyon (KF), 46 (%20.5)'sında ise atipik füzyon (AF) paterni saptandı. AF'lu hastaların ilk tanı yaşları KF'lu hastalarınkinden daha erkendi (48.2 vs 54.3) (p=0,03). KF'lu hastalarla AF'lu hastaların sağkalım süresi (154.3 ay vs 117.4 ay) ve excitus oranları (%17.1 vs %15.9) arasında istatistiksel olarak fark yoktu. Takipli 163 KF'lu hastanın 73 (%44.8)'ü dirençli iken 44 AF'li hastanın 24 (%54.5)'ü dirençli idi. Arada istatistiksel fark bulunmasa da AF'lu hastalarda daha çok direnç gelişmişti. 110 yanıtsız hastanın 7 (%6.3)'si akselere fazda, 16 (%14.5)'sı ise blastik fazda idi. ABL kinaz bölge mutasyon analizi yapılmış olan 93 yanıtsız hastamızın 13 (%14.4)'ünde mutasyon saptandı. (8 T315I, 2 Y253H, 1 E255K, 1 V299L ve 1 F317L). Akselere-blastik fazdaki hastalarla kronik fazdaki hastalar mutasyon oranlarına göre incelendiğinde akselere-blastik fazdaki hastalarda anlamlı biçimde yüksek mutasyon saptandı (%36.8 vs %8.4). Mutasyon saptanan grupta sağkalım süresi bariz şekilde kısa (96.8 ay vs 150.1 ay), excitus oranı ise yüksekti (%38.5 vs %23.4). (p>0.05) Dirençli hastalarda, yanıtlı hastalarla kıyaslandığında dalak daha büyük (181.8 mm vs 153 mm), beyaz küre daha yüksek (153.2x109/L vs 104.3x109/L), hemoglobin (10.7 g/dL vs 11.5 g/dL) ve hematokrit düzeyleri (%32.3 vs %35.4) daha düşük ve β2-mikroglobulin (3,040.1ng/mL vs 2,581.5ng/mL) seviyeleri daha yüksekti (p0.05). KF'lu hastalarla AF'lu hastalar karşılaştırıldığında bakılan parametreler açısından anlamlı bir farklılık saptanmadı. KF'lu dirençli hastalarla AF'lu dirençli hastalar arasında da bu parametreler açısından farklılık saptanmadı. Dirençli hasta grubu içinde ABL kinaz bölge mutasyonu saptananlarla saptanmayanlar karşılaştırıldığında bakılan parametreler açısından arada istatistiksel bir fark saptanmadı. SONUÇ: 261 KML hastasının takibini içeren çalışmamız `Tirozin Kinaz İnhibitörlerine (TKİ) Dirençli Kronik Myeloid Lösemi (KML) Hastalarında BCR-ABL Kinaz Bölge Mutasyonlarının Sıklığı, Dağılımı Ve Prognoza Etkisi` konusundaki Türkiye'deki en geniş çalışmadır. Dirençli hastalardaki ABL kinaz bölge mutasyon oranları (%14.4) literatürle benzerdi. T315I en sık görülen mutasyondu. Çalışmamızda literatürde halen tartışmalı bir konu olan AF ile kötü prognoz ilişkisi araştırılmış olup bir ilişki bulunamamıştır. Ancak yeni çalışmalar ve farklı mutasyon panellerinin geliştirilmesi bu konuda yeni katkılar yapabilir. Klinik ve hematolojik parametrelerin dirençli hastaları tanımlamada yeterince güçlü olduğu gösterildi. Tanı anındaki dalak büyüklüğü, beyaz küre sayısı, hemoglobin düzeyleri ve β2-mikroglobulin düzeyleri TKİ'ne yanıtı tahmin etmekte kullanılabileceğini gösterdik. AIM: In this study, we evaluated the frequency of TKI resistance, the distribution of ABL kinase mutations and the distribution of BCR-ABL FISH patterns and their effects on resistance in CML patients. In particular, the effect of genetic studies in patients with resistant CML and the correlation of findings with clinical and hematological parameters were studied.MATERIAL-METHOD: Cytogenetics, FISH BCR-ABL fusion patterns, RT-PCR BCR-ABL results, and ABL kinase domain mutations in TKI-resistant patients were evaluated in patients with liver and spleen size, hemograms, LDH and β2-microglobulin levels. Data was obtained from patient files and archive records of our department.RESULTS: There were 144 male and 143 female patients diagnosed with CML. Mean age at diagnosis was 52.5±17.3 years. The excitus rate of all patients was 17.2%. Of the 261 patients whose data were available, 110 (42.2 %) were resistant to TKI. Excitus rate was significantly higher (28.1% vs 9.3%) and survival time was significantly lower (139.5 months vs 206.6 months ) when compared to imaitinib- resistant patients with sensitive patients. Of the 224 patients whose data were available, 178 patients (79.5%) have classical fusion (CF) patterns and 46 (20.5%) patiens have atypical fusion (AF) patterns by FISH. Mean age at diagnosis in patients with AF pattern is earlier then in patients with CF (48.2years vs 54.3 years) (p=0,03). There was no statistically significant difference between patients with CF and patients with AF between the survival time (154.3 months vs. 117.4 months) and excitus rates (17.1% vs. 15.9%). While 73 (44.8%) of 163 CF patients were resistant, 24 (54.5%) of 44 AF patients were resistant. Although there was no statistical difference, more resistance developed in patients with AF.Of the 110 resistant patients, 7 (6.3%) were in the accelerated phase and 16 (14.5%) were in the blastic phase. Of the 93 resistant patients with ABL kinase domain mutation analysis, 13 (14.4%) had mutations (8 T315I, 2 Y253H, 1 E255K, 1 V299L and 1 F317L). Significantly higher mutation rates were detected in patients with accelerated-blastic phase compared to patients with chronic phase (36.8% vs. 8.4%). The overall survival was obviously short (96.8 months vs. 150.1 months) and excitus rate was high (38.5% vs 23.4%) in the patients with mutation (p> 0.05).In resistant patients, spleen sizes were larger (181.8 mm vs 153 mm), White Blood Cell Counts (153.2x109/L vs 104.3x109/L) and blood levels of β2-microglobulin (3,040.1 ng/mL vs 2,581.5 ng/mL) were higher and levels of hemoglobin (10.7 g/dL vs 11.5 g/dL) and hematocrit (32.3% vs 35.4%) were lower then in sensitive patients. Remarkably, the platelet counts were lower (430,153 / dL vs 497,983 / dL) and the LDH levels were higher (987.6 U/L vs. 903.8 U/L) in resistant patients as well (p> 0.05).There were no significant differences in terms of the parameters examined (spleen size, hemogram, LDH, β2-microglobulin) when patients with CF and patients with AF were compared as well imatinib resistant patients with CF and imatinib resistant patients with AF were compared. There was no statistically significant difference between the patients with and without ABL kinase mutations in the resistant group in terms of the parameters examined.CONCLUSION: In brief this report which includes 261 follow-up parients signifies the most extended study on `Frequency, Distribution and Impact On Prognosis of BCR-ABL Kinase Domain Mutations In Tyrosine Kinase İnhibitor (TKI) Resistant Chronic Myelogenous Leukemia (CML) Patients` from Turkey. Rate of resistance (14.4%) with regard to ABL kinase domain mutations was similar to that found in the literature. T315I was the most common mutation. Impact of atypical fusion patterns to detection of high risk(resistance) in CML patients which is still a debatable issue in the literature yielded no impact to the relevance situation. Hovewer we believe that new mutation detection panels would change this consensus. Hovewer it was clearly shown that clinical and hematological parametres were strong enough to define resistant CML patient. Finally the study show that the size of spleen, white blood cell count, hemoglobin and β2-microglobulin levels at diagnosis in CML patients can be used to predict the response. 107

Fanconi anemisi (FA), multipl konjenital anomaliler, hematolojik bulgular, kemik iliği yetmezliği ile karakterize, malignite riski yüksek ve özgün sitogenetik bulguları olan nadir genetik bir hastalıktır. Moleküler patogenezi, Fanconi anemisi/meme kanseri (FA/BRCA) yolağında, DNA tamir mekanizmasının işlevinde rol alan genlerden herhangi birinde, biallelik mutasyonlarla ilişkilendirilmektedir. Günümüzde bu yolakta FA ilişkili 17 gen tanımlanmıştır. Yapılan incelemeler, FA genlerindeki mutasyonların etnik farklılıkların da olduğu heterojen bir dağılımda olduğunu göstermektedir. Klinik heterojenite tanı ve tedavide multidisipliner bir yaklaşımı gerektirmektedir. FA'nın sitogenetik tanısında, hücre kültüründe çapraz bağ yapıcı ajanların varlığında kromozom bulgularının incelenmesi gerekmektedir. Moleküler tanısında ise FA altgruplarını oluşturan, en az 15 genin incelenmesi önerilmektedir. Genel olarak dünyadaki sıklığının yaklaşık 1/350.000 olduğu tahmin edilmektedir. FA'nın geniş klinik spektrumu, çok sayıda gende mutasyonlarının dağınık yerleşimli saptanması ve `hotspot` gen bölgelerin olmaması moleküler tanıyı zorlaştırmaktadır. Bu çalışmada, FA klinik tanısı alan 11 olgu, FA ilişkili 17 genin kodlayan ve diğer ilişkili bölgelerini kapsayan, ekibimizce tasarlanmış Yeni Nesil Dizileme (YND) hedef gen paneli ile Ion Torrent platformunda incelendi. On bir ailenin üçünde 2 farklı gende (FANCA, BRIP1) dört farklı mutasyon saptandı. Bu mutasyonların üçü daha önce tanımlanmış, biri tanımlanmamış (BRIP1, NM_032043.2, c.761_764delAGCA) idi. Çalışmamızın mutasyon saptama oranı tüm aileler değerlendirildiğinde %27,27, sadece kromozom kırık testi pozitif gözlenen aileler değerlendirildiğinde ise %75 oldu. Saptanan değişimler ve panelimizin kapsamadığı bölgeler Sanger dizileme yöntemi ile araştırıldı. FA'lı olgularda, ilişkili 17 genin ülkemizdeki mutasyon sıklıklarının belirlenmesi, genetik danışmaya yararlı bilgiler edinilmesi, genotip-fenotip çalışmalarına katkı sağlanması, hastaların klinik takip ve prognozunda hasta yararına bilgiler edinilmesi beklenmektedir. Fanconi anemia (FA) is a rare syndrome characterized by bone marrow failure, malformations, cancer predisposition and specific cytogenetic findings, mostly associated with bi-allelic mutations in any of the genes involved in DNA repair mechanisms of the Fanconi anemia/breast cancer (FA/BRCA) pathway, where presently 17 genes are identified. The diagnosis and treatment of clinical heterogeneity requires a multidisciplinary approach. For cytogenetic diagnosis of FA, cell cultures must be examined for chromosomal findings with DNA crosslink agents. For molecular diagnosis, at least 15 genes must be examined. General prevalence in the world is roughly 1/350,000. Due to its high clinical heterogeneity, scattered distribution of mutations along the genes, and the absence of hot spots, complicates its genetic diagnosis. In this study, we investigated the probands with the clinical diagnosis of FA by in-house-designed next generation sequencing (NGS) targeted gene panel, for use in Ion Torrent platform. The panel designed covers all the coding sequences of 17 FA associated genes. Four different mutations in two genes (FANCA, BRIP1) are detected, in three out of 11 families. One of these mutations was novel (BRIP1, NM_032043.2, c.761_764delAGCA). Mutation detection rate, for total number of cases, was 27,27%, furthermore if only cases with positive chromosome breakage test are included, then the rate increased up to 75%. Mutations were confirmed and targeted regions not covered by the panel were screened with Sanger sequencing. Molecular genetic diagnosis of FA will benefit patients and their families through early diagnosis, genetic counseling, precursory treatment and, ideally, prenatal diagnosis. 121

İşitme kayıplı bir bireyin standart bir izlem ve bakım alabilmesi için, moleküler etiyolojinin ileri genetik analizlerle belirlenmesi önemlidir. Bu çalışmada, aile ağacı bulguları ile otozomal resesif kalıtım gösterdiği düşünülen, koklear implantlı Türk olgularda otozomal resesif nonsendromik işitme kaybının genetik etiyolojisi araştırılmıştır. GJB2 genindeki mutasyonların öncelikle tarandığı çalışma dizaynında olgular mendelian ekzom dizi analizi olarak da isimlendirdiğimiz, 2761 geni kapsayan hedeflenmiş yeni nesil dizi analizi paneli (Illumına TruSightTM Exome) ile analiz edilmiştir. Bu panel 102 işitme kaybı geni ve çok sayıda Mendelian hastalıktan sorumlu genleri içermektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, 29 ailenin 21'inde klinik tablodan sorumlu genetik sebebi belirledik. Yedi ailede 3 farklı GJB2 varyantı saptandı. Kalan 14 ailede diğer bilinen nonsendromik işitme kaybı genlerinde (CDH23, DFNB31, GPSM2, LOXHD1, MARVELD2, MYO7A, MYO15A, TMC1, TMIE, USH1G) 15 farklı variant saptandı. Bu varyantların 8 tanesi daha önce tanımlanmamıştı. Bizim çalışma dizaynımızla mutasyon belirleme oranımız %72.4 olarak tespit edildi. Bu sonuç nonsendromik işitme kaybında hedeflenmiş dizi analizinin kullanışlı bir yöntem olduğunu göstermektedir., Genetic testing is an important step in the standart care of individuals with hearing loss, In this study, the genetic etiology of autosomal recessive nonsyndromic hearing loss (ARNSHL) in Turkish patients with cochlear implant who had a pedigree suggestive of an autosomal recessive inheritance has been investigated. As a workflow, , a targeted next generation sequencing panel (Illumına TruSightTM Exome) that we briefly called mendelian exome sequencing was performed in nonsyndromic hearing loss patients who were screened for GJB2 previously. In this panel, 2761 genes including 102 deafness genes and a number of genes causing Mendelian disorders were covered. Using this method, causative variants in 21 of 29 families were identified. In seven families, 3 different GJB2 variants were found. Remaining 14 families had 15 different variants in other known NSHL genes (CDH23, DFNB31, GPSM2, LOXHD1, MARVELD2, MYO7A, MYO15A, TMC1, TMIE, USH1G). Eight of these variants are novel. Confirming the usefulness of targeted sequencing approach in NSHL, 72.4 of mutation detection rate was described.

Amaç: GNAI2 geninin 193 numaralı kodonunda bir hipofiz tümöründe ilk kez saptanmış olan bir mutasyonun polimorfizm olma olasılığının incelenmesi. Hastalar ve Yöntem: Kandan elde edilen DNA’lar GNAI2 geninin beşinci ve altıncı eksonları ile aralarındaki intron bölgesini içerecek şekilde Polimeraz Zincir Tepkimesi PZT ile çoğaltıldı. PZT ürünleri Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi SSCP yöntemiyle mutasyon belirleme MDE ve poliakrilamit jellerinde incelendi. Seçilen bazı örneklerin otomatik DNA analizi gerçekleştirildi. Bulgular: SSCP analizinde farklı örnekçe belirlenen iki örneğin otomatik DNA dizi analizlerinde, 193 numaralı kodonda mutasyon olmadığı ancak GNAI2 geninin beşinci ve altincı eksonları arasındaki intron bölgesinde bir C/T C20151 değişikliğinin olduğu saptandı. Sonuç: Bulgularımız GNAI2 geninin 193 numaralı kodonunda daha önce belirlenen değişikliğin polimorfizm olma olasılığını desteklememektedir., Objective: To investigate whether a variation in codon 193 of the GNAI2 gene previously determined in a recurrent somatotroph adenoma is a polymorphism. Patients and Methods: Genomic DNA extracted from blood was amplified for the fifth and sixth exons and the intervening sequence of the GNAI2 gene with Polymerase Chain Reaction PCR . PCR products were analyzed with Single Strand Conformation Polymorphism SSCP on Mutation Detection Enhancement MDE and polyacrylamide gels. Selected samples were subjected to direct sequencing. Results: In total, two samples exhibited abnormal banding patterns in SSCP analysis. DNA sequencing of the PCR products revealed no mutations in codon 193. On the other hand, these samples exhibited a C/T C20151 variation in the intervening sequence between exons 5 and 6 of the GNAI2 gene. Conclusions: Our results do not support the possibility of a polymorphism in codon 193 of the GNAI2 gene.

Hayatın erken evrelerinde başlayarak orta yaş ve sonrasında koroner arter hastalığı (KAH) ile sonuçlanan ateroskleroz, birçok nedene bağlı bir hastalıktır. Endotel disfonksiyonu, aterosklerozun yapısal değişikliklerinden önce oluşur ve gelecekteki kardiovasküler olayları öngörmeye yardım eden bağımsız bir faktördür. Endotel disfonksiyonuna neden olan çeşitli mekanizmaların içinde en belirgin olanı nitrik oksit azalmasıdır. Bu durumun nedeni nitrik oksidin biyolojik aktivitesinin veya eNOS enzim aktivitesinin azalmasıdır. Azalmış nitrik oksit salınımının ateroskleroz gelişimi üzerindeki etkisinin belirlenmesiyle eNOS enzimini kodlayan gende çeşitli mutasyonlar saptanmıştır. Bu mutasyonların bozulmuş nitrik oksit salınımına, sonuç olarak da koroner arter hastalığına neden olabileceği bildirilmiştir. Çalışmamızda, KAH'lığında eNOS T786C ve eNOS G894T polimorfizmlerinin olası rolünün belirlenmesi amaçlandı.Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Kardiyoloji AD'ında koroner anjiyografi uygulanan 175 birey çalışmaya dahil edildi. Koroner arterlerinde herhangi birinde %70 ve fazlası darlığı olan 89 birey koroner arter hastası (hasta grubu), herhangi bir darlık ya da lezyon tespit edilmeyen 86 birey kontrol grubu olarak çalışmaya dahil edildi.Kontrol ve KAH grubunda nitrik oksit düzeyi ELISA (Organo Teknika, Avusturya), lipid profili ve açlık kan şekeri düzeyi Cobas Integra 800 otoanalizör (Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Almanya) ile belirlendi. Kontrol ve KAH grubuna ait genomik DNA'lar tam kandan izole edildi. eNOS T786C ve eNOS G894T polimorfizmleri, mutasyon belirleme kitleri kullanılarak gerçek-zamanlı PZR cihazı (LightCycler480 II, Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Almanya) ile saptandı.Nitrik oksit düzeyinde kontrol ve hasta grubu arasında anlamlı bir farklılık saptanmadı (p=0,246). eNOS T786C polimorfizminin, KAH grubunda TT, TC ve CC genotipi sıklığı sırasıyla %42.7, 41.6 ve 15.7, kontrol grubunda ise %62.8, 29.1 ve 8.1 olarak saptandı. TT genotipiyle karşılaştırıldığında, TC genotipine sahip olanların 2.100 kat (p=0,026), CC genotipine sahip olanların ise 2,842 kat (p=0,040), ayrıca C alleline sahip olanların, T alleline sahip olanlara göre 1,964 kat (p=0,005) daha fazla KAH oluşturma riskine sahip olduğu belirlendi. eNOS G894T polimorfizminde, kontrol grubu ve KAH grubu arasında anlamlı bir fark bulunmadı (p>0,05).Sonuç olarak, eNOS T786C varyantlarının KAH için risk faktörü olarak değerlendirilebileceği düşünüldü. Atherosclerosis is a disease develops due to many reasons begins in the early stages of life and after middle age, results in coronary artery disease. Endothelial dysfunction is an independent factor that helps to predict the future cardiovascular events and occurs before the structural changes of atherosclerosis. The most prominent of the various mechanisms that cause endothelial dysfunction is reduction of nitric oxide. The reason for this situation is the reduction in biological activity of nitric oxide or the reduction in eNOS enzyme activity. With the determination of the effect of decreased release of nitric oxide on the development of atherosclerosis, various mutations was detected in the gene encoding the enzyme eNOS. It has been reported these mutations may lead impaired the release of nitric oxide and eventually to coronary artery disease.In our study, we aimed to determine the possible role of eNOS polymorphisms T786C and G894T in coronary artery disease.175 individuals who underwent coronary angiography in Mersin University Medical Faculty Department of Cardiology were included. 89 individuals with 70% or more stenosis in any coronary arteries were grouped as coronary artery disease group and 86 person with not detected any stenosis or lesion is classified as a control.Fasting blood sugar, lipid profiles were determined by enzymatic colorimetric method (Cobas Integra 800 otoanalizör, Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Almanya) and nitric oxide levels detected by ELISA (Organo Teknika, Avusturya) in control and CAD group. Genomic DNA was isolated from whole blood in control and CAD groups. eNOS T786C and G894T polymorphisms of eNOS, were determined by real-time PCR (LightCycler480 II, Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Almanya) with mutation detection kits.Nitric oxide level was not significantly different between patients and control group (p=0.246). In T786C polymorphism of eNOS, TT, TC and CC genotype frequencies are 42.7%, 41.6 and 15, respectively, in CAD group and 62.8%, 29.1 and 8.1, respectively in the control group. Compared with the TT genotype, those with TC genotype has 2100-fold (p = 0.026), and those with the CC genotype has 2.842-fold (p=0.040) and C allel has 1,964-fold (p=0,005) were determined to have greater risk of developing CAD. eNOS G894T polymorphism, showed no significant difference between CAD group and control group.In conclusion, the eNOS G894T genotypes were not associated with CAD and the eNOS T786C variants was be evaluated as a risk factor for CAD. 107

Genel popülasyonda yaygın olarak görülen koroner arter hastalığı koroner arter lümeninin bir ateromatöz plak ile daralması ya da tıkanması sonucu gelişir. Koroner kollateral dolaşım ciddi koroner darlık sonucu gelişen hipoksi durumlarında ise miyokarda kan sağlayan alternatif bir yoldur. Gelişmiş bir koroner kollateral dolaşım myokardı iskemik hasarlardan koruyarak koroner arter hastalığının prognozunu etkileyebilir. Ancak kollateral formasyonunu etkileyen mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır. Bu çalışmada koroner arter hastalığında serum hipoksi ile indüklenebilir faktör-1 (HIF-1?), eritropoetin (EPO), vaskuler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) düzeyleri ile bu moleküllerin gen polimorfizmlerinin anjiyogenezle ilişkisinin araştırılması amaçlanmıştır.Çalışmamıza Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Kardiyoloji kliniğinde koroner anjiyografi uygulanan 146 birey alınmıştır. Koroner arterlerin herhangi birinde %70 ve fazlası darlığı olan 83 birey koroner arter hastası, herhangi bir darlık ya da lezyon tespit edilmeyen 63 kişi kontrol olarak gruplandırılmıştır. Serum HIF-1?, EPO ve VEGF düzeyleri ELISA, açlık kan şekerleri, lipid profilleri enzimatik kolorimetrik yöntem ile belirlenmiştir. Kontrol ve hasta grubunun genomik DNA'ları tam kandan izole edildi. HIF-1? P582S C/T, EPO rs1617640, VEGF-2578C/A ve VEGF -1154G/A polimorfizmleri gerçek-zamanlı PCR ile saptandı. Tüm istatistiksel analizlerde SPSS 11.5 paket programı kullanıldı.Hasta ve kontrol grubu arasındaki kardiyovasküler risk faktörleri olan yaş ve cinsiyet açısından anlamlı bir fark bulundu. Hasta grubunda yaş ortalamasının ve erkek birey sayısının kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu bulundu. Ancak DM, HT, aile öyküsü, sigara kullanımı ve hiperlipidemi bakımından gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı. Serum HIF-1 ve EPO düzeyleri hasta grubunda anlamlı derecede farklılık gösterirken (p0,05).Sonuç olarak, incelemesi yapılan bu proteinler KAH olan olgularda etkilenmektedir. Bu proteinlerin düzeyleri moleküler mekanizmalardan etkilenmekle birlikte, oluşan doku hasarının ortaya çıkardığı diğer mediyatörlerin de etkisi altında olabilir. Konunun tam olarak aydınlatılabilmesi için ilgili genlerin bilinen polimorfik yapılarının, bu polimorfik yapıya sahip olmayan ancak protein düzeyi belirgin yüksek ya da düşük olan olguların gen dizi analizlerinin, olguların gen ekspresyonlarının belirlenmesi ve hasar yeri lokal kan örneklerinde protein düzeylerinin saptanmasını kapsayan geniş çaplı bir araştırma çalışmasının planlanması yararlı olacaktır. Coronary artery disease (CAD) which is widely seen in the general population occurs as a result of narrowing or obstruction of coronary artery lumen with an atheromatous plaque. Coronary collateral circulation is an alternative pathway that supplies circulation for myocardial in the case of hypoxia caused by severe coronary stenosis. A devoloped coronary collateral circulation may prevent myocardial from ischemic damages and then can effect prognosis of coronary artery disease. But mechanisms which effect coronary colleteral formation have been not exactly understood. We aimed to determine the possible role of serum levels of Hypoxia-inducible factor 1 ? (HIF-1?), erythropoietin (EPO), Vascular endothelial growth factor (VEGF) and their gene polymorphism in patients with CAD and with angiogenesis in this study.In this study, 146 subjects underwent coronary angiography by Mersin University Medical Faculty Cardiology Department were included. 83 subjects selected who has ?70% stenosis in any of the major coronary arteries as CAD and 63 subjects who have no stenosis or lesion as control were classified. Serum HIF-1 ?, EPO and VEGF levels have been measured by ELISA and fasting blood glucose, lipid profile by enzymatic colorimetric methods. Genomic DNA of control and CAD groups was extracted from whole blood. HIF-1? P582S C/T, EPO rs1617640, VEGF-2578 C/A and VEGF -1154 G/A gene polymorphism was detected by using mutation detection kit with real-time PCR. All statistical calculations were performed using the SPSS software package version 11.5.Cardiovascular risk factors which have age and gender were found a different significantly between patient and control groups. The mean age and number of men individuals were found significantly higher in the patient group compared with control. But DM, HT, family history, smoking and hyperlipidemia were found no statistically significant difference between the groups. Serum HIF-1 and EPO levels were found significantly higher in CAD group compared with control group (p

Retinitis pigmentosa (RP) ve Leber'in konjenital amorozisi (LCA) oldukça yüksek klinik ve genetik çeşitlilik gösteren kalıtsal retina dejenerasyonları arasındadır. Bu çalışmada, yüksek veri analizine imkan veren ve genomboyu genotiplendirme için etkin bir metot olan Affymetrix 250K SNP mikrodizin (mikroarray) yöntemi kullanılarak arRP ve LCA tanısı konulan on Türk ailede yer alan toplam elli yedi bireye ait genomik DNA genotiplendirilerek, hastalıktan sorumlu lokus ve genler başarılı şekilde tanımlanmıştır. Genotiplendirme verileri değerlendirilerek homozigotluk haritalaması yapılmış, haritalama sonuçları değerlendirildiğinde arRP ve LCA'lı hasta bireylerin RDH12, CERKL, CRB1, AIPL1, USH2A ve EYS genleri ile bağlantı gösterdiği bulunmuştur. RDH12, CERKL, CRB1 ve AIPL1 genlerinin tüm ekzonları, direkt DNA dizi analizi ile mutasyonlar açısından taranmıştır. Mutasyon taramaları sonucunda AIPL1 geninde Q141X, CRB1 geninde 701dupACAGG(fs)?710X, CERKL geninde IVS1+5G>C olmak üzere üç yeni mutasyon ve RDH12 geninde ise daha önce tanımlanmış T49M mutasyonu saptanmıştır. RDH12, CERKL, CRB1 ve AIPL1 genlerindeki mutasyonlar farklı toplumlarda tüm arRP ve LCA mutasyonlarının %1-5' inden sorumlu bulunmuştur.Mutasyon olasılığının düşük olmasından dolayı bu genler mutasyon tarama çalışmaları için seçilecek ilk aday genler arasında değildir. Bu nedenle hastalığa neden olan mutasyonların saptanmasında tek tek bu genlerin incelenmesi yerine, tüm genomun taranmasına ihtiyaç vardır. Bu yaklaşım, küçük ailelerde ve tek hasta bireylerde bile kalıtsal göz hastalıklarından sorumlu genlerin ve patojenik mutasyonların tanımlanması için oldukça etkindir. Inherited retinal degenerations, including retinitis pigmentosa (RP) and Leber congenital amaurosis (LCA), show high clinical and genetic heterogenity. In this study, whole genome genotyping by high-throughput Affymetrix 250K SNP microarray was successfully performed in genomic DNA samples of fifty seven individuals from ten Turkish families with LCA and arRP. Homozygosity mapping analysis was performed and it revealed linkage to RDH12, CERKL, CRB1, AIPL1, USH2A and EYS genes in patients affected with arRP and LCA. With the use of direct DNA sequence analysis, all exons of RDH12, CERKL, CRB1 and AIPL1 genes were screened for disease causing mutations. The mutation screening in these genes revealed the presence of three novel mutations: Q141X in AIPL1 gene, 701dupACAGG(fs)?710X in CRB1 gene, IVS1+5G>C in CERKL gene, one previously reported mutation T49M in RDH12 gene.Mutation frequency survey of different populations for RDH12, CERKL, CRB1 and AIPL1 mutations showed that they account for 1-5 % of all LCA and arRP associated gene mutations. For this reason, these genes are not top candidates for mutation screening studies due to the low probability of mutation detection. Instead of screening these genes for mutations one at a time, there needs to be a preliminary screening of the whole genome in order to find the genes most likely responsible for the mutations. This approach is useful even in small families and index cases in identification of genes and disease causing pathogenic mutations for these hereditary eye diseases. 149

Hiperlipidemi, plazma lipoprotein konsantrasyonlarının, etnik kökene, yaşa ve cinsiyete göre belirlenmiş sınır değerlerin üzerine çıkmasıyla karakterize tablodur. Lipoproteinlerin bir veya daha fazla grubunun üretiminde veya dolaşıma salınımında artış, plazmadan uzaklaştırılmasında azalma veya her iki mekanizma sonucu oluşabilmektedir. Hiperlipidemiler temel olarak genetik bir defekte bağlı olarak gelişen primer hiperlipidemiler veya altta yatan komplike bir duruma ikincil olarak gelişen sekonder hiperlipidemiler olarak sınıflandırılır. Günümüzde hiperlipidemiler için bir çok sınıflandırma sistemi mevcuttur. Lipoproteinleri elektroforetik mobilitelerine göre sınıflandıran Frederickson sınıflandırması bunlardan biridir.Hiperlipidemiler özellikle neden oldukları koroner arter hastalıkları nedeniyle dünya genelinde mortalite ve morbiditenin önde gelen sebebi haline gelmiştir. Ayrıca koroner arter hastalıklarına zemin hazırlayan morfolojik değişikliklerin erken çocukluk döneminde başladığı bilinmektedir. Bu nedenle hiperlipidemili çocuk hastaların erken tespit ve tedavileri toplum sağlığı açısından büyük öneme sahiptir. Koroner arter hastalıkları açısından en yüksek riski kolesterol yüksekliği ile giden hiperlipidemi tipleri oluşturmaktadır. Ailevi hiperkolesterolemi, LDLR genindeki defektler sonucu bozulmuş kolesterol yıkımı ve hiperkolesterolemi ile karakterize otozomal dominant bir hastalıktır. Kesin tanısı mutasyon analizi ile konulsa da, rutin mutasyon analizinin pratik olmaması nedeniyle bazı tanısal kriterler geliştirilmiştir. Bunlarda birisi de Simone Broome tanısal kriterleridir.Çalışmamızda, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Metabolizma ve Beslenme ünitesinde izlenmiş olan primer hiperlipidemili hastalarının dosyaları değerlendirilmiştir. Değerlendirme sonrası tüm hastalar Frederickson sınıflandırma sistemine göre tekrar sınıflandırılmış, buna göre hiperlipoproteinemi tip IIa grubuna giren hastalar ailevi hiperkolesterolemi tanısı açısından Simone-Broome kriterleriyle değerlendirilmiştir. Çalışmanın son aşamasında tip IIa hasta grubunda mutasyonların en sık görüldüğü 2 ekzonda DHPLC ve DNA dizi analiz yöntemleri kullanılarak mutasyon analizi yapılmıştır.Bu çalışmada, bölümümüzde takip edilen primer hiperlipidemi hastalarının genel özelliklerinin belirlenmesi, dosya tanıları ve gözden geçirme sonrası tanı değişikliklerinin ortaya konulması, ailevi hiperkolesterolemi hastalarının Simone Broome sınıflandırma kriterleri temel alınarak belirlenmesi, sonuçların mutasyon analizleri ile birlikte değerlendirilmesi ve sonuç olarak hiperlipidemi hastalarının tanı, tedavi ve takibinde kullanılabilecek bir kılavuzun hazırlanması amaçlanmıştır.163 primer hiperlipidemi hastasının değerlendirildiği çalışmada, hastalarımızın genel profili belirlenmiş, tanı, takip, sınıflandırma ve arşivleme sürecindeki eksiklikler ortaya konulmuştur. Özellikle sekonder etiyolojiye yönelik yapılan tetkik, aile hikayesi sorgusuyla ilgili eksiklikler ve çalışma sürecindeki tanı değişiklikleri dikkat çekici bulunmuştur. 84 tip IIa hastasına ait DNA materyaline uygulanan DHPLC metodu sonrası 20 hastaya DNA dizi analiz yapılmış, 4 hastada 2 farklı mutasyon, 17 hastada 6 farklı polimorfizm gösterilmiştir.Hafif hiperkolesterolemisi olan 2 hastada homozigot mutasyon saptanması fenotip genotip ilişkisi üzerine etkili faktörlerin varlığını ve önemini göstermiştir. Mutasyon çalışması yapılmış tüm hastalar Simone Broome kriterleri ile değerlendirildiğinde, kriterleri karşılayan hastalardaki mutasyon saptama oranının %84 olduğu görülmüştür. Dolayısıyla bu kriterlerin, rutin mutasyon taramasının mümkün olmadığı veya kısıtlı imkanlarla mutasyon taraması yapılacak şartlarda vakaların tespit ve tanımlanmasında kullanımının uygun olacağı ancak hastalığı ekarte etmeyeceği sonucuna varılmıştır. Hyperlipidemia is characterized by elevated plasma lipoprotein concentrations over the limits determined by age, gender and ethnic origin. The mechanism mayeither be increased production of one or more groups of lipoproteins or their decreased clearence or both. Hyperlipidemias are classified as primary hyperlipidemias due to an underlying genetic defect and secondary hyperlipidemias resulting from other medical conditions. There are many classification systems used in practice and Frederickson classification is one of them, which classifies lipoproteins according to their electrophoretic mobilities.Hyperlipidemias, being an important risk factor for coronary artery disease, is one of the leading causes of mortality and morbidity all around the world. As morphological changes causing coronary artery diseases begin in childhood, early diagnose and treatment is very important for public health point of view. Among hyperlipidemias, hypercholesterolemia has the maximum risk for coronary artery disease development. Familial hypercholesterolemia is an autosomal dominant disease characterised with defective cholesterol removal from circulation caused by mutations in LDLR gene. Definite diagnosis is possible with mutation analysis, but genetic tests are not routinely available, some diagnostic criterias are developed, one of which is Simone Broome diagnostic criterias.In our study we evaluated patient files diagnosed as primary hyperlipidemia at Pediatric Metabolism and Nutrition unit, Hacettepe University Faculty of Medicine. After first evaluation period, all primary hyperlipidemia patients were classified according to Frederickson classification again and those who were classified as hyperlipoproteinemia type IIa are evaluated according to Simone Broome criteria to diagnose familial hypercholesterolemia. Finally, in type IIa patient group we analysed mutations by DHPLC and DNA sequence analysis methods on two exons that mutations are mostly encountered.In this study we aimed to review clinical characteristics of our primary hyperlipidemia patients, to show their changes of diagnosis before and after reevaluation, to determine familial hypercholesterolemia patients based upon Simone Broome criteria and to evaluate this data with mutation analyses results of those patients. As a result we aimed to prepare a guideline to diagnose, treat and follow-up those patients.In our study 163 primary hyperlipidemia patients were evaluated retrospectively to determine the overall distribution of spesific lipoprotein disorders, whilst the shortcomings in the course of diagnosis, follow-up, classification and archiving were presented. Especially lack of family histories information ,etiological work-ups for secondary hyperlipidemias and changes in the specific diagnosis were remarkable in the follow-up . Amplified DNA materials of 84 typeIIa hyperlipidemia patients were analysed with DHPLC method and subsequently DNA sequencing was carried out for the 20 patients with possible mutated DNAs. Two novel mutations in 4 patients and 6 novel polymorphisims in 17 patients were detected. Two patients with mild hypercholesterolemia were found to carry a homozygous mutation which suggests other factors influencing the genotype-phenotype relationship. When all mutation analysis carried out patients were re-evaluated according to Simone Broome criterias, mutation detection rate would be 84% amongst the patients fulfilling the criterias. We have come to the conclusion that, these criterias are very useful for defining and determining patients when mutation analysis is not routinely possible or only could be done in a limited setting. 131

Özellikle gelişmiş ülkelerin önemli sağlık sorunlarından biri olan kolorektal kanserler, genetik ve çevresel faktörlerin katkılarıyla gelişen multifaktöriyel bir hastalıktır. Bu vaka kontrol çalışmasında kolorektal karsinoma ile CYP2C2 alt gurubunun bir üyesi olan endojen ve eksojen maddelerin karsinojenlerin ve ilaçların metabolizmasında önemli rol alan CYP2C9 ve CYP2C19 gen polimorfizmini ve aynı zamanda sigara, alkol, ailede kanser hikayesi, asbestoz maruziyeti gibi risk faktörlerini araştırdık. Çalışmaya ailesinde kanser hikayesi olmayan 85 sağlıklı gönüllü ile Meram Tıp Fakültesi Tıbbi Onkoloji ve Genel Cerrahi kliniklerine başvuran klinik ve histopatolojik olarak çoğunluğu adenokarsinom olan kolorektal kanserli 85 hasta alındı. CYP2C9 ve CYP2C19 genlerinin heterozigot ve mutant genotiplerini belirlemek için CYP2C9*2, CYP2C9*3 ve CYP2C19*2, CYP2C19*3 mutasyon saptama kitleri Light Cycler Real Time Polymerase Chain Reaction ile kullanıldı. Sonuçlar vaka ve kontrol guruplarında istatistiksel olarak karşılaştırıldı ve hesaplanan odds oranları kullanıldı. Kolorektal karsinomdaki risk faktörleri ve CYP2C9*2, CYP2C9*3 ve CYP2C19*2, CYP2C19*3 genlerinin polimorfik genotip sıklıklarının araştırıldığı bu vaka kontrol çalışmasında; kolorektal kanserli hastalar ve kontrol gurubu arasında anlamlı fark saptanamadı. (p 0.05). Kolorektal kanserli hastalarda beyaz toprağa maruz kalanların oranı anlamlı oranda (p 0.05) yüksek bulundu ve beyaz toprağın kolorektal kanser için bir risk faktörü olabileceği düşünüldü., Colorectal cancers are important health problems particularly in developed countries, are multifactorial diseases developing by the effects of both genetic and environmental factors. In this case-control study, we evaluated the relationship between colorectal carcinoma and gene polymorphizms of CYP2C9 and CYP2C19 which are the members of CYP2C subfamily playing important roles in the metabolism of endogenous and exogenous compounds, and also assessed other possible relations with carcinogens and drugs as well as many other risk factors such as smoking, alcohol, family history of cancer and asbestos exposure. Eighty-five patients histopathologically diagnosed with colorectal carcinoma admitted to Departments of Medical Oncology and Surgery at Meram Medical Faculty and eighty-five healhty volunteers, who have no family history of cancer, were included in this study. Heterozygote and mutant genotypes of CYP2C9 and CYP2C19 genes were determined by CYP2C9*2, CYP2C9*3 and CYP2C19*2, CYP2C19*3 Mutation Detection Kits by Light Cycler Real Time Polymerase Chain Reaction. Results were statistically compared in these case-control subjects and odds ratios were used. There were no significant differences between patients with colorectal carcinoma and control groups. However, asbestos exposure ratio in patients with colorectal carcinoma was significantly higher (p < 0.05) than control subjects. Therefore, asbestos exposure may be considered as a risk factor for colorectal carcinoma.

Tromboz kanın damarlar içerisinde patolojik bir şekilde pıhtılaşması durumudur. Dünyada ve Türk toplumunda hastalık ve ölümlere neden olduğu bilinmektedir. Tromboz, kan akımındaki değişiklikler, damar duvar değişiklikleri, pıhtılaşma faktörleri ve bunların inhibitörlerinin kan düzeylerindeki değişiklikleri sonucu ortaya çıkmaktadır. Son yıllarda yapılan araştırmalar tedavi stratejilerinin geliştirilmesi, tromboz patogenezinin önlenmesi ve tanımlanması üzerinde yoğunlaştığından, bu çalışmalarda genellikle moleküler biyoloji ve genetik temeline dayanan teknikler kullanılmaktadır.Tromboz patogenezi, multifaktöriyel olup çok sayıda kalıtsal ve edinsel faktörün değişik mekanizmalarla rol oynadığı karmaşık bir süreç ile meydana gelmektedir. Tromboz ile ilgili çalışmalar bugüne kadar antitrombin III, protein C ve S, faktör V, protrombin, metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) gen bölgeleri ve bu gen bölgelerindeki spesifik mutasyonlara odaklanmıştır. Bununla birlikte faktör yükseklikleri ile ilgili olarak yapılan araştırmaların birçoğu fizyolojik çalışmalardan oluşmaktadır. Bu çalışmalar, faktör VIII düzeyi yüksekliğinin tromboz ile ilişkili olduğunu ortaya çıkarmıştır. Ayrıca yüksek faktör VIII düzeylerinin kalıtılsal olduğuda birçok olguda belirtilmektedir.Bu tez çalışmasında, çalışma grubu venöz tromboz teşhisi konulmuş 20 birey ile 20 sağlıklı kontrol bireyden oluşturuldu. Tüm bireylerin faktör VIII geni promotor bölgesi ve 26 ekson bölgesi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılıp, SSCA yöntemi ile bilinmeyen bir mutasyon ya da polimofizim taraması yapıldı.Yaptığımız analizler sonucunda faktör VIII geni promotor bölgesinde venöz tromboz hastaları ve sağlıklı kontrol grubu bireyleri açısından, PCR sonrası yapılan SSCA poliakrilamit jel görüntülerinde herhangi bir patern farklılığına rastlamadık. Faktör VIII geninde, APC kesim yerlerinin bulunduğu ekson 8/9 ve ekson 11 bölgelerinin venöz tromboz hastaları ve sağlıklı kontrol grubu bireyleri için, herhangi bir patern farklılığına rastlamadık. APC bağlanma bölgesi olan ekson 19'da bir venöz tromboz hastasında farklı patern belirlendi. Dizileme analiz sonucunda bunun bir mutasyon ya da polimorfizm olmadığı saptandı.Faktör VIII geninin ekson 6, ekson 13, ekson 14F ve ekson 25 bölgelerinde ise farklı paternler belirlendi. Farklı patern veren bireylerin dizileme analizi sonuçlarına göre ekson 6 ve ekson 13'te herhangi bir mutasyon ya da polimorfizm olmadığı saptandı. Ekson 14F ve ekson 25 bölgelerine ait dizileme sonuçlarında 3 bireye ait belirli bölgelerde baz değişimleri olduğu tespit edildi. 14F bölgesinde saptanan baz değişimlerinden birinin gen ürününün amino asit dizisini değiştirdiği belirlenirken, diğer 2 baz değişikliğinin amino asit dizisine etki etmediği saptandı.Sonuç olarak, faktör VIII geni promotor bölgesi ve 26 ekson bölgesinde yapılan moleküler analizler sonucunda, faktör VIII seviyesi yüksekliği ile ilişkilendirilebilecek herhangi bir mutasyon ya da polimorfizm olmadığı tespit edildi. Thrombosis is pathologic coagulation of blood in vessels. It is known that it leads to disease and death in the world and in Turkish population. Thrombosis results from variations in blood flow, structural changes in vessel walls, alterations in the level of coagulation factors and their inhibitors. Since the recent researches are focused on improvement of therapy strategies, prevention and identification of thrombosis pathogenesis, generally the techniques employed in these studies are based on molecular biology and genetics.Pathogenesis of thrombosis is a complex multifactorial condition in which various hereditary and environmental factors play role. The studies focused on thrombosis until today involves antithrombin III, protein C and S, factor V, prothrombin, methylentetrahidrofolat reductase (MTHFR) gene regions and the mutations found within these gene regions. Besides, most of the researches performed about factor levels consist of physiologic studies. These studies revealed that high FVIII level is associated with thrombosis. Also, in many cases it was mentioned that high FVIII levels are inherited.In this study, experiment groups are selected from 20 individuals with venouse thrombosis diagnosis and control groups are selected from 20 healthty individuals. FVIII gene promotor regions and 26 exon regions of all individuals were amplified by polymerase chain reaction and unknown mutation detection or polymorphism screening were made by SSCA method.As a result of our analysis, we have not detected any different patterns in the FVIII gene promoter region of healthy individuals and venous thrombosis patients in the SSCA polyacrylamide gels which were performed after PCR. In FVIII gene, there was no pattern difference between exon 8/9 and exon 11 regions which have an APC cleavage site when venous thrombosis patients and healthy individuals were compared. A different pattern was detected from a venous thrombosis patient in exon 19 which has an APC binding region. After sequence analysis, it was found that there is not any mutation or a polymorphism.Different patterns were detected in the exon 6, exon 13, exon 14F and exon 25 regions of FVIII gene. It was also found that there were no mutations or polymorphism in exon 6 and exon 13 according to sequence analysis of the individuals who have different patterns. Base changes were detected in specific regions of 3 individuals after the sequence analysis of exon 14F and exon 25. While one of the base changes detected in the 14F region, was found to change the amino acid sequence of the gene product, other 2 base changes were found not to affect the amino acid sequence.As a result of molecular analysis performed on factor VIII promoter and 26 exon regions, neither any mutations nor polymorphisms related with high levels of factor VIII were detected. 130

Talasemi, otozomal resesif olarak kalıtılan hematolojik bir hastalıktır.Çesitli ülkelerde ve aynı ülkenin farklı bölgelerinde dagılım bakımındanheterojenite göstermektedir. talasemide, geni üstünde veya etrafında meydanagelen mutasyonlar, beta globin zincir yapımının azalmasına ya da hiç sentezedilmemesine neden olur. zincir yapımına göre 0 ve + olmak üzere iki tipibulunmaktadır. 0 talasemide hiç beta zinciri yapılmamaktadır. + talasemi de ise azmiktarda beta zinciri yapımı vardır. Türkiye'de en sıklıkla rastlanan -talasemimutasyonu IVS I-110'dur.Bu çalısmada -talasemi mutasyon tanısında kullanılan klasik yöntemlerlemikroarray yönteminin karsılastırılması ve mikroarray teknolojisinin -talasemiprenatal tanısında kullanımına yönelik bir ön çalısma yapılması amaçlanmıstır.Tasıyıcı ve hastalarda talasemi mutasyon tiplerinin saptanmasında ARMS ve DNAmikroarray yöntemleri kullanılmıstır. Örnekler toplam 52 kisiden saglanmıstır. Tümörnekler hem ARMS hem de mikroarray yöntemleri için ayrı ayrı çalısılmıs vemutasyon taraması sonucunda her iki yöntemle de aynı sonuçlar elde edilmistir.Çalısma sonucunda; 23 allelin IVS I-110, 13 allelin IVS I-1, 9 allelin IVS I-6, 9allelin IVS II-1, 8 allelin Cd39 ve 6 allelin IVS II-745 mutasyonunu içerdigigözlenmistir. Ayrıca 13 olgunun homozigot, 3 olgunun da çift heterozigot özellikgösterdigi belirlenmistir. Hiçbir olguda Cd6 ve -87 mutasyonları tespitedilememistir.Sonuç olarak DNA mikroarray yönteminin kullanılması ile klasik yöntemlereoranla daha hızlı sonuç elde edilmis ve tek seferde çok sayıda örnegi çalısma imkanısaglanmıstır. Bu durum prenatal tanı için de kolaylık saglayacaktır. Thalassemia is an hereditary hematological disorder inherited autosomalrecessively. The distribution of thalassemia shows heterogenity not only in variouscountries but also different regions of the same country. In -thalassemia,mutations located in or around of beta gene cause a decrease in the production ofbeta globin chain or lack of synthesis. There are two types of -thalassemia, 0 and+, according to the production of beta globin chain. In 0 thalassemia, no betachain is produced. In + thalassemia, a small amount of beta chain production ispresent. In Turkey the most common thalassemia mutation is IVS I-110.With this study, we aimed to compare microarray techniques with classicaltechniques and to establish a method for the use of microarray technologies inprenatal diagnosis of thalassemia. ARMS and DNA microarray methods are usedfor the detection of thalassemia mutations in carriers and patients. Our sampleswere obtained from total 52 individuals. All samples were separately studied withboth ARMS and microarray methods and the same results were also obtained in bothmethods after the mutation detection. At the end of this study, it is observed thatallelle numbers of IVS I-110, IVS I-1, IVS I-6, IVS II-1, Cd39 and IVS II-745mutations were 23, 13, 9, 9, 8 and 6, respectively. Moreover, it is determined that 13and 3 of cases were homozygote and double heterozygote, respectively. Cd6 and -87mutations couldn?t be determined in any cases.In conclusion, more rapid results were obtained by using DNA microarrayaccording to conventional methods and prenatal diagnosis is not only simplified bythis method but also an opportunity is given for studying much more samples in asingle experiment. 75

Genetik hastalıkların klinik tanısının doğrulanması, genotip?fenotipilişkisinin kurulması ve doğum öncesi tanı verilebilmesi için buhastalıklara yol açan mutasyonların tanımlanması gereklidir. Bunedenle, değişik mutasyon tarama yöntemleri geliştirilmiştir. Buyöntemlerden biri de High Resolution Melting Curve (HRM) analizidir.HRM analizi DNA'nın sıcaklıkla denatürasyonunun floresan boyaölçümü ile takibi esasına dayanır, Polimeraz Zincir Reaksiyonu(PZR)'nun yapıldığı tüpte, 10?15 dakika içerisinde gerçekleştiğindendiğer tarama yöntemlerinin yerini alabilecek niteliktedir. Tezçalışmasında, HRM analizinin delesyon tipi mutasyonları saptamadakietkinliğinin araştırılması ve delesyon boyutu, DNA amplikon boyutu,GC içeriği, Mg2+ ve DNA konsantrasyonu, DNA thermal cycler cihazı vefloresan işaret veren boya gibi değişkenlerin HRM analizinindelesyonları saptama hassasiyetine olan etkilerinin incelenmesiamaçlanmıştır. Bu doğrultuda, NF1 geni ekzon 4b'de bulunan 496delGTve 499delTGTT; ekzon 12a'da bulunan 1758delTA; ekzon 22'de bulunan3759delCTACC ve 3818delCT ve CFTR geni ekzon 10'da bulunan ?F508mutasyonları incelendi. Çift zincirli DNA'ya bağlanma özelliğine sahipfloresan boya olan SYTO9 varlığında PZR yapıldı ve yüksekçözünürlüklü DNA denatürayon eğrileri elde edildi. Heterozigot vehomozigot dizi farklılıkları normalize ve türev eğrilerin analizedilmesiyle belirlendi. Mutasyon taşıyan örnekler, normal örneklerdeneğrilerin şekline ve durumuna göre ayırt edildi. Çalışılan 4 ekzondaincelenen 6 delesyonun tümü saptandı. Amplikon boyutunun ve GCoranının arttığı ekzonlarda, kompleks eğriler oluştu. 2-8 ng/?larasındaki DNA konsantrasyon değerlerinde HRM analizinin etkinliğideğişmedi. Mg2+ konsantrasyonunun artması sonucunda Tm derecesininarttığı belirlendi. DNA amplifikasyonun gerçekleştirildiği thermal cyclercihazının HRM analizi sonuçlarını değiştirmediği saptandı. Ayrıca,HRM analizi ile delesyon saptanmasında SYBR Green boyasınınkullanılamayacağı belirlendi. Sonuç olarak, HRM analizinin delesyonsaptamak için kullanılabilecek uygun bir yöntem olduğu gösterilmiştir.Anahtar Kelimeler: DNA denatürasyonu, floresan işaretleme, DNA Tmderecesi, Real-time PZR, genetik test Detection of mutations in genetic diseases isimportant for the confirmation of clinical diagnosis, for theestablishment of genotype-phenotype correlation and prenatal diagnosis.For that reasons, a variety of mutation scanning techniques have beendeveloped. High Resolution Melting Curve (HRM) analysis is one ofthese techniques. It is based on the measurement of fluorescent dyeduring thermal DNA denaturation. Mutation detection takes place inthe same reaction tube as the amplification and it takes only 10 ? 15minutes, therefore it may replace the other scanning methods. In thisthesis, our aim is to search efficiency of HRM analysis for the detectionof deletion type mutations, and define the parameters such as deletionsize, DNA amplicon size and GC content, Mg2+ and DNA concentration,type of DNA thermal cycler machine and flourescent dye which canaffect HRM analysis. For this purpose, we investigated the mutations inthe NF1 gene which are 496delGT and 499delTGTT (exon 4b),1758delTA (exon 12a), 3759delCTACC and 3818delCT (exon 22) and?F508 (exon 10) mutation in the CFTR gene. PCR was performed in thepresence of the double stranded DNA binding dye SYTO9 and highresolutionmelting curves were obtained. Heterozygous and homozygoussequence variations were analyzed from normalized and derivatedgraphs. Mutant genotypes were distinguished from the wild-type interms of melting curve shape and position and all of 6 deletions weredetected. However complex curves are obtained for the large ampliconsbecause of the increased amount of the GC domains. The efficiency ofHRM analysis did not change in DNA concentrations between 2-8 ng/?l.It was determined that Tm degree increases with increasing amount ofMg2+ concentrations. The type of PCR equipment where the DNAamplifications were performed did not change the results of HRManalysis. Also, it was determined that SYBR Green dye can not be usedfor detection of the deletions with HRM analysis. In the light of theseresults, HRM analysis can be used to detect deletion type mutations andas a prescreening test for unknown mutations.Key Words: DNA denaturation, fluorescent labeling, DNA Tm Degree,Real-time PCR, genetic test 73

ÖZETDNA'DA MEYDANA GELEN BAZI MUTASYONLARIN VE HøBRøDøZASYONUNTAYøNøNE YÖNELøK ELEKTROKøMYASAL DNA BøYOSENSÖRLERøNøNTASARIMIDNA'da meydana gelen bazı mutasyonların ve hibridizasyonun tayinine yönelik elektrokimyasalDNA biyosensörlerinin tasarımı. DNA'nın çift sarmal yapısının keúfinden yarım asır sonra, 21.yüzyılın baúlarında bilim dünyası biyolojik araútırmalarda izlenen çok çeúitli yöntemlerle karúıkarúıya bulunmaktadır ve araútırmacılar özellikle moleküler biyoloji ve nanoteknolojialanlarındaki hızlı geliúmelerden etkilenmektedir. Gen teknolojisindeki geliúmelerle birlikte,analitik tayin yöntemlerinin geliúme yönü de yüksek kalitede, gittikçe küçülen boyutlarda ileriteknoloji ürünlerinin moleküler DNA analizleri için geliútirilmesi do÷rultusunda ilerlemektedir.Çalıúmamızda DNA hibridizasyonunun ve mutasyonlarının tayinine yönelik farklı özellikleresahip iki elektrokimyasal DNA biyosensörü tasarımı gerçekleútirildi. Moleküler biyolojialanındaki tüm bu geliúmeler paralelinde, ilk bölümde Hepatit B hastalı÷ı tedavisinde yo÷unolarak kullanılan Lamivudin adlı ilacın, bu hastalı÷ın etkeni olan Hepatit B virüs genomundameydana getirdi÷i nokta mutasyonlarının tayini yapıldı. Kalem grafit elektrot, sentetikoligonükleotitler, klon ürünleri ve polimeraz zincir reaksiyonu ile üretilen ürünler ile yapılantayinlerde diferansiyel puls voltametri tekni÷i kullanıldı. Biyosensör tasarımında çeúitli deneyselparametrelerin (hedef konsantrasyonu, hibridizasyon süresi, hibridizasyon sonrası sensöryüzeyinin yıkanma süresi, sensör seçimlili÷i, en düúük tayin sınırı ve tekrarlanabilirlik) tayineolan etkileri incelendi. Asetat tamponu (pH: 4,8) içerisinde gerçekleútirilen ölçümlerde, elektrotyüzeyinden hibridizasyondan önce yanıt alınmazken, hedef dizi ile hibritleúme sonrasında eldeedilen yanıtın (guanin yükseltgenme sinyali) yüksek oldu÷u gözlenmiútir. Prob dizinin hedeftentek bazı farklı ve rastgele dizilerle olan hibridizasyonu ile elde edilen yanıtların ise sırasıylaazaldı÷ı gözlenmiútir. Hassas úekilde hasta örneklerinde de mutasyon tayini gerçekleútirilmiútir.Kalem elektrot yüzeyinin kolayca yenilenebilir olması, kalem elektrot sisteminin çoklu analizlereuygulanabilece÷i hatta mikroçip cihaz üretiminde kullanılabilece÷i fikrini düúündürmüútür.Lamuvidin'in uzun süreli kullanımında virüs genomunda oluúan nokta mutasyonları, virüsün ilacakarúı direnç geliútirmesine neden oldu÷undan mutasyon tayininin tedaviye yeni bir yön verilmesiaçısından önemi büyüktür. Tasarımı yapılan biyosensörle kısa sürede yapılan mutasyon tayini,klasik tayin yöntemlerine farklı bir alternatif getirmiútir. Bu yeni biyosensör yalnızca hızlı, ucuzve kolay analiz sa÷lamakla kalmayıp, aynı zamanda iki ayrı türdeki lamivudin direnç mutasyonuhakkında bilgi vermektedir. Çalıúmamızın ikinci bölümünde gıda kaynaklı hastalıklara neden olanSalmonella choleraesuis subsp. choleraesuis bakterisinin tayinine yönelik biyosensör tasarımıyapılmıútır. Salmonella bakterisini tanımlayan DNA parçasının (Salmonella genomunun) tayini,enzime dayalı genosensör ile gerçekleútirilmiútir. Hibridizasyon tayini, biotin-streptavidinetkileúiminin kullanıldı÷ı, sandviç modelli hibridizasyon tekni÷iyle spesifik olarak oluúan ürün?α-naftol? üzerinden yapılmıútır. Diferansiyel puls ve kare dalga voltametri tekniklerininkullanıldı÷ı ölçümlerde, tek kullanımlık perde baskılı karbon elektrot yüzeyinde gerçekleúen ikilihibrit yapısı (sandviç hibrit) en yüksek yanıtı vermiútir. Hedef dizi yerine rastgele dizikullanıldı÷ında ise yanıtta büyük bir azalma olmuútur. Çeúitli özellikte probların hibridizasyonaetkisi, prob tutturma metodu, hedef konsantrasyonu, polimeraz zincir reaksiyonu ile üretilenürünlerin seyrelme oranı gibi deneysel parametreler incelendi. Ayrıca en düúük tayin sınırı veba÷ıl standart sapma gibi parametreler de hesaplandı. Bu elektrokimyasal genosensörle 50 kezseyreltilmiú PCR ürünleriyle bile hedefe özgül olarak hibridizasyon tayini yapılabilece÷i bulundu.Geliútirilen bu biyosensörle kısa sürede yapılan bakteri tayini klasik tayin yöntemlerine yeni biralternatif getirmiútir. Tasarımı yapılan her iki biyosensörün de ileride DNA çiplerindekullanılabilecek teknolojik altyapıyı içerdi÷i bulundu. ABSTRACTTHE DESIGN OF ELECTROCHEMICAL DNA BIOSENSORS FOR THE DETECTIONOF SOME DNA MUTATIONS AND HYBRIDISATIONAfter half century of the discovery of double-stranded DNA structure, in 21st century, scienceworld has faced with many kinds of diagnosis methods in biological research area so researchershave been influenced on fast advancement in molecular biology and nanotechnology. Thedirection of analytical determination methods have advanced with gene technology, nano-scaledevice technology and nanomaterial usage in biosensors. In this thesis study, two differentelectrochemical DNA biosensors were designed for the detection of DNA hybridization and DNAmutations. In parallel with molecular biological advancement firstly, we described anelectrochemical DNA genosensor for the detection of HBV (YMDD) and the discrimination ofthe point mutation types (YVDD and YIDD) by using the oxidation signal of guanine and adisposable pencil graphite electrode in connection with DPV. The detection scheme containedsynthetic oligonucleotides, cloned products and polymerase chain reaction products. In thebiosensor design, different experimental parameters were examined such as optimum targetconcentration, optimum hybridisation and washing time, specifity of the biosensor, detectionlimit, reproduciblity⦠etc. in order to understand the influence of these parameters on thehybridisation/mutation detection. Before the hybridisation, no signal observed because ofguanine-free probe but after the hybridization the highest guanine signal were obtained because oftarget sequence. (Measurement were performed in acetate buffer pH: 4.8) After hybridisationbetween probe modified surface and mismatch/non-complementary sequences, guanine oxidationsignals decrease alternately. In terms of the detection of Lamuvidine resistance, this study is ofimportance because fast and sensitive electrochemical detection of mismatch analysis wasperformed. With the help of the experimental results reported here, a microarray device may beproduced. Additionally, Lamuvidine resistance can be detected from patient samples using thisdevice. The resistance analysis related to the hepatitis B virus (HBV) genotyping and treatmentprocured key information for the study of infected patients. Consequently, the biosensor whichwas designed in this thesis, is provides an alternative detection in comparison to traditionaldetection schemes for mutation analysis. This new biosensor not only provides a rapid, cost-effective, simple analysis but also gives information concerning both genotyping and lamivudineresistance. In the second part of this thesis study, we developed a biosensor for the detection ofSalmonella choleraesuis subsp. choleraesuis bacteria which is caused by food-borne diseases. Inthis work, oligonucleotide modified screen-printed carbon electrodes were used for the enzyme-amplified sensing of DNA sequences that identify the Salmonella bacteria. The capture probe wasimmobilized onto screen-printed carbon electrodes using the adsorption method. Hybridizationreaction was detected through the sandwich format, based on the coupling of biotin-streptavidininteraction using a streptavidin conjugated to alkaline phosphatase. The enzyme catalyzed theconversion of electroinactive -naphthyl phosphate to -naphthol; this product is electroactiveand has been detected by differential pulse voltammetry. Measurements were performed beforeand after the hybridisation reaction. When the sandwich hybrid structure was occured ontoelectrode surface, the highest -naphthol signal was observed. When the non complementaryoligonucleotide was use as a target -naphthol signal decreased sharply. Additionally, differentexperimental parameters were examined such as different types of probe usage, different probeimmobilization methos, optimum target concentration, optimum dilution rate of PCR products,detection limit and reproduciblity in order to understand the influence of these parameters on thehybridisation. The electrochemical genoassay allowed specific detection of the polymerase chainreaction (PCR) amplified targets, even diluting the sample of interest about 50-fold. This newbiosensor provide an alternative detection scheme for bacterial analyis in food. Bothelectrochemical genosensors which were designed in this thesis have substructure of DNAmicrochip technology. 250

1. ÖZET Ailevi Akdeniz Ateşi (Familial Mediterranean fever: FMF), kısa periyodik ateş ve serozal dokutan etkileyen iltihap atakları ile karakterize otozomal resessif bir hastalıktır. Öncelikle Akdeniz ve çevresindeki populasyonlan etkilemekle birlikte, hastalık Ermeni, Sefardik Museviler, Türk ve Arap populasyonlan ile sınırlı kalmıştır. Heterozigot taşıyıcı sıklığı, bu toplumlarda yüksek seviyelere ulaşmaktadır. FMF'in en önemli komplikasyonu özellikle renal ve ilerleyici olan amiloidoz'dur. Amiloidoz, böbrek yetmezliği ile sonuçlanır. Elazığ ili ve çevresinde FMF, MEFV gen mutasyonlannın incelenmesi amacı ile hazırlanan çalışma doğrultusunda Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik ABD'a başvuran 35 hastanın MEFV gen mutasyonlan ve fenotip-genotip ilişkisini belirleme çalışmalan yapılmıştır. Dört farklı MEFV gen mutasyonu incelenmiş, Türk ve dünya literatüründe sunulan bilgilerle mukayese edilmiştir. Ülkemizde henüz sağlıklı olarak elde edilmemiş olan heterozigot taşıyıcılığının yüksek olduğunu gösteren bulgular elde edilmiştir. Diğer yandan mutasyon inceleme yöntemimiz, FMF'in toplum taraması için bir tarama aracı olarak değerlendirilmiştir. Bizim toplumumuzda yaygın diğer mutasyonlann da eklenmesi ile bu yöntem daha da geliştirilecektir. Böylece sağlıklı genetik danışmanlık ve populasyon taramalan ile FMF için önleyici ve daha geçerli yaklaşımlar temin edebileceğimizi düşünmekteyiz. Anahtar Kelimeler: FMF, MEFV Mutasyonlan, Türk toplumu, fenotip-genotip ilişkisi. 2. ABSTRACT Familial Mediterranean Fever (FMF) is an autosomal recessive disease which characterized with short periodic fever, inflammation attacks involving pleura, periton and synovia. Although the disease had involved primarily populations of the area surrounding Mediterranean, the disease had remained restricted to Armanian, Sephardic Jews, Turkish and Arab populations. The frequency of the heterozygote carriers is reaching high levels in these populations. The most important complication of FMF is the amiloidosis which is especially renal and progressive. Amiloidosis results in renal failure. It has been performed that phenotype-genotype correlations and MEFV mutations detection of the 35 FMF patients submitted Firat University Medical Faculty, Department of Medical Biology and Genetics in the province of Elazig. It has beeen detected four distinct mutations of the MEFV and evaluated by comparision of the data presenting in Turkish and worldwide literature. We have provided findings that revealed high heterozygote carriers level which had beeen still unavailable in Turkey right now. On the other hand, our mutation detection method has been evaluated as a screening tool for population screening for FMF. By addition of new mutations which are common in our population, this method will be improved. So we consider that we could provide more accurate data and preventive approach by current genetic counseling and population screening. Key words: FMF, MEFV mutations, Turkish population, phenotype-genotype correlations. 91

6. ÖZET Meme Kanserli Hastalarda p27/Kipl Gen Mutasyonlarının Araştırılması P27/kipl proteini siklin bağlı kinaz inhibitor proteinleri ailesine ait olup, hücre döngüsünün negatif kontrolünde rol almaktadır. Son araştırmalar düşük p27 ekspresyonunun hastalarda kötü sağkalım ve ciddi malignansi ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir. Meme kanseri olan 24 hastada PCR-SSCP uygulanarak, bu gende genetik anormallikler tespit edildi. P27 değişimlerinin meme kanseri gelişimi ile ilgisi olduğu belirlendi. P27/kipl geni iki ekzon ve bir introndan oluşmaktadır. Bu nedenle bu bölgeler üç set primer kullanılarak çoğaltıldı. 11 (%45.8) tümör örneğinde farklı bant bulunduğu gözlendi. Bu mutasyonların iki tanesi ekzon 1-5' bölgesinde, sekiz tanesi ekzon 1-3' bölgesinde, bir tanesi de ekzon 2 bölgesinde saptandı. Genin 3' bölgesindeki değişimlerin, 109. kodonun polimorfizmleri olduğu daha önce gösterilmiştir. Bu polimorfîzmler önceden tanımlanmış olup, Bgl I restriksiyon enzim kesim bölgesi içerdikleri bilinmektedir. Kodon 109'daki polimorfizmi kesin olarak doğrular şekilde, farklı banda sahip PZR ürünleri Bgll ile kesilmişlerdir. 6.SUMMARY P27/Kipl Gene Mutation Detection in Breast Cancer Patients The p27/Kipl protein belongs to family of cyclin-dependent kinase inhibitory proteins that are negative regulators of cell cycle progression. Recent observations suggest that low p27 expression may correlate with poor survival in patients with certain malignancies. To determine whether p27 alterations may be involved in breast cancer progression, we have analysed the presence of genetic abnormalities in this gene in 24 patients with breast carcinoma using PCR- SSCP. The coding region of he p27/Kipl gene consist of two exons and an intron. Therefore three sets of primers were used for the amplification of these regions. Aberrantly migrating bands were observed in 11 (%45.8) of the tumor samples. Two of these mutations were in the 5' region of exon 1, 8 were in the 3' region of exon 1 and one mutation was in exon 2. The mutations at the 3' end were polymorphism at codon 109 of the gene. These polymorphism have been described previously and are known to create a restriction site for Bgl I. To confirm the exact nature of this codon 109 polymorphism aberrantly migrating PCR products were also digested with Bgl I. 69

ÖZET Trombozlu Hastalarda Protein C Geninde Mutasyon Taraması Trombotik hastalıklar tüm dünyada en önemli morbitide ve mortalite nedenlerinden birisidir. Tromboz gelişimi multifaktöriyel olup çok sayıda edinsel ve kalıtsal faktörün değişik mekanizmalarla bu gelişime katkıda bulunduğu bilinmektedir. Kalıtsal venöz trombozda çoğunlukla pıhtılaşma sistemini kontrol altında tutan doğal inhibitor mekanizma bozukluklarının rol oynadığı bilinmektedir. Venöz trombozda risk faktörü olan Protein C geninde mutasyon tarama çalışması yapıldı. Elisa yöntemi ile trombozlu hasta ve kontrol gurubunda yapılan serum Protein C ölçümü sonucu; hasta gurubunda Protein C serum düzeyleri kontrol gurubuna göre anlamlı olarak düşük bulundu (p=0.005). Trombozlu hasta gurubunda 6 kişinin Protein C düzeyi normal değerlerin altında çıkmış ve bu ölçüme göre hastaların % 12'sinde Protein C eksikliği bulunmuştur. Protein C geninin 2,3,4,5,6,7,8,9.'cu ekzonlan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılıp Tek Sarmal Komformasyon Polimorfizmi (SSCP) ile incelendiğinde; 1 tane ekzon2, 4 tane ekzon3, 1 tane ekzon4/5, 2 tane ekzon7, 3 tane ekzon8, 2 tane ekzon9-3', 2 tane de ekzon9-5' bölgesinde toplam 9 hastada olası mutasyon tespit edilirken hiçbir kontrol gurubu örneğinde olası mutasyona rastlanmamıştır. 46 SUMMARY Mutation Detection of Protein C Gene in Thrombosis Patients Thrombotic disease is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world. As the devolepment of thrombosis is multifactorial, it is known that numbers of hereditary and acquired factors are involved in this process with different mechanisms. İt is also known that impairment of the natural inhibitor mechanism which regulates coagulation system mostly plays an important role in hereditary venous thrombosis. Mutation in the Protein C gene which is a risk factor in venous thrombosis is screened. When serum protein C levels in patient and control groups are measured by ELİSA, levels in the patient group was signiflcally low compared to the control group (p=0.005). Protein C level was below normal in 6 patients and due to this measurement, deficiency of Protein C was found in 12 % of patients. When exons (2,3,4,5,6,7,8,9) of the Protein C gene were amplified by Polimerase Chain Reaction (PCR) and analysed by Single Strand Comformation Polymorphism (SSCP); one exon 2, four exon 3, one exon 4/5, two exon 7, three exon 8, two exon 9-3', two exon 9-5', a total of nine patients were found to have probable mutations while no sample from the control group had any mutations. 47 54

İV ÖZET Göz merceğinin saydamlığını kaybetmesi olan katarakt hastalığı dünyada en sık rastlanan göz bozukluğudur ve körlüğün başlıca nedenidir. Kalıtsal kataraktın, fötal sentez sırasında sentezlenen mercek proteinlerine ait genlerdeki mutasyonlardan kaynaklandığı düşünülmektedir. Bu araştırmada konjenital kataraktlı 9 ailedeki 15 bireyden elde edilen DNA'lardan y-kristalin geninin 2. eksonu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılmıştır. Amplifikasyon ürünlerinde Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) yöntemiyle mutasyon taraması yapılmıştır. SSCP mutasyonların saptanmasında %80-90 verimle çalışan hızlı bir teknik olup çalışılan hasta bireylerde bu gen bölgesinde mutasyon saptanamamıştır. ABSTRACT The cataract results from loss of transparency of eye lens and it is the most common eye abberation in the world, it is the primary cause of blindness. It is thought that the inherited cataract results from mutations related to eye lens proteins synthesized during fetal synthesis. In this research, amplification products (exon II of the y-kristalin gene) amplified by `Polymerase Chain Reaction` (PCR), from DNA's collected from whole blood from 15 individuals of 9 families with congenital cataract are screened for mutation by `Single Strand Conformational Polymorphism'` (SSCP). SSCP is a sensitive and rapid tecnique in mutation detection with 80-90% yield. No mutation was detected in the gene region studied in these families. 98