Search

Bu çalışma, vinclozolinin, arıcılıkta peteklere zarar veren ve ekonomik yönden zararlı bir tür olan Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae)’ nın bazı enzim aktiviteleri (Glukoz Oksidaz, Katalaz ve Ksantin Oksidaz) üzerine etkisini belirlemek amacıyla yapılmıştır. Deney grupları için, stok kültürlerden elde edilen yumurtalar, farklı dozlarda (20, 40 ve 60 ppm) vinclozolin karıştırılmış besin içine bırakılmış ve yumurtadan çıkan larvaların bu besinle beslenmeleri sağlanmıştır. Aynı vinclozolin oranlarında homojenattaki protein miktarlarındaki değişimleri incelemek için böcekten protein izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Homojenatlardaki toplam protein miktarı Bradford metodu ile belirlenmiş ve ekstraktlara SDS- PAGE analizi yapılarak protein profilleri çıkartılmıştır. Elde edilen ekstraktlar, enzim aktivite analizleri için kullanılmıştır. Bu çalışmada, özellikle savunma mekanizmasında etkili olan katalaz enzim aktivitesi, karbonhidrat metabolizmasında rol alan glukoz oksidaz ile nükleotid metabolizmasında görev alan ksantin oksidaz enzim aktiviteleri ölçülmüştür. Aktivite sonuçları incelendiğinde; 20, 40 ve 60 ppm vinclozolin içeren besinle beslenen larvalarda, vinclozilin konsantrasyonundaki artışa bağlı olarak katalaz ve glukoz oksidaz aktivitelerinin arttığı, ksantin oksidaz aktivitesinin ise sabit kaldığı gözlenmiştir. This study was aimed to determine the effect of vinclozolin on some enzym activities (glucose oxidase, catalase and xanthine oxidase) of Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) which is an economically harmful species damaging the honeycomb in beekeeping. For experimental groups, the eggs obtained from stock were dropped into the mixed feed of vinclozolin at different doses (20, 40 and 60 ppm) and had the larvae fed with this feed. However, at the same rate vinclozolin concentration, three different protein isolation methods were examined to determine maximum level in amount of protein in the homogenates. The total amount of protein was determined by Bradford method and the protein extracts were performed by SDS- PAGE analysis to obtain protein profile. The obtained extracts were used for enzyme activity analysis. In this study, activity of catalase enzyme, particularly effective in defense mechanism, activity of xanthine oxidase involved in nucleotide metabolism and activity of glucose oxidase in the metabolism of carbohydrates were measured. When compared with the results from control groups, the enzyme activities of the larvaes fed with the feed including 20, 40 and 60 ppm of vinclozolin were observed to vary or remain constant. Accordingly, glucose oxidase and catalase activities increased with the increase in amount of vinclozolin in the feed and the activity of xanthine oxidase remained stable.

Enzymes are important materialsthat are used in many industries and they have a very high cost. Although theconditions for the enzymes in catalytic reactions are appropriate, enzymes caneasily lose their activity in the presence of high temperature, high or low pHand organic / inorganic solvents. With the immobilization process, it ispossible to ensure that the enzymes are economically usable. For this purpose, theglucose oxidase (GOx) enzyme was immobilized to aminomethyl polystyrene (APS)nanospheres and the optimization parameters (pH, temperature, reusabilitynumber, storage stability, substrate concentration) were determined. Michaelis-Menten equation for free andimmobilized enzyme and Kmand Vmax values werecalculated. In particular, it has been found that the substrate of the immobilizedenzyme containing Pt(IV) ion shows a high affinity for the substrate. After 12months, immobilized enzymes were found to maintain about 85% of their activity., Enzimler, pek çokendüstride kullanılan, maliyetleri oldukça yüksek olan önemli materyallerdir.Katalitik tepkimelerde enzimler için şartlar uygun olsa bile yüksek sıcaklık,yüksek veya düşük pH ve organik/inorganik çözücülerin varlığında enzimler aktifliklerinikolaylıkla kaybedebilirler. İmmobilizasyon işlemi ile birlikte, enzimlerinekonomik açıdan kullanılabilirliğini sağlamak mümkündür. Bu amaçla,(aminometil) polistiren (APS) kaynaklı nanokürelere glukoz oksidaz (GOx) enzimiimmobilize edildi ve optimizasyon parametreleri (pH, sıcaklık, tekrar kullanımsayısı, depolama kararlılığı, substrat derişimi) belirlendi. Serbest veimmobilize enzim için Michaelis-Menten eşitliği ile Kmve Vmak değerleri hesaplandı. Özellikle Pt(IV) iyonu içerenimmobilize enzimin substratına karşı yüksek ilgi gösterdiği tespit edildi. 12ay sonunda immobilize enzimlerin yaklaşık % 85 aktifliklerini koruduklarıgörüldü.

TEZ12728 Tez (Yüksek Lisans) -- Çukurova Üniversitesi, Adana, 2017. Kaynakça (s. 72-75) var. IX, 76 s. :_res. (bzs. rnk.), tablo ;_29 cm. Glukoz tayinine yönelik bu çalışmada glukoz oksidaz enzimi ve peroksidaz enzimi, sığır serum albümini/jelatin ve glutaraldehit ile çapraz bağlanarak Au elektrot yüzeyine sabitlenmiş ve geliştirilen biyosensör ile glukoz ölçümleri 0.9 V’ta amperometrik yöntem ile alınmıştır. Tasarlanan biyosensörün optimizasyon çalışmalarında öncelikle biyoaktif tabaka için jelatin miktarı, sığır serum albumin miktarı ve glutaraldehit yüzdesi gibi parametreler, çalışma koşullarının optimizasyonunda ise tarama hızı, pH, sıcaklık ve tampon derişimi optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Karakterizasyon çalışmaları içinde doğrusal tayin aralığı, raf ömrü, ölçüm tekrarlanabilirliği ve serumda glukoz analizleri yapılmıştır. Biyoaktif tabakanın optimizasyonunda BSA miktarı, jelatin miktarı ve glutaraldehit yüzdesi sırasıyla 0.030 gr, 0.45 gr ve % 2.5 olarak tespit edilmiştir. Fosfat tamponunun pH: 7.5 ve 50 mM, tarama hızının 0.05 V/s, sıcaklığın ise 35 °C optimum çalışma koşullarını sağladığı belirlenmiştir. Au/BSA-jelatin/glukoz oksidaz-peroksidaz/glutaraldehit modifiye biyosensör için karakterizasyon çalışmalarında 5-400 mg/dL aralığında glukoz için doğrusal sonuçların alındığı belirlenmiştir. Raf ömrü çalışmalarında 40.günün sonunda yanıtın % 72’ye kadar korunduğu, 80 mg/dL derişimle kullanılarak yapılan tekrarlanabilirlik çalışmalarında (n=13) standart sapma (S.S) = ±0.1320 ve % varyasyon katsayısı (V.K) = 0.165 olarak bulunmuştur. Serum örnekleriyle yapılan çalışmalarda; biyosensör, kit ve altın standart olarak kabul ettiğimiz merkez laboratuvar sonuçlarının ROC eğrileri analizi yapılmıştır ve biyosensör sonuçlarının (.90-1.00) ile mükemmel aralıkta olduğu bulunmuştur. In this study for the determination of glucose, glucose oxidase enzymes and peroxidase enzymes fixed on the gold electrode by using BSA/gelatin and crosslinking by glutaraldehyde. Measurements were carried out at 0.9 V with amperometric method. During the optimization studies the amount of gelatin, bovine serum albumin and glutaraldehyde were determined. For the optimization working condition pH, temperature, scanning rate and buffer concentration were carried out. Afterwards, some paramaters such as linearity, repeatability of the measurement, shelf life, and serum glucose analyses were carried out. From the bioactive layer optimization studies; gelatin, bovine serum albumin amount and optimal percentage glutaraldehyde were determined as 0.45 gr, 0.030 gr and %2.5 for the Au/BSA-Gelatin/GOD-POD/ glutaraldehyde modified biosensor. Phosphate buffer of pH 7.5 and 50 mM, scanning rate of 0.05 V/s, temperature 35 °C were determined as a optimum working conditions. It was determined that linear results are obtained between the ranges of 5-400 mg/dL for glucose concentration. As for shelf life studies, at the end of 40th day of responses has been preserved by 72%, repeatability of the measurement (n=13) standard deviation (S. S) = ±0,1320 and % coefficient of variation (V. K) = 0.165, respectively. Studies with using serum samples; biosensor, kit, central laboratory results accepted as gold standard ROC curve analysis reviewed and the biosensor results (.90-1.00) were found with excellent range. Bu Çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje no: TYL-2015-3899.

Bu tezde glukoz oksidaz enziminin kalem grafit elektrot yüzeyine çeşitli immobilizasyon yöntemleri kullanılarak biyosensörler tasarlanmıştır. Glukoz oksidaz enzimi kullanılarak glukoz tayinine yönelik biyosensörler oluşturulmuştur. İlk olarak glukoz oksidaz enzimi jelatin ve glutaraldehit ile çapraz bağlanarak kalem grafit elektrot yüzeyine sabitlenmiştir.(PGE/Glukoz oksidaz-jelatin/glutaraldehit).İkinci olarak farklı bir biyosensör tasarlanmıştır. Bu amaçla glukoz oksidaz enzimi nafyon ve glutaraldehit ile kalem grafit elektrot yüzeyine sabitlenerek bir biyosensör hazırlanmıştır. Geliştirilen biyosensörler ile glukoz ölçümleri -0.7 V'ta amperometrik yöntem ile yapılmıştır. Hazırlanan biyosensörlerin optimizasyon çalışmalarında öncelikle optimum enzim miktarı, jelatin miktarı, nafyon yüzdesi ve glutaraldehitte bekleme süresi gibi parametreler çalışılmıştır. Çalışma koşullarının optimizasyonunda pH ve sıcaklık optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. Daha sonra karakterizasyon çalışmaları içinde doğrusal tayin aralığı, tekrarlanabilirlik, tekrar üretilebilirlik, girişim etkisi ve örnek analizi gibi bazı parametreler belirlenmiştir. Optimizasyon çalışmalarından PGE/jelatin-glukoz oksidaz/glutaraldehit modifiye biyosensör için enzim miktarı, jelatin miktarı ve glutaraldehitte bekletme süresi sırasıyla 1,14U/mL, 20 mg ve 3 dakika olarak tespit edilmiştir. Fosfat tamponu (50 mM, pH: 7,5) ve 30°C sıcaklığın optimum çalışma koşullarını sağladığı belirlenmiştir. PGE/jelatin-glukoz oksidaz/glutaraldehit modifiye biyosensör için karakterizasyon çalışmalarında 50 µM - 1000 µM aralığında glukoz için doğrusal sonuçların alındığı belirlenmiştir. PGE/nafyon/glukoz oksidaz/glutaraldehit modifiye biyosensör için glukoz oksidaz miktarı, nafyon yüzdesi ve glutaraldehitte bekletme süresi sırasıyla 1,14 U/mL, %1,5 ve 5 dakika olarak belirlenmiştir. Fosfat tamponu (50 mM, pH: 7,5) ve 30°C sıcaklığın optimum çalışma koşullarını sağladığı belirlenmiştir. PGE/nafyon/glukoz oksidaz/glutaraldehit modifiye biyosensör için karakterizasyon çalışmalarında 50 µM - 1000 µM aralığında glukoz için doğrusal sonuçların alındığı belirlenmiştir., In this thesis, biosensors will be created using a variety of methods to pencil graphite electrode surface immobilization of glucose oxidase enzyme is intended. Biosensors for detection of glucose using glucose oxidase enzymes are generated. Firstly, glucose oxidase was crosslinked with gelatin and gluteraldehyde and fixed on the pencil graphite electrode surface. (PGE/Glucose oxidase-gelatin/ gluteraldehyde). Secondly, a different biosensor was designed. For this aim, biosensor was prepared by using nafiion. Glucose oxidase enzyme was fixed on pencil graphite electrode surface with nafion and gluteraldehyde. (PGE/Glucose oxidase /nafion/ gluteraldehyde). Glucose measurements were carried out at -0.7 V with amperometric method by developed biosensor systems. In optimization studies for designed biosensor, firstly, the optimal amount of enzyme, gelatin,optimal percentage nafion and optimum glutaraldehyde duration time were carried out. Optimization of working conditions; optimum pH and optimum temperature also investigated. Afterwards, in the characterization studies some paramaters such as linearity, repeatability, reproducibility, interference effects of some compounds and sample analyses were determined. From the optimization studies, amount of enzyme, gelatine amount and glutaraldehyde duration time were determined as 1.14U/mL, 20 mg and 3 minutes for the PGE/gelatine-glucose oxidase/glutaraldehyde modified biosensor. In optimum condition, buffer system is 50 mM, pH: 7.5 phosphate buffer and optimum temperature is 30°C. It was determined at the characterization studies on the PGE/gelatine-catalase/glutaraldehyde biosensor that linear results are obtained between the ranges of 50 µM to 1000 µM glucose concentration. Amount of enzyme, nafion rate and glutaraldehyde duration time were determined as 1.14U/ml, 1.5% and 5 minute for the PGE/nafion/glucose oxidase/glutaraldehyde modified biosensor. Phosphate buffer (50 mM; pH 7.5 ) and 30°C were established as providing the optimum working conditions. It was determined at the characterization studies on the PGE/nafion/glucose oxidase/glutaraldehyde biosensor that linear results are obtained between the ranges of 50 µM to 1000 µM glucose concentration.

Son dönemlerde doğadan esinlenerek yeni nesil biyouyumlu malzeme üretimi üzerine araştırmalar yapılmaktadır. Bu malzemelerin biyomedikal uygulamalarda kullanımı biyomateryaller, biyosensörler, fonksiyonel membranlar ve yapay doku iskeleleri gibi çeşitlilik göstermektedir. Bu çalışmada "doğal ve fonksiyonel" özellikleri olan biyokatalitik membran üretimi amaçlanmıştır. Bu hedef doğrultusunda, model altyapı proteini olarak seçilen sığır serum albümin ıslak kimya teknikleri ile amiloid forma dönüştürülmüştür. Glikoz oksidaz enzimi yapıdaki aktif biyolojik ajan olarak seçilmiştir. Biyokatalitik membran elektro-eğirme yöntemi ile "nano" ölçekte fiberlerin rastgele yığını şeklinde üretilmiştir. Tez kapsamında gerçekleştirilen çalışmalar, üretilen biyokatalitik membranın yapısındaki proteinin amiloid forma dönüştürülebildiğini, yapıdaki enzimin 0,7 µA akım şiddeti yarattığını ve 2547 U/m2 aktiviteye erişilebildiğini göstermiştir., In the recent years, the researches on the production of new generation biocompatible materials are inspired by the nature. The use of these materials in biomedical applications vary as, biomaterials, biosensors, functional membranes and artificial tissue scaffolds. In this study, production of a biocatalytic membrane with "natural and functional" features, was intended. Towards this goal, bovine serum albumin was selected as the model infrastructure protein. Then, it had been transformed into amyloid form with the wet chemistry techniques. Glucose oxidase is selected as the active agent in the biological structure. Biocatalytic membrane was produced with electro-spinning method, in the form of random bundle of nanofibers. The results of the studies carried out within the scope of the thesis showed that, the protein used to produce biocatalytic membrane can be converted into amyloid form, the enzyme in the structure was created a current of 0.7 ?A and achived an activity of 2547 U/m2.

Bu çalışmada, farklı oranlarda glukoz oksidaz ve askorbik asit ilavesinin simbiyotik dondurmaların fizikokimyasal, duyusal, ve mikrobiyolojik özellikleri üzerine etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla kontrol, % 0.025, % 0.05, % 0.1 oranlarında glukoz oksidaz ve % 0.025, % 0.05 ve % 0.1 oranlarında askorbik asit ilave edien 7 farklı dondurma üretilmiş ve -25±1C'de 90 gün süreyle depolanmıştır. Depolamanın 7. gününde dondurmaların fizikokimyasal ve duyusal analizleri gerçekleştirilmiş, 1, 7, 30, 60 ve 90. günlerinde ise probiyotik bakteri sayıları belirlenmiştir.Farklı oranda glukoz oksidaz ve askorbik asit ilavesinin örneklerin fiziksel, kimyasal ve duyusal özelliklerine etkisi önemsiz bulunmuştur (p>0,005). Glukozoksidaz ilavesi ile probiyotik bakterilerin gelişimini olumsuz yönde etkilemiştir. Buna karşılık askorbik asit ilavesi probiyotik bakterilerin canlılığını arttırmıştır. Örneklere ilave edilen askorbik asit oranı arttıkça dondurmalardaki probiyotik bakteri sayısının da artığı belirlenmiştir (p0.05). Addition of glucose oxidase had negative effect on the growth of probiotic bacteria. On contrary, addition of ascorbic acid stimulated the growth of probiotic bacteria.With the increase in ascorbic acid level, probiotic bacteria counts were increased (p

PEO olarak kodlanan tiyofen sonlu poli(etilen oksit) ve 3-metiltiyenil metakrilat ve p-vinilbenziloksi poly (etilen oksit) birimleri içeren ve CP olarak kodlanan kopolimerin sabit potensiyel altında yapılan elektroliz yardımıyla su-sodyum dodesil sülfat (SDS), su-paratoluen sülfonik asit (PTSA) ve asetonitril (AN)-tetrabütilamonyum tetrafloroborat (TBAFB) solvent-elektrolit çiftleri kullanılarak PEO ve CP’nin pirol (Py) ile kopolimerleri sentezlendi. CP ve PEO’nun pirol kullanılarak elde edilen kopolimerleri glukoz oksidaz tutuklamaları için kullanıldı. Enzim elektrotlarının optimum pH ve sıcaklıkları, çalışma kararlılıkları ve raf ömürleri tayin edildi. Bu enzim elektrotlarının kinetik parametreleri de ayrıca incelendi. Hazırlanan biyosensörler ile Türkiye’de iki farklı firmaya ait portakal sularındaki glukoz miktarı ölçüldü. Graft copolymerization of Thiophene ended poly(ethylene oxide) (PEO) and random copolymer (CP) of 3-methylthienyl methacrylate and p-vinylbenzyloxy poly (ethyleneoxide) CP and PEO with pyrrole (Py) were achieved in H2O - sodium dodecylsulfate (SDS), H2O - p-toluenesulphonic acid (PTSA) and acetonitrile (AN) - tetrabutylammonium tetrafluoroborate (TBAFB) solvent electrolyte couples via constant potential electrolyses. Immobilizations of glucose oxidase enzyme were performed in the matrices obtained via copolymerization of PEO and CP with pyrrole. Immobilization was carried out via entrapment of enzyme in matrices during the polymerization of pyrrole. Temperature optimization, operational stability and shelf-life of the enzyme electrodes were investigated. Maximum reaction rate (Vmax) and Michaelis-Menten constant (Km) were determined. The amount of glucose in orange juices of Turkey was investigated by using enzyme electrodes.

TEZ9716 Tez (Yüksek Lisans) -- Çukurova Üniversitesi, Adana, 2012. Kaynakça (s. 75-90) var. xi, 91 s. : res. (bzs. rnk.), tablo ; 29 cm. Bu çalışmada Emir üzüm şırasının şeker (Glikoz) içeriği katalaz enzimini de içeren glikoz oksidaz kullanarak glikonik asite dönüştürülmüş ve daha sonra Saccharomyces.(S.) cerevisiae, Kloeckera (K.) apiculata ve Williopsis (W.) saturnus mayalarının saf ve karışık kültürleriyle şeker içeriği azaltılmış üzüm şırasından düşük alkollü şarap üretilmiştir. Bu amaçla esas denemelerde kullanılacak steril üzüm şırasının şeker içeriği 1 g/L Hyderase kullanarak 20oC’de, 4L/dak sürekli steril hava vererek ve 330 d/dak.da karıştırarak 30 saat süreyle fermentörde glikonik aside dönüştürülmüştür. Şeker içeriği düşürülmüş üzüm şırasının indirgen şeker miktarı 95.88 g/L ve toplam asit miktarı 488 me/L bulunmuştur. Düşük alkollü şarap üretimi için S. cerevisiae, K. apiculata ve W. Saturnus mayalarının saf ve karışık kültürleri şeker içeriği azaltılmış şıraya aşılanmıştır. Şeker içeriği düşürülmüş şıradan S. cerevisiae’nın saf kültürüyle elde edilen örnek de kontrol olarak kullanılmıştır. W. saturnus’un saf kültür fermantasyonu dışında, diğer tüm fermantasyonlarda yoğunluk azalması daha çabuk olmuştur. Etil alkol miktarı %3.5-4 (h/h) olduğunda fermantasyon kükürt dioksit ilavesi ve soğuk uygulaması ile durdurulmuştur. Elde edilen şaraplarda etil alkol %3.52-4.04 (h/h), toplam asitlik 482.1-511.8 me/L, indirgen şeker 18.1-23.1 g/L, toplam yüksek alkol 67.718-103.935 mg/L, toplam ester 18.472-32.285 mg/L ve asetaldehit 13.622-111.503 mg/L arasında bulunmuştur. Duyusal analiz sonuçlarına göre en çok beğenilen örnek şeker içeriği azaltılmış şıradan S. cerevisiae’ nın saf kültürü ile üretilen düşük alkollü şarap olmuştur. Bu örneği S. cerevisiae ile K. apiculata’nın karışık ve W. saturnus’un saf kültürleriyle elde edilen şaraplar izlemiştir. In this study, sugar (Glucose) content of Emir grape must was converted to gluconic acid using glucose oxidase and then, low alcohol wines were produced using pure and mixed cultures of Saccharomyces (S.) cerevisiae, Kloeckera (K.) apiculata and Williopsis (W.) saturnus from reduced sugar grape must. For that reason, the sugar level of grape must which was used in the main fermentations was converted using 1 g/L of Hyderase at 20oC with mixing at 330 rpm and aerating with 4 L/min of filtered air for 30 h in a fermentor. The reducing sugar amount and total acidity were found 95.88 g/l and 488 meq/L, respectively. Pure and mixed cultures of S. cerevisiae, K. apiculata and W. saturnus were inoculated into reduced sugar grape must. The low alcohol wine obtained from untreated grape juice using pure culture of S. cerevisiae was used as a control. Unlike pure culture fermentation of W. saturnus, drop in the specific gravity of fermentations performed were quite rapid. When the ethyl alcohol content reached to 3.5-4 % (v/v), the fermentation was stopped by the addition of sulphur dioxide and cold treatment. The composition parameters of low alcohol wines were ethyl alcohol %3.52- 4.04 by vol., total acidity 482.1-511.8 meq/L, reducing sugar 18.1-23.1 g/L, total higher alcohols 67.718-103.935 mg/L, total esters 18.472-32.285 mg/L ans acetaldeyhde 13.622-111.503 mg/L. According to the sensory analysis, the most preferred sample was the wine obtained using pure culture fermentation of S. cerevisiae from reduced sugar grape must, followed by the wines produced from mixed culture of S.cerevisiae and K. apiculata and then, pure culture fermentation of W. saturnus. Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: ZF2010YL55.

Bu çalışmada atık maddeler kullanılarak, katı ortamda Aspergillus niger ile Glukoz Oksidaz üretimi araştırılmıştır. Karbonhidrat olarak şeker pancarı melası, katı destek maddesi olarak çay atıkları, kalsiyum karbonat kaynağı da yumurta kabuğu kullanılmıştır. Glukoz Oksidaz üretimi için optimum şartlar (süre, MnO2, O2 etkisi) incelenmiştir. En fazla enzim üretimi 96 saatte gözlenmiştir. Hücre dışı enzim aktivitesi 10,6 ünite/mL olarak, spesifik aktivite ise 10,2 ünite/mg protein olarak saptanmıştır. MnO2 kullanıldığında enzim aktivitesi 1,57 kat artmıştır. Üretim ortamından hava geçirildiğinde (akış hızı 16 mL/s) enzim aktivitesi kontrole göre 1,64 kat artmıştır.Anahtar Kelimeler : Glukoz oksidaz, Aspergillus niger, At ???? k maddeler, MnO2 In this study, Glucose Oxidase production was investigated with aspergillus Niger in solid state medium by using waste material. Sugarcane molasses as carbohydrates, tea waste as a solid support material, the egg shell as a source of calcium carbonate were used. The optimum conditions for production of Glucose Oxidase (time, the affect of MnO2 and O2) were investigated. Maximum enzyme production was obtained at 96 hours. Extracellular enzyme activity and specific activity were found 10.6 units / mL and 10.2 units / mg protein, respectively. Enzyme activity was 1.57-fold increased by using MnO2. When air (flow rate 16 mL/s) passed through production medium, enzyme activity was 1.64-fold increased according to the control.Key Words : Glucose oxidase, Aspergillus niger, Waste materials, 66

Sunulan çalışma ile önemi giderek artan, birçok araştırmaya konu olan biyosensörler ve biyoyakıt pili uygulamalarında kullanılmak üzere elektriksel iletimi geliştirilmiş glukoz oksidaz (GOD) bazlı enzim elektrodu oluşturulması hedeflenmiştir.Bu amaçla, enzimin redoks aktif merkezi ve elektrot arasındaki elektriksel iletimin arttırılması esas alınarak, farklı immobilizasyon yöntemleriyle elektriksel iletkenliği geliştirilmiş glukoz oksidaz bazlı enzim elektrodu tasarımı önerilmiştir.Tez kapsamında amaçlanan GOD enzim elektrodu tasarım çalışmaları kovalent bağlama, elektrokimyasal immobilizasyon ve apo-enzimin yeniden yapılandırılması yöntemleri ile gerçekleştirilmiş, hazırlanan enzim elektrotların performansları karşılaştırılmıştır.Elektrot ve enzimin redoks aktif merkezi arasındaki elektron transferini arttırmak amacıyla, kovalent bağlama ve elektrokimyasal immobilizasyon yöntemlerinde medyatör moleküllerinden, apo-enzimin yeniden yapılandırılması yönteminde ise direk elektron transferinden yararlanılmıştır.Enzim elektrodu tasarım çalışmalarından, kovalent ve elektrokimyasal immobilizasyon yöntemlerinde iletken polimer olarak polipirol (PPy), medyatör olarak dimetilaminometil ferrosen (DMAMFc), apo-enzimin yeniden yapılandırılması yönteminde ise iletken polimer olarak polianilin (PAn) ile modifikasyon yapılmıştır. İmmobilizasyon işlemlerinin verimini arttırmak amacıyla her immobilizasyon yöntemine özgü immobilizasyon parametreleri incelenmiştir. Apo-enzimin yeniden yapılandırılması yönteminde stabilizasyon problemi ile karşılaşıldığı için immobilizasyon parametreleri üzerinde çalışılamamıştır.pH ve sıcaklık gibi çevresel koşulların hazırlanan enzim tabanlı elektrotların performansına etkisi bir elektrokimyasal potansiyostat-galvanostat sisteminde kronoamperometri (CA) yöntemiyle incelenmiştir. Enzim elektrotların kalibrasyon eğrileri çıkartılarak kinetik parametreler (Imax, Km) hesaplanmıştır. Buna göre elektrokimyasal immobilizasyon yöntemiyle hazırlanan enzim elektrodunun Km değeri 7 mM, Imax değeri 833 µA, kovalent bağlama yöntemiyle hazırlanan enzim elektrodunun Km değeri 19.87 mM, Imax değeri 1250 µA, apo-enzimin yeniden yapılandırılmasıyla hazırlanan enzim elektrodunun Km değeri 27.4 mM, Imax değeri 2000 µA olarak bulunmuştur.Kovalent bağlama ve elektrokimyasal immobilizasyon yöntemleri ile hazırlanan enzim elektrotları biyoyakıt hücresinde test edilmiştir. Biyoyakıt hücresinin performansı, akım-voltaj karakteristiğini veren değerlendirmeler ile sunulmuştur. Bu sonuçlara göre kovalent bağlama ile oluşturulan biyoanodun bağlı olduğu biyoyakıt hücresinde açık devre potansiyeli (OCP) 333 mV, kısa devre akım yoğunluğu 18.17 µA/cm2 (0.85 ? direnç altında), maksimum güç yoğunluğu 0.9 µW/cm2; elektrokimyasal immobilizasyon ile oluşturulan biyoanodun bağlı olduğu biyoyakıt hücresinde ise açık devre potansiyeli (OCP) 456 mV, kısa devre akım yoğunluğu 13.30 µA/cm2 (0.85 ? direnç altında), maksimum güç yoğunluğu 0.88 µW/cm2 olarak bulunmuştur.Son olarak farklı immobilizasyon yöntemleri ile hazırlanan enzim elektrotlarının yüzeyleri AKM ve FTIR teknikleri ile topografik ve kimyasal olarak karakterize edilmiştir.Bu çalışma ile dünyada son dönemde hızlı bir gelişme sürecine giren enzim tabanlı yakıt pili teknolojisinde ve hemen her alanda kullanılma imkanı bulan biyosensörlerin gelişiminde farklı enzim immobilizasyon yaklaşımları ile elektrot performansının değerlendirmesi sunulmuştur. This study aims to develop electrical conductivity of glucose oxidase based (GOD) enzyme electrode for biosensors and biofuel cells applications which has become more important.For this purpose, the design of glucose oxidase based enzyme electrode which is based on development of electrical conductivity between the redox active center of enzyme and the electrode prepared by different enzyme immobilization techniques has been proposed.In the scope of thesis, the design studies of GOD enzyme electrode including covalent bounding, electrochemical immobilization and reconstitution of apo-enzyme techniques have been presented. The enzyme electrodes prepared by different immobilization techniques were compared with each other.To increase the electron transfer between the redox center of enzyme and electrode, in the covalent bounding and electrochemical immobilization techniques the mediator molecules, in the reconstitution of apo-enzyme technique direct electron transfer were used.Polipyrrole (PPy) as conductive polymer and dimethyl aminomethyl ferrocene (DMAMFc) as mediator were used in the covalent bounding and electrochemical immobilization techniques. Polyaniline as conductive polymer was used in the reconstitution of apo-enzyme technique. For increasing the efficiency of immobilization, some parameters of immobilization were studied. Immobilization parameters of reconstitution of apo-enzyme technique couldn?t be studied due to stabilization problem of this technique.The effects of environmental factors such as pH and temperature on enzyme based electrodes were investigated by chronoamperometry (CA) technique in electrochemical potantiostat-galvanostat system. Calibration curves of enzyme electrodes were plotted and the kinetic parameters (Km, Imax) were calculated. For the enzyme electrode prepared by electrochemical immobilization, Km is 7 mM and Imax is 833 µA. For the prepared enzyme electrode by covalent bounding, Km is 19.87 mM, Imax is 1250 µA. For the third one, theenzyme electrode prepared by the reconstitution of apo-enzyme, Km is 27.4 mM, Imax is 2000 µA.Prepared enzyme electrodes by covalent bounding and electrochemical immobilization techniques were tested on a biofuel cell. The performance of the biofuel cell was discussed from its current-potential characteristics. According to this result, biofuel cell consist of prepared bioanode by covalent bounding open circuit potential (OCP) is 333 mV, short circuit current density was 18.17 µA/cm2 (under 0.85 ? resistance) and maximum power density was 0.9 µW/cm2. Biofuel cell consist of prepared bioanode by electrochemical immobilization open circuit potential (OCP) is 456 mV, short circuit current density was 13.30 µA/cm2 (under 0.85 ? resistance) and maximum power density was 0.88 µW/cm2.Finally, the surfaces of prepared enzyme electrodes by different immobilization techniques were characterized as topografhical and chemical by AFM and FTIR.With this study the performances of enzyme electrodes which prepared by different immobilization techniques on biofuel cells and biosensors were presented. 121

Bu tez projesi kapsamında, üç farklı glukoz biyosensörü tasarlandı. Piranoz oksidaz (POx) ve glukoz oksidaz (GOx) enzimleri farklı immobilizasyon metodlarıyla elektrot yüzeyine immobilize edildi. Bu sistemlere yönelik optimizasyon ve karakterizasyon çalışmaları yapıldı.Poliamidoamin (PAMAM) temelli piranoz oksidaz biyosensörüne yönelik yapılan optimizasyon çalışmalarına göre optimum enzim miktarı ve pH; 9,4 U ve 6 olarak bulundu. Bu koşullarda, glukoz için doğrusal tayin aralığı 0,025 mM-0,5 mM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde 0,3 mM glukoz için tekrarlı 7 ölçüm alındı. Standard sapma (S.D) ve varyasyon katsayısı (c.v) ± 0,011 mM ve % 3,57 olarak bulundu. Operasyonel kararlılığın belirlenmesi amacıyla belirli aralıklarla 9 gün boyunca ölçüm alındı. İlk 2 günde alınan 30 ölçüm sonunda aktivite kaybı gözlenmedi. 9 günde alınan 80 ölçüm sonunda biyosensör cevabının % 50 azaldığı gözlendi. Tekrar üretilebilirlik ve substrat spesifikliği belirlendi. Ayrıca bu sistem FIA sistemiyle kombine edildi. Bu sistemde aynı koşullar altında, glukoz için doğrusal tayin aralığı 0,025 mM-1 mM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde 0,5 mM glukoz için tekrarlı 10 ölçüm alındı. Standard sapma (S.D) ve varyasyon katsayısı (c.v) ± 0,019 mM ve % 3,69 olarak bulundu. Operasyonel kararlılığın belirlenmesi amacıyla 6 saat boyunca 15 ölçüm alındı ve biyosensör cevabının % 9,3 oranında azaldığı gözlendi. Tekrar üretilebilirlik ve substrat spesifikliği belirlendi.Altın nanopartikül (AuNP)-polianilin (PANI)/AgCl/jelatin nanokompozit temelli piranoz oksidaz biyosensörü ikinci sistem olarak geliştirildi. Yapılan optimizasyon çalışmalarına göre optimum enzim miktarı ve pH; 0,75 U ve 6,5 olarak bulundu. Bu koşullarda, glukoz için doğrusal tayin aralığı 0,05 mM-0,75 mM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde 0,25 mM glukoz için tekrarlı 6 ölçüm alındı. Standard sapma (S.D) ve varyasyon katsayısı (c.v) ± 0,005 mM ve % 2,16 olarak bulundu. Operasyonel kararlılığın belirlenmesi amacıyla 6 saat boyunca 8 ölçüm alındı ve biyosensör cevabının % 12 oranında azaldığı gözlendi. AuNP'nin biyosensör cevabına etkisi ve substrat spesifikliği belirlendi. Son olarak biyosensör, doğal örneklerdeki glukoz miktarının analizi için kulanıldı. Biyosensörden elde edilen veriler referans metod olarak spektrofotometrik Trinder reaksiyonuna dayanan ticari glukoz deney kitlerinden elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldı.Manyetik Fe3O4 nanopartikül temelli glukoz oksidaz biyosensörü üçüncü sistem olarak geliştirildi. Yapılan optimizasyon çalışmalarına göre optimum biyonanopartikül miktarı ve pH; 10 µL ve 6 olarak bulundu. Bu koşullarda, glukoz için doğrusal tayin aralığı 0,25 mM-2 mM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik denemelerinde 2 mM glukoz için tekrarlı 10 ölçüm alındı. Standard sapma (S.D) ve varyasyon katsayısı (c.v) ± 0,051 mM ve % 2,51 olarak bulundu. Operasyonel kararlılığın belirlenmesi amacıyla 6 saat boyunca 15 ölçüm alındı ve biyosensör cevabının % 17 oranında azaldığı gözlendi. Son olarak biyosensör, doğal örneklerdeki glukoz miktarının analizi için kulanıldı. Biyosensörden elde edilen veriler referans metod olarak spektrofotometrik Trinder reaksiyonuna dayanan ticari glukoz deney kitlerinden elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldı.Anahtar Kelimeler: Glukoz biyosensörü, piranoz oksidaz (POx), glukoz oksidaz (GOx), poliamidoamin (PAMAM), altın nanopartikül (AuNP), polianilin (PANI), nanokompozit, Fe3O4 manyetik nanopartikül. In this project, tree different glucose biosensors were designed. Pyranose oxidase (POx) and glucose oxidase (GOx) enzymes were immobilized on to electrode surfaces via different immobilization methods. Optimization and characterization studies were carried out by glucose substrate.According to the optimization studies, for the polyamidoamine (PAMAM) based pyranose oxidase biosensor, optimum enzyme amount and pH were found to be as 9.4 U and 6.0. Under these conditions, linearity for the glucose was in the range of 0.025 mM and 0.5 mM. As for the repeatability, 7 subsequent measurements were taken for 0.3 mM glucose. Standard deviation (S.D) and coefficient of variation (c.v) were calculated as ± 0.011 mM and 3.57 %. For the operational stability, sensor responses were followed during 9 days. First 2 days 30 measurement were carried out and any drop wasn?t observed. At the end of this period 80 measurement were carried out and 50 % drop was observed. Reproducibility and substrate specifity of the proposed system was investigated. Also this system was combined FIA. Under same conditions, linearity for the glucose was range of 0.025 mM and 1 mM. As for the repeatability, 10 subsequent measurements were taken for 0.5 mM glucose. Standard deviation (S.D) and coefficient of variation (c.v) were calculated as ± 0.0189 mM and 3.69 %. For the operational stability, sensor responses were followed during 6 hours, 15 measurements were carried out and only 9.3 % drop was observed at the end of this period.Pyranose oxidase biosensor based on gold nanoparticles (AuNP)- polyaniline(PANI)/AgCl/gelatin nanocomposite has been developed for the second biosensor system. According to the optimization studies, optimum enzyme amount and pH were found to be as 0.75 U and 6.5. Under these conditions, linearity for the glucose was in the range of 0.05 mM and 0.75 mM. As for the repeatability, 6 subsequent measurements were taken for 0.25 mM glucose. Standard deviation (S.D) and coefficient of variation (c.v) were calculated as ± 0.005 mM and 2.16 %. For the operational stability, sensor responses were followed during 6 hours 8 measurements were carried out and 12 % drop was observed at the end of this period. Substrate specifity of the proposed system and effect of AuNP to biosensor response was investigated. Finally, proposed biosensor was used to analyze glucose content in real samples. Obtained data from the biosensing system was compared with a commercial enzyme assay kit based on spectrophotometric Trinder rection as a reference method.Glucose oxidase biosensor based on magnetic Fe3O4 nanoparticles (Nano- Fe3O4) has been developed for the third biosensor system. According to the optimization studies, optimum bionanoparticle amount and pH were found to be as 10 µL and 6.0. Under these conditions, linearity for the glucose was in the range of 0.25 mM and 2 mM. As for the repeatability, 10 subsequent measurements were taken for 2 mM glucose. Standard deviation (S.D) and coefficient of variation (c.v) were calculated as ± 0.051 mM and 2.51 %. For the operational stability, sensor responses were followed during 6 hours 15 measurements were carried out and 17 % drop was observed at the end of this period. Finally, proposed biosensor was used to analyze glucose content in real samples. Obtained data from the biosensing system was compared with a commercial enzyme assay kit based on spectrophotometric Trinder rection as a reference method.Keywords: Glucose biosensor, pyranose oxidase (POx), glucose oxidase (GOx), polyamidoamine (PAMAM), gold nanoparticle (AuNP), polianiline (PANI), nanocomposite, Fe3O4 magnetic nanoparticle. 87

Enzimlerin katalitik özelliklerinin geliştirilmesinde kullanılan ve iyi bilinen stratejilerden biride biyobaskılamadır. Son zamanlarda, baskılamanın ve enzim immobilizasyon metotlarının bir kombinasyonu olan, çapraz bağlı baskılanmış proteinler (CLIP) tekniği tanımlanmıştır. Bu teknik, enzimde önceden kararlaştırılmış seçicilikte, tanıma bölgelerinin oluşturulmasında kullanılabilir. CLIP formundaki enzimler, substrat veya ürün spesifikliğinde değişim; termal, pH ve organik çözücü stabilitelerinde de artış gösterirler. Bu çalışmada çapraz bağlı baskılanmış glukoz oksidaz (GOD) hazırlanarak (CLI-GOD), GOD enziminin termal ve pH stabilitesi ile substrat affinitesinin arttırılması amaçlanmıştır. Çapraz bağlı baskılanmış GOD, kombinasyonel çapraz bağlı baskılama yaklaşımı (CLIP) kullanılarak üç adımda hazırlanmıştır. CLIP tekniğindeki ilk adım, glukoz oksidaz üzerinde polimerize olabilir vinil gruplarının oluşturulmasıdır. İtakonik anhidrit esas olarak proteinlerdeki lizin aminoasitlerinin primer amino gruplarıyla ve çok daha az oranda da tirozin aminoasitlerinin hidroksil grupları ve sistein aminoasitlerinin sülfhidril gruplarıyla açillenme reaksiyonu vermektedir. Daha sonraki adımda ise türevlendirilmiş GOD, fosfat tamponu içerisinde kosubstratsız (oksijen) ortamda kendi substratı olan D-glukoz ile muamele edildi. GOD-Glukoz kompleksi n-propanol ile çöktürüldü. Elde edilen protein pelleti liyofilize edildi. Bu ikinci adımda, kontrol örneği de glukoz olmaksızın aynı işleme tabii tutuldu. Son adımda ise GOD-Glukoz kompleksi, kuru siklohekzan içerisinde çapraz bağlayıcı olarak etilen glikol dimetilakrilat (EGDMA) ve başlatıcı olarak ta 2,2'-azo-bisizobütirilnitril (AIBN) kullanılarak radikal polimerizasyona sokuldu. Spesifik glukoz-GOD etkileşimleriyle oluşturulan, indüklenmiş baskılanmış kalıbın, çöktürme süresince korunduğu ve sonuçta oluşan modifiye aktif kısmın, organik çözücü içerisinde, kovalent çapraz bağlama ile “kararlaştırıldığı” gösterilmiştir. Saf GOD enzimi, çapraz bağlı baskılanmış GOD enzimi ve kontrol örneğinin (çapraz bağlı baskılanmamış GOD) aktiviteleri dinitrosalisilik asit (DNSA) metoduyla belirlenmiştir. Doğal glukoz oksidaza kıyasla, çapraz bağlı baskılanmış glukoz oksidazın termal ve pH stabilitesinde, ve ayrıca substrat affinitesinde (Km saf-GOD: 140,9 mM; Km CLI-GOD: 83,3 mM) bir artışın olduğu gösterilmiştir. Çapraz bağlı baskılanmış GOD ve kontrol örneğinin aktivitelerinin sırasıyla 3,52 U/mg.protein ve 1,81 U/mg.protein olduğu gösterilmiştir. Saf enzim iki ay sonunda başlangıç aktivitesinin % 68’ini yitirirken, CLI-GOD enzimi ise başlangıç aktivitesinin sadece % 5’lik kısmını yitirmiştir. Biyoteknolojik uygulamalar açısından, elde edilen bu sonuçlar büyük ekonomik önem taşımaktadır.

Enzimlerin katalitik özelliklerinin geliştirilmesinde kullanılan ve iyi bilinen stratejilerden biride biyobaskılamadır. Son zamanlarda, baskılamanın ve enzim immobilizasyon metotlarının bir kombinasyonu olan, çapraz bağlı baskılanmış proteinler (CLIP) tekniği tanımlanmıştır. Bu teknik, enzimde önceden kararlaştırılmış seçicilikte, tanıma bölgelerinin oluşturulmasında kullanılabilir. CLIP formundaki enzimler, substrat veya ürün spesifikliğinde değişim; termal, pH ve organik çözücü stabilitelerinde de artış gösterirler.Bu çalışmada çapraz bağlı baskılanmış glukoz oksidaz (GOD) hazırlanarak (CLI-GOD), GOD enziminin termal ve pH stabilitesi ile substrat affinitesinin arttırılması amaçlanmıştır. Çapraz bağlı baskılanmış GOD, kombinasyonel çapraz bağlı baskılama yaklaşımı (CLIP) kullanılarak üç adımda hazırlanmıştır. CLIP tekniğindeki ilk adım, glukoz oksidaz üzerinde polimerize olabilir vinil gruplarının oluşturulmasıdır. İtakonik anhidrit esas olarak proteinlerdeki lizin aminoasitlerinin primer amino gruplarıyla ve çok daha az oranda da tirozin aminoasitlerinin hidroksil grupları ve sistein aminoasitlerinin sülfhidril gruplarıyla açillenme reaksiyonu vermektedir. Daha sonraki adımda ise türevlendirilmiş GOD, fosfat tamponu içerisinde kosubstratsız (oksijen) ortamda kendi substratı olan D-glukoz ile muamele edildi. GOD-Glukoz kompleksi n-propanol ile çöktürüldü. Elde edilen protein pelleti liyofilize edildi. Bu ikinci adımda, kontrol örneği de glukoz olmaksızın aynı işleme tabii tutuldu. Son adımda ise GOD-Glukoz kompleksi, kuru siklohekzan içerisinde çapraz bağlayıcı olarak etilen glikol dimetilakrilat (EGDMA) ve başlatıcı olarak ta 2,2'-azo-bis-izobütirilnitril (AIBN) kullanılarak radikal polimerizasyona sokuldu. Spesifik glukoz-GOD etkileşimleriyle oluşturulan, indüklenmiş baskılanmış kalıbın, çöktürme süresince korunduğu ve sonuçta oluşan modifiye aktif kısmın, organik çözücü içerisinde, kovalent çapraz bağlama ile ?kararlaştırıldığı? gösterilmiştir. Saf GOD enzimi, çapraz bağlı baskılanmış GOD enzimi ve kontrol örneğinin (çapraz bağlı baskılanmamış GOD) aktiviteleri dinitrosalisilik asit (DNSA) metoduyla belirlenmiştir.Doğal glukoz oksidaza kıyasla, çapraz bağlı baskılanmış glukoz oksidazın termal ve pH stabilitesinde, ve ayrıca substrat affinitesinde (Km saf-GOD: 140,9 mM; Km CLI-GOD: 83,3 mM) bir artışın olduğu gösterilmiştir. Çapraz bağlı baskılanmış GOD ve kontrol örneğinin aktivitelerinin sırasıyla 3,52 U/mg.protein ve 1,81 U/mg.protein olduğu gösterilmiştir. Saf enzim iki ay sonunda başlangıç aktivitesinin % 68'ini yitirirken, CLI-GOD enzimi ise başlangıç aktivitesinin sadece % 5'lik kısmını yitirmiştir. Biyoteknolojik uygulamalar açısından, elde edilen bu sonuçlar büyük ekonomik önem taşımaktadır. Bioimprinting is one of the well-known strategies to manipulate the catalytic properties of the enzymes. Recently, a technique of crosslinked imprinted proteins (CLIP) has been described with a combination of imprinting and enzyme immobilization methods. This technique can be used for the production of recognition sites with predetermined selectivity in the enzyme. The CLIP enzymes show altered substrate or product specificity, enhanced thermal, pH and organic solvents stability.The aim of this study is preparation of crosslinked imprinted glucose oxidase (CLI-GOD) for improving its thermal and pH stability, and also substrate affinity. Crosslinked imprinted GOD is prepared in three steps by combinatorial crosslinked imprinting approach (CLIP). The first step of the CLIP technique is to introduce polymerizable vinyl groups into glucose oxidase. Itaconic anhydride acylate mainly primary amino groups of lysine residues of proteins and to much lesser extent hydroxyl groups of tyrosine and sulfhydryl groups of cysteine residues. Subsequently, derivatized GOD was treated with D-glucose, enzymes substrate, in the absence of cosubstrate (oxygen) in phosphate buffer. The GOD-glucose complex was precipitated by using n-propanol. The resulting protein pellet was lyophilized. In this second step, control is subjected to the same process without glucose. In the final step, GOD-glucose complex was polymerized radically in dry cyclohexane by using ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as a crosslinker and 2,2'-azo-bis-izobütirilnitril (AIBN) as the initiator. It was demonstrated that the induced imprinted memory created for specific glucose?GOD interactions was preserved during precipitation and the resultant modified active site was ?frozen? by covalent cross-linking carried out in organic solvent. The activities of native enzyme, crosslinked imprinted GOD enzyme and control sample (crosslinked non-imprinted GOD) are determined by dinitrosalicylic acid (DNSA) assay.We demonstrated an important increase of thermal and pH stability, and also substrate affinity (Km native-GOD: 140.9 mM; Km CLI-GOD: 83.3 mM) of crosslinked imprinted glucose oxidase compared to native glucose oxidase. Crosslinked imprinted glucose oxidase and control activities are found as 3.52 U/mg.proteins and 1.81 U/mg.proteins respectively. After two months, while pure enzyme lost 68 % of it?s initially activity, the CLI-GOD lost only 5 % of it?s initially activity. The economical outcomes of the results which we obtained may be very promising in terms of biotechnological applications. 118

Bu çalışmada, çeşitli silan bileşikleri içeren sol-jel kaplama çözeltileri kullanılarak sol-jel modifiye elektrotlar hazırlandı. Filmlerin yapışma özellikleri üzerine kurutma süresi, kurutma sıcaklığı ve kaplama çözeltilerinin bileşiminin etkileri sistematik olarak incelendi ve optimize edildi.H2O2 ve dopamin için hazırlanan sol-jel modifiye elektrotların sensör karakteristikleri incelendi. Sol-jel bileşimi, film kalınlığı, potansiyel, elektrolit tür ve konsantrasyonu gibi sensör yanıtını etkileyen deneysel parametreler sistematik olarak incelendi ve optimize edildi. Sol-jel modifiye elektrotların H2O2 ve dopamin sensör olarak kullanılabileceği görüldü.Sol-jel matrikslere glikoz oksidazı immobilize etmek suretiyle sol-jel/enzim elektrotlar da hazırlandı. Sol-jel/enzim elektrotların amperometrik yanıtı üzerine film kalınlığı, enzim miktarı, potansiyel, pH, interferans gibi faktörlerin etkileri incelendi ve optimize edildi. Optimal enzim elektrotlar için amperometrik sensör karakteristikleri (duyarlılık, doğrusallık, seçicilik, yanıt süresi ve kararlılık) belirlendi. Enzim elektrotlar için elde edilen bulguların tatmin edici olduğu gözlendi.Sonuç olarak, anılan sol-jel kaplamaların sensör tasarımında alternatif membran olarak kullanılabileceği iddia edilmektedir. In this study, sol-gel-modified electrodes were prepared by using sol-gel coating solutions containing various silane compounds. The effects of drying period, drying temperature and composition of coating solutions on the adhesive properties of films were systematically examined and optimized.The sensor characteristics of the prepared sol-gel modified electrodes for H2O2 and dopamine were checked. The experimental parameters affecting sensor response such as sol-gel composition, film thickness, potential, electrolyte type and concentration were systematically investigated and optimized. It was seen that the sol-gel modified electrodes could be used as H2O2 and dopamine sensor.Moreover, sol-gel/enzyme electrodes were prepared by immobilizing glucose oxidase in the sol-gel matrices. The effects of factors such as film thickness, enzyme amount, potential, pH, interference on the amperometric response of the sol-gel/enzyme electrodes were examined and optimized. The amperometric sensor characteristics (sensitivity, linearity, selectivity, response time and stability) for the optimal enzyme electrodes were determined. It was observed that the obtaining findings for the enzyme electrodes were satisfactory.As a result, it has been claimed that the mentioned sol-gel coatings could be used as an alternative membrane in the sensor design. 140

Bu çalışmada, süne zararına uğramış buğday ununda glikoz oksidaz (GO), heksoz oksidaz (HO), sitrik asit (SA) katkı maddelerinin tek başlarına ve kombinasyonlarının kullanılmasının ekmek nitelikleri (hacim [1], gözenek değeri [2], yükseklik [3], taban çapı [4], yükseklik/taban çapı [5], ekmek içi yumuşaklığı [6] ve nem içeriği [7]) üzerindeki etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bunun için, ekmek hamuru hazırlanmasında; katkı maddesi olarak, mono ve digliseridlerin diasetil tartarik asit esterleri (DATEM), şeker, L-askorbik asit ve transglutaminazın yanısıra değişen miktarlarda GO (0, 15, 30 ve 45 mg/kg), HO (0, 15, 30 ve 45 mg/kg) ve SA (0, 75, 150 ve 225 mg/kg) kullanılarak araştırmada toplam 64 farklı ekmek üretimi gerçekleştirilmiştir.Elde edilen bulgulara göre, başta HO olmak üzere GO ve diğer katkı maddeleri ekmek niteliklerini önemli ölçüde (p

Bu çalışmada, oksidoredüktaz enzimlerin, hazırlanan ve karakterize edilen farklıpoliimid materyallerdeki immobilizasyonu incelenmiştir.Glukoz oksidaz enziminin ilgili matrikslerde başarılı bir şekilde immobilize edildiğibulunmuştur. Polimerik matrikslerdeki immobilizasyonu etkileyen parametreler (polimerik filmkalınlığı, enzim miktarı, ortam pH'sı, vb.) sistematik olarak incelenerek, poliimid-GOx esaslıbiyosensörler hazırlanmıştır. Daha sonra, hazırlanan biyosensörlerin, duyarlılık, doğrusallık,seçicilik, yanıt süresi ve kararlılık gibi sensör karakteristikleri belirlenmiştir.Sonuç olarak, değişik poliimid türevlerinin, biyosensör tasarımında alternatifimmobilizasyon materyalleri olarak kullanılabileceği iddia edilmektedir. In this study, the immobilization of oxido-reductase enzymes in the prepared andcharacterized various polyimide materials was investigated.It has beeen found that glucose oxidase enzyme was successfully immobilized in therelevant matrices. By systematically examining the parameters (polymeric film thickness,enzyme amount, medium pH, eg.) affecting immobilization in the polymeric matrices,polyimide-GOx based biosensors have been prepared. Then, the sensor characteristics such assensitivity, linearity, selectivity, response time and stability of the prepared biosensors havebeen determined.As a result, it has been claimed that various polyimide derivatives could be used asalternative immobilization materials for the biosensor design. 120

Glukonik asit ve türevleri gıda, ilaç, tekstil, deterjan, deri, yapı ve diğer biyolojik endüstrilerde kullanılan önemli maddelerdir. Bu çalışmada, çalkalamalı erlenlerde immobilize glukoz oksidaz enzimi kullanılarak glukonik asit üretiminin en uygun koşulları araştırılmıştır. Glukoz oksidaz, hapsetme yöntemiyle Ca-alginat jellerde immobilize edilmiştir. Silikon ve soya yağlarının aktiflik üzerine etkisi incelenmiştir. Serbest ve immobilize enzim için spesifik aktiviteler sırasıyla 2,6 x10-2 U/mg ve 1,7x10-2 U/mg bulunmuştur. %4 (v/v) silikon yağı veya soya yağı kullanıldığında, bu yağların kullanılmadığı ortama göre immobilize glukoz oksidazın aktifliği, sırasıyla 1,69 ve 1,33 kat artmıştır. Gluconic acid and derivatives are important compounds that are used in food, pharmaceutical, textile, detergent, leather, construction and other biological industries. In this study, optimum conditions for production of gluconic acid were investigated by using immobilized glucose oxidase enzyme in shake flasks. Glucose oxidase was immobilized in alginate gels with the method of entrapment. Effects of silicone oil and soybean oil on production of gluconic acid was studied. The specific activities were found 2,6x10-2 U/mg and 1,7x10-2 U/mg, for free and immobilized enzyme, respectively. When 4 % (v/v) silicone oil or soybean oil were used, the activity of immobilized glucose oxidase increased 1,69 times and 1,33 times, compared to media without these oils, respectively. 99

Tekstil ön terbiye işlemlerinde enzim kullanımının konvansiyonel hasıl sökme, hidrofilleştirme, ağartma ve boyama proseslerine göre avantajları; daha az kimyasal kullanımı, daha çevreci olması, su ve enerji tasarrufu sağlamasıdır. Bu çalışmada; nişasta haşıllı pamuklu kumaşların hasıl sökme, hidrofilleştirme, ağarma ve boyama işlemlerinin enzim kullanımı ile tek banyoda yapılmıştır. Bu yönteme “tek banyo yöntemi” denilmiştir. Çalışmanın ilk aşamasında, konvansiyonel hasıl sökme proseslerinde kullanılan amilaz esaslı enzimler yerine amiloglikozidaz/pullulenaz karısımı enzim (Dextrozyme DX, Novozymes) ile nişastanın tamamen glikoza parçalanması için çalışma şartlarının optimizasyonu yapılmıştır. Çalışmanın ikinci aşamada, hasıl sökme banyosundaki glikozdan glikoz oksidaz enzimi ile hidrojen peroksit eldesi ve bu hidrojen peroksit ile maksimum beyazlık derecesinin elde edildiği ağartma işlem koşulları saptanmıştır. Çalışmanın üçüncü aşamasında ise, ağartma işlemi sonunda katalaz enzimi ile hidrojen peroksitin giderimi ve aynı banyoda reaktif boyalarla boyama işlemi yapılmıştır. Bu işlemin ardından tek banyo yönteminin konvansiyonel yönteme göre avantajları ve dezavantajları tartışılmıştır. Ayrıca farklı metotlarla immobilize edilen glikoamilaz ve Glkoz oksidaz enzimlerinin etkinliği de araştırılmıştır. The advantages of biotechnology are: less auxiliary demand; lower environmental impact; and energy and water savings compared to the conventional desizing, scouring, bleaching and dyeing sequence. The objective of this study was to develop a new process for desizing, scouring, bleaching and dyeing starch-sized cotton fabrics in one bath with enzymatic processes. This process is called “one bath method.” In the first step of this study, process optimization was done for desizing which was performed with an amyloglucosidase/pullanase enzyme (Dextrozyme DX, manufactured by Novozymes) instead of a conventional amylase enzyme in order to hydrolyze starch into single glucose units. In the second step of this study, glucose oxidase enzyme was used to yield hydrogen peroxide from the glucose generated during desizing and bleaching was performed by this enzymatically-generated hydrogen peroxide to ensure maximum whiteness. In the third step of this study, decomposition of hydrogen peroxide after bleaching was done with catalase enzyme and fabric was dyed in the same bath with reactive dyes. The advantages and disadvantages of one bath method compared with conventional process was discussed. And also, amyloglicosidase and glucose oxidase enzymes immobilizations were done by different methods and its effect on effectiveness were examined. Novozymes Genencor Cargil A.Ş.

ÖZET Bu araştırmanın amacı, glikoz oksidaz(GO) enziminin tek basma veya bazı katkılarla kombinasyonlannm hamur reolojisi ve ekmek kalitesine etkilerini belirlemektir. Bu amaçla glikoz oksidaz ile kombinasyon yapılmak üzere, hamur geliştirici olarak kullanılan askorbik asit(AA) ve son zamanlarda özellikle kuvvetli unlarda kullanılan hemiselülaz(HS) enzimi seçilmiş ve denemelerde Tip 650 un kullanılmıştır. Sonuçlar göstermiştir ki, genellikle bütün katkıların tek kullanımları, kontrole göre iyi ekmek özellikleri vermiştir. İkili kombinasyonlarda ise GO ile AA uygulamalarında ekmek özellikleri ve bayatlama değeri açısından çok iyi sonuçlar elde edilmiştir. GO ile HS kombinasyonunda ise kontrole göre özgül ekmek hacmi, 2 ppm GO + 20 ppm HS(G1H1) ile 6 ppm GO + 20 ppm HS(G3H1) uygulamalarında, daha düşük bulunmuştur. 72 saat sonunda 6 ppm GO + 35 ppm HS(G3H2) kontrolden daha sert ekmek içi özellikleri tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre; GO+AA kombinasyonları, ekmek özellikleri üzerine GO + HS kombinasyonlarından daha etkili olmuştur. Özellikle 4 ppm GO + 10 ppm AA (G2A1) kombinasyonu tavsiye edilebilir. Anahtar Kelimeler: Glikoz oksidaz, askorbik asit, hemiselülaz, hamur, ekmek, bayatlama u ABSTRACT THE EFFECTS OF GLUCOSE OXIDASE ON THE DOUGH RHEOLOGY AND BREAD QUALITY The aim of this research was to determine the effects of glucose oxidase(GO) used alone or combination with other additives on the dough rheology and bread quality. With this aim, ascorbic acid(AA) used as dough improvement and hemicellulase(HS) used in strong flour recently were selected as other additives and Type 650 flour was used in trials. The results showed that alone usage of all additives were generally better than control. In the combined applications, highly good results were obtained in GO + AA combined applications with respect to bread properties and staling. Specific loaf volumes determined in 2 ppm GO + 20 ppm HS(GIHI) and 6 ppm GO + 20 ppm HS (G3H1) combined applications were lower than control. 6 ppm GO + 35 ppm HS (G3H2) combined application could not delay the staling of bread at the end of 72 hours according to control. According to the results obtained, GO + AA combined applications were more affective on the bread properties than GO + HS combined applications. Especially, 4ppm GO + lOppm AA(G2A1) combined application can be recommended. Key Words: Glucose oxidase, ascorbic acid, hemicellulase, dough, bread, staling 62

Bu çalışmada, aktif soya ununun ekmek üretimindeki performansım artırmak amacıyla lipaz ve glukoz oksidaz enzim katkılarının etkisi araştırılmıştır. Bu amaç doğrultusunda enzimce aktif soya unu (% 0 ve 0,5) katkılı Tip 550 ve Tip 650 unlara; glukoz oksidaz (% 0 ve 0.0016) ve lipaz (% 0 ve 0,002) enzimleri katkılanarak ekmek denemeleri yapılmıştır. Enzimce aktif soya unu; Tip 550 unlardan yapılan ekmeğin organoleptik özelliklerini düzeltirken, hem Tip 550 hem de Tip 650 unlardan yapılan ekmeklerde kabuk rengini koyulaşıp ekmek içini beyazlatmış ve bayatlamayı geciktirici etkide bulunmuştur. Ayrıca aktif soya unu Tip 650 unlarda ekmek hacmini artırmıştır. Glukoz oksidaz enzimi Tip 550 unlarda, ekstensograf enerji değerini düşürüp direnci artırmıştır. Tip 650 unlarda ise, ekmek hacmini ve simetriyi artırırken, kabuk rengini açıp, ekmek içi renginin koyulaşmasına sebep olmuştur. Lipaz enzimi, Tip 550 unlarda tüm ekstensograf özelliklerine olumlu etkide bulunurken, ekmek içi tekstürünü düzeltmiştir. Tip 650 unlardan yapılan ekmeklerde ise ekmeğin organoleptik özelliklerini ve hacmini artırırken, bayatlamayı geciktirmiştir. Tip 550 unlarda glükoz oksidaz ve lipazın kombine kullanımı ekstensografta enerji değerini artırmıştır. Tip 650 unlarda enzimce aktif soya ununun lipazla birlikte kullanılması en yüksek ekmek hacmini vermiştir. En geç ekmek bayatlaması tip 650 unlarda katkıların üçlü kombinasyonu ile, tip 550 unlarda ise; aktif soya ununun tek başına kullanılmasıyla elde edilmiştir., İn this study, the effects of the glucose oxidase (0 and 0,0016 %) and lipase (0 and 0,002 %) enzyme preparates on the performance of the fullfat active soy flour (0 and 0,5 %) addition on breadmaking properties. The full fat active soy flour addition increased the crust color intencity bleached the bread crumb and increased the crumb softness for both the type 550 and 650 bread flours. Also anhanced the organoleptic properties of the breads made with type 550 flour. Glucose oxidase enzyme preparate caused the decrease in extensograph energy while increasing the dough resistance. But for type 650 flour, glucose oxidase addition increased the loaf volume and simetry. It decreased the crumb color intencity with darker crumb color. The lipase addition increased the extensogram properties for type 550 flour. For type 650 flour, additionally increased the loaf volume, crumb softness and the other organoleptic properties. Glucose oxidase together with lipaseincreased the extensogram energy for type 550 flour. Enzyme active soy flour together with lipase enzyme addition increased the loaf volume for type 650 flour significantly. The all three additives caused the softness bread crumb for type 650 flour while the soy flour being more effective for type 550 flour.

ÖZET DOKTORA TEZİ ENZİM İMMOBİLİZASYONUNU TEMEL ALAN GLUKOZ BİYOSENSÖRLERİNİN GELİŞTİRİLMESİ Yasemin NUMANOĞLU Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof.Dr. Sibel SUNGUR Biyosensör, temel olarak biyolojik ve fizikokimyasal bileşenleri birleştiren ve geniş çeşitliliği olan bir sistemdir. Biyosensörlerde enzimlerin kullanımı elektrotların yüzeyinin immobilize enzim ile kaplanması yöntemiyle gerçekleştirilir. Çalışmada kullanılan glukoz oksidaz enzimi (p-D-Glukoz: Oksijen oksido redüktaz, E.C. 1. 1.3.4) moleküler oksijen varlığında J3-D-glukozun, hidrojen peroksit ve 5-glukanolaktona dönüşümünü katalizleyen enzimdir. Bu çalışmada gıda, içecek ve klinik tayinlerde kullanılmak üzere glukoz biyosensörü geliştirilmiştir. Glukoz oksidaz enzimi, jelatine gluteraldehit çapraz bağlayıcısı kullanılarak çapraz bağlama yöntemine göre immobilize edilmiştir. İmmobilizasyonda jelatinin yanında dolgu maddesi olarak poliakrilamit kullanılmıştır. Jelatin ve jelatin-poliakrilamit taşıyıcı sistemleri ile glukoz oksidaz eniziminin immobilizasyonu optimize edilerek en uygun biyosensörun geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada, serbest enzim, immobilize enzim ve immobilize glukoz oksidaz elektrodan kimyasal ve elektrokimyasal (arnperometrik) yöntemler kullanılarak karakterize edilmiş ve sonuçlar birbirleriyle karşılaştırmıştır. Sıcaklık, pH, çapraz bağlayıcı konsantrasyonu, enzim konsantrasyonu, tekrar kullanılabilirlik, termal inaktivasyon ve kinetik parameterlerin incelendiği çalışmada ayrıca biyolojik örneklerde bulunabilecek ürik asit biyosensörün tepkisini ne şekilde etkilediği araştırılmıştır. Bu çalışmada gıda, içecek ve klinik uygulamalarda glukoz tayini amacıyla daha önce literatürde yer almayan yeni bir glukoz biyosensörü geliştirilmiştir. Hızlı, hassas ve kullanımı pratik olan bu biyosensörün maliyeti oldukça düşük olup duyarlılığı değişmeden Sİ günlük bir süre boyunca en az 1 7 kez kullanılabileceği tespit edilmiştir. 2003, 122 sayfa ANAHTAR KELİMELER: Enzim immobilizasyonu, arnperometrik enzim elektrotu, glukoz oksidaz, jelatin, poliakrilamit, gluteraldehit, glukoz biyosensörü, immobilize glukoz oksidaz. ABSTRACT Ph. D. Thesis DEVELOPMENT OF GLUCOSE BİOSENSORS BASED ON ENZYME IMMOBILIZATION Yasemin NUMANO?LU Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Sibel SUNGUR Biosensors are systems that mainly combine biological and physicochemical components and also have a wide variety. Enzyme usage in biosensors is accomplished by coating the electrode surface with immobilized enzyme. The enzyme used in this work, glucose oxidase (p-D glucose: oxygen oxidoreductase, EC. 1. 1.3.4) catalysis the conversion of p-D glucose to hydrogen peroxide and 5-glucanolactone in the presence of molecular oxygen. In this work, a glucose biosensor was developed to be used in food, drink and clinical detections. Glucose oxidase was immobilized into gelatine with process polyacrylamide polymer was added to gelatine as filling material, it was aimed to optimise the immobilization of glucose oxidase onto gelatine and gelatine-polyacrylamide support systems to develop the most convenient biosensor. The free and immobilized enzymes and immobilized glucose oxidase biosensors were characterized using chemical and electrochemical methods (amperometric) and the results were compared. Temperature, pH, cross-linking agent concentration, enzyme concentration, reusability, thermal stability and kinetic active compaunds (uric acid, ascorbic, glycerine, NH4+ and NaCI and KCI ) on the response of biosensor was also investigated, in this study a new glucose oxidase biosensor, which have not previously been citied in literatüre, have been devoloped for determination of glucose in food, drink and clinical application. This fast responding, accurate and easily usable biosensor's production cost is low and can be used 17 times within 51 days without loosing its accuracy. Responding, accurate and easily usable biosensor's production cost is low and can be used 1 7 times within 5 1 days without loosing its accuracy. 2003,122 pages Key Words: Enzyme immobilizalion, amperometric enzyme electrode, glucose oxidase, gelatine, polyacrylamide, glutaraldehyde, glucose biosensor, immobilized glucose oxidase. 122

ÖZET Doktora Tezi PEKTİNİN ENZİM İMMOBİLİZASYONUNDA VE BİYOSENSÖRLERDE KULLANIMI Gülendem GÜNENDİ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman : Prof. Dr. Sibel SUNGUR Biyosensör, biyolojik tepkileri elektrik sinyaline dönüştüren ölçme cihazıdır. Bu sistem bir yandan biyolojik materyalin yüksek spesifîkliğini diğer tarafdan fiziksel sistemin tayin duyarlılığını birleştirmektedir. Biyoaktif materyal olarak enzim içeren biyosensörlere enzim elektrotları denmektedir. Enzim elektrodan; bir elektrot ve onun etrafında immobilize enzim tabakasından oluşmaktadır. Çalışmada; gıda ve klinik uygulamalarda önemli olan glukoz tayininda kullanılmak üzere hassas, özgün, hızlı, kolay, ucuz ölçüm yapabilen bir glukoz biyosensörü geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, Aspergillus niger'dea elde edilen glukoz oksidaz ((3-D-glukoz; oksijen oksiredüktaz, E.C. 1.1.3.4) enzimi kullanılmıştır. Glukoz oksidaz moleküler oksijen varlığında P-D-glukozun, hidrojen peroksit ve 5-D-glukanolaktona dönüşümünü katalizleyen enzimdir. Geliştirilen immobilize glukoz oksidaz elektrotunda enzim pektine krom III sülfat kullanarak çapraz bağlama yöntemine göre bağlanmıştır. Elde edilen immobilize enzim kullanılarak glukoz biyosensörü geliştirilmiştir. Serbest enzim ve immobilize glukoz oksidaz elektrotunun kimyasal ve elektrokimyasal yöntemlerle karakterizasyonu yapılmıştır, örneklerin pH, sıcaklık, çapraz bağlayıcı, pektin ve enzim konsantrasyonu, respons süresi, tekrar kullanılabilirlilik, depolama kararlılığı, termal inaktivasyonu, girişim veren maddelerin etkisi ve kinetik özellikler kimyasal ve elektrokimyasal yöntemler kullanılarak tayin edilmiş ve optimum sistem belirlenmiştir. 2003, 127 sayfa ANAHTAR KELİMELER: amperometrik enzim elektrotu, glukoz biyosensörü, glukoz oksidaz, pektin, krom III sülfat, immobilize glukoz oksidaz ABSTRACT Ph. D. Thesis USAGE OF PECTIN IN ENZYME IMMOBILIZATION AND BIOSENSORS Gülendem GÜNENDÎ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor : Prof. Dr. Sibel SUNGUR Biosensor is a device, which transforms biological responses into electrical signals, the combine the excellent specificity of biomaterials with the high sensitivity of physical instruments. Biosensors equipped with an enzyme as the bioactive component are called `enzyme electrodes`. Enzyme electrodes consist of an electrode coated with a layer of immobilized enzyme. In this study it was aimed to develop a specific, precise, fast responding, simple and cheap biosensor for glucose determination in food industry and clinical applications. The enzyme glucose oxidase (P-D-glucose; oxygen oxidoreductase, E.C. 1.1.3.4), extracted from Aspergillus Niger was used of for this purpose. This enzyme is known to catalyse the transformation of P-D-glucose into hydrogen peroxide and 5- D-glucanolactone in the presence of molecular oxygen. In the developed glucose oxidase electrode, enzyme was immobilized into pectin with chromium III sulphate using the cross-linking method. Glucose biosensor was developed using this immobilized enzyme. The free enzyme and immobilized glucose oxidase electrode were characterized by using chemical and electrochemical (amperometric) techniques. Temperature, pH, concentrations of cross-linking agent, pectin and enzyme, response time, reusability, storage stability, thermal stability, possible effects of interfering substances and the kinetic parameters of the enzyme electrode were studied using chemical and electrochemical methods and the optimum conditions were realized. 2003, 127 pages Key Words: amperometric enzyme electrode, glucose biosensor, glucose oxidase, pectin, chromium III sulphate, immobilized glucose oxidase 137

ÖZET YÜKSEK LİSANS TEZİ BAZI ENZİMLERİN SUBSTRAT, AKTİVATÖR VE İNHÎBİTORLERİ İLE KİNETİK PARAMETRELERİNİN TAYİNİ Betül LEYLEK Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Salih YILDIZ 2003, 6i sayfa Jüri: Prof. Dr. Salih YILDIZ Prof Dr. Tevfîk ATALAY Doç. Dr. Mustafa ERSÖZ Bu çalışmada Aspergillus Niger den elde edilen Glucose Oxidase enziminin P~D- glukozu enzimatik olarak yükseltgeme reaksiyonu, aerobik ortamda o-tolidini indikatör olarak kullanarak spektrofotometrik metot ile incelendi. Çalışmada inhibitörsüz veya aktivatörsüz denemelerin yanında değişik metal iyonlarının kullanıldığı denemeler de yapıldı. Bu metal iyonlarının reaksiyon üzerine etkisi incelendi ve bunlara ait kinetik parametreler tayin edildi. pH'ı 5,0 olan 0,5 M Asetat tamponunda, ortalama 27°C de I/ molibdat ve o- tolidin bulunan ortamda, inhibitor veya aktivatör kullanılmadan yapılan denemelerde 1^=2,08 İxl0`5 M ve Vm=2,725xl03 AA/sn olarak bulundu. Ni+/ Co+2 ve Mn+2 iyonları kullanılarak yapılan denemelerde Nı 2 iyonlarının reaksiyona herhangi bir inhibitor veya aktivatör etki göstermediği, Co+2 ve Mn+2 iyonlarının ise bu enzimatik reaksiyonu inhibe ettiği bulundu. Co!2 iyonun `Sınırlı- Yarışmalı` inhibisyon, Mn+2 iyonunun ise `Yarışmasız` inhibisyon meydana getirdiği tespit edildi. Co+2 iyonunun 2,00x1 0`4 M ve 3,00x1 0`4 M konsantrasyonları için K; değerleri sırasıyla 2,057x1 03 M`1 ve 0,835xl03 M`1, Mn+2 iyonunun 2,00x10`* M ve3,00xlO-4 M konsantrasyonları için Ki değerleri ise sırasıyla 2, 136x1 03 M`1 ve l?065x!03 M`1 olarak tayin edildi. ABSTRACT M. Sc. Thesis DETERMINATION OF KINETIC PARAMETERS WITH SUBSTRAT, ACTIVATOR AND INHIBITORS OF SOME ENZYMES Betül LEYLEK Selc-ak University Graduate School oi Sarural and Applied Science Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Salih YILDIZ 2003, Ci page Jury: Prof. Dr. Salih YILDIZ Prof. Dr. Tevfik ATALAY Doç. Dr. Mustafa ERSÖZ In this study, the enzymatic oxidation of £-D-glucose by Glucose Oxidase (GOD) enzym obtained from Aspergillus Niger by the use of o-tolidine indicator reactions under aerobic conditions were studied with a spectrophotometric method. In the study, various experiments have been carried out with different metal ions. Effect to reaction of this metal ions were investigated, and their kinetics parameters have been calculated. In 0,5 M acetate buffer with pH 5,0, the experiments made at the 27°C, under the condition in which there was I`, molybdate and o-tolidine Km was found as 2,081xl0`5 M. At the experiments made using Ni,jl, Co* and Mn `ions were »ccni that nc effect to reaction of Ni+2. It was found Mn+2 and Co+2 ions were also inhibited the enzymatic reaction. It was determined that Co+2 ions had uncompetitive inhibited. The inhibition consants Ki was calculated as 2,057xl03 M`1 at 2,00x1ü`4 M concentration and 0,835xl03 M`1 at 3,00x10`* M concentration for Co+2 ion, 2,136xl03 M'1 at 2,00x10`* M and l,065x!03 M`1 at 3,00x1 ir*M concentration for Mn+2 ion. 61

oz YÜKSEK LİSANS TEZİ EKMEK YAPIMINDA GLİKOZ OKSIDAZ KULLANILMASININ ETKİLERİ Fırat AYAŞ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Ali ALT AN Yıl:2003, Sayfa :61 Jüri Prof. Dr. Ali ALTAN Prof. Dr. A. Can ÜLGER Yrd. Doç. Dr. M. Sertaç Özer Bu çalışmada, glikoz oksidazın (GO) ekmek nitelikleri üzerindeki etkisinin incelenmesi ve askorbik asidin (AA) etkisi ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Bunun için, ekmek hamuru hazırlanmasında; katkı maddesi olarak, a-amilaz, DATEM ve glikoz şurubunun yanısıra değişen miktarlarda AA ve/ya da GO kullanılmıştır. Daha sonra, iki ayrı un kullanılarak üretilen ekmeklerin hacim verimleri (1), gözenek değerleri (2), Neuman pişme katsayıları (3), ekmek içi yumuşaklığı (4), yükseklik/taban çapı oram (5) ve nem içerikleri (6) belirlenmiştir. Elde edilen bulgulara göre, GO ve diğer katkı maddeleri ekmek niteliklerini önemli ölçüde etkilemektedirler (p

oz YÜKSEK LİSANS TEZİ EKMEK HAMURU YAPIMINDA GLİKOZ OKSIDAZ KULLANILMASININ ETKİLERİ Ayşe Pelin KÜÇÜK ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Ali ALTAN Yıl:2003, Savfa :98 Jüri Prof. Dr. Ali ALTAN Prof. Dr. A. Can ÜLGER Yrd. Doç. Dr. M. Sertaç ÖZER Bu çalışmada, glikoz oksidazın (GO) hamın- nitelikleri üzerindeki etkisinin incelenmesi ve askorbik asidin (AA) etkisiyle karşılaştırılması amaçlanmıştır. Ekmek hamuru hazırlanmasında; katkı maddesi olarak, glikoz şurubunun yanısıra, değişen miktarlarda AA ve/ya da GO kullanılmıştır. İki ayn un (zayıf ve nisbeten kuvvetli) kullanılarak unların farinogram (gelişme süresi, stabilite süresi, yoğurma tolerans sayısı ve yumuşama derecesi) ve hamurların ekstensogram (sabit deformasyondaki direnç (R5), maksimum direnç (Rmax), uzama yeteneği, enerji ve direnç/uzama ) değerleri ölçülmüştür. Elde edilen bulgulara göre, GO unların farinografik özelliklerini etkilememekte, ekstensografîk özelliklerini ise önemli ölçüde etkilemektedir. AA ise farinograf ve ekstensograf değerlerini etkilemektedir. GO, AA ve `GO + AA`nm uygun kullanım miktarları unun niteliklerine bağlı olarak değişmekte olup, denemede kullanılan niteliklere sahip unlar için GO'nun 30 mg/kg - 40 mg/kg, AA'nın 75 mg/kg - 100 mg/kg ve `GO + AA` nın `30 + 50` mg/kg ve `40 + 50` mg/kg düzeylerinin uygun olduğu, özellikle GO'nun daha yüksek düzeylerde kullanılmasının, glütenin aşın sertleşmesine (hamurun işleme mukavemetinin artmasına) yol açarak, hamurun sahip olduğu özelliklerde gerilemeye neden olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler : Hamur, Glikoz Oksidaz, Askorbik Asit, Oksidasyon, Enzimler m ABSTRACT M.Sc. THESIS THE EFFECTS OF THE USE OF GLUCOSE OXIDASE IN DOUGH MAKING Ayşe Pelin KÜÇÜK DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Ali ALT AN Year:2003, Pages :98 Jury Prof. Dr. Ali ALTAN Prof. Dr. A. Can ÜLGER Ass. Prof. Dr. M. Sertaç ÖZER The aim of this study was to investigate the effects of glucose oxidase (GO) and compare to that of ascorbic acid (AA) in dough properties. AA and GO was used as a food additives at different rates in adition to glucose syrup during dough preperation. Two different flours (low quality and relatively high quality) were prepared and dough development time, stability, mixing tolerance index and valorimeter values measured. Dough prepared and the resistance at a constant extension of 5 cm (R5), maximum resistence (Rmax), extensibility (E), area under the curve (A) and the ratio of maximum resistance to extension (Rmax/E) values were measured. The results showed that the use of GO did not effect the farinographic properties and significantly affectted the extensigraphic properties. AA effect the dough characteristics (farinographic and extensigraphic properties). The uses of optimum dosages of GO, AA and `GO + AA` were varied depending on flour characteristics. The optimum levels of these additives were determined as 30 mg/kg - 40 mg/kg for GO, 75 mg/kg - 100 mg/kg for AA and `30 + 50` mg/kg and `40 + 50` mg/kg for `GO + AA` for flours which were showing similar characeri sties to the flours used in the experiments. The use of higer dosages of GO, caused excessive hardening of gluten and decreased the characteristics values of dough. Key Words: Dough, Glucose Oxidase, Ascorbic Acid, Oxidation, Enzymes. rv 98

ÖZET Yüksek lisans Tezi KİTOSANA-DAYALI HİDROJELLERİN BAZI BÎYOTIP UYGULAMALARININ ÎNCELENMESİ Serap DURKUT Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Y. Murat ELÇİN Bu çalışmada, hidrojel yapısındaki kitosan 1(1 ->4) bağlı 2-amino-2-deoksi-fi-D- glukopiranoz] mikrokürelerin bazı potansiyel biyoüp uygulamaları ele alındı. İlk olarak, mikrokürelerin çap dağılımı, yüzey morfolojisi ve su tutuculuğu gibi fiziksel özellikleri belirlenip, İR spektral incelemeleri yapıldı. İkinci bölümde, glukoz oksidaz enzimi (GOx; E.C. 1.1.3.4) çeşitli tipteki kitosan mikrokürelerde immobilize edilip, immobilize GOx'm özellikleri serbest formuyla karşılaştırmalı olarak incelendi. Üçüncü bölümde, GOx içeren kitosan mikrokürelerin insulin pompası olarak uygulanabilirliği araştırıldı. Sonuçlar, fizyolojik pH (7,4) ile enzünatik dönüşümün gerçekleştiği pH (4,0-4,5) arasında, mikrokürelerin şişme-büzülme özelliği göstererek kısmen glukoza-tepkili insulin salımı yaptıklarını ortaya koydu. In vivo deneylerden oluşan son bölümde ise, kitosan mikrokürelerin rat epigastrik groin fasyasmda gösterdikleri doku uyumu ve biyobozunma davranışlan iki ve altı aylık periyodlarda takip edildi. 2001, 75 sayfa ANAHTAR KELİMELER: Kitosan mikroküre, hidrojel, diyabet, insulin pompası, modüle salım, glukoz oksidaz, immobilizasyon, biyouyum, biyobozunma. ABSTRACT MSc. Thesis INVESTIGATION OF SOME BIOMEDICAL APPLICATIONS OF CHITOSAN-BASED HYDROGELS Serap DURKUT Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor Assoc. Prof. Dr. Y. Murat ELÇÎN In this study, some of the potential biomedical applications of chitosan [(l-*4) linked 2- amino-2-deoxy-p-D-glucopyranose] microspheres having hydrogel properties were evaluated. Initially, the physical characteristics, i.e. diameter range, surface morphology and water uptake, of the microspheres were determined; IR spectral analysis were performed. In the second part, glucose oxidase enzyme (GOx; E.C. 1.1.3.4) was immobilized within several types of chitosan microspheres, and then the characteristics of immobilized GOx was compared with its native form. In the third part, the applicability of GOx containing chitosan microspheres as an insulin pump was searched. Results revealed that, the microspheres made a partially glucose-responsive insulin release by demonstrating a swelling-shrinking behaviour between the physiological pH (7,4) and the enzymatic transformation pH (4,0-4,5). In the last part containing the in vivo experiments, the tissue compatibility and biodegradation characteristics of chitosan microspheres were followed up in the epigastric groin fascia of rats for periods of two and six months. 2001, 75 pages KEY WORDS: Chitosan microsphere, hydrogel, diabetes, insulin pump, modulated release, glucose oxidase, immobilization, biocompatibility, biogegradability. 75

ÖZET DOKTORA TEZİ ENZİM İÇEREN POLİMER FİLMLERİNİN HAZIRLANMASI ve BİYOKATALİTİK ENZİM ELEKTROTU GELİŞTİRİLMESİ Emel EMREGÜL Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman : Doç. Dr. Sibel SUNGUR Jüri: Prof.Dr. Atilla ÖKTEMER Prof. Dr. Muzaffer TALU Doç. Dr. Sibel SUNGUR Biyolojik aktif materyal olarak enzim içeren biyosensörler, diğer adıyla enzim elektrotları, temel olarak bir elektrot ve bu elektrotun etrafında immobilize enzim içermektedir. Glukoz oksidaz (P-D-Glukoz: Oksijen oksido redüktaz, E.C.1.1.3.4.) moleküler oksijenin varlığında P-D-glukozun, hidrojen peroksit ve 5-D-glukanolaktona dönüşümünü katalizleyen enzimdir. Çalışmada gıda, içecek ve klinik uygulamalarda glukoz tayininde kullanılmak üzere glukoz biyosensörü geliştirilmiştir. Glukoz oksidaz enzimi jelatine krom III asetat kullanılarak çapraz bağlama yöntemine göre immobilize edilmiştir. Elde edilen immobilize enzim kullanılarak iki tür glukoz biyosensörü geliştirilmiştir. Bunlar; jelatin-glukoz oksidaz enzim elektrotu (J-GOD) ve polianilin-jelatin-glukoz oksidaz enzim elektrotudur (PAA-J-GOD). Çalışmada serbest enzim, immobilize glukoz oksidaz elektrotları kimyasal ve elektrokimyasal (amperometrik) yöntemler kullanılarak karakterize edilmiş ve sonuçlar karşılaştırılmıştır. Sıcaklık, pH, çapraz bağlayıcı konsantrasyonu, kinetik özellikler, enzim konsantrasyonu, tekrar kullanılabilirlik ve elektroaktif bileşiklerin etkisi incelenen parametreler arasındadır. Bu çalışmada gıda ve klinik uygulamalarda glukoz tayini amacıyla daha önce literatürde yer almayan iki yeni glukoz biyosensörü geliştirilmiştir. Hızlı, hassas, kolay sonuç veren bu biyosensörlerin maliyeti oldukça düşük olup en az iki aylık bir süre boyunca kararlı olarak en az 20 kez tekrar kullanılabileceği tespit edilmiştir. 1999, 134 sayfa ANAHTAR KELİMELER: enzim immobilizasyonu, amperometrik enzim elektrotu, glukoz oksidaz, jelatin, polianilin, krom HI asetat, glukoz biyosensörü, immobilize glukoz oksidaz ABSTRACT Ph.D. Thesis PREPARATION OF ENZYME CONTAINING POLYMER FILMS and DEVELOPMENT OF BIOCATALYTIC ENZYME ELECTRODE Emel EMREGÜL Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor : Assoc.Prof.Dr. Sibel SUNGUR Jury: Prof.Dr. Atilla ÖKTEMER Prof. Dr. Muzaffer TALU Assoc.Prof.Dr. Sibel SUNGUR Biosensors, namely enzyme electrodes, containing an enzyme as a biological active material, basically contain an electrode encircled by an immobilized enzyme. Glucose oxidase (p*-D- Glucose: oxygen oxidoreductase, E.C. 1.13.4) is an enzyme which catalyzes the the conversion of P-D-glucose to hydrogen peroxide and 5-D- glucanolactone in the presence of molecular oxygen. In this study a glucose oxidase biosensor was developed for the utility of glucose determination in food, drink and clinical applications. Glucose oxidase was immobilized into gelatin with chromium III acetate using the cross-linking method. Two types of glucose biosensors were developed using the immobilized enzyme. These are ; Gelatin-glucose oxidase enzyme electrode (G-GOD) and polyaniline-gelatin-glucose oxidase enzyme electrode (PAA-G-GOD). The free and immobilized enzymes and immobilized glucose oxidase biosensors have been characterized using chemical and electrochemical methods (amperometric) and die results have been compared in this study. Temperature, pH, cross-linking agent concentration, enzyme concentration, kinetic properties, reuseabilhy and effect of electroactive compunds are among the parameters scrutinized. In this study two new glucose oxidase biosensors, which have not previously taken part in literature, have been developed for the determination of glucose in food and clinical applications. It has been determined that these biosensors which give quick, sensitive and and easy results are not only low in cost but can be used 20 times stabily within a period of 2 months. 1999, 134 pages KEY WORDS: enzyme immobilization, amperometric enzyme electrode, glucose oxidase, gelatin, polyaniline, chromium Dl acetate, glucose biosensor, immobilized glucose oxidase 134

oz Bu çalışmada, inhibitor olarak davranan glikolik asit oksidazının(GAO) bileşik serileri elektron-topolojik (ET) metodu ile incelendi. GAO inhibitor serilerindeki toplam 89 bileşiğin konformasyonal analizi ve kuantum kimyası hesaplamaları yapılarak, serilerdeki aktif ve inaktif olan bileşikler belirlendi. ET metodu ile aktif bileşikler içerisinde hangi fragmentin (parçanın) bileşiğe aktiftik özelliği kazandırdığı tespit edildi. Aktivitenin elektron-topolojik alt matrisi (moleküler aktif fragment) kılavuzunda bazı yeni bileşiklerin aktif olacağı ileri sürüldü. ABSTRACT In this study, series of compounds of glycolic acid oxidase (GAO) which are behaviored as inhibitory were studied by the electron-topological (ET) method. By making conformational analysis and calculations of quantum chemistry of sum of the 89 compounds in the inhibitory series were determined compounds that are activity and inactivity in the series. It was determined which fragment gained the compounds activity characteristic in the ac tivity compounds by the ET method. It was forward that some new compounds might be activity in this guide the electron- topological submatrix (molecular activity fragment). oz Bu çalışmada, inhibitor olarak davranan glikolik asit oksidazının(GAO) bileşik serileri elektron-topolojik (ET) metodu ile incelendi. GAO inhibitor serilerindeki toplam 89 bileşiğin konformasyonal analizi ve kuantum kimyası hesaplamaları yapılarak, serilerdeki aktif ve inaktif olan bileşikler belirlendi. ET metodu ile aktif bileşikler içerisinde hangi fragmentin (parçanın) bileşiğe aktiftik özelliği kazandırdığı tespit edildi. Aktivitenin elektron-topolojik alt matrisi (moleküler aktif fragment) kılavuzunda bazı yeni bileşiklerin aktif olacağı ileri sürüldü. ABSTRACT In this study, series of compounds of glycolic acid oxidase (GAO) which are behaviored as inhibitory were studied by the electron-topological (ET) method. By making conformational analysis and calculations of quantum chemistry of sum of the 89 compounds in the inhibitory series were determined compounds that are activity and inactivity in the series. It was determined which fragment gained the compounds activity characteristic in the ac tivity compounds by the ET method. It was forward that some new compounds might be activity in this guide the electron- topological submatrix (molecular activity fragment). 45

in ÖZET Bu çalışmada, pirolün 0.8 V'luk bir potansiyel altında glikoz oksidaz içeren KC1 çözeltisi içerisindeki elektropolimerizasyonu (co-immobilization) ile amperometrik glikoz biyosensör hazırlanmış ye hazırlanan enzim elektrot, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan hidrojen peroksiti yükseltgemek amacıyla 0.7 V potansiyelde tutularak glikoza karşı yanıt alınmıştır. Enzim elektrodun elektrokimyasal yanıtı üzerine değişik parametrelerin (film kalınlığı, monomer (pirol) derişimi, elektrolit derişimi, tampon derişimi, sıcaklık, pH, karıştırma hızı, v.s) etkisi sistematik olarak incelenerek bu parametrelere ait optimum değerler tesbit edilmiştir. Daha sonra, optimize edilmiş enzim elektrodun lineerliği, seçiciliği ve kararlılığı saptanarak, enzimatik reaksiyona ilişkin aktivasyon enerjisi hesaplanmıştır. Sonuç olarak, biyosensör yapımı için, 0.01 M KC1, 100U/ml GOD ve 0.25 M pirolün optimum şartlar olduğu ve optimal yanıtın, 0.777 um film kalınlığı, pH 7 ve 308 K'lik sıcaklıkta elde edildiği görülmüştür. Ayrıca amperometrik yanıtın sıcaklığa bağımlılığından enzimatik reaksiyona ilişkin aktivasyon enerjisinin 13 kj/mol olduğu bulunmuştur. Hazırlanan enzim elektrodun 2.5-15 mM glikoz derişimlerine lineer bir şekilde cevap verdiği ve sukroz, askorbik asit, süksinik asit, maleik asit gibi interferans etki yapan türlere karşı yanıt vermediği gözlenmiştir. Ayrıca, değişik bekletilme koşullan altında saklanan enzim elektrotların ömür ve işlemsel kararlılıkları peryodik olarak test edilmektedir. IV ABSTRACT In this study, an amperometric glucose biosensor was prepared by the electropolymerization of pyrrole onto a platinium electrode in the presence of the enzyme glucose oxidase (GOD) in a KC1 solution at a potential of 0.8V vs. Ag/AgCl. The enzyme was incorporated into polypyrrole film during the electropolymerization process (Co-immobilization). Glucose response were measured by potentiostating the enzyme electrode at a potential of 0.7 V (vs. Ag/AgCl) in order to oxidize the hydrogen peroxide generated by the oxidation of glucose by the enzyme in the presence of oxygen. Effects of various parameters (film thickness, concentrations of monomer (pyrrole), electrolyte, enzyme and buffer, temperature, pH, stirring rate, e.g.) on the steady-state- electrochemical response of the prepared enzyme electrode were systematically investigated and the optimum values of these parameters were found. Then, linearity, selectivity and stability of optimized enzyme electrode were determined. Moreover, activation energy for enzymatic reaction was calculated. In conclusion, it was found that a concentration of 0.25 M pyrrole in the presence of 100U/ml of glucose oxidase in a 0.01 M KC1 solution, were the optimal parameters for the fabrication of the biosensor. The optimal response was obtained for film thickness of 0.777 jam at pH 7 and at a temperature of 308 K. The temperature dependence of the amperometric response indicated an activation energy of 13 kj/mole. The linearity of the enzyme electrode response ranged from 2.5 mM to 15 mM glucose. The specificity of the enzyme electrode was investigated for various substrates such as sucrose, ascorbic acid, succinic acid, maleic acid and no discrenible signal was detected above the background current. The shelf life and the operational stability of the enzyme electrodes under various storage conditions has been tested periodically. 68

ÖZET Bu araştırmanın amacı, kandaki glikoz derişiminin ölçümünde kullanılacak sandviç türü bir glikoz oksidaz elektrot geliştirilmesidir. Pt-Ag/AgCİ amperometrik esaslı bir elektrod kullanılmıştır. Tanıyıcı tabaka, sandviç benzeri bir yapıda, yangeçirgen iki membran araşma yerleştirilmiş bir enzim tabakasından oluşturulmuştur. Araştırmanın ilk bölümünde çözücü döküm yöntemiyle değişik gözenek yapısında, poliüretan, polietersülfon, selüloz asetat membranlar üretilmiştir. Selüloz asetat membranlar, KOH ile deasetillenerek modifiye edilmiştir. Satin alınma yoluyla değişik gözenek yapısında polikarbonat membranlar temin edilmiştir. Bu membranlar, plazma polimerizasyonuyla HMDS ile veya PVAL adsorpsiyonu ve çapraz bağlanması ile kaplanarak modifiye edilmiştir. PVAL kaplı membranlara, CNBr aktivasyonuyla heparin immobilize edilmiştir. Tüm bu membranlar, SEM, FTIR-ATR ve temas açısı ölçümleriyle karakterize edilmiştir. Farklı miktarlarda enzim (GOD), seyreltici protein (BSA) ve çapraz bağlayıcı (glutaraldehit) kullanılarak hazırlanan enzim tabakaları, bu membranlar araşma değişik kombinasyonlarda yerleştirilerek, seçicilik, doğrusallık, cevap süresi, duyarlılık ve kanla uyuşabilirlik yönünden en uygun sandviç yapısı araştırılmıştır. Bulunan önemli sonuçlar şu şekilde özetlenebilir: (i) Elektrod seçiciliği, iç membran olarak kullanılan membranın hem yapısı (gözenek boyutları ve yükü) hemde elektroaktif maddelerin boyut ve yükü ile ilgilidir. Araştırma kapsamında denenen membranlardan seçicilik yönünden en uygun membran, çözücü döküm yöntemiyle hazırlanan PES membrandır; (ii) enzim elektrodun substrat derişimi yönünden kullanılabileceği derişim aralığını gösteren doğrusallık sınırı, sandviç türü elektrodda dış membran kütle transfer özellikleri değiştirilerek kontrol edilebilir. Hasta kanında ulaşılan en yüksek glikoz derişimi 30 mM civarındadır. Bu doğrusallık sınırına, polikarbonat membranın modifiye formlarıyla ulaşılabilmektedir. HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile modifiye edilmiş PC membranlarda doğrusallık üst sınırı 60 mM'dır; (iii) elektrod cevap süresi, kullanılan sandviçin hem kütle transfer hemde tepkime hızlarıyla ilgilidir. Sunulan araştırma kapsamında test edilen sandviçlerde cevap süresi 46 ile 225 s arasında değişmektedir. Doğrusallık sının da göz önüne alınırsa, cevap süresi 48 s olan HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile modifiye edilmiş PC membranın en uygun dış membran olduğu söylenebilir; (iii) araştırmada incelenen sandviçlerle oluşturulan elektrodların, doğrusallık sınırlan ile duyarlılıklan ters yönde değişmektedir. PC membran dış membran olarak kullanıldığında doğrusallık sının ve duyarlılık 10 mM ve 54.05 nA/mM iken, HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile modifiye edilmiş PC memoranda aynı değerler sırasıyla 60 mM ve 8.96 nA/mM'dır. Modifiye PC'm11 doğrusallık sının ve cevap süresi de göz önüne alındığında, duyarlıklık yönünden de yeterli, dolayısıyla dış membran olarak en uygun olduğu söylenebilir; (iv) enzim tabakası, hem kütle transfer hemde tepkime hızlan dolayısıyla elektrod performansım etkilemektedir. Elektrod cevap süresi ve doğrusallık sının yönünden en uygun büeşimin (30 mg GOD+200 mg BSA)/ml tampon olduğu söylenebilir; (v) kanla uyuşabilirlik, dış membran yüzey özellikleri ile ilgilidir. Kullanılan membran yüzey alam düşük olduğundan, membranlann hiçbiri önemli bir kan hücresel eleman kaybına yol açmamıştır. En yüksek protein adsorpsiyonu, HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile modifiye edilmiş PC membranda gözlenmiştir. Ancak albumin ön adsorpsiyonu, bu membrandaki protein adsorpsiyonunu önemli miktarda azaltmıştır. Tüm membranlar kanın pıhtılaşmasına yol açmaktadır, dolayısıyla antikoagülant kullanımına ihtiyaç vardır. Heparin immobilizasyonu yeterli etkinlikte yapılamadığı için, pıhtılaşma süresi uzatılmasına rağmen tamamen önlenememiştir; (vi) geliştirilen elektrodlar ile kandan doğrudan glikoz ölçümü yapmak mümkündür. Diğer yöntemlerle korelasyon en iyi HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile modifiye edilmiş PC membramn dış membran olarak kullanıldığı durumda elde edilmiştir. Seçicilik, doğrusallık, cevap süresi, duyarlılık ve kanla uyuşabilirlik yönünden en uygun sandviç yapısı şöyledir: (i) iç membran: PES, (ii) enzim tabakası: (30 mg GOD+200 mg BSA)/ml tampon derişiminde protein karışımı ve (iii) dış membran: HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile yüzeyi modifiye edilmiş PC membran. Ill ABSTRACT The aim of this study is to develop a sandwich type glucose oxidase electrode to measure the blood glucose level. The amperometric electrode utilizes Pt anode and Ag/AgCl as reference. The recognition system is in the form of sandwich made up of two semipermeable membrane with an enzyme layer placed in between them. In the first part of the study, polyurethane, polyethersulphone and cellulose acetate membranes with different pore structure were prepared by solvent casting method. Cellulose acetate membranes were modified by deacetylation with KOH. Polycarbonate membranes with different pore sizes were purchased from the manufacturer. The surfaces of those membranes were modified either by HMDS utilizing plasma polymerization technique, or by PVAL adsorption and cross-linking. PVAL coated surfaces were further modified by heparin immobilization via CNBr activation. All membranes were characterized by SEM, FITR-ATR and Contact Angle measurements. The enzyme layers were prepared by using different amount of enzyme (GOD), inactive protein (BSA) and crosslinking agent (gluteraldehyde). Those enzyme layers were placed in between different combinations of membrane layers to investigate the performance of electrode on the basis of; selectivity, linearity, response time, sensitivity and blood compatibility. The results may be summarized as follows; (i) The selectivity of the electrode is directly proportional with the physical and physicochemical structure (pore size, charge density, etc.) of the inner membrane and chemical properties and sizes of electroactive compounds. Only the PES membrane is totally satisfies the requirements of the selectivity, (ii) The linearity of the electrode can be described as the upper limit of the linear response of electrode through the substrate concentration, which can be controlled by changing the mass transfer properties of the outer membrane. The upper limit of the glucose concentration of the blood in diabetic patients is approximately 30 mM. The sanwich type enzyme electrode can reach to that limit by utilizing modified polycarbonate membranes. The linearity of the electrode was extended to 60 mM by employing the HMDS modified PC membranes, (iii) The response time of the electrode is related to the mass transfer and reaction rates in the sandwich. In this study, the response time of the sandwiches varies between 46-225 s. Including the linear range of the membrane, the HMDS modified PC membranes with 48 s of response time can be considered as the most convenient outer membrane, (iv) TheIV sensitivity and the linearity of the sandwiches are generally inversely proportional to each other. In the case of utilizing PC membrane as outer layer in the sandwich, the linearity and sensitivity becomes 10 mM and 54.05 nA/mM, however, in the case of HMDS-PC membrane, those values becomes 60 mM and 8.96 nA/mM. Considering the linearity, response time, and acceptable sensitivity, Plasma polymerization modification of PC membranes with HMDS, can be evaluated as the most suitable membrane as an outer layer, (v) The enzyme layer affects the electrode performance by mass transfer and reaction rate. The best combination of enzyme and inactive protein was found to be (30 mg GOD+200 mg BSA)/ml buffer, for better linearity and response time, (vi) Blood compatibility is directly related to the surface characteristics of the outer membrane which faces the biologic environment including substrate, and blood components. Due to the very small contact area utilization in the electrode sandwich, not a significant change in blood cells were observed. The highest protein adsorption was observed on HMDS-PC surfaces. The treatment with the albumin pre- adsorption to that surface significantly decreased the plasma proteins adsorption. All membranes were coagulated the blood, so the requirement for the usage of anticoagulation reagent is arised. The immobilisation of heparin to the surfaces has extended the coagulation time, but could not eliminate completely, (vii) The direct measuring of glucose concentration from blood showed a good agreement with the `conventional hospital laboratory findings`. The best correlation was achieved by employing HMDS-PC membrane. The best sandwich structure on the basis of selectivity, linearity, response time, sensitivity and blood compatibility is: (i) inner membrane: PES (ii) enzyme layer: the mixture of (30 mg GOD+200 mg BSA)/ml buffer (iii) outer membrane: Plasma polymerization modification of PC membranes with HMDS. 159

11 ÖZET Bu çalışmada kullanılan Aspergillus nigerNRRL-3 susu glikoz oksidaz ve D-glukonik asit üreten endüstriyel bir organizmadır. Hücre-içi yerle şime sahip glukoz oksidaz (E.C. 1.1.3.4) enziminin aktivite tayininde, bir elektron akseptörü olan benzokinon kullanıldı. Buna göre, benzo- kinon'un redüksiyon ürünü olan hidrokinon ' un 290 nm'de gösterdiği ab- sorbans artışının başlangıçtaki hızı (AA/dakika) ölçüldü. Bir enzim ünitesi, 25` C de dakikada 1 Aimol benzokinon'un hidrokinon'a indirgenme sini katalizleyen enzim miktarı olarak tanımlandı. Üretim koşullarını optimize edebilmek amacıyla, durgun ve çalkantılı üretim şekilleri, üretim pH'sı ve sıcaklığı, enzim indüks iyonunu ger çekleştiren minumum glukoz miktarı ve kültür ortamının oksijence zenginleştirilmesi gibi fizyolojik parametreler incelendi. A. nigeA. WRRL-3 glukoz oksidazmın maksimum üretimi için, optimum pH: 5.6, optimum sıcaklık 30 `C olarak saptandı. Glukoz oksidaz enziminin indüksiyonu için minimum glukoz derişimi 0.002 M olarak belirlendi. Aynı zamanda çalkalama hızına ve ortamın oksijence zenginleştirilmesi ne bağlı olarak enzim aktivitesinin arttırılabileceği belirlendi. Glukoz oksidaz aktivitesinin arttırılabilmesi ve daha ekonomik koşul larda enzim üretiminin gerçekleştirilebilmesi için, A.nigeA. WRRL-3 susu nitröz asit ve U.V.+ N-metil-N'-nitrosoguanidin metodu kullanıla rak mutasyona uğratıldı, tndikatör olarak metil red içeren vasatlarda glukonik asit üretim yeteneği yüksek bulunan mutantlar, oluşturdukları zon çaplarına bağlı olarak seçildi. Elde edilen 11 mutant suş, 0.01, 0.1 ve 0.5 M D-glukoz içeren Czapek-Dox sıvı besi yerinde üretilerek aktiviteleri saptandı. Atasal susa göre aktiviteleri % 38.8 ve % 105.5 oranında artmış iki suş izole edilerek A&peAgilhi nigeA NSG-,, ve kt>pOAgUlUA nigeA NSG*. olarak adlandırıldı. Ill SUMMARY k&poJxjgWLuA nigzx MRRL-3 which was used in this study is an industrial organism that produces glucose oxidase and D-gluconic acid. Benzoquinone which is an electron acceptor was employed for the intra-cellular glucose oxidase activity determination. For this purpose, the initial rate of increase (AA/min) in absorbans at 290 nm following the enzymatic reduc tion of benzoquinone to hydroquinone was muasured. One enzyme unite was defined as the amount of enzyme which catalyzes the reduction of 1 umol benzoquinone to hydroquinone in one minute at 25 *C Various pysiological parameters such as static and stirred production, growth temperature and pH, the minumum glucose concentration for the enzyme induction and enrichment of the medium with oxygen, was inves tigated for the optimization of cultural conditions. Optimum pH and temperature for the maximum production of k.nigOA blKR.L-3 glucose oxidase activity were obtained as 5.6 and 30 'C respectively. The minimum glucose concentration for the enzyme induction was found to be 0.002 M. At the same time, it was found that the enzyme activity could be elevated depending on the agitation rate and enrichment of the medium with oxygen. In the present study, k.nig&i WRRL-3 was treated with different mutagens such as nitrous acid and U.V.+ N-methyl-N'-nitrosoguanidine for the selection of mutants having the improved glucose oxidase production ability. These improved mutants were selected depending on the zone diameters on the growth medium containing methyl red as an chromogenic indicator. Eleven mutants that were selected with this procedure were cultured on the Czapex-Dox medium containing, 0.01, 0.1 and 0.5 M of glucose and screened for the glucose oxidase activity. Two of these mutants named k&pzitgiltuA nlgOA HSG~_* and A6peAgilla6 nigeA WSGj* were found to have increased glucose oxidase activity at the ratio of 38.8 % and 105.5 % respectively comparing the parental strain of A. nigeJL NRRL-3. 57

ÖZET Yüksek Lisans Tezi GLİKOZ OKSİDAZ ENZİMİNİN FOTO?RAFİK JELATİN İÇİNDE ÇAPRAZ BA?LANMA İLE İMMOBİLİZASYONU Y.Murat ELÇİN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman : Prof. Dr. Ural AKBULUT 1990, sayfa 101 Jüri : Prof. Dr. Ural AKBULUT Prof. Dr. Ali USANMAZ Prof. Dr. Atilla ÖKTEMER Bu çalışmada, glikoz oksidaz enziminin fotoğrafik jelatin içinde, CrZ(S0i)5(0H)2, Cr(CH3C00)3, KCr(S0i)2. 12H20 ve HCHO kullanılarak kimyasal çapraz bağlama metodu ile immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Yeni bir teknik uygulanarak immobil enzim içeren film şeritleri hazırlanmış; enzimin kararlılığı ile kullanma sayısının sıcaklık ve pH yanında jelatin, enzim ve çapraz bağlayıcı konsantrasyonlarına bağlı olarak değişimi incelenmiştir. Sonuçta, Cr4(S0£t)5(0H)2'ın bağlayıcı olarak kullanıldığı enzim filmlerinin en dayanıklı tür olduğu bulunmuştur. ANAHTAR KELİMELER: Enzim İmmobilizasyonu, Glikoz Oksidaz, Jelatin, Çapraz Bağlanma . ABSTRACT Masters Thesis IMMOBILIZATION OF GLUCOSE OXIDASE ENZYME IN PHOTOGRAPHIC GELATIN BY CROSS LINKING Y. Murat ELÇİN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor : Prof. Dr. Ural AKBULUT 1990, page 101 Jury : Prof. Dr. Ural AKBULUT Prof. Dr. Ali USANMAZ Prof. Dr. Atilla ÖKTEMER In this study, the immobilization of glucose oxidase enzyme into photographic gelatin by chemical cross linking method with Crij(S0i)5(0H)2. Cr(CH5C00)3, KCr(S0Z)2.12H20 and HCHO was accomplished. By using a new technique, films containing immobilized enzyme were prepared; the change of enzyme stability and reuse, number with temperature and pH along with the concentrations of gelatin, enzyme and cross-linker were investigated. Finally,, the type of enzyme film in CrZj(S0ii)5(0H)2 used as the cross linker was found to have the most stable structure. KEY WORDS : Immobilization of Enzymes, Glucose Oxidase, Gelatin, Cross Linking 101

48 - -ÖZET- Çalışmamızda Wistar albino, inbred ve outbred sıçan larımızı üç deney grubuna ayırdık ve intra peritonal gli koz tolerans tes t ( i. p. G. T. T. ) lerini inceledik. Birinci ve üçüncü deney grubumuzu oluşturan sıçanla rımızın i. p. G. T. T. ' lerini 12 saat aç bıraktıktan sonra in celedik. İkinci deney grubumuzu oluşturan sıçanlarımızın i. p. G, T. T.' lerini ise tok olarak inceledik. Birinci ve ikinci deney grubumuzu oluşturan sıçanla rımızın anestezisinde dietil eter kullandık. Üçüncü deney grubunu oluşturan sıçanlarımızın anes tezisinde ise sodyum nembutal kullandık. Her deney grubundaki sıçanlara %5 lik glikoz çözel tisinden hayvan ağırlığının kg'ı başına 1,5 gram olacak şe kilde periton içine enjekte ederek glikoz yüklemesi öncesi yani 0. dakika ve glikoz yükleme sonrası (30,60,90,120,180, 240 ve 300) üncü dakikalarda hayvanların kuyruk veninden al dığımız kan numunelerinde glikoz oksidaz yöntemi ile kan şe keri değerlerini ölçtük. Tüm deney gruplarımızın int raperi tonal glikoz tole rans testi (i.p.G.T.T.) sonuçlarının, normal glikoz tolerans testi değerleri ile benzerlik gösterdiğini saptadık.- 49 - Birinci deney grubumuzu oluşturan sıçanların glikoz yüklemesi öncesi ve glikoz yüklemesi sonrası belli zaman lardaki ortalama kan şekeri değerleri arasında istatistikî olarak anlamlı bir fark bulamadık. İkinci deney grubumuzu oluşturan sıçanlarımızın gli koz yüklemesi öncesi ve glikoz yüklemesi sonrası belli za manlardaki ortalama kan şekeri değerleri arasında bazı za manlarda anlamlı bazı zamanlarda ise anlamsız değerler bul duk. Üçüncü deney grubumuzu oluşturan sıçanların glikoz yüklemesi öncesi ve glikoz yüklemesi sonrası belli dakika lardaki ortalama kan şekeri değerleri arasında istatistiki olarak anlamlı bir fark bulamadık. Uyguladığımız i. p. G. T. T. s ir asında her deney grubun da, 30. dakika kan şekeri değerlerinin, elde ettiğimiz or talama kan şekeri eğrilerini inceleyerek maksimum seviyele re yükseldiğini gördük ve bu dakikadaki kan şekeri değeri nin normal glikoz tolerans testi değerleri ile benzerlik gösterdiğini müşehade ettik. Ayrıca anestetik olarak kullandığımız dietil eter i- le sodyum nembutal 'in sıçanların kan şekeri üzerinde ne gi bi bir etkiye sahip olduğunu inceledik ve dietil eterin kan şekeri üzerinde hiperglis emik bir etki göstermesine --rağmen sodyum nembutalin kan şekeri üzerinde hipoglisemik veya hiperglis emik bir etkisi olmadığını saptadık. DEÎAM'da yetiştirdiğimiz Wistar albino sıçanlarımıza uyguladığımız intraper i t onal glikoz tolerans testi (i.p.G.T.T.) neticesinde, çalışmamızı oluşturan 60 sıçandan spontan diabetli olana rastlamadık. 55