İnfluenza A virüsüne ait sentetik peptidlerin polielektrolitlerle konjugasyon reaksiyonunun floresans rezonans enerji transferi ve diğer yöntemlerle incelenmesi

Influenza A Virüsü farklı zaman ve yerlerde epidemilere ve dünya çapında pandemilere neden olmuştur ve gelecekte de olması yüksek ihtimal olan bir hastalıktır. En son 2009 yılında halk arasında Domuz Gribi adı ile bilinen Influenza A Virüsü?nün neden olduğu pandemi nedeniyle Dünya Sağlık Örgütü alarm seviyesini 5?den en üst düzey olan 6 dereceye çıkartmıştır.Bu tez çalışmasında Influenza A Virüsüne ait dört farklı peptid dizisi kullanılmıştır. Bunlardan iki peptid dizisi tarafımızdan sentezlenmiş diğer iki dizi ise ticari olarak satın alınmıştır. Bu peptid dizilerinin karakterizasyonları yapılmıştır. Peptid polielektrolit biyokonjugatlarının ve komplekslerinin oluşturulması için dört farklı taşıyıcıkullanılmıştır; poliakrilik asid, poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasid), dekstran aldehit ve bovin serum albumin. Taşıyıcılardan poliakrilik asit ve bovin serum albumin ticari olarak alınmıştır. Poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasid) ve dekstran aldehit tarafımızca sentezlenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Influenza A Virüsüne ait farklı peptid epitopları kullanılarak değişik yöntemlerle adıgeçen taşıyıcılar ile biyokonjugatları ve kompleksleri sentezlenmiştir. Bu biyokonjugat ve komplekslerin fizikokimyasal yapıları incelenmiş, peptid antijenlerinin immünojenliğinin yükseltilmesi amacıyla peptid biyokonjugatlarının gerekli üç boyutlu yapıları oluşturulmuş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Biyokonjugatların ve komplekslerin oluşumu farklı spektroskopik ve kromatografik yöntemlerle xxviaydınlatılmıştır. Elde edilen sonuçlar kıyaslandığında karbodiimid varlığında kovalent bağlar ile oluşan biyokonjugatların daha verimli bağlandığı görülmüştür. Sentetik aşı modeli olarak tasarladığımız Influenza A Virüsü M2 peptidi-polielektrolit biyokonjugatları için; in vivo uygulamalarda kullanılan düşük konsantrasyonlarda MCF-7 hücreleri üzerinde kayda değer bir toksik etki göstermediği; hem MTT deneyleri ile, hem de Flow Cytometry yöntemi ile hücre canlılığı kontrol edilerek birbirini destekleyen sonuçlar elde edilmiştir ve biyokonjugatların deney hayvanları üzerinde kullanabilirliği ortaya konulmuştur.Konjugasyon reaksiyonunun oluşumu floresans boya kullanılarak Floresans Rezonans Enerji Transferi yöntemi yardımı ile araştırılmıştır. İntermoleküler mesafe hesabı yapılıp, saf peptid ve biyokonjugat oluşumunda konformasyondaki değişimler hesaplanmış ve sayısal değerlerle de ifade edilmiştir. Literatürde ilk kez Influenza A Virüsü Hemagglutinin H3N2 91-106 peptid dizisi modellenmiş, moleküler mekanik yöntem ile minimum enerjiye sahip olduğu optimize geometrisi belirlenmiştir. FRET yöntemi ile deneysel verilere dayalı elde edilen sayısal değerlerin, teorik olarak hesaplanan değerler ile örtüştüğü ispatlanmıştır.Bu tez kapsamında Floresans Enerji Transferi Yöntemi ile biyokonjugattaki donör ve akseptör arasındaki intermoleküler mesafe hesabı ile elde edilen bilgiler, Influenza A Virüsü?nün neden olduğu epidemilere ve pandemilere neden olan salgın hastalığa karşı spesifik antikorların elde edilmesi, nanobiyosensörlerin oluşturulması, tanı kitlerinin ve en önemlisi günümüzde popüler çalışmalar arasında yer alan merhum Hocamız değerli bilim insanı Prof. Dr. Mehmet Mustafaev Akdeste?nin hedefi olan aynı polimer matriksine birden fazla hastalığın antijeninin bağlanarak multifonksiyonel biyoteknolojik aşıların geliştirilmesine ışık tutacak bir çalışmadır.Anahtar Kelimeler: Influenza A Virüsü, Floresans Rezonans Enerji Transferi, kovalentkonjugasyon, optimize geometri, üç boyutlu konformasyon. Influenza A virus had caused epidemics and pandemics all over the world at different times and probably will cause in the future, too. Lastly in 2009, WHO raised the level of pandemic alert from phase 5 to 6 because of colloquially known as Swine Flu caused by Influenza A Virus. In this PhD. thesis, four different peptide sequences of the influenza A virus was used. Two of them were synthesized in our laboratory and the other two sequences were purchased commercially. These peptide sequences were characterized. Four different carriers (polyacrylic acid, poly(N-vinyl-2-pyrrolidone-co-acrylic acid), dextran aldehyde, and bovine serum albumin) were used for the synthesis of the peptide polyelectrolyte bioconjugates and formation of the complexes. Polyacrylic acid and bovine serum albumin were purchased commercially. Poly(N-vinyl-2-pyrrolidone-co-acrylic acid) and dextran aldehyde were synthesized and characterized in our laboratory. Bioconjugates and complexes of different peptide epitopes of Influenza A Virus were synthesized through the mentioned carriers with various methods. Physicochemical structures of these bioconjugates and complexes were investigated, in order to increase immunogenity of the peptide antigens, the necessary three-dimensional structures of peptide bioconjugates were formed and characterized. The formation of bioconjugates and complexes were clarified by various spectroscopic and chromatographic methods. When results were compared, bioconjugates formed with xxviiicovalent bonds which were obtained in the presence of carbodiimide was found to be more efficient.For the Influenza A virus M2 peptide polyelectrolyte bioconjugates designed as a synthetic vaccine model; it didn?t show significant toxic effect on the MCF-7 cells using low concentrations in vivo applications; by controlling cell viability with Flow Cytometry method and MTT experiments, results that supporting each other have been obtained and the usability of bioconjugates upon the experimental animals have been presented.The formation of conjugation reaction was investigated by Fluorescence Resonance Energy Transfer method with using Fluorescence dye. By calculating intermolecular distance, conformation changes in the pure peptide and the formation of bioconjugate were calculated and expressed with numerical values. In the literature, the peptide sequence of Influenza A virus Hemagglutinin H3N2 91-106 was modeled for the first time, the optimized geometry with minimum energy were determined by molecular mechanics method. The numerical values obtained that are based on experimental data proved to overlap the theoretically calculated values by FRET method. In this PhD. thesis, with the information obtained from intermolecular distance calculations between donor and acceptor in bioconjugate by Fluorescence Energy Transfer Method clearly showed to obtaining of specific antibodies against the disease because of the epidemics and pandemics caused by Influenza A viruses, the creation of nanobiosensors and diagnostic kits and the most important; target of our teacher, precious scientist, decedent Prof. Dr. Mehmet Mustafaev Akdeste, the development of multifunctional biotechnology vaccines with binding of more than one disease's antigen on the same polymer matrix.Keywords: Influenza A virus, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Covalent Conjugation, Optimized geometry, 3-dimensional conformation 237