Search

Tez (yüksek lisans) - Anadolu Üniversitesi, Anadolu Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, İleri Teknolojiler Anabilim Dalı, Kayıt no: 470557, Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF)'nin kanser metabolizmasındaki rolü literatürde ortaya konulmuş olup bu çalışmada, insan kanında da bulunan, VEGF'ye bağlanan ve iki zincirden oluşan bloklayıcı Anti-VEGF antikorunun rekombinant olarak üretilmesi amaçlanmıştır. Bu bağlamda, insan kanından total RNA izole edilmiş, buradan cDNA sentezlenmiş ve Anti-VEGF antikorunun iki zincirinin gen dizisine spesifik primerler kullanılarak PCR reaksiyonları ile anti-VEGF genleri klonlanmıştır. Daha sonra klonlanan genler yine aynı teknikle birleştirilip tek zincir haline getirilmiş ve uygun klonlama, ekspresyon plazmit vektörleri ve konakçılar ile birlikte ekspresyonu sağlanmıştır. Çalışmanın son aşamasında, konakçı bakteriden, ağır ve hafif zincirinin birbirine bağlı olduğu rekombinant Anti-VEGF antikorunun izolasyonu ve saflaştırması gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma nikel afinite kromatografisi kullanılarak sağlanmış ve Western Blot ile proteinin karakterizasyonu yapılmıştır. Daha sonra; Anti-VEGF antikorunun, dış ortam koşullarına dayanıklılığını arttırmak için, rutenyum tabanlı aminoasit monomerleri ile fotosensitif çapraz bağlamayı sağlayan ANADOLUCA metodu kullanılarak Nano-Anti-VEGF konjugatı üretilmiştir. Bu VEGF nanobloklayıcının karakterizasyonları Zeta ile boyut analizi, SEM ile yüzey morfolojisi ve CD spektroskopisi ile sekonder yapısı incelenerek ortaya konulmuştur. Nano-Anti-VEGF'nin ilaç sektöründe, tedavi sürecinin nasıl devam ettiğini izleyebilmek amacı ile moleküler görüntüleme teknolojisi sayesinde takip edilebilirliğini sağlamak için akridin, BODIPY ve FITC gibi farklı floresans özellikteki maddeler ile konjugatı sentezlenmiştir.

Serbest oksijen radikallerinin biyolojik sistemlerdeki en önemli etkilerinden biri lipidler üzerine olanıdır. Doymamış yağ asitlerinin alil grubundan bir hidrojen çıkarak lipid radikali meydana gelmektedir ki oluşan bu radikal oksijen ile reaksiyona girmekte ve lipid peroksit radikalini oluşturmaktadır. Bu olaya lipid peroksidasyon adı verilmektedir ve çeşitli organlar üzerinde hasar yapıcı etkiler oluşturmaktadır. Lipid peroksit radikali diğer lipidlerle zincir reaksiyonu başlatmakta ve lipid hidroperoksitleri oluşturmaktadır. Ortamda bulunan demir ve bakır iyonları LPO'yu hızlandırmaktadır. Lipid radikaller yüksek derecede sitotoksik ürünlere de dönüşebilir. Bunlar arasında en çok bilinen ürün aldehit grubundan malondialdehittir.Güçlü antioksidan özellikteki melatonin (uyku hormonu olarak bilinen ve indol yapısına sahip endojen bir bileşiktir), genellikle lipid peroksidasyonun başlattığı olayları önlemesinin yanı sıra zincir reaksiyonlarını keserek de etki göstermektedir. Aynı zamanda, melatonin lipid peroksidasyonun peroksit radikalini de yakalayarak etkisiz hale getirmektedir. Melatonin güçlü bir antioksidan özelliğinin yanında güçlü bir radyasyon koruyucu etkisi de vardır.Bir diğer güçlü antioksidan etkili endojen bileşik de alfa lipoik asittir (ALA). Lipoik asitin özellikle mitokondriyada korumasız durumda bulunan mitokondriyal DNA'nın, yine mitokondride üretilen serbest oksijen radikalleri tarafından korunması görevi bulunmaktadır. Daha önce yaptığımız çalışmada melatonin türevlerinin ALA ile konjügasyonu gerçekleştirilmiş ve lipid peroksidasyon inhibisyonu üzerinde biyolojik çalışmalar yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar, ilk kez sentezlenen ve yapıları açıklanan moleküllerin sübstütient şablonuna göre irdelenmiştir. Lipid peroksidasyonu inhibisyonunda standart antioksidan bileşikler alfa lipoik asit, melatonin ve BHT ile sentezlenen bileşikler kontrol grubuna göre karşılaştırıldığında, (1), (3), (4), (15), (17), (19), (8), (9), (10), (11), (14), (13), (12) no'lu bileşiklerin, lipid peroksidasyonunu yüksek oranda inhibe ettikleri görülmüştür. BHT ile karşılaştırıldığında LPO'yu anlamlı olarak inhibe edenler (17) ve (13) no'lu bileşikler olarak saptanmıştır. Ayrıca (18) no'lu bileşiğin LPO'yu %100 inhibe ettiği görülmüştür.Anahtar Sözcükler : α-Lipoik Asit, Antioksidan, Lipid Peroksidasyon, Melatonin. Synthesis, Structure Elucidation and Lipid Peroxidation Inhibition Evaluations of Novel Melatonin and alpha-Lipoic acid Conjugation DerivativesFree oxygen radicals acting on lipids is one of the important features in biological systems. Removing a hydrogen from allyl group of unsaturated fatty acids results to lipid radical which is then reacts with molecular oxygen to form lipid peroxy radicals. This evidence is known as lipid peroxydation causing damges on various organs. Lipid peroxy radical initiates chain reactions through other lipids and lipid hydroperoxides are formed. The environmental occurrence of iron and copper ions accelerate lipid peroxidation process. Lipid radicals can also be converted to highly cytotoxic products. Among these malondialdehyde (MDA) is one of the well-known aldehyde products.The strong antioxidant properties of melatonin (known as sleep hormone having an indole moiety), besides generally preventing the evidences induced by lipid peroxidation, also showing its effect by cutting off the chain reactions. Indeed, melatonin is able to scavenge the peroxy radical of lipid peroxydation. Melatonin, besides its powerful antioxidant properties, has also strong radioprotective activity. Another powerful endogenous antioxidant compound is alpha-lipoic acid (ALA). Lipoic acid is found in particularly vulnerable in the protection of mitochondrial DNA (mtDNA) where in the free oxygene radicals are being formed by the resulting processes of energy production in that organelle. Our earlier studies were performed conjugation with AL melatonin derivatives and the inhibition of lipid peroxidation was carried out on biological studies. The results obtained are first synthesized and their structures were examined by the described molecules sübstütient template. Lipid peroxidation inhibition in a standard antioxidant compounds from lipoic acid, melatonin, and BHT with synthesized compound compared by the control group (1), (3), (4), (15), (17), (19), (8), (9 ), (10), (11), (14), (13), (12) numbered compounds have been shown to high inhibit lipid peroxidation. Compared with BHT were significantly inhibit LPO (17) and (13) numbered as compounds were identified. In addition, (18) numbered compound have been shown to %100 inhibit lipid peroxidation.Keywords: α-Lipoic Acid, Antioxidant, Lipid Peroxidation, Melatonin. 106

İnfluenza A, her yıl dünya nüfusunun %5 ile 20'sini etkileyen, binlerce insanın ölümüne sebep olan önemli bir viral hastalıktır. İnfluenza A, damlacık ve solunum yolu salgılarına temas ile yayılmasından ve de bir metrelik mesafe bulaşı için riskli alan olmasından dolayı, yüksek mortalite ve morbidite ile seyreden bir enfeksiyona neden olmaktadır. Bu viral hastalığın özellikle klinik teşhisinde, diğer solunum yolu hastalıkları ile karıştırılması nedeniyle, tedavisinde yanlış ilaç kullanımı söz konusu olmaktadır. Bu durum enfeksiyon ile mücadelede dezavantaj oluşturmaktadır. Epidemilerin ve pandemilerin önlenmesi için, hastalık riski olan bireylere hızlı ve doğru tanının konulması, enfeksiyonun kontrolü için büyük bir önem taşımaktadır. Ancak influenza A virüsünün yapısında meydana gelen değişimler, bu virüsün etkin bir şekilde hızlı ve doğru tanısına yönelik yöntemlerin geliştirilmesini zorlaştırmıştır. İnfluenza A virüsünün yapısındaki, virüsün zarfından arınması esnasında protonların viriyona girişini sağlayan iyon kanalı olarak işlev gören M2 proteini, normalde virüs partikülleri üzerinde düşük miktarda bulunmaktadır. Ancak, virüsün bu bileşeni infekte hücre yüzeyinde oldukça bol miktarda salgılanmaktadır. Neredeyse tüm influenza A alt türlerinde korunmuş olduğu bilinen virüse ait bu bileşeninin, influenza A virüsü tanısına yönelik yeni yöntem geliştirmek amacıyla kullanılması son zamanlarda araştırmacıların ilgisini çekmiştir.Bu tez çalışmasında; influenza A virüsünün korunmuş antijenik bölgesi olan M2e proteininin 24 amino asitten oluşan M2e peptidine spesifik influenza A'ya karşı üretilen immunoglobulin Y antikoru kullanılmıştır. M2e peptidine spesifik IgY antikoru, ELISA testinde kullanılmak üzere alkalin fosfataz enzimi ile kovalent konjugasyon yöntemiyle gluteraldehit varlığında konjuge edilmiştir ve karakterizasyonu spektroskopik yöntemlerle yapılmıştır. 2015-2016 sürveyans sezonunda, İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Viroloji ve Temel İmmunoloji Bilim Dalı Ulusal İnfluenza Referans Laboratuarı'nda `İnfluenza Benzeri Hastalık-(İBH)` ön tanısı ile toplanan nazofrangeal sürüntü örneklerinden, influenza A tanısında altın standart olarak kabul edilen eş zamanlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (real-time reverse transcription polymerase chain reaction, rRT-PCR) yöntemi ile 11 adet pozitif ve 3 adet negatif olduğu belirlenen toplam 14 adet örnek kullanılmıştır. Bu nazofrangeal sürüntü örnekleri, sentezlenen M2e spesifik IgY-ALP konjugatı kullanılarak geliştirilen ELISA testi ile değerlendirilmiştir ve elde edilen sonuçların rRT-PCR yöntemi ile elde edilen sonuçlarla örtüştüğü belirlenmiştir. Bu tez çalışması ile dünyada ilk kez M2e peptidine spesifik IgY antikoruna dayalı influenza A virüsünün tanısında kullanılmak üzere serolojik tanı yöntemi geliştirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Alkalin fosfataz, IgY, İnfluenza A, Kovalent Konjugasyon, Sandviç-ELISA, Tanı. Influenza A is an important viral disease affects 5 to 20% of the world population each year and causes the death of thousands of people. Influenza A causes an infection associated with high mortality and morbidity because spreading respiratory tract secretions by contact and droplets and also being the risk area for a meter transmission distance.The use of the wrong drug treatment is concerned due to mixing with other respiratory diseases, especially the clinical diagnosis of this viral disease. This constitutes a disadvantage in fighting infection. For the prevention of epidemics and pandemics, rapid and correct diagnosis for individuals with risk of disease have great importance for the control of infection. However, due to the changes occurring in the structure of the influenza A virus, effective development of methods for rapid and accurate diagnosis of this virus become difficult.M2 protein that in the structure of the Influenza A virus and function as an ion channel that allows the entry of protons to the virion during purification of the virus from its envelope, is normally in lower amount on the virus particles. However, this component of the virus is secreted quite abundant on the surface of infected cells. This component of the virus is known to be preserved in almost all of the Influenza A virus subtypes recently attracted the attention of researchers to develop new methods for the diagnosis of Influenza A virus.In this thesis, immunoglobulin Y antibody that specific to M2e peptide which consists of 24 amino acid of M2e protein, conserved antigenic region of the influenza A virus, was used. M2 peptide-specific IgY antibody were conjugated with alkaline phosphatase enzyme in the presence of the glutaraldehyde by covalent conjugation method to be used in ELISA test and characterization was performed by spectroscopic methods. In the 2015-2016 surveillance season, nazofrangeal swab samples with the diagnosis of `Influenza-like Diseases (ILD)` in Istanbul University, Istanbul Faculty of Medicine, Medical Microbiology Department, Division of Virology and Basic Immunology Department, National Influenza Reference Laboratory were collected and 11 positive and 3 negative swab identified with real-time reverse transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR) method which is golden standard in diagnosis of Influenza A, total 14 swab were used. This nazofrangeal swab samples were evaluated with ELISA test developed by using synthesized M2-specific IgY-ALP conjugate and obtained the results was determined to coincide with the results obtained with rRT-PCR method.Serological diagnostic method based on M2 peptide-specific IgY antibody have been developed for use in the diagnosis of the Influenza A virus with this study for the first time in the World.Keywords: Alkaline phosphatase, IgY, Influenza A, Covalent Conjugation, Sandwich-ELISA, Diagnosis. 89

Araştırmada köfte üretiminde farklı seviyelerde (%0, %0,05, %0,1, %0,25 ve %0,5) konjuge linoleik asit kullanımının, farklı sıcaklıklarda (150C, 200C ve 250C) pişirilen köftelerin bazı kalite kriterleri ve heterosiklik aromatik amin (HAA) oluşumu üzerine etkileri incelenmiştir. Kontrol grubu köftelerde kimyasal kompozisyonun yanı sıra, pH ve TBARS analizleri yapılmıştır. Farklı seviyelerde konjuge linoleik asit içeren köfteler ise farklı sıcaklıklarda pişirme işlemini takiben su, pH, TBARS ve HAA analizlerine tabii tutulmuştur. Ayrıca örneklerin pişirme kaybı da belirlenmiştir. HAA analizleri ise katı faz ekstraksiyon yöntemine göre yalnızca pişirilmiş örneklerde gerçekleştirilmiştir. Araştırma sonucunda, pişirme işlemi neticesinde örneklerde su miktarının azaldığı, pH değerinin ise arttığı tespit edilmiştir. Örneklerde %38,31-52,88 arasında değişen oranlarda pişirme kaybı görülmüştür. Isıl işlem görmemiş köftelerde 1,19 mg MDA/kg olarak tespit edilen TBARS değeri, pişmiş örneklerde 1,64-2,51 mg MDA/kg arasında değişiklik göstermiştir. Köfte üretiminde konjuge linoleik asit kullanımının örneklerin su içeriği, pişirme kaybı ve TBARS değeri üzerine önemli bir etkisi gözlenmezken (p>0.05), pH ve toplam HAA içeriği üzerine çok önemli (p), MeIQx (0,21 ng/g'a kadar), MeIQ (0,09 ng/g'a kadar), 7,8-DiMeIQx (0,15 ng/g'a kadar), 4,8-DiMeIQx (0,08 ng/g'a kadar), PhIP (0,83 ng/g'a kadar), AαC (0,24 ng/g'a kadar) ve MeAαC (0,05 ng/g'a kadar) içerdiği tespit edilmiştir. Pişirilen örneklerin toplam HAA içeriği 0,03-1,49 ng/g arasında değişiklik göstermiştir. Köfte üretiminde %0,25 oranında konjuge linoleik asit kullanımı, özellikle 250C'de pişirilen köftelerde toplam HAA içeriğini önemli ölçüde azaltmıştır. In the present study, the effects of conjugated linoleic acid usage at different levels (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25% and 0,5%) in meatball production on some quality criteria of meatballs cooked at different temperatures (150C, 200C and 250C) and the formation of heterocyclic aromatic amines (HCAs) were investigated. Not only the chemical composition analyses but also pH and TBARS analyses were carried out in raw beef meatballs, while water, pH and TBARS analyses were determined in cooked samples. In addition, cooking losses were also determined. HCAs analyses were carried out only in cooked samples according to solid phase extraction method. It was determined that the water content of samples decreased with cooking, while pH increased. The cooking losses were ranged from 38,31 to 52,88%. TBARS value that was 1,19 mg MDA/kg in raw samples was ranged from 1,64 to 2,51 mg MDA/kg in cooked samples. The usage of conjugated linoleic acid in the production of meatball had no significant effect (p>0.05) on water content, cooking loss and TBARS value, while it had very significant effect (p), MeIQx (up to 0,21 ng/g), MeIQ (up to 0,09 ng/g), 7,8-DiMeIQx (up to 0,15 ng/g), 4,8-DiMeIQx (up to 0,08 ng/g), PhIP (up to 0,83 ng/g), AαC (up to 0,24 ng/g) and MeAαC (up to 0,05 ng/g) were detected in the samples. The total HCA content of the samples was ranged between 0,03 and 1,49 ng/g. The usage of 0,25% conjugated linoleic acid in the production of meatball significantly reduced total HCA content, especially in samples cooked at 250C. 86

Steenrod cebirinde birçok açık problem vardır. Bunlardan bir tanesi kanonik anti-otomorfizma olan /chi dönüşümü altında Steenrod cebirinin üreteçlerinin görüntüsünü belirleme problemidir. Başka bir problem ise yine konjugasyon dönüşümü altında değişmez olan elemanların oluşturduğu altcebirin boyutunun belirlenmesidir. Bu problemlerin çözüme kavuşturulması ile cebirsel topolojinin esas problemlerinden biri olan n-küre S^n in homotopi gruplarının hesaplamasına yönelik sonuçlar elde edilir. Amacımız, bu tezde bu problemleri ifade edip çözümlerine ışık tutacak verileri oluşturmaktır. Bu tezde, ilk olarak Steenrod cebir yapısından bahsedildi. Milnor tarafından ortaya konulan Milnor çarpımı verildi. Ayrıca Silverman'ın stripping denilen tekniğine ayrıntılı olarak değinildi. Bir sonraki bölümde Lin'in yapmış olduğu çalışma ele alındı. Burada, Steenrod karelerinin konjugasyon altındaki görüntüsünün uygun açılımında bulunan tüm uygun monomiallerin kümesi belirlendi. Son bölümde, Crossley ve Whitehouse'un çalışması incelendi. Buradaki tüm sonuçlar ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Son olarak, konu ile ilgili açık problemlere yer verilmiştir. There are many open problems in the Steenrod algebra. One of them is to determine image of generators of Steenrod algebra under the map /chi which is canonical antiautomorphism. Another problem is to determine dimension of subalgebra which consists of invariant elements under the conjugation map. With solutions of these problems, it is obtained results for computing homotopy groups of n-sphere S^n which is one of the main problem in algebraic topology. Our aim is to form datas which shed light on solutions by stated these problems in the thesis. Firstly it is dealed with the structure of Steenrod algebra. Milnor product which is due to Milnor is given. Moreover, it is detailed technique called stripping. In the next section, it is discussed Lin's paper. Here, it is determined the set of all admissible monomials which lie in admissible expansion of image under the conjugation of Steenrod squares. In the last section, Crossley and Whitehouse's paper is studied. All results in the paper are detailed. Finally, open problems related to topic are included. 76

Influenza A Virüsü farklı zaman ve yerlerde epidemilere ve dünya çapında pandemilere neden olmuştur ve gelecekte de olması yüksek ihtimal olan bir hastalıktır. En son 2009 yılında halk arasında Domuz Gribi adı ile bilinen Influenza A Virüsü?nün neden olduğu pandemi nedeniyle Dünya Sağlık Örgütü alarm seviyesini 5?den en üst düzey olan 6 dereceye çıkartmıştır.Bu tez çalışmasında Influenza A Virüsüne ait dört farklı peptid dizisi kullanılmıştır. Bunlardan iki peptid dizisi tarafımızdan sentezlenmiş diğer iki dizi ise ticari olarak satın alınmıştır. Bu peptid dizilerinin karakterizasyonları yapılmıştır. Peptid polielektrolit biyokonjugatlarının ve komplekslerinin oluşturulması için dört farklı taşıyıcıkullanılmıştır; poliakrilik asid, poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasid), dekstran aldehit ve bovin serum albumin. Taşıyıcılardan poliakrilik asit ve bovin serum albumin ticari olarak alınmıştır. Poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasid) ve dekstran aldehit tarafımızca sentezlenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Influenza A Virüsüne ait farklı peptid epitopları kullanılarak değişik yöntemlerle adıgeçen taşıyıcılar ile biyokonjugatları ve kompleksleri sentezlenmiştir. Bu biyokonjugat ve komplekslerin fizikokimyasal yapıları incelenmiş, peptid antijenlerinin immünojenliğinin yükseltilmesi amacıyla peptid biyokonjugatlarının gerekli üç boyutlu yapıları oluşturulmuş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Biyokonjugatların ve komplekslerin oluşumu farklı spektroskopik ve kromatografik yöntemlerle xxviaydınlatılmıştır. Elde edilen sonuçlar kıyaslandığında karbodiimid varlığında kovalent bağlar ile oluşan biyokonjugatların daha verimli bağlandığı görülmüştür. Sentetik aşı modeli olarak tasarladığımız Influenza A Virüsü M2 peptidi-polielektrolit biyokonjugatları için; in vivo uygulamalarda kullanılan düşük konsantrasyonlarda MCF-7 hücreleri üzerinde kayda değer bir toksik etki göstermediği; hem MTT deneyleri ile, hem de Flow Cytometry yöntemi ile hücre canlılığı kontrol edilerek birbirini destekleyen sonuçlar elde edilmiştir ve biyokonjugatların deney hayvanları üzerinde kullanabilirliği ortaya konulmuştur.Konjugasyon reaksiyonunun oluşumu floresans boya kullanılarak Floresans Rezonans Enerji Transferi yöntemi yardımı ile araştırılmıştır. İntermoleküler mesafe hesabı yapılıp, saf peptid ve biyokonjugat oluşumunda konformasyondaki değişimler hesaplanmış ve sayısal değerlerle de ifade edilmiştir. Literatürde ilk kez Influenza A Virüsü Hemagglutinin H3N2 91-106 peptid dizisi modellenmiş, moleküler mekanik yöntem ile minimum enerjiye sahip olduğu optimize geometrisi belirlenmiştir. FRET yöntemi ile deneysel verilere dayalı elde edilen sayısal değerlerin, teorik olarak hesaplanan değerler ile örtüştüğü ispatlanmıştır.Bu tez kapsamında Floresans Enerji Transferi Yöntemi ile biyokonjugattaki donör ve akseptör arasındaki intermoleküler mesafe hesabı ile elde edilen bilgiler, Influenza A Virüsü?nün neden olduğu epidemilere ve pandemilere neden olan salgın hastalığa karşı spesifik antikorların elde edilmesi, nanobiyosensörlerin oluşturulması, tanı kitlerinin ve en önemlisi günümüzde popüler çalışmalar arasında yer alan merhum Hocamız değerli bilim insanı Prof. Dr. Mehmet Mustafaev Akdeste?nin hedefi olan aynı polimer matriksine birden fazla hastalığın antijeninin bağlanarak multifonksiyonel biyoteknolojik aşıların geliştirilmesine ışık tutacak bir çalışmadır.Anahtar Kelimeler: Influenza A Virüsü, Floresans Rezonans Enerji Transferi, kovalentkonjugasyon, optimize geometri, üç boyutlu konformasyon. Influenza A virus had caused epidemics and pandemics all over the world at different times and probably will cause in the future, too. Lastly in 2009, WHO raised the level of pandemic alert from phase 5 to 6 because of colloquially known as Swine Flu caused by Influenza A Virus. In this PhD. thesis, four different peptide sequences of the influenza A virus was used. Two of them were synthesized in our laboratory and the other two sequences were purchased commercially. These peptide sequences were characterized. Four different carriers (polyacrylic acid, poly(N-vinyl-2-pyrrolidone-co-acrylic acid), dextran aldehyde, and bovine serum albumin) were used for the synthesis of the peptide polyelectrolyte bioconjugates and formation of the complexes. Polyacrylic acid and bovine serum albumin were purchased commercially. Poly(N-vinyl-2-pyrrolidone-co-acrylic acid) and dextran aldehyde were synthesized and characterized in our laboratory. Bioconjugates and complexes of different peptide epitopes of Influenza A Virus were synthesized through the mentioned carriers with various methods. Physicochemical structures of these bioconjugates and complexes were investigated, in order to increase immunogenity of the peptide antigens, the necessary three-dimensional structures of peptide bioconjugates were formed and characterized. The formation of bioconjugates and complexes were clarified by various spectroscopic and chromatographic methods. When results were compared, bioconjugates formed with xxviiicovalent bonds which were obtained in the presence of carbodiimide was found to be more efficient.For the Influenza A virus M2 peptide polyelectrolyte bioconjugates designed as a synthetic vaccine model; it didn?t show significant toxic effect on the MCF-7 cells using low concentrations in vivo applications; by controlling cell viability with Flow Cytometry method and MTT experiments, results that supporting each other have been obtained and the usability of bioconjugates upon the experimental animals have been presented.The formation of conjugation reaction was investigated by Fluorescence Resonance Energy Transfer method with using Fluorescence dye. By calculating intermolecular distance, conformation changes in the pure peptide and the formation of bioconjugate were calculated and expressed with numerical values. In the literature, the peptide sequence of Influenza A virus Hemagglutinin H3N2 91-106 was modeled for the first time, the optimized geometry with minimum energy were determined by molecular mechanics method. The numerical values obtained that are based on experimental data proved to overlap the theoretically calculated values by FRET method. In this PhD. thesis, with the information obtained from intermolecular distance calculations between donor and acceptor in bioconjugate by Fluorescence Energy Transfer Method clearly showed to obtaining of specific antibodies against the disease because of the epidemics and pandemics caused by Influenza A viruses, the creation of nanobiosensors and diagnostic kits and the most important; target of our teacher, precious scientist, decedent Prof. Dr. Mehmet Mustafaev Akdeste, the development of multifunctional biotechnology vaccines with binding of more than one disease's antigen on the same polymer matrix.Keywords: Influenza A virus, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Covalent Conjugation, Optimized geometry, 3-dimensional conformation 237

İnsanlarda gastrointestinal sistem florası¬nın elemanı olan enterokoklar, önemli hastane infeksiyonu etkenleri arasındadır. Çalışmamızda Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi hastanesinde çeşitli klinik servislerde yatmakta olan hastalardan alınan idrar, bos, kan, katater, pü ve rektal swab örneklerinden elde edilen kültür koleksiyonundan seçilen 64 Enterococcus faecium suşunda çoklu ilaç dirençliliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Suşların identifikasyonunda Phonex antibiyogram cihazı ve rapid ID 32 Strep APİ kiti kullanılmıştır. Antibiyogram duyarlılıkları ise Phonex antibiyogram cihazı ve disk difüzyon yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Suşlardaki direnç yüzdeleri; ampsiline % 100, streptomisine % 87.5, kanamisine % 100, gentamisine % 67.18, kloramfenikole % 32.81, tetrasikline % 21.87, rifampisine % 100, vankomisine % 96.87, eritromisine % 100 ve teikoplanine % 79.68 olarak belirlenmiştir. Antibiyotik direncinden sorumlu genlerin belirlenmesi amacıyla polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi kullanılmıştır. PZR ürünleri dizi analizi ile doğrulanmıştır. Çalışmamızda Van B tipi direnç içeren suş saptanmış ve Türkiye'den bildirilen ikinci olgu olduğu görülmüştür. Ayrıca antibiyotik direnç genlerinin konjugasyon yolu ile aktarımı araştırılmış vanA direnç geni duyarlı suşlara aktarılabilmiştir.Anahtar Kelimeler: E. faecium, Antibiyotik Direnç, Konjugasyon The enterococci which are the elements of gastrointestinal system flora, are some of the important factors of nosocomial infections. In our study, our intention was to determine muti-drug resistancy of 64 Enterococcus faecium strains which are chosen from bacterial cultures obtained from the urine, CSF, blood, catheter, pus and rectal swab specimens taken from hospitalized patients at various clinical departments of Akdeniz University Faculty of Medicine. Phonex antibiogram device and rapid ID 32 Strep API kit were used for the identifications of strains. Antibiogram susceptibilities were carried out by using Phonex antibiogram device and disc diffusion methods. The percentages of resistance in strains are determined as; ampsiline % 100, streptomycin % 87.5, kanamycin % 100, gentamycin % 67.18, chloramphenicol % 32.81, tetracycline % 21.87, rifampycin % 100, vancomycin % 96.87, erythromycin % 100 and teicoplanin % 79.68. Polymerase chain reaction (PCR) method was used in order the determine the genes responsible for antibiotic resistance. PCR products was confirmed by sequence analysis. In our study, strains with Van B type resistance are detected and found to be the second case reported from Turkey. Also transfer of the antibiotic resistance genes by conjugation was researched, vanA resistance gene were able to transfered to sensitive strains.ey Words: E. faecium, Antibiotic Resistance, Conjugation 126

Enterokoklar insan ve hayvanların bağırsak florasında ve ayrıca gıdalarda bulunan Gram pozitif bakterilerdir. Gıdalarda probiyotik ve starter kültürler olarak kullanılmaktadır. Çalışmamızda, Türkiye' deki peynirlerden izole edilen 48 Enterococcus cinsi üyesinde virülans faktörler ve antibiyotik direnç determinantlarının sıklıkları araştırılmıştır. E. faecium ve E. faecalis suşlarında 11 antibiyotik için duyarlılık testleri, disk difüzyon ve mikrodilüsyon yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Suşlardaki direnç yüzdeleri; ampisilin için % 16.6, streptomisin için % 97.91, nalidiksik asit için % 100, kanamisin için % 100, gentamisin için % 14.58, kloramfenikol için % 22.91, tetrasiklin için % 25, rifampisin için % 79.16, vankomisin için % 79,16, eritromisin için % 97.91, siprofloksasin için % 62.5 olarak belirlenmiştir. Antibiyotik direncinden sorumlu genler belirlemek amacıyla polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi kullanılmıştır. tetM ve vanB genleri için tüm suşlar negatif bulunmuştur. PZR ürünleri dizi analizi ile doğrulanmıştır. PZR yöntemi ile enterokokların virülanslığı ile ilişkili agregasyon faktör (AS) geni, yüzey proteini esp, kollojen bağlayıcı adhezin ace, E. faecalis endokardit antijen efaA, jelatinaz gelE, fsr lokusu, sitolizin genleri (cylM, cylA, cylB) ve seks feromonları (cpd, cob, ccf) araştırılmıştır. Virülans determinantların E. faecalis suşlarında E. faecium suşlarına oranla daha fazla oldukları saptanmıştır. Antibiyotik direnç genlerinin konjugasyon yolu ile aktarımı araştırılmış ancak bu çalışmalarda konjugant elde edilememiştir. Enterococci are Gram-positive bacteria which present in the gut of humans and animals and can also be food products. They are used as starter and probiotic cultures in foods. In this study, we investigated the incidence of virulence factors and antibiotic resistance determinants of 48 Enterococcus isolates originated from cheese in Turkey. Susceptibility testing for 11 antibiotics were analyzed with disc diffusion and microdilution methods in E. faecalis and E. faecium strains. Resistance levels of strains was determined as for ampicillin (% 16.6), streptomycin (% 97.91), nalidixic acid (% 100), kanamycin (% 100), gentamicin (% 14.58), chloramphenicol (% 22.91), tetracycline (% 25), rifampicin (% 79.16), vancomycin (% 79.16), erythromycin (% 97.91), ciprofloxacin (% 62.5). To identify genes responsible from antibiotic resistance, polymerase chain reaction (PCR) method was used. All strains were found negative in respect of tetL and vanB genes. Sizes of amplicons were verified by sequence analysis. The presence of the aggregation substance (AS) gene, the surface protein gene esp, the accessory colonisation factor ace, the E. faecalis endocarditis antigen efaA and the gelatinase gelE gene, fsr locus, cytolysin genes (cylM, cylA, cylB), sex pheromones (cpd, cob, ccf) which are involved in the virulence of enterococci, were also tested by PCR. Virulence determinants in E. faecalis strains determined greater numbers compared to E. faecium strains. Conjugation mechanisms was investigated for acquire antibiotic resistance genes but any transconjugant was determined. 128

Bu çalışmada, ileri işlenmiş tavuk eti ürünleri arasında büyük bir tüketim potansiyeli bulunan nugget hamuruna (Kontrol-K grubu) doğrudan (D grubu) ve mikrokapsül (M grubu) formda % 2 oranında (w/w) KLA ilave edilmiş ve bu iki uygulamanın donmuş depolama süresince son ürün üzerine olan etkileri araştırılmıştır.Yapılan analizler sonucunda depolama süresince nugget gruplarının pH değerlerindeki değişikliklerin istatistik açıdan önemli olduğu belirlenmiştir (P0.05). Donmuş depolama süresince D ve M grubu nuggetların tiyobarbitürik asit (TBA) değerleri arasında önemli bir fark görülmemesine rağmen, bu iki grubun, K grubu nuggetlardan daha düşük TBA değerlerine sahip oldukları belirlenmiştir. Yapılan varyans analizinde p-anisidin, peroksit ve toplam oksidasyon değerleri için uygulama şekli*depolama süresi interaksiyonunun istatistik açıdan önemli olduğu belirlenmiştir (p0.05). Thiobarbituric acid (TBA) values of D and M groups did not differ significantly during frozen storage while this value was the lowest in M group. In the variance analysis the interaction between application method*storage time was found to be significant for p-anisidin, peroxide and total oxidation values (p

Streptococcus thermophilus süt endüstrisinde önemli yere sahip ve süt fermentasyonunda başlangıç kültürü olarak kullanılmaktadır. Gıda güvenliği açısında başlangıç olarak kullanılan kültürlerin dışarıdan gen transferine karşı korunaklı olması istenmektedir. Dolayısı ile bu çalışmada, doğal yoğurtlardan izole edilmiş 106 adet Streptococcus thermophilus'un izolatında PZR ile konjugasyon potansiyelleri comX geni üzerinden moleküler olarak belirlenmiştir. Toplam 45 izolatta comX geni varlığı tespit edilmiştir. Bu 45 izolatın tamamında transkonjugant kolonilerinin oluşup oluşmadığının teyidi yapılmıştır. Kolonilerde konjugasyon referans E.coli'de bulunan pNZ276 plazmiti kullanılarak yapılmıştır. Bu plazmit hem E.coli hemde S.thermophilus'larda replike olabilme özelliğine sahiptir. Konjugasyon E. coli ve Streptococcus thermophilus türlerinin aynu petride bütülmesi ile gerçekleştirimiştir. Trans konjugasyon seçimi pNZ276plazmitinin Eritromisin direnç özelliğine göre seçilmiştir. Ayrıca iki türü birbirinden ayırmada katalaz testi kullanılmıştır. 45 izolatın 6 tanesinde (7, 24, 30, 36, 37, 46)transkonjugasyon belirlenmiştir. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında comX gen varlığı konjugasyon üzerinde rol almaktadır. S. thermophilus has very important place in milk industry and used as starter culture for fermantation. Interms of the food saftey the starter cultures must have protection systemagainst forein gene transfer. Therefore in this work, Conjugation potentials of 106 species of S. thermophilus which were isolated from natural yoghurt samples were identified forthe existence of comX gene, using PZR tecnique. Totally, existence of comX gene in 45 isolates were determined. Being transconjugant colony for all these isolates has beenverified. Verifying of transconjugant colonies was determined by pNZ276 plasmid which present in E. coli. This plasmid naturally presents in E.coli and has able to replicate in S.thermophilus. Conjugation was performed in same petri dishes by growing up both E.coli and S. thermophilus. Transcongugants were selcted by erythromycin resitance which iz encoded by pNZ276 plasmid. Catalase test also used to distinguish these two species. 6 of 45 isolates were determined as transconjugant (7, 24, 30, 36, 37, 46 ). In additions, expresional analysis of comX gene showed that it is presence in bacteria responsible for the high conjugation frequency between strains by comparing with control group. 39

Bu çalışma, 4-hidroksienonların radikal yükseltgen seryum(IV) amonyum nitrat aracılığıyla konjuge dienlerle radikal halkalaşma reaksiyonlarını içermektedir. Araştırmada 4-hidroksienon bileşiği olarak 4-hidroksi-2H-kromen-2-on (1a), 4-hidroksi-pirano[4,3-b]piran-2-on (1b), 4-hidroksi-1-metilkinolin-2(1H)-on (1c), 4-Hidroksi-2H,5H-pirano[3,c]kromen-2,5-dion (1d) ve 4-hidroksi-2H,5H-pirano[4,3-b]piran-2,5-dion (1e) kullanıldı. Konjuge dien olarak (1E)-büta-1,3-dien-1-ilbenzen (2a), 2-[(1E)-büta-1,3-dien-1-il]tiyofen (2b), [(1E)-3-metilbüta-1,3-dien-1-il]benzen (2c), 2-[(1E)-3-metilbüta-1,3-dien-1-il] tiyofen (2d), [(1E)-3-fenilbüta-1,3-dien-1-il]benzen (2e) ve 1,1'-büta-1,3-dien-1,1'-diildibenzen (2f) kullanıldı. Radikal yükseltgen olarak seryum(IV) amonyum nitrat ve mangan(III) asetat kullanıldı.4-hidroksienonların seryum(IV) amonyum nitrat ve mangan(III) asetat aracılığıyla konjuge dienlerle reaksiyonları sonucunda 2,3-dihidrofurokromen bileşikleri (3a-s) ve elde edilen bu 3a-s bileşiklerinin DDQ ile reaksiyonlarından dihidrofuranlar (4a-f) elde edildi.Elde edilen ürünler kolon ve preperatif ince tabaka kromotografisi kullanılarak saflaştırıldı. Bileşiklerin yapıları spektroskopik yöntemler (IR, 1H-NMR, 13C-NMR ve kütle spektrumu) ile aydınlatıldı. This study covers the radical cyclizations of 4-hydroxyenones with conjugated dienes mediated by radical oxidants cerium (IV) ammonium nitrate (CAN). In the study, 4-hydroxy-2H-kromen-2-one (1a), 4-hydroxy-pirano[4,3-b]piran-2-one (1b), 4-hydroxy-1-methylqinoline-2(1H)-one (1c), 4-hydroxy-2H,5H-pirano[3,c]kromen-2,5-dione (1d) ve 4-hydroxy-2H,5H-pirano[4,3-b]piran-2,5-dione (1e) were used as 4-hydroxyenones. (1E)-buta-1,3-diene-1-ylbenzene (2a), 2-[(1E)-buta-1,3-diene-1-yl]thiophene (2b), [(1E)-3-methylbuta-1,3-diene-1-yl]benzene (2c), 2-[(1E)-3-methylbuta-1,3-diene-1-yl]thiophene (2d), [(1E)-3-phenylbuta-1,3-diene-1-yl]benzene (2e) ve 1,1?-buta-1,3-diene-1,1?-diyldibenzene (2f) were used as conjugated dienes. Cerium(IV) ammonium nitrate and manganese(III) acetate were used as radical oxidants.Cerium(IV) ammonium nitrate and manganese(III) acetate mediated reactions of 4-hydroxyenones with conjugated dienes led to the formation of 2,3-dihydrofurocromene (3a-s) and this coumpounds reactions with DDQ formed dihydrofuranes (4a-f).Products obtained were purified through coloumn and preparative thin layer chromatography. Structures of compounds were characterized by spectroscopic methods (IR, 1H-NMR, 13C-NMR and mass). 154

Polielektrolit özellikteki farklı sentetik polimerlerin biyomoleküller ile etkileşimleri biyolojik açıdan önemli mekanizmaların varlığını ortaya koymakta ve biyomedikal uygulamalar için büyük önem taşımaktadır. Polielektrolit - biyomolekül konjugatları yeni tip sentetik polimerik aşı sistemlerinin geliştirilmesinde, biyomolekülün kararlılığının arttırılmasında, organ, doku, hücre ve reseptör hedeflemelerinin gerçekleştirilmesinde, biyopolimre ait çözünürlük gibi kimi sorunlarının giderilmesi ve canlıda uzun sürede salınımının sağlanmasında, biyouyumluluğunun arttırılmasında, tanı teşhis kitlerinin hazırlanmasında, biyosensör sistemlerinin geliştirilmesinde önemli ve öncü sistematik yapıları teşkil etmektedirler.Bu yönde yapılan çalışmlarımızda sentetik polielektrolitlerin (poliakrilikasid, polioksidonyum gibi polimerler ve polimetilvinileter-ko-maleikanhidrid, poli(vinilpirolidon-ko-akrilikasid), poli(asetikasid-ko-N-izopropilakrilamid) gibi kopolimerler) özellikle antikanser özelliği bilinen betulin , steroid yapıdaki hormonlardan estradiol ve progestron, melanoma kanser peptidlerinden MAGE-3(121-134) peptid dizesi ve BSA gibi biyomoleküller ile farklı yöntemler ve çapraz bağlayıcılar (EDC, CDI, vb.) kullanılarak gerçekleştirilen konjugasyon reaksiyonları ile sentezlenen konjugatların ve hazırlanan komplekslerin kimilerinde yapı işlev analizleri, sitotoksisite testleri, antioksidan özelliklerinin incelenmesi kimilerinde ise immünolojik hayvan deneyleri gerçekleştirildi.Bu sayede daha etkin, kararlı, hücre yönlendirmesi yapılabilen diagnostikler elde edilmesi amaçlanmakta, teşhis kitlerinde ve tedavi yöntemlerinde kullanılmasına yönelik ön çalışmaların yapılması hedeflenmektedir. Interaction of biomolecules with different synthetic polymers, which has polyelectrolyte characteristic, reveals biologically the existence of important mechanisms and it has a great importance for biomedical practice. Polyelectrolyte - biomolecule conjugates comprise as an important and lead systematic structures in developing of the new types of synthetic polymeric vaccine systems, increasing the stability of biomolecule, realizing to organ, tissue, cell, and receptor targeting, overcoming some problems, such as resolution of biopolymer and the provision of long-period oscillation creature, increasing biocompatibility, preparing diagnosis and diagnostic kits and developing biosensor systems.In our laboratory work, some of conjugates are synthesized with performed conjugation reactions using different methods and cross linkers (EDC, CDI, etc.) and some of complexes were prepared with synthetic polyelectrolytes (polymers like polyacrylic acid, polioksidonyum and copolymers like poly methylvinylether, co-maleic anhydride, poly(vinyl pyrrolidone, co acrylic acid), poly (N isopropyl acrylamide co asetikasid) ) and biomolecules like betulin which is known its anticancer effect, estradiol and progesterone which are steroid hormones, MAGE-3 (121-134) peptide line which is melanoma cancer spesific peptide and BSA. In some of conjugates and complexes antioxidation and cytotoxicity tests, analysis of the structure function and in some of them immunological animal experiments were realized.In this way, obtaining more efficient, stable, cell orientation can be done diagnostics is intended and preliminary studies in order to use identification kits and methods of treatment are targeted. 201

ÖZETPROTEİN KONJÜGASYONU - YENİ BİR FORMÜLASYON ÇALIŞMASIPeptit, protein gibi biyolojik moleküller, hastalıkların iyileştirilmesinde oldukça fazla kullanılmaktadır. Basınç ölçekli inhalerler, ilaç aktif maddelerinin akciğerler vasıtasıyla kan dolaşımına taşınmasında kullanılan etkileyici bir cihazdır. İlaç partiküllerinin dispers olmasını sağladığından, bu tip cihazlarda uçucu çözücü sistemi çok önemlidir. İlaç endüstrisi genellikle kloroflorokarbon çözücülerini kullanmaktadır. Ancak; bu çözücüler ozon tabakasına zarar verdiğinden, bunların yerine klor içermeyen, çevre dostu çözücüler araştırılmaktadır. Bu tez çalışmasında, model çözücü olarak 2H,3H-perfloropentan ve model protein olarak tripsin kullanıldı. Basınç ölçekli inhalerlerin formülasyonlarında eksipiyan olarak kulla-nılan polietilen glikol, polipropilen glikol ve polietilen oksit-polipropilen oksit-polietilen oksit blok kopolimerinin, 2H,3H-perfloropentan içindeki faz davranışları incelendi. Monometil veya dimetil polietilen glikol, dihidroksil polietilen glikol’e nazaran daha fazla çözündü. Dolayısıyla polimerin çözünürlüğü, sahip olduğu fonksiyonel grup ile çözücü arasındaki etkileşime bağlıdır. 2H,3H-perfloropentan içinde çözünmeyen tripsin, çözünürlüğünün arttırılması için monometil polietilen glikol 500, polipropilen glikol 1000 ve polietilen oksit-polipropilen oksit-polietilen oksit blok kopolimeri 1100 ile konjüge edildi. Bu polimerler, tripsinin amin grupları ile reaksiyona girebilmesi için, öncelikle N,N'-karbonildiimidazol kullanılarak reaktif hale getirildi. Elde edilen modifiye tripsinlerin, model çözücü 2H,3H-perfloropentan içinde, farklı sıcaklıklardaki çözünürlük davranışı incelendi. Bütün sıcaklıklarda bulanık olan örneklerin UV spektrofotometresiyle kantitatif analizi yapıldı. 4oC’de daha fazla çözündüğü saptandı. Ayrıca bu tez çalışmasında poli(amidoamin) dendrimerlerin polietilen glikol ile konjügasyonu da çalışıldı. Poli(amidoamin) dendrimerler gen terapisinde oldukça yaygın kullanılmaktadır. Yine 2H,3H-perfloropentan içinde çözünmeyen poli(amidoamin) dendrimerleri, sentezlenen reaktif monometil polietilen glikol ile %50 ve %100 oranında modifiye edildi ve %100 modifiye olan poli(amidoamin)’in çözünürlüğü arttırıldı. ABSTRACTPROTEIN CONJUGATION - A NEW FORMULATION STRATEGYBiological molecules such as peptide and protein has been used for the treatment of diseases. Pressure metered dose inhalers are the devices to send the active molecules to the blood stream via lungs attractively. Volatile propellant is very important as it provides to disperse medicine particles. The propellant used in these devices is chlorofluorocarbons. However, they are known to cause to ozone depletion, drug companies are trying to replace them with more environmentally friendly fluorinated solvents. In this project, 2H,3H-perfluoropentane as model propellant and trypsin as model protein were used. The phase behaviors of polyethylene glycol, polypropylene glycol ve polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide block copolymer which are used as exipients in pressure metered dose inhalers, in 2H,3H-perfluoropentane were investigated. Monomethyl and dimethyl polyethylene glycols were more soluble than dihydroxyl polyethylene glycol. Therefore, the solubility is dependant on the functional group-solvent interaction. Unsoluble trypsin in 2H,3H-perfluoropentane, was conjugated by monomethyl polyethylene glycol 500, polypropylene glycol 1000 ve polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide block copolymer 1100, to improve its solubility. Polymers were firstly activated using N,N-carbonyldiimidazole in order to react with the amine groups of trypsin. The solubility behaviors of modified trypsins at different temperatures were obtained. Quantitative analysis of modified trypsin solutions having cloudy apperance by UV spectrophotometer was made. They were more soluble at 4oC. Also 50% and 100% conjugation of poly(amidoamine) dendrimers which are widely used for gene therapy, by polyethylene glycol was studied. Unsoluble poly(amidoamine) dendrimers in 2H,3H-perfluoropentane became soluble when 100% conjugation was performed.

Bu çalışmada Ankara'da bulunan 4 kuşevi, 3 bireysel kuş yetiştiricisi ve 2 petshop'ta bulunan 162 kafesten alınan 320 adet dışkı örneği Ames Transport Medium'lu steril svaplar (Cultiplast Tampon Plast) aracılığıyla toplanmıştır. Çalışmada toplanan örnekler, kanarya (98), muhabbet kuşu (106), papağan (25), saka (14), Hint bülbülü (Mandalin) (22) ve güvercin (55) ırkı hayvanlardan sağlanmıştır. Toplanan örnekler soğuk zincir altında muhafaza edilerek laboratuvara ulaştırılmıştır.Çalışmada kafes kuşlarından taze olarak toplanan 320 adet dışkı örneği kültürel yöntemler kullanılarak incelenmiştir. 320 adet dışkı örneğinin 56 tanesinden (% 17.50) E. coli izole edilmiştir. 56 suşun 44 adedinde (% 78,57) tetrasiklin direnci tespit edilmiştir. Konjugasyon deneyi yapılan 35 adet suşun 3 adedinde (% 8.57) aktarım saptanmıştır. Izole edilen suşların 35 adedinde (% 62.50) tet(A), 22 adedinde (% 39.28) tet(B) ve 15 adedinde (% 26.75) hem tet(A) hem de tet(B) genleri tespit edilmiştir. Plazmid izolasyonu 56 adet E. coli suşunun 42 adedinden (% 75) gerçekleştirilmiştir.Sonuç olarak, bu çalışmada kafes kuşlarının dışkı örneklerinden izole edilen E. coli suşlarının tetrasiklin direnci ve direnç aktarımı klasik ve moleküler yöntemler kullanılarak tespit edildi. Klasik yöntemler daha ucuz olmasına karşılık, bu yöntemlerle tespit edilemeyen sonuçların moleküler yöntemler kullanılarak daha güvenli şekilde elde edilebileceği ve bunların da direnç tespiti açısından rutin olarak uygulanabileceği gösterildi. In this study, 320 fecal samples collected from 162 cages from 4 bird houses, 3 individual bird owners and 2 petshops in Ankara. Fecal samples were taken with sterile swaps, using Ames Transport Medium (Cultiplast Tampone Plast). Examples collected from canaries (98), love birds (106), parrots .(25), goldfinches (14), Indian nightaingale (22) and geese (55). All samples sent to the laboratory with cold cycle.In the study, fresh fecal samples were analyized by cultural methods. From 56 of 320 fecal samples identified as E. coli (% 17.50). 44 of 56 E. coli strains (% 78,57) were identified as tetracycline resistance strains. In conjugation experiment, 3 of 35 (% 8.57) E. coli strains had showed conjugation. 35 tet(A) genes (% 62.50), 22 tet(B) genes (% 39.28), 15 tet(A) and tet(B) genes (% 26.75) were isolated from E. coli strains, respectively. Also, plasmid isolations were made and from 56 strains we found 42 strains (% 75).In conclusion, tetracycline resistance and transferation of resistance of E. coli strains which isolated from fecal samples were detected by using classical and molecular methods. In contrast, the classical methods were cheaper but detection of the results by moleculer methods were more trustful and shown that detection of resistance by these methods could be useful for the routine analysis. 80

Bu yazı, 20-26 Eylül 2004 tarihleri arasında düzenlenen V. Uluslararası Türk Dili Kurultayı’nda bildiri olarak sunulmuştur. Türk dilinde fiil işletimi sırasında belli bir döneme kadar müstakil bir şimdiki zaman eki görülmemektedir. Eski Anadolu Türkçesinin ilk dönemlerinden itibaren kullanılan şimdiki zaman ekleri birbirlerinden farklı kullanım özellikleri gösterirler. Zaman belirleyiciler ise zaman eklerini sınırlayan ve belirleyen kelimeler olarak karşımıza çıkarlar. Bu yazıda aynı zaman dilimini ifade etmek için kullanılan ama daha en başından ayrılıklarını hissettiren şimdiki zaman eklerinin kullanımında zaman belirleyicilerinin rolünü ortaya koyabilmek ve zaman belirleyicilerle kullanılan örnekleri inceleyerek bir tespitte bulunabilmek amaçlanmıştır. No independent present progressive affix had been observed during the verb operations in Turkish language until a specific period. The present progressive affixes, which have bben in use since the beginning of the first periods of the Old Anatolian Turkish, display usage characteristics different from one another. As for time determinants, they appear to function as the words limiting and determing the time affixes. The present article aims both to put forward the role of the time determinants in the use of the present progressive affixes, which are used to express the same time segment, but at the same time, making their being different felt since the very beginning, and to make findings through examining the samples making use of time determinants.

Klebsiella pneumoniae bakterileri; üriner sistem enfeksiyonları, üst solunum yolu enfeksiyonları ve hastane enfeksiyonlarının önemli bir ajanıdır. Çalışmamızda; Ocak 2004-Şubat 2005 tarihleri arasında, Ankara Numune Hastanesi, Ankara Hastanesi, Gazi Hastanesi, Ankara Üniversitesi bni Sina Tıp Fakültesi Hastanesi ve Konya Numune Hastanesine başvuran üriner sistem enfeksiyon şüpheli hastalardan alınan idrar örneklerinden toplam 125 adet K. pneumoniae suşu izole edilmiş ve bazı antibiyotiklere karşı direnç durumları belirlenmiştir. Extended Spectrum Beta Lactamase (ESBL) üreten suş sayıları ile plazmid taşıyan suşların plazmid profilleri araştırılmıştır. Tüm suşlar; Penicilline % 99.2, Ampicilline % 96 ve Chloramphenicole % 16.8 oranında dirençli bulunmuştur. Aminoglikozid grubu antibiyotiklerden Amikacine % 8, Streptomycine % 22.4 ve Gentamicine ise % 15.2 oranında dirençli oldukları görülmüştür. Sefalosporin grubu antibiyotiklerden Cefotaxime ve Ceftazidime % 22.4, Ceftriaxona % 19.2 oranında dirençli oldukları görülmüştür. Toplam suşların % 36'sının ESBL ürettiği, % 65.6'sının plazmid taşıdığı, bu plazmid büyüklüklerinin 1.6-30.1 kb arasında değiştiği ve plazmidlerin sekiz farklı plazmid profili oluşturdukları belirlenmiştir. Çoklu dirençli ve plazmid taşıyan verici K. pneumoniae suşları, alıcı Salmonella spp. suşu ile konjugasyona sokulmuş ve 19.3 kb büyüklüğünde plazmid taşıyan 5 adet suşun bu plazmidlerini aktardıkları görülmüştür. K. pneumoniae suşlarının plazmid büyüklükleri ile antibiyotik dirençlilikleri arasında bir ilişki saptanamamış fakat büyük plazmidlerin küçük plazmidlere oranla ESBL üretiminde daha çok etkili oldukları sonucuna varılmıştır., Klebsiella pneumoniae bacteria are an significant agent of urinary system infections, upper respiratory tract infections and nosocomial infections. In our study, totally 125 K. pneumoniae strains were isolated from the urinary samples provided from suspected patients with urinary system infections applied to Ankara Numune Hospital, Ankara Hospital, Gazi Hospital, bni Sina Medical School of Ankara University and Konya Numune Hospital from January 2004 to February 2005 and their resistant characteristics were investigated against antibiotics we used. The number of the strains producing Extended Spectrum Beta Lactamase (ESBL) and plasmid profiles of the strains including plasmids were investigated. All strains were found to be resistant to penicillin 99.2 %, to ampicillin 96 % and to chloramphenicol 16.8 %. They were also determined to be resistant to some aminoglycosid group of antibiotics such as amikacin 8 %, streptomycin 22.4 % and gentamicin 15.2 %. In addition, these strains were seen to be resistant to some antibiotics from cephalosporin group such as cefotaxime and ceftazidime 22.4 %, ceftriaxon 19.2 %. It was determined that 36 % of all strains producing ESBL, 65.6 % contained plasmids, the size of these plasmids ranges 1.6 to 30.1 kb and these plasmids from eight different plasmid profiles. Multiple resistant and plasmid-carrying donor K. pneumoniae strains were conjugated with recipient Salmonella spp. strains and five strains carrying plasmids in size of 19.3 kb were observed to transfer these strains. No relationship was found between plasmid size of K. pneumoniae strains and their antibiotic resistance, but it was concluded that plasmids in larger size are more effective in ESBL production than smaller size plasmids.

oz YÜKSEK LİSANS TEZİ BRUSELLOZ'UN LABORATUVAR TANISI EREN ERGICAN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. Sadık DİNÇER Yıl: 2003 Sayfa: 58 Jüri: Doç. Dr. Sadık DİNÇER Doç. Dr. Mehmet Macit İLKİT Yrd. Doç. Dr. Hatice GÜVENMEZ Bu çalışmada, Başkent Üniversitesi Adana Uygulama ve Araştırma Merkezine başvuran hastaların Bruselloz yönünden incelenmesi ve kan kültürlerinden izole edilen bakterilerin antibiyotik dirençlilik durumlarının belirlenmesi ve dirençlilik mekanizmalarından plazmidik olanların konjugasyon ile dirençlilik transferinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Bruselloz şüpheli 4758 hastadan alman kan örneklerinde serolojik testler (Serum Aglütinasyon testi, Coombs testi ve Rose-Bengale Plate testi) ve kan kültürleri yapılmıştır. Kan kültürleri sonucunda 3'ü (%27) erkek, 8'i (%73) kadın toplam 1% olguda Brucella melitensis saptanmıştır. Bu kökenlerin AK, C, CRO, S, CN, SXT, FEP, DA, OFX, CİP, FOX, SCF, RP ve TE antibiyotiklerine duyarlılığı araştırılmış ve izole edilen bakterilerin bu antibiyotiklere karşı olan dirençlilik oranları sırası ile, % 45.5, 0.0, 36.4, 36.4, 36.4, 45.5, 45.5, 54.5, 36.4, 36.4, 45.5, 18.2, 9.1, 9.1 olarak belirlenmiştir. Nitrosefin yöntemine göre izolatların p-laktamaz üretme yetenekleri araştırılmış ve bu izolatlardan sadece El susunun P-laktamaz üretme yeteneğinde olduğu görülmüştür. K2+E.coli konjugasyon çalışmasında; K2 izolatından.S.co/f ye FOX antibiyotiği için %5, DA ve S antibiyotiği için %100, El+E.coli çalışmasında ise DA, S ve SXT için %100 transfer gerçekleşmiştir. Anahtar Kelimeler: Bruselloz, Dirençlilik, Konjugasyon ABSTRACT MSc THESIS LABORATORY DIAGNOSIS OF BRUCELLOSIS EREN ERGICAN DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL APPLIED SCIENCES UNIVERSTY OF ÇUKUROVA Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Sadık DİNÇER Year: 2003 Page: 58 Jury : Assoc. Prof. Dr. Sadık DİNÇER Assoc. Prof. Dr. M. Macit İLKİT Assist. Prof. Dr. Hatice GÜVENMEZ In this study, the blood cultures were carried out from the Brucellosis patients who applied to the Başkent University Adana Applied and Research Centre. Antibiotic resistances of the isolated cultures were determined and the resistance mechanism via of conjugation was determined. Blood samples from the 4758 patients suspected with Brucellosis infection were examined with serological tests and according to the blood culture results, 8 (73 %) female and 3 (27 %) male patients blood cultures were positive for Brucella sp. Isolated bacteria were identified as Brucella melitensis according to the biochemical tests. The isolated strains were examined for their sensitivity to AK, C, CRO, S, CN, SXT, FEP, DA, OFX, CIP, FOX, SCF, RP and TE antibiotics. Resistance percentages of the isolated strains to these antibiotics were determined as total male and female patients. Resistance percentage of the antibiotics above was determined as 45.5 %, 0.0, 36.4, 36.4, 36.4, 45.5, 45.5, 54.5, 36.4, 36.4, 45.5, 18.2, 9.1, 9.1, respectively. According to the Nitrocephin method, ^-lactamase production ability of the isolates was investigated^ and only El strain was observed to produce 0-lactamase. According to the K2+E.coli Conjugation test results, plasmid conjugation ratio was accomplished as 5% against FOX while DA and S were 100%. When compared to the results of El+E.coli strains, 100 % transfer rate was obtained with DA, S and SXT. Key words: Brucellosis, Antibiotic Resistances, Conjugation II 58

ÖZET Yüksek Lisans Tezi EKZOPOLÎSAKKARİT ÜRETEN LAKTOKOK SUŞLARINM İZOLASYONU, TANISI VE BU SUŞLARD A EKZOPOLÎSAKKARİT ÜRETİMİNİN GENETİK ANALİZİ Ela KOÇER Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK Bu çalışmada, Türkiye' nin değişik bölgelerindeki geleneksel süt işletmelerinden sağlanan çiğ süt ve peyniraltı suyu örneklerinden izole edilen 90 adet Lactococcus lactis suşunda (48 adet L. lactis subsp. lactis, 29 adet L. lactis subsp. cremoris ve 13 adet L. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis) ekzopolisakkarit üretim yeteneği ve bu özelliğin genetik determinantları araştırıldı. Doksan adet L. lactis suşu içerisinde 4 adet L. lactis subsp. lactis ve 2 adet L. lactis subsp. cremoris suşu ekzopolisakkarit üretme yeteneğinde bulundu. Mutasyonel analiz ve konjugal aktarım çalışmaları sonucu; L. lactis subsp. tactis ELL4 suşunda 5.6 kb, ELL6 suşunda 30.0 kb, ELL23 suşunda 27.2 kb ve ELL39 suşunda 7.4 kb, L. tactis subsp. cremoris ELC5 suşunda 32.7 kb ve ELC19 suşunda 31.1 kb büyüklükteki plazmidlerin ekzopolisakkarit üretiminden sorumlu oldukları saptandı. L. lactis subsp. tactis ELL 23 ile L. tactis subsp. cremoris ELC5 ve ELC19 suçlarında ekzopolisakkarit üretimi yeteneğini determine eden plazmidlerin konjugal aktarım sıklığı verici hücre basma 1.5x10 - 4.5x1ü`4 arasında belirlendi. Konjugantların tümünde, ekzopolisakkarit üretimini determine eden plazmidlerin stabilite oranlan doğal suşlardan daha yüksek bulundu. Ekzopolisakkarit üretme yeteneğindeki 6 L lactis susu, denemede kullanılan 25 laktik fajın tümüne karşı dirençlilik özelliği gösterdi Ekzopolisakkarit üreten suşlarda faj dirençliliğin, faj adsorbsiyonunun engellenmesi suretiyle meydana geldiği saptandı. 2002, 77 sayfa ANAHTAR KELİMELER: L. lactis, ekzopolisakkarit, plazmid, konjugasyon, stabilite. ABSTRACT Master Thesis ISOLATION AND IDENTinCATION OP EXOPOLYSACCHARIDE PRODUCER STRAINS OF LACTOCOCCI AND GENETIC ANALYSIS OF EXOPOLYSACCHARIDE PRODUCTION IN THESE STRAINS ElaKOÇER Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof Dr. Mustafe AKÇELİK In this study, exopolysaccharide production abilities and genetic determinants of this character in producer strains among 90 Lactococcus lactis strains (48 L. lactis subsp. lactis, 29 L lactis subsp. cremoris and 13 L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis), isolated from raw milk and whey samples of traditional dairy plants from different regions of Turkey, were investigated. Four strains of L. lactis subsp. lactis and 2 strains of L. lactis subsp. cremoris showed exopolysaccharide production ability among 90 strains of L. lactis. Exopolysaccharide production ability of these strains were found to be determined by 5.6 kb, 30.0 kb, 27.2 kb and 7.4 kb plasmids for ELL4, ELL6, ELL23 and ELL39 strains of L. lactis subsp. lactis and 32.7 kb and 31.1 kb for ELC5 and ELC19 strains of L. lactis subsp. cremoris, respectively. Plasmids, encoding exopolysaccharide production in L. lactis subsp. lactis ELL23, L. lactis subsp. cremoris ELC5 and ELCİ 9 could be transferred by conjugation with the frequency rate of 1.5xl0`3 - 4.5x1 0`4 per donor cell. The stability of plasmids encoding exopolysaccharide production in all conjugants were higher than their wild type strains. Six exopolysaccharide producer strains, determined in this study, showed complete resistance against all of 25 lactic phages. The mechanism of phage resistance was determined as inhibition of phage adsorption in all exopolysaccharide producer strains. 2002, 77 pages KEY WORDS: L. lactis, exopolysaccharide, plasmid, conjugation, stability. 77

Bu çalışmada, Türkiye' nin farklı bölgelerinden sağlanan çiğ süt ve peyniraltı sularından izole edilen Lactococcus lactis subsp. lactis suşlarında laktoz metabolizmasını kodlayan plazmidlerin konjugal aktarımı ve stabiliteleri araştırıldı. Peyniraltı suyu örnekleri, endüstriyel starter kültür kullanılmaksızın değişik tip peynirler üreten klasik işletmelerden toplandı. 50 Lactococcus lactis subsp. lactis suşunda, moleküler büyüklükleri 26.3 - 38.5 kb arasında değişen altı farklı laktoz plazmidi tanımlandı. Tüm laktoz plazmidleri konjugal aktarım yeteneğinde bulundu. Bu plazmidlerin konjugal transfer sıklıkları; iki seks faktörünün interaksiyonuna bağlı olarak, CluVAgg`, Agg+ x CluVAgg*, Agg` ya da CluVAgg` x CluVAgg` konjugasyon eşleri için 1.5 x 10'5 -1.0 x 10`7 ve CluVAgg` x CluVAgg* konjugasyon eşleri için 7.1 x 10~2 - 2.7 x 10`3 oranlarında değişim gösterdi. Laktoz plazmidlerinin stabiliteleri ise; doğal suşlarda % 82-95, MG1390 susu için tanımlanan konjugantlarda % 77-98 ve MCL8060 suşu için tanımlanan konjugantlarda % 44-67 arasında saptandı. ANAHTAR KELİMELER: Lactococcus lactis subsp. lactis, laktoz fermentasyonu, plazmid, konjugasyon. In this study, the stabilities and conjugal transfers of the plasmids which encode lactose metabolism in Lactococcus lactis subsp. lactis strains isolated from raw milk and whey samples in different regions of Turkey were inspected. Whey samples were collected from traditional dairy plants which produce different type of cheeses without using industrial starter cultures. Six different lactose plasmids having the size range of 26.3 - 38.5 kb were identified from SO L. lactis subsp. lactis strains. All of the lactose plasmids were found to have the ability of conjugal transfer. Depending on the interactions between the two sex factors the conjugal transfer frequencies of these plasmids have ranged in the rates of 1.5 x 10~s -1.0 x 10`7 for CluVAgg`, Agg+ x Clu7Agg+, Agg` or Clu+/Agg` x CluVAgg` conjugation pairs and 7.1 x 10`2 - 2.7 x 10`3 for CluVAgg` x Clu7Agg+ conjugation pairs. And the stability of the lactose plasmids were % 82-95 in wild type strains, % 77-98 in the conjugants of strain MG1390, % 44-67 in the conjugants of strain MCL8060. KEY WORDS: Lactococcus lactis subsp. lactis, lactose fermentation, plasmid, conjugation. 69

IV ÖZET Bu araştırmada bir antibiyotiği dekstrana bağlama teknikleri üzerinde çalışılmıştır. Antibiyotik - alarak Kloramfenikol seçilmiş ve makromolekül olarak da 70.000 dalton molekül ağırlığındaki dekstranın epiklorohidrinle oluşturulan klorohidroksipropil dekstran polimer türevi kullanılmıştır. Kloramfenikol-klorohidroksipropil dekstran konjugasyonu iki farklı yöntem kullanılarak denenmiştir. Bunlar Pharmacia ve Molteni yöntemleridir. Konjugasyon işleminin gerçekleşip geçekleşmediği, spektrofotometrik tayin ve alkali hidrolizasyon teknikleri ile araştırılmıştır. Konjugasyon sonrasında antibiyotiğin etkinliği ise, Pseudomonas aeruginosa 'nın kullanıldığı antibiyogram tekniği ile denenmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda bağlanmanın, Pharmacia yöntemine göre hazırlanan konjugasyon örneğinde, Molteni tarafından geliştirilen konjugasyon yöntemindekine oranla daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Elde edilen Kloramfenikol-klorohidroksipropil dekstran konjugata. ile yapılan çalışmalar sonunda, bu tip konjugasyon ürünlerinin ilaç taşımacılığı alanı için iyi bir aday olabileceği teklif edilmiştir. SUMMARY In this research, an antibiotic is conjugated to a macromolecule by using two different techniques. A chlorohydroxypropyl dextran polymer derivative which is produced with 70.000 dalton molecular weight dextran and epichlorohydrin is used as the macromolecule and Chloramphenicol as the antibiotic. Chloramphenicol-chlorohydroxypropyl dextran conjugation is achieved by using two different methods called Pharmacia and Molteni methods. Establishment of the conjugation is tested with spectrophotometry measurements and alkalene hydrolization. After the conjugation, effectiveness of the linked antibiotic is tested by antibiogram technique using Pseudomonas aeruginosa. Results indicate that Pharmacia method is more efficient than Molteni method in terms of the amount of the drug conjugated. In conclusion it is suggested that Chloramphenicol- dextran conjugate is a suitable candidate for a drug delivery agent. 26