Search

Nöroblastom, çocuk döneminde görülen ekstrakraniyal solid bir tümördür. Çocuklarda görülen tümörler arasında yaygın oranda görülmesi ve agresif prognozu nedeni ile oldukça önemlidir. Hücre yüzeyinde meydana gelen glikosilasyon değişiklikleri pek çok hastalığın ortaya çıkmasında ve ilerlemesinde önemlidir. Tümör hücreleride gözlemlenen bu değişiklikler glikozilasyonda rol oynayan glikosiltransferazların ve glikosidazların ekspresyon seviyelerinde veya aktivitesinde meydana gelen değişikliklere bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Spesifik glikosilasyon inhibitörleri, biyolojik süreçlerde glikosilasyonun rolünü aydınlatmak amacı ile yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Çalışmamızda, N-bağlı glikozilasyon inhibitörü olduğu bilinen Tunikamisin’in SH-SY5Y hücre hattı üzerinde 24 ve 48 saatlik süre ile uygulanmıştır. 24 saatlik MTT sonuçlarında tunikamisinin dozu 7.746 µM, 48 saatte ise 91.477 µM bulunmuştur. Tunikamisin uygulanmış deney gruplarında α-2,8-sialiltransferaz 8B, β1,6-Nasetilglukozaminiltransferaz V, N-Asetilgalaktozaminiltransferaz 3, β1,3-Nasetilglukosaminiltransferaz-3 ile K-RAS proto-onkogen, H-RAS proto-onkogen, Raf-1 protoonkogen Serin/Treonin Kinaz, Mitojen aktifleştiren kinaz ve hücre dışı sinyalin aktiflediği kinazların, gen ekspresyon düzeyleri qRT-PCR yöntemi ile araştırılmıştır. Tunikamisin’in, SHSY5Y hücre hattı üzerinde 24 ve 48 saatlik uygulama sürelerinde glikolizasyon enzim düzeyleri üzerine farklı etkilere sahip olduğunu görülmüştür. 24 saatlik Tunikamisin grubunda β1,6-Nasetilglukozaminiltransferaz V ve N-Asetilgalaktozaminiltransferaz 3 ekspresyon düzeylerinin kontrol grubu ile karşılaştırıldığında azaldığı görülmüştür. Alfa-2,8-sialiltransferaz 8B ve β1,3N-asetilglukosaminiltransferaz-3 ekspresyonları her iki deney grubunda da kontrole göre yüksek bulunmuştur. Bu anlamda SH-SY5Y, hücre hattında Tunikamisin’in glikozilasyon mekanizması üzerinde etkili olabileceği belirlenmiştir. Neuroblastoma, a solid extracranial tumor that commonly affects children, Its high prevalence among pediatric tumors and aggressive prognosis make it extremely significant. The emergence and development of many diseases are largely dependent on changes in glycosylation that take place on the cell surface. These modifications are due to changes in the expression levels or activities of the glycosyltransferases and glycosidases, which are involved in glycosylation, in tumor cells. The use of specific glycosylation inhibitors to define the role of glycosylation in biological processes is too common. In our study, Tunicamycin, known to be an N-linked glycosylation inhibitor, was applied on the SH-SY5Y cell line for 24 and 48 hours. In the 24-hour results, the dose of tunicamycin was 7,746 µM, and 91,477 µM in 48 hours. The levels of expression in the Tunicamycin group of 2,8-sialyltransferase 8B, 1,6-Nacetylglucosaminyltransferase V, N-Acetylgalactosaminyltransferase 3 and 1,3-Nacetylglucosaminyltransferase-3, as well as the proto-oncogenes K-RAS, H-RAS, Raf-1, Mitogen-Activated Kinase and Extracellular Signal-Activated Kinases, were investigated by qRT-PCR. At 24 and 48 hours after administration, Tunicamycin was found to have different effects on the glycosylation enzyme levels in the SH-SY5Y cell line. When compared to the control group, the expression levels of 1,6-N-acetylglucosaminyltransferase V and N- acetyl galactosaminyltransferase 3 were lower in the 24hour Tunicamycin group. The expression levelsof 1,3-N-acetylglucosaminyltransferase-3 and α-2,8 sialyltransferase 8B was higher in both experimental groups compared to the control. In this sense, it has been determined that in the SH-SY5Y cell line, Tunicamycin treatment may be effective in the glycosylation mechanism.

Çocukluk çağı kanseri nöroblastoma, sempatik sinir sistemi hücrelerinde ortaya çıkan solid bir tümördür ve çocuklarda görülen kanser türlerinin yaklaşık %6-7’sini oluşturmaktadır. Nöroblastoma gelişiminde hücre içi ve hücre dışı birçok protein ve sinyal yolağı rol oynamaktadır. Nöroblastoma tedavisinde kullanılan konvansiyonel kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi müdahalelere ek olarak son yıllarda immünoterapi ve protein hedefli tedavi yöntemleri de uygulanmaktadır. Bu yöntemlere ilave olarak özellikle tedavi sonrasında ortaya çıkabilecek yan etkileri azaltmak için bitkisel kaynaklı uygulamalar da önemli bir çalışma alanı olmuştur. Kurkumin zerdeçaldan elde edilen ve anti-inflamatuar, antibiyotik, anti-diyabetik ve anti-kanser özellikleri tanımlanmış bitkisel bir bileşiktir. Yapılan çalışmalar kurkuminin transkripsiyon faktörleri, büyüme faktörleri, inflamatuar mediyatörleri ve sitokinleri, hücre döngüsü proteinleri, enzimleri, protein kinazları ve apoptotik proteinleri dahil birçok biyolojik hedefleri ve hücresel yolakları etkileyebilme potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir. Fakat düşük çözünürlük ve emilim gibi dezavantajlara sahip olmak ile birlikte, bu eksikliklerin giderilmesi için çeşitli formülasyonlar geliştirilmektedir. Yakın zamanda geliştirilen bu bileşiklerden olan yeni nesil ultrasol kurkuminin (next generation ultrasol curcumin, NGUC), rat plazmasında kurkumine göre yaklaşık olarak 65 kat daha fazla bulunduğu raporlanmış ve bundan dolayı daha etkili olabileceği düşünülmüştür. Bu çalışmada sahip olduğu avantajlarından dolayı NGUC’un N1E-115 nöroblastoma hücreleri üzerine etkileri kurkumin ile karşılaştırmalı olarak in vitro araştırılmıştır. N1E-115 hücrelerine farklı konsantrasyonlarda kurkumin ve NGUC uygulanmış ve hücrelerin proliferasyonu MTT testi ile belirlenmiştir. 48 saatlik madde uygulamasından sonra elde edilen sonuçlar kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 200, 100 ve 50 µM kurkumin uygulamalarının N1E-115 hücrelerinin canlılığını yaklaşık olarak %50 oranında azalttığı gözlemlenmiştir. 25 µM konsantrasyondaki kurkumin uygulamasının N1E-115 hücrelerinin canlılığını %40 oranında azalttığı bulunmuştur. Benzer şekilde, 200 µM NGUC uygulaması hücre canlılığını yaklaşık olarak %45 oranında azaltırken, 100 µM NGUC uygulaması hücre canlılığını %33’lük bir oranda azaltmıştır. Flow sitometrik analizler, düşük konsantrasyonlardaki kurkuminin N1E-115 hücrelerinde apoptozu tetiklediğini gösterirken, daha yüksek konsantrasyonlardaki NGUC apoptozu tetiklemiştir. Kurkumin uygulanan gruptaki saf kurkumin oranı %95 ve NGUC içerisinde %20 oranında kurkumin bulunduğundan, saf kurkuminoid oranı (95/20) açısından 4,75 kat fark bulunmaktadır. Dolayısıyla elde edilen sonuçlar bu bağlamda değerlendirildiğinde NGUC’un kurkumine oranla daha iyi bir etkiye sahip olduğu düşünülmektedir. Yapılan mekanistik analizler kurkumin ve NGUC’un N1E-115 hücrelerinde hücre döngüsünde, NFkB ve apoptoz sinyal yolaklarında rol oynayan proteinleri kodlayan bazı genlerin mRNA ekspresyonları üzerine istatistiksel olarak anlamlı etkilerinin olmadığını ortaya koymuştur. Sonuç olarak bu tez çalışmasında, kurkumin ve NGUC’un N1E-115 nöroblastoma hücrelerinin üzerine etkisi karşılaştırmalı olarak incelenmiş, her iki maddenin de hücreler üzerinde farklı konsantrasyonlarda sitotoksik bir etkiye sahip olduğu literatürde ilk kez gösterilmiştir. Her ne kadar yapılan mekanistik analizler tam olarak bir sinyal yolağı üzerine etkisini net olarak ortaya koyamasa da sonuçlar her iki maddenin hücrelerde apoptozu tetikleyerek hücre ölümüne neden olduğunu göstermiştir. Gelecekte yapılacak hem in vitro hem de in vivo çalışmalar, kurkumin ve NGUC’un nöroblastoma hastalarında konvansiyonel tedavi yöntemlerine ilave olarak yan etkileri azaltabilecek doğal bir bileşik olarak kullanılabilirliğini ortaya koyacaktır. Neuroblastoma is a type of solid tumors in childhood arising from the cells of the sympathetic nervous system and constitutes approximately 6-7% of the cancer types observed in children. Many intracellular and extracellular proteins and signaling pathways play a critical role in the development of neuroblastoma. In addition to conventional chemotherapy, radiotherapy and surgery used for the treatment of neuroblastoma, immunotherapy and protein-targeted treatment approach have been applied in recent years. Besides these methods, natural substances have also been subject to many studies specially to reduce the side effects that may occur after conventional treatments. Curcumin is a natural compound derived from turmeric and has antiinflammatory, antibiotic, anti-diabetic and anti-cancer properties. Studies have shown that curcumin has the potential to affect many biological targets and cellular pathways, including transcription factors, growth factors, inflammatory mediators and cytokines, cell cycle proteins, enzymes, protein kinases and apoptotic proteins. However, curcumin has some disadvantages such as low solubility, bioavailability and absorption, thus different formulations are being developed to overcome these problems. A study has recently reported that the new generation ultrasol curcumin (NGUC), which is one of these recently developed compounds, is found to be approximately 65 times more bioavailable in rat plasma than curcumin, suggesting that NGUC may be more effective than curcumin. In this study, therefore, the effects of NGUC and curcumin on N1E-115 neuroblastoma cells were comparatively investigated in vitro. N1E-115 cells were treated with different concentrations of curcumin and NGUC and the proliferation of cells was determined by MTT assay. Our findings revealed that after 48h incubation period the treatment of N1E-115 cells with 200, 100 and 50 µM curcumin reduced cell viability by approximately %50 compared to control cells. Moreover, curcumin administration at a concentration of 25 µM caused 40% reduction in the viability of N1E-115 cells. Similarly, while 200 µM NGUC administration caused approximately %45 reduction in the cell viability, 100 µM NGUC treatment caused %33 reduction. Flow cytometric analysis of cells treated with curcumin and NGUC showed that while low concentrations of curcumin induced apoptosis in N1E-115 cells, higher concentrations of NGUC were required to induce apoptosis. Given that the rate of pure curcumin is 95% in the curcuminadministered group and 20% in NGUC, there is a 4.75-fold difference in pure curcumin ratio (95/20) between NGUC and curcumin. When the results of this study are evaluated in this context, NGUC can be suggested to have a better effect than curcumin. The further analysis by qPCR revealed that curcumin and NGUC did not have statistically significant effects on mRNA expression of genes encoding proteins involved in cell cycle, NFkB pathway and apoptosis in N1E-115 cells. In conclusion, in this thesis, the effects of curcumin and NGUC on N1E-115 neuroblastoma cells were examined comparatively, and our results demonstrate for the first time that both substances have a cytotoxic effect on cells at different concentrations. Although the mechanistic analysis could not clearly reveal any effects on a specific signaling pathway, the results showed that both substances triggered apoptosis, leading to cell death. Further research is needed to reveal the use of curcumin and NGUC as a natural compound that can reduce side effects of conventional treatment methods in neuroblastoma patients.

Amaç: Nöroblastom, çocuklarda kansere bağlı ölümlerin yaklaşık % 15'ini oluşturan, beyin dokusu içerisinde hızlı bir şekilde yayılabilen tümörlerinden biridir. Türkiye'de `Gımmi, havyıldız` adıyla bilinen Astrodaucus Drude (Apiaceae) cinsi, Türkiye ve İran'da gıda maddesi olarak tüketilmektedir. Bu bitkiden izole edilen Umbelliferon (UMB) bir kumarin türevi bileşiktir ve anti-oksidan, anti-kanser, anti-inflamatuvar ve nöroprotektif etkileri bulunmaktadır. Bu çalışmada, A. orientalis (L.) Drude'nin meyvelerinden metanol ekstresinin elde edilmesi, bu ekstreden UMB izole edilmesi ve ekstre ile birlikte UMB'un SH-SY5Y insan Nöroblastom hücrelerinde sitotoksite ve oksidatif stres üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.Materyal ve Metot: Astrodaucus orientalis meyvelerinin metanol ekstresi hareketli maserasyon ile elde edildi ve metanol ekstresinden kolon kromatografisi ile UMB bileşiği izole edildi. İzole edilen UMB'un yapısı, spektroskopik yöntemler (1D, 2D-NMR ve HRESIMS) ile belirlendi. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) F12'inde büyütülmüş SH-SY5Y hücrelerine elde edilen ekstrenin (10-1-10-6 mg/mL) ve UMB'un (10 µM-1 mM) farklı doz aralıkları eklenerek 24 ve 72 saat süreyle inkübasyona bırakıldı ve daha sonra hem ekstrenin hem de UMB'un SH-SY5Y insan nöroblastom a hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkisi zamana ve doza bağlı olarak MTT yöntemi ile ölçüldü. Reaktif oksijen türlerinin üretimini değerlendirmek için ise total oksidan düzeyi (TOS) ve total antioksidan düzeyi (TAS) analizleri gerçekleştirildi. Bulgular: MTT analiz sonuçlarına göre, Astrodaucus orientalis meyve metanol ekstresinin ve bu ekstreden izole edilen UMB'un IC50 konsantrasyonları, sırasıyla 72. saatte 10-2 mg/mL ve 250 µM olarak belirlendi. TAS ve TOS analiz sonuçlarına göre ise antioksidan seviyeyi, yüksek konsantrasyonlarda hem bitki ekstresinin hem de UMB'un azalttığı gözlendi.Sonuç: Bu çalışmada SH-SY5Y insan Nöroblastom hücrelerinde Astrodaucus orientalis meyve metanol ekstresinin ve bu ekstreden izole edilen UMB'un sitotoksik ve oksidan etkileri olduğu tespit edildi. Elde ettiğimiz bu veriler ışığında UMB'un tek başına veya diğer ilaçlar ile kombinasyonu halinde nöroblostom tedavisinde kemoterapötik ilaçlara alternatif olarak kullanılabileceği sonucuna varıldı.Anahtar Kelimeler: Astrodaucus orientalis, hücre kültürü, nöroblastom, umbelliferonaha sonra doldurulacaktır Aim: Neuroblastoma is one of the tumors that can spread rapidly in brain tissue, and causes 15% of cancer-related deaths in children. Astrodaucus the Drude genus (Apiaceae), is known as `Gimmi, havyıldız` in Turkey, is consumed as food in Turkey and Iran. Umbelliferone (UMB) ısolated from this plant a coumarin derivative compound and has anti-oxidant, anti-cancer, anti-inflammatory and neuroprotective effects. In this study, it was aimed to obtain methanol extract from A. orientalis (L.) Drude fruit, to isolate UMB from this extract and to investigate the effects of UMB on cytotoxicity and oxidative stress in SH-SY5Y human neuroblastoma cells.Material and Method: The methanol extract of Astrodaucus orientalis (L.) Drude fruits was obtained by mobile maceration and the UMB compound was isolated from the methanol extract by column chromatography. The structure of the isolated UMB was determined by spectroscopic methods (1D, 2D-NMR and HRESIMS). Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) was added to SH-SY5Y cells grown in F12 (10-1-10-6 mg / mL) and UMB (10 µM-1 mM) by adding different dose intervals for 24 and 72 hours. The cytotoxic effect of both extract and UMB on the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line was measured by MTT method depending on time and the dose. Total oxidant level (TOS) and total antioxidant level (TAS) analyzes were performed to evaluate the production of reactive oxygen species.Results: According to MTT analysis results, IC50 concentrations of fruit methanol extract of A. orientalis and UMB isolated from this extract were determined respectively as 10-2 mg / mL and 250 µM at 72 hours. According to the results of TAS and TOS analysis, it was observed that antioxidant level decreased by both plant extract and UMB at high concentrations.Conclusion: In this study, it has been determined that fruit methanol extract of Astrodaucus orientalis and UMB isolated from this extract showed the cytotoxic and antioxidant effects on SH-SY5Y human neuroblastoma cells. In the light of these data, it was concluded that UMB can be used alone or in combination with other drugs as an alternative to chemotherapeutic drugs in the treatment of neuroblostoma.Key Words: Astrodaucus orientalis, cell culture, neuroblastoma, umbelliferone aha sonra doldurulacaktır 79

Hastalarımızın ortanca yaşı 2,5 yıl (0,01-13) ve erkek kız/oranı 1,3 bulundu. Hastaların 158'i nöroblastom, 23'ü ganglionöroblastom, 5'i ganglionörom tanısı ile izlendi. En sık yerNüks sonrası genel sağ kalımda etkili kriterlerin belirlenmesi hastaların gruplanmasında önemlidir. Randomize kontrollü çalışmalarda hasta gruplarının planlanması, yüksek riskli hastaların belirlenerek uygun tedavi verilmesi, cerrahisiz ya da kemoterapisiz izlenecek hastaların seçilmesi başlıca kullanım alanlarıdır. Bu klinik ve biyolojik faktörlerin kullanımının yaygınlaşması daha başarılı sağ kalım sonuçları sağlayacaktır.leşim yeri adrenal bölgeydi (%66). Evre 1, 2, 3, 4 ve 4S hastalarımızın oranları sırasıyla %9.7, %18.8, %16.1, %43 ve %12.4'tü. 5 yıllık genel yaşam hızları %100, %81, %45, %14, %60 saptandı. Sağ kalım analizlerinde düşük evre (p

Kemoterapi Sonrası Febril Nötropeni Gelişen Akut Lenfoblastik Lösemi, Nöroblastom Ve Lenfoma Tanılı Çocuk Hastalarda Solunum Yolu Enfeksiyonu Yapan Virüslerin İncelenmesiAmaç: Febril nötropeni, kanser tedavisi için kemoterapi alan hastalarda sık görülen bir komplikasyon olup mortalitenin önemli nedenlerindendir. Bu çalışmada kemoterapi sonrası febril nötropeni tanısı alan akut lenfoblastik lösemi, nöroblastom ve lenfoma hastalarında solunum yolu virüsleri sıklığının tespit edilmesi ve bunların febril nötropeni ataklarındaki rolünün incelenmesi hedeflendi.Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada Şubat 2018 ile Şubat 2019 tarihleri arasında Çukurova Üniversitesi Balcalı Hastanesi Çocuk Onkoloji Bilim Dalı ve Adana Şehir Hastanesi Çocuk Onkoloji kliniklerinde yatırılarak takip ve tedavi edilen febril nötropenideki Akut lenfoblastik lösemi (ALL), nöroblastom ve lenfoma tanılı toplam 55 olgudan (her atak yeni bir olgu olarak değerlendirildi) nazofaringeal sürüntü örneği alındı. Alınan örneklerden solunum yolu virüsleri olan, respiratuar sinsitiyal virüs, influenza A ve B, parainfluenza, metapnömovirüs, bocavirüs, koronavirüs, rinovirüs, adenovirüs varlığı Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Viroloji Laboratuvarı'nda real-time PCR testleri kullanılarak araştırıldı. Hastaların klinik özellikleri, laboratuar, mikrobiyoloji sonuçları, tedavileri ve tespit edilen viral etken sonuçları kaydedildi.Bulgular: Çalışmaya alınan 55 olguda tanı olarak en sık akut lenfoblastik lösemi (%45,4), 2. sıklıkla nöroblastom (%40), 3. sıklıkla lenfoma (%14,6) saptandı. Hastaların ortalama yatış süresi 14,85±10,43 gün olup, ortalama nötropeni süresi ise 8,71±4,27 gün idi. Febril nötropeni ataklarının %69,1'inde mikrobiyolojik ajan tespit edildi. Hastaların 29'unda (%52,7) solunum yolu virüsü tespit edilmiş olup, 6'sında (%20,6) birden fazla virüs ile koenfeksiyon mevcuttu. En sık izole edilen virüs rinovirüs olup, ikinci sıklıkla adenovirüs görüldü. Yüksek riskli hasta grubunda nötropeni süresi anlamlı derecede daha uzun ve solunum yolu virus sıklığı daha fazla bulundu. Hastaların %86,2'sinde solunum semptomu izlendi, akciğer enfeksiyonu olan hastalarda solunum yolu virüs sıklığı istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulundu. Kombine tedavi alan hastalarda solunum yolu virüs sıklığı anlamlı yüksek bulundu. 5 hastada mortalite gelişmiş olup bu hastaların tamamı febril nötropeni atağına hastanede girmiştir ve hepsinde mikrobiyolojik olarak enfeksiyon odağı saptanmıştır.Sonuç: Çalışmamız solunum yolu virüslerinin kanserli çocuklarda febril nötropeni ataklarında önemli bir enfeksiyon ajanı olduğunu göstermiştir. Real-time PCR yöntemi kullanılarak solunum yolu virüslerinin erken tanısı ile FUO'lu hastalarda ampirik antibiyotik ve antifungal kullanımının azaltılabileceği kanısındayız.Anahtar Kelimeler: Kanser, febril nötropeni, solunum yolu virüsleri Investigation of Respiratory Viruses in Febrile Neutropenic Children with Acute Lymphoblastic Leukemia, Neuroblastoma and Lymphoma After ChemotherapyObjectives: Febrile neutropenia is a common complication in patients receiving chemotherapy for cancer treatment and is one of the major causes of mortality. The aim of this study is to determine the prevalence of respiratory tract viruses and their role in the development of neutropenic fever in children with acute lymphoblastic leukemia, neuroblastoma and lymphoma.Materials and Methods: In the scope of this study, nasopharyngeal swab samples were taken from 55 patients (each episode of a patient was evaluated as a new case), who were referred to Pediatric Oncology Clinics of Medical Faculty of Cukurova University and City Hospital of Adana from February 2018 to February 2019. Nasopharyngeal sample was obtained for the detection of respiratory viruses which are respiratory syncytial virus (RSV), influenza A and B, parainfluenzavirus (PIV), metapneumovirus (hMPV), bocavirus, coronavirus, rhinovirus, adenovirus, at Virology Laboratory within the body of Department of Medical Microbiology by using real-time PCR tests. Cases' symtoms, laboratory and microbiological findings, treatments and detected respiratory viruses were recorded.Results: Most of the patients had acute lymphoblastic leukemia (%45,4), and then neuroblastoma had the most frequency in patients (%40). Lymphoma was the least common (%14,6). The overall median length of hospital stay was 14,85±10,43 days and median duration of neutropenia was 8,71±4,27 days. Microbiologically documented infections were found in 69,1% episodes. Overall, respiratory viral infections were associated with 52,7% of febrile neutropenia of which 20,6% were viral coinfections. Rhinovirus was the most frequently detected virus then adenovirus was the most. High risk patients had longer median duration of neutropenia and respiratory virus frequency was higher in these patients. Respiratory symptoms were present at admission in 86,2% of the episodes. The frequency of respiratory viruses was found to be statistically significant in patients with lung infection. The frequency of respiratory virus was significantly higher in patients receiving combination therapy. 5 patients died and all of them presented febrile neutropenic episodes during hospitalization. These 5 patients had microbiologically documented infections.Conclusions: Respiratory viruses are shown to be important causative agents in children with cancer and an episode of febrile neutropenia. Therefore, we are of the opinion that the ability to detect respiratory viruses in a short time by using real-time PCR tests may be helpful in reduce the extensive use of antibacterial and antifungal treatment in patients with febrile neutropenia.Keyword: Cancer, febrile neutropenia, respiratory viruses. 108

Nöroblastom (NB) nöral krestten köken alan embriyonik bir tümördür.Klinik remisyon elde edilen ileri evre hastalıkta en büyük sorun minimal rezidüel hastalığın (MRH) varlığıdır. Peroksizom proliferatör-aktive edici reseptör nükleer transkripsiyon faktörü olup hücre çoğalması ve diferansiasyonu regüle etmektedir.Rosiglatazon (RZG) peroksizom proliferatör- aktive edici reseptör agonisti antidiyabetik bir ajandır.Bu çalışmada amacımız; Nöroblastom Minimal rezidüel hastalık hücre modeli oluşturmak ve rosiglatozonun (RZG) minimal rezidüel hastalık modelinde (MRH) nöronal kök hücre diferansiasyonu üzerinde etkili olup olmadığının belirlenmesiydi. Çalışmada N-Myc pozitif KELLY ve N-Myc negatif hücre hattı SH-SY5Y kullanılmıştır.Hücrelerin canlılıkları WST-1 ile analiz edilerek IC50 dozları belirlendi.NB hücrelerine tekrarlı sisplatin (CDDP) uygulamaları ile arta kalan hücrelere dayalı MRH modeli oluşturuldu.PHOX2B gen ekspresyonunun 2 kat ve daha fazla artış/azalışı hücrelerin MRH modelinin oluşmasının bir göstergesi olarak kullanıldı.PHOX2B gen ekspresyonu RT-PCR yöntemi ile belirlendi.MRH modeli oluşturulan NB hücrelerinde CDDP ve RZG hücre canlılığı,apoptoz,nöronal kök hücre farklılaşması ile ilişkili S-100,Oct-3,Nestin,Sox2 ve CD133 protein ekspresyonları aracılığı ile farklılaşma üzerine etkisi değerlendirildi. Bulguların,SPSS22 programında non-parametrik Mann-Whitney-U testi ile istatistik analizi yapılmıştır.p

Amaç: Bu araştırmada subkutan ksenograft nude fare nöroblastom tümör modelinde lipoplatin (LİPO) uygulamasının sisplatin (CDDP) uygulamasına göre sitotoksik, sitostatik, ototoksik ve nefrotoksik etkilerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır.Yöntem: Deneysel olarak planlanan bu çalışmada 20 gr olan, 5-6 haftalık 21 adet erkek nude fareye subkutan yolla C1300 nöroblastom hücreleri verilmiştir. Tümör oluşup 150 mm3 çapa eriştiğinde intraperitonel yolla kontrol grubuna 20mg/ kg serum fizyolojik, CDDP 20 mg/kg ve LİPO 20 mg/kg verilmiştir. Ajanlar verilmeden önce (bazal) ve sonra (72. saat) işitsel fonksiyon testleri yapılmıştır. 72 saat sonunda hayvanlar sakrifiye edilerek tümör ve koklea çıkarılmıştır. İdrar örneklerinde kreatinin değerlendirilmiştir. Parafine gömülen doku örneklerinde TUNEL ile apoptoz ve nekroz, immünohistokimya ile de COX2, SOD2 ve INOS anti-oksidan ve anti-inflamatuar ilişkili protein düzeyleri tespit edilmiştir. Elde edilen veriler gruplar arasında SPSS 22.0 versiyonu ile karşılaştırılmıştır. P değeri 0,05 'den küçük ise anlamlı kabul edilmiştir.Bulgular: Tümörde apoptoz ve nekroz oranları LİPO grubunda CDDP'ye göre daha fazladır (p=0,035 ve p=0,010). Spiral ganglionda apoptoz ve nekroz LİPO grubunda, CDDP'ye göre daha düşüktür (p=0,002 ve p=0,002). Kokleada LİPO ve kontrol grubunda pozitif COX2 paterni mevcut iken CDDP'de negatiftir (p=0,001). SOD2 ve INOS2 gruplar arası fark göstermemiştir (p>0,05). İşitsel fonksiyonlar bazal değerlerde benzer olup, LİPO grubunda CDDP'ye göre kısmen daha iyi işitme eşiklerine sahiptir. Sonuç: Nöroblastom tedavisinde, CDDP'nin doz sınırlayıcı yan etkilerini gidermek üzere LİPO kullanımı yararlı gözükmektedir. Ayrıca LİPO, aynı dozda CDDP 'den daha yüksek anti-tümor etkiye sahiptir. İlerleyen çalışmalarda LİPO'nun bu üstün özelliklerinin mekanizmasının tümör mikroçevresi dahilinde de değerlendirilmesi önerilmektedir.Anahtar Kelimeler: Nöroblastom, Lipoplatin, Sisplatin, Ototoksisite, Sitotoksisite Aim: The aim of this study was to compare the cytotoxic, cytostatic, ototoxic and nephrotoxic effects of lipoplatin (LIPO) administration according to cisplatin (CDDP) application in the subcutaneous xenograft nude mouse neuroblastoma tumor model.Method: In this experimentally planned study, C1300 neuroblastoma cells were given subcutaneously to 21 male nude mice, weighted 20 gram. When the tumor reached 150 mm3 diameter, 20 mg / kg of saline to the control group, 20 mg / kg of cisplatin and 20 mg / kg of LIPO were given intraperitoneally. The auditory function tests were performed before the agents were given (basal) and after 72 hours of administration. At 72nd hours, the animals were sacrificed and the tumor and cochlea were removed. Creatinine was evaluated in urine samples. In paraffin-embedded tissue samples, apoptosis and necrosis (TUNEL) and anti-oxidant and anti-inflammatory related protein levels (COX2, SOD2 and INOS) were determined by immunohistochemistry. The data were compared between the groups with SPSS 22.0 version. P value less than 0.05 is considered significant.Results: Apoptosis and necrosis rates were higher in the LIPO group than in CDDP (p = 0.035 and p = 0.010). In the spiral ganglion, apoptosis and necrosis were lower in the LIPO group than in CDDP (p = 0.002 and p = 0.002). COX2 pattern in the cochlea was positive in both control and LIPO group and negative in CDDP (p = 0.001). SOD2 and INOS2 showed no difference between groups (p> 0.05). The auditory functions are similar in baseline values and have a better threshold value in the LIPO group than CDDP.Conclusion: In the treatment of neuroblastoma, the use of LIPO seems to be beneficial to eliminate the dose-limiting side effects of CDDP. In addition, LIPO has a higher anti-tumor effect than CDDP. In further studies, it is recommended that the mechanism of these superior properties of LIPO should be evaluated within the tumor microenvironment.Keywords: Neuroblastoma, Lipoplatin, Cisplatin, Ototoxicity, Cytotoxicity 68

Amaç: Parkinson Hastalığı (PH) ciddi yaşam konforu ve iş gücü kaybına hatta ölüme sebep olan, toplumsal olarak da ülke ve dünya ekonomisine ciddi bir yük oluşturan nörodejeneratif bir hastalıktır. Yaşla birlikte ilerleyen bu hastalık, insan ömrünün uzadığı günümüzde daha da fazla önem kazanmıştır. Ancak henüz kesin bir tedavi, veya koruyucu bir yöntem geliştirilememiştir. Biz bu çalışmada PH'de timokinonun koruyucu bir ajan olarak potansiyelini inceledik.Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda SH-SY5Y hücrelerine 6-hidroksidopamin (6-OHDA) uygulamasıyla oluşturulmuş PH hücre kültürü modeli kullanılmıştır. Modele uygulanacak 6-OHDA ve timokinonun doz ve uygulama süresinin belirlenmesi ve timokinonun nöron koruyucu etkisinin gösterilmesi için MTT ile spektrofotometrik inceleme yapılarak hücre canlılığı tespit edilmiştir. 6-OHDA 100 μM ve timokinon 2.5 μM konsantrasyonda uygulanmıştır. Western Blot yöntemiyle 6-OHDA'nın Bax proteini ve 6-OHDA ve timokinonun kaspaz-3, bcl-2 ve bcl-xl protein düzeylerine etkisi incelenmiştir. Elde edilen veriler One way ANOVA ve Tukey testleri ile analiz edilmiştir.Bulgular: MTT testinde timokinonun hücre canlılığını arttırdığı, nöronlarda koruyucu bir etkisi olduğu görülmüştür (p0.05), 12 saatte ise 6-OHDA Bcl-2'yi kontrole göre azaltmış (p0.05), ancak timokinon tek başına uygulandığında bcl-xl düzeyini arttırmıştır (p0.05).Sonuç: Bu çalışma verileri sonucunda timokinonun SH-SY5Y hücre canlılığını koruduğu, bcl-2 ve bcl-xl düzeylerini de arttırdığı görülmüştür. Dolayısıyla timokinonun nöron koruyucu bir etkisinin olduğu ve bu etkiyi apoptoz mekanizmasını baskılayarak oluşturduğu gösterilmiştir. Bu bulgular ışığında timokinonun PH'de nöroprotektif etkilerinin olduğu düşünülmekle beraber, daha ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Objective: Parkinson's Disease (PD) is a neurodegenerative disease that seriously hampers life standards and working ability and can even cause death. It is also a serious burden on the economy of our country and world. Human life span has greatly increased in recent years and so diseases that progresses with age like PD have become more important. Still, an effective cure or protection method against this disease could not yet be developed. In this study, we investigated thymoquinons potential as a protective agent.Methods: In our study we have used a PD model of 6-OHDA administrated SH-SY5Y cells. To determine 6-OHDA and thymoquinone doses we would use on our model and whether thymouinone has a neuroprotective effect, we have used spectrophotometer analysis with MTT cell viability test. We determined the doses of thymoquinone and 6-OHDA as 2.5 μM and 100 μM respectively. Western blotting method was used to determine the effect 6-OHDA had on the apoptotic protein Bax and 6-OHDA and thymoquinone had on the caspase-3, bcl-2 and bcl-2. Statistical analyisis was made using the Tukey and ANOVA tets.Results: MTT test showed us thymoquinone improved cell viability and so has a neuroprotective property (p0.05). However when given without 6-OHDA, thymoquinone could make significant increase in bcl-2 levels compared to control (p0.05).Conclusions: This study shows thymoquinone preserves cell viability of SH-SY5Y cells and increases bcl-2 and bcl-2 proteins. Thus it was deduced that thymoquinone has a neuroprotective property which takes effect through inhibiting apoptosis. In light of these findings, thymoquinone can be said to hold promise for a future protective PD medicine, however to accomplish this, further research needs to be cunducted. 66

Çelik, H. The Effect of Atorvastatin on Sestrin-2, Sirtuin-1, TPP1 and LC3B in Amyloid Beta Induced Alzheimer’s Disease Model in Human Neuroblastoma Cell Culture. Hacettepe University Graduate School of Health Sciences, M.Sc. Thesis in Pharmacology, Ankara, 2019. Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease characterized by the accumulation of amyloid-beta (Aβ) peptides and the formation of neurofibrillary tangles in the brain, accompanied by neuronal loss and inflammation, decreased cognitive functions and dementia. Disorders in lipid metabolism are thought to be associated with the development of AD. The fact that cholesterol affects the formation of Aβ from amyloid precursor protein (APP) reveals the need for investigating the pathogenesis of AH in terms of Aβ-cholesterol pathways. Recent studies have shown that there is a close relationship between the pathology of AH and autophagy pathways. Autophagy is a vital in the cleavage and removal of protein aggregates, such as Aβ, which is the reason of AD pathology, by lysosomal destruction. The aim of this study was to investigate the role of cholesterol-related pathways in sestrin-2 (SESN2), sirtuin-1 (SIRT1), a lysosomal enszyme tripeptidyl peptidase 1 (TPP1) ve microtubule associated protein light chain-3 (LC3B) proteins, which are thought to be responsible for antioxidant and autophagy-inducing mechanisms. Aβ (10 μM) applied to human neuroblastoma (SH-SY5Y) cell line and increased SESN2 expression, decreased SIRT1 expression. Co-administration of atorvastatin (1μM) has been shown to inhibit 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase enzyme and lipid peroxidation indicator malondialdehyde (MDA) in these cells. The autophagy marker LC3B increased with co-administration of Aβ (10 μM) and atorvastatin (1μM). No change has been shown in the levels of the lysosomal enzyme TPP1. In this thesis, we can conclude that atorvastatin has a pharmacological effect during Aβ damage by regulating the expression of SESN2, SIRT1 and LC3B proteins as well as HMG-CoA reductase enzyme inhibitor and antioxidant effect. HÜBAB (Proje Numarası: THD-2017-13478) ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xi TABLOLAR xv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Alzheimer hastalığı (AH) 4 2.2. Alzheimer hastalığı (AH) oluşumu ile ilgili hipotezler 4 2.2.1. Kolinerjik Hipotez: 4 2.2.2. Aβ Kaskad Hipotezi 5 2.2.3. Tau Hipotezi 6 2.2.4. Kolesterol Hipotezi 6 2.3. Alzheimer Hastalığı (AH) ve Oksidatif Stres 7 2.4. Lizozomlar ve Otofaji 8 2.5. Otofaji-lizozom yolağı (ALP) ve Alzheimer Hastalığı (AH) ile ilişkisi 12 2.6. Sestrinler (SESN’ler) 14 2.7. Sirtuinler (SIRT’ler) 18 2.8. Tripeptidil peptidaz 1 (TPP1) 23 2.9. Statinler 24 3. GEREÇ VE YÖNTEM 27 3.1. Hücre Kültürü 27 3.1.1. Hücrelerin Pasajlanması 27 3.1.2. Deneysel AH Hücre Kültürü Modeli için Aβ1-42 proteinin hazırlanması 27 x 3.1.3. Sitotoksisite Deneyleri 28 3.1.4. Deney Gruplarının Oluşturulması ve Tedavisi 29 3.1.5.Hücrelerden Total Protein Ekstrelerinin Elde Edilmesi 29 3.2. Western Blot 30 3.3. ELISA Lipid Peroksidasyon Testi 31 3.4. ELISA HMG-KoA Aktivite Tayini 32 3.5. Kullanılan Çözeltiler 32 3.6. Kimyasallar ve Malzemeler 33 3.7. Kullanılan Cihazlar 34 3.8. İstatistiksel Analiz 34 4. BULGULAR 35 4.1. Sitotoksisite Sonuçlarının Değerlendirilmesi 35 4.2. İn vitro Aβ1-42 ve Atorvastatin Uygulamasının Otofaji ile İlişkili Proteinlere Etkisinin Karşılaştırılması 37 4.3. İn vitro Aβ1-42 ve Atorvastatin Uygulamasının Lipid Peroksidasyon Göstergelerine Etkisi 45 4.4. İn vitro Aβ1-42 ve Atorvastatin Uygulamasının HMG-KoA Enzim Aktivitesine Etkisi 46 5. TARTIŞMA 47 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 55 7. KAYNAKLAR 56 8. EKLER Ek 1. Tez Çalışması ile İlgili Etik Kurul İzni Ek 2. Orijinallik Ekran Çıktısı Ek 3. Dijital Makbuz 9. ÖZGEÇMİŞ Çelik, H. İnsan Nöroblastoma Hücre Kültüründe Amiloid Beta ile Oluşturulan Alzheimer Hastalığı Modelinde Atorvastatinin Sestrin-2, Sirtuin-1, TPP1 ve LC3B Ekspresyonuna Etkisi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakoloji Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2019. Alzheimer hastalığı (AH), beyinde amiloid-beta (Aβ) peptidlerin birikimi ve nörofibriler yumakların oluşumu ile karakterize, bilişsel fonksiyonların azaldığı ve demansın gözlendiği nörodejeneratif bir hastalıktır. Lipid metabolizmasındaki bozuklukların AH gelişimi ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Kolesterolün amiloid prekürsör protein (APP)’den Aβ oluşumunu etkilediğinin gösterilmesi, AH patogenezinin Aβ-kolesterol yolakları açısından araştırılması ihtiyacını ortaya koymaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar AH patolojisi ile otofaji yolakları arasında da yakın bir ilişki olduğunu göstermektedir. Otofaji, AH’nın patolojisini oluşturan Aβ gibi protein agregatlarının lizozomal yıkımla parçalanmasında ve hücreden uzaklaştırılmasında yaşamsal öneme sahiptir. Nörodejeneratif hasara ve Aβ toksisitesine karşı koruyucu olarak değiştikleri gösterilen, bu etkilerinde antioksidan ve otofajiyi indükleyici mekanizmaların sorumlu olduğu düşünülen sestrin-2 (SESN2) ve sirtuin-1 (SIRT1) ile lizozomal bir enzim olan tripeptidil peptidaz 1 (TPP1) ve otofaji belirteci mikrotübülle ilişkili protein hafif zinciri (LC3B) proteinlerinin etki mekanizmalarında kolesterol düşürücü atorvastatinin rolünün araştırılması amaçlanmıştır. İnsan nöroblastoma (SH-SY5Y) hücre hattına uygulanan Aβ (10 μM)’nın SESN2 ekspresyonunda artış, SIRT1 ekspresyonunda azalma yaptığı, eşzamanlı atorvastatin (1μM) tedavisinin bu proteinlerdeki değişiklikleri kontrol seviyelerine geri döndürdüğü ayrıca hücrelerde 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A'yı (HMG-KoA) ve lipid peroksidasyonunun göstergesi malondialdehiti (MDA) inhibe ettiği gösterilmiştir. Otofaji belirteci LC3B, Aβ (10 μM) ile atorvastatinin (1μM) eşzamanlı uygulaması ile artmış, lizozomal bir enzim olan TPP1 seviyelerinde ise değişiklik olmamıştır. Bu tez çalışmasında, atorvastatinin Aβ hasarı sırasında farmakolojik etkisini, HMG-KoA redüktaz enzim inhibitörü ve antioksidan etkisinin yanı sıra, SESN2, SIRT1 ve LC3B proteinlerinin ekspresyonlarını değiştirerek gösterdiği sonucuna varabiliriz.

Amaç: Nöroblastom ilk bir yaş içerisinde spontan benign forma dönüşüm gösterebilir veya regrese olabilir. Bebeğin bu dönem içerisinde anne sütü gibi maruz kaldığı bir faktör veya durum buna neden olabilir. Bu çalışmada anne sütünün nöroblastom diferansiyasyonunda etkinliğinin değerlendirilmesi amaçlandı.Gereç ve Yöntem: SHSY5B nöroblastom hücrelerine in-vitro ortamda %1 (Grup 1), %2 (Grup 2) ve %5'lik (Grup 3) konsantrasyonlarda anne sütü verildi ve hücreler diferansiyasyon açısından morfolojik olarak incelendi. Nöron diferansiyasyonu nörit uzaması ile kontrol edildi. Bulgular: Hücre diferansiyasyonunu değerlendirmek amacıyla ölçülen ortalama nörit uzantısı, gruplar arasında karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı derecede farklı bulundu (p=0.001). Kontrol grubu ile Grup 1, 2 ve 3 karşılaştırıldığında anne sütü gruplarında nörit uzantısı daha uzun idi ve aralarında istatistiksel anlamlı farklılık vardı (Kontrol; 31.4 ± 5.7 Px vs. Grup 1; 90.4 ± 14 Px, p=0.002; Kontrol; 31.4 ± 5.7 Px vs. Grup 2; 94.9 ± 14.6 Px, p=0.002; Kontrol; 31.4 ± 5.7 Px vs. Grup 3; 95.4 ± 14.6 Px; p=0.002). Grup 1, 2 ve 3 kendi aralarında nörit uzaması açısından karşılaştırıldığında, nörit uzaması anne sütü konsantrasyonu arttıkça daha uzun bulunmasına rağmen istatistiksel olarak anlamlı değildi (Grup 1: 90.4 ± 14 Px vs. Grup 2: 94.9 ± 14.6 Px; p=0.41, Grup 1: 90.4 ± 14 Px vs. Grup 3: 95.4 ± 14.6 Px; p=0.28, Grup 2: 94.9 ± 14.6 Px vs. Grup 3: 95.4 ± 14.6 Px; p=0.95). Kontrol, Grup 1, Grup 2 ve Grup 3 gruplarındaki nörit uzaması günlere göre karşılaştırıldığında uzunluk değişimi açısından istatistiksel olarak anlamlı idi (Kontrol; p=0.001, Grup 1; p

Son yıllarda THC gibi beyin ve periferik dokularda kannabimimetik etki gösteren yeni nesil sentetik kannabinoidlerin kullanımı giderek yaygınlaşmakta ve sentetik kannabinoidlere bağlı çok ciddi hatta ölümcül yan etkiler rapor edilmektedir. İlk jenerasyon sentetik kannabinoidlerin temsilcisi olan JWH-018 esrarın öforik ve psikoaktif etkilerinden sorumlu olan CB1 reseptörü üzerinde THC'den 4-5 kat daha yüksek afinite göstermektedir.Günümüzde sentetik kannabinoidlerin sitotoksisite mekanizmalarını araştıran çok az sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmada JWH-018'in insan nöroblastom SH-SY5Y hücre dizisinde sitotoksik, apoptotik, genotoksik etkileri ve oksidatif stres parametreleri üzerine etkileri araştırılmıştır. Sitotoksisitenin ve IC50 değerinin belirlenmesi amacıyla MTT, NRU ve LDH testleri yapılmıştır. MTT, NRU ve LDH testlerinde hücre canlılığında istatistiksel olarak anlamlı bir değişim gözlenmemiştir. Oksidatif stres parametrelerini değerlendirilmek üzere maruziyet sonrası glutatyon (GSH), tiyobarbitürik asit reaktif maddeler (TBARS) ve protein karbonil seviyeleri; glutatyon peroksidaz (GSH-Px), glutatyon redüktaz (GR), süperoksid dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT) aktiviteleri ölçülmüştür. Genotoksisite tayini için Comet analizi, apoptoz/nekroz oranının belirlenmesi için Annexin V/PI boyaması yapılmıştır. Oksidatif stres parametrelerinden GSH seviyesinde anlamlı düşüş, protein karbonilizasyon seviyesinde anlamlı artış, GR ve CAT aktivitelerinde anlamlı düşüşler görülmüştür. Apoptoz/nekroz oranında ve genotoksisite değerlendirilmesinde JWH-018 maruziyetine bağlı olarak anlamlı değişim gözlenmemiştir .Anahtar Kelimeler: Sentetik kannabinoid, JWH-018, Nöroblastoma SH-SY5Y, İnvitro sitotoksisite, oksidatif stres Abuse of new generation synthetic cannabinoids has been increasing due to THC like cannabimimetic effects on Central Nervous System and serious side effects even fatalities due to synthetic cannabinoids abuse have been reported. JWH-018, one of the first generation of new syntethic cannabinoids, shows 4-5 times higher binding affinity to CB1 receptor which is responsible for euphoria and psychoactive effects of marijuhana. There are very few studies investigating the cytotoxicity mechanisms of synthetic cannabinoids. In this study, JWH-018's cytotoxic, apoptotic, genotoxic effects and effects on oxidative stress parameters on neuroblastoma SH-SY5Y cell line were investigated. Firstly, MTT, NRU and LDH assays were performed to determine cytotoxicity and IC50 value. According to MTT, NRU and LDH test results, there were no statistically significant change in cell viability observed.Evaluating the oxidative stress parameters, glutathione (GSH), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), protein carbonyl levels and glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) acitivities were measured. For genotoxicity evaluation, Comet assay was performed. For apoptosiz/necrosis ratio determination, Annexin V/PI assay was performed. There was a statistically significant decrease in GSH levels, decrease in glutathione reductase and catalase enzyme activities and increase in protein carbonylation levels. There was no statistically significant change in apoptosis/necrosis ratio and comet assay observed due to JWH-018 exposure.Key Words: Synthetic cannabinoid, JWH-018, Neuroblastoma SH-SY5Y, In vitrocytotoxicity, Oxidative stress 80

Reelin, nöral gelişmede çok önem taşıyan iyi korunmuş bir ekstraselüler glikoproteindir. Reelin proteinindeki bozukluklar ve RELN geninde meydana gelen mutasyonlar sonucu oluşan nöral hastalıklara ilişkin birçok çalışma yapılmıştır. Ancak, bu hastalıklarda Reelin'in yapısında bulunan glikanların olası rolü hakkında herhangi bir bilgi bulunmadığı gibi, Reelin'in yapısında yer alan glikanlar hakkındaki bilgiler de çok sınırlıdır. Glikoproteinlerin yapısında yer alan farklı glikan birimleri proteinlerin mikroçevresini değiştirerek görevlerini kontrol edebilirler. Böylece, hücrenin neredeyse tüm işlevlerinde doğrudan veya dolaylı olarak görev alırlar. Aynı aminoasit sıralarına sahip iki proteindeki glikozilasyon değişiklikleri proteinin işlevini doğrudan değiştirebildiği için, Reelin glikoproteininin glikan zincirlerinin de molekülün işlevi üzerinde etkili olması yüksek bir olasılıktır. Bu nedenle bu tez çalışmasında; SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattından Reelin glikoproteinini ve önemli fragmanlarını izole etmek ve bu izolatların uç glikan profillerini lektin blotlama ile, bu glikanların yapı (monosakkarit) analizlerini ise CapLC-ESI-MS/MS ile belirlemek amaçlanmıştır. Bu amaçla, SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattı kullanılmıştır. Hücreler uygun koşullar altında kültüre edikten sonra total ve sitoplazmik protein ekstraksiyonları yapılmıştır. Western Blotlama ile hangi bandın/bantların Reelin proteinine ait olduğu belirlenmiştir. Bu bantların taşıdığı uç glikan birimlerini saptamak için SNA, MAA, GNA, PNA ve DSA lektinleri kullanılarak lektin blotlama yapılmıştır. Hücre hattından immün çöktürme tekniği ile, Reelin glikoproteini izole edilmiştir. İzole edilen Reelin fragmanının monosakkarit analizi, CapLC-ESI-MS/MS sistemi ile gerçekleştirilmiştir. SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattının total protein profili SDS-PAGE ile üç farklı lizis tampon (Ripa, NucBuster, IP-lysis) kullanılarak gösterilmiş, her üçünde de çok yakın sonuçlar elde edilmiştir. Reelin, 400, 310, 250 ve 85 kDa ağırlıklarında olmak üzere dört fragman şeklinde elde edilmiştir. Reelin glikoprotein fragmanlarında uç glikan olarak, α2,6 ve α2,3 bağlı sialik asitler, β-Galaktoz, α-Mannoz, β-GlcNAc saptanmıştır. Bant alan yoğunluğu bakımından en yüksek değer 400 kDa Reelin fragmanındaki α2,3 bağlı sialik asit bandında, 601 birim olarak bulunmuştur. Dört Reelin fragmanındaki toplam bant alan değerleri fazladan aza doğru sırasıyla α2,3 bağlı sialik asit (1224 birim), β-Galaktoz (1165 birim), α2,6 bağlı sialik asit (764 birim), β-GlcNAc (672 birim) ve α-Mannoz (205 birim) şeklindedir. Reelin glikoproteininin saflaştırılması transfeksiyon yapılmamış hücrelerden immün çöktürme tekniği ile gerçekleştirilmiş ve 250 kDa'luk Reelin fragmanı saf olarak izole edilmiştir. Bu izolatın monosakkarit analizi sonucu, miktarları fazladan aza doğru sırasıyla; N-asetilgalaktozamin, N-asetilglukozamin, galaktoz, glukoz ve mannoz olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak, pek çok hastalık, glikokonjugatlardaki glikozilasyon değişmeleriyle ve/veya glikanların tanınmasıyla ilgili olarak ortaya çıkar. Reelin'in bir glikoprotein olduğunun bilinmesine karşın, glikan profiline ilişkin literatür bilgisi çok sınırlıdır. LC-MS/MS gibi yüksek analitik tekniklerle Reelin glikan analizleri, ilk kez gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, Reelin üretimi için transfeksiyon sistemi kullanılmadan doğal formda saflaştırma yapılması, olası glikan değişimlerini engellemesi açısından önemlidir ve literatürde rastlanmamıştır. Belirlediğimiz Reelin fragmanlarından 85 kDa'luk fragman da ilk kez ifade edilmiştir. Yüksek miktarda aminli glikan birimlerinin (GlcNAc ve GalNAc) belirlenmesi, Reelin üzerinde N-glikanların yanı sıra O-glikanların da önemli bir yerinin olabileceğini göstermektedir. Bu sonuçların ve devamında yapılacak çalışmaların, nöropsikiyatrik hastalıkların mekanizmasının daha detaylı anlaşılmasına ve glikobiyoloji bakış açısıyla bu hastalıkların teşhis ve tedavisi için yapılan araştırmalara katkı sağlaması beklenmektedir., Reelin is a highly conserved extracellular glycoprotein that have an importance in neural development. There is many research related with neural disease originate from dysfunction of Reelin protein and mutation of RELN gene. However, the information about the glycans in the structure of reelin is very limited as well as no information about the possible roles of glycans in the disease. Different units of glycan in the structure of glycoproteins can control their function by altering the microenvironment of proteins. Thus, they act to function directly or indirectly in almost all functions of the cell. It is highly probable that the glycan chains of the Reelin glycoprotein also have an effect on its function since the glycosylation changes in the two proteins with the same amino acid sequences can directly alter the protein's function. In this thesis, it is aim to isolate of the Reelin glycoprotein and its important fragments from SH-SY5Y neuroblastoma cell line and to characterize of glycans profiles of these isolates by lectin blotting and structure (monosaccharide) analysis of these by CapLC-ESI-MS/MS. For this aim, SH-SY5Y neuroblastoma cell line was used. Total and cytoplasmic protein extractions were carried out after cells were grown in appropriate conditions. Band / bands belong to Reelin were determined using Western blotting. Lectin blotting was carried out using SNA, MAA, GNA, PNA and DSA lectins to determine the terminal units of glycan on the Reelin bands. Reelin glycoprotein was isolated from the cell line using an immunoprecipitation technique. Monosaccharide analysis of the isolated Reelin fragment was performed using the CapLC-ESI-MS/MS system. The total protein profile of the SH-SY5Y neuroblastoma cell line was demonstrated by SDS-PAGE using three different lysis buffers (Ripa, NucBuster, IP-lysis) and very similar results were obtained in all three cases. Reelin was obtained in the form of four fragments with weight of 400, 310, 250 and 85 kDa. α2,3 and α2,6 bound sialic acids, β-Galactose, α-Mannose, β-GlcNAc were determined in the fragments of Reelin glycoprotein as terminal unit of glycan. The highest value in terms of band area density was found to be 601 units in the α2,3 linked sialic acid band of the 400 kDa fragment of Reelin. Total value of band areas in the four fragments of Reelin were α2,3 linked sialic acid (1224 unit), β-Galactose (1165 unit), α2,6 bound sialic acids (764 unit), β-GlcNAc (672 unit), α-Mannose (205 unit) respectively. Purification of the Reelin glycoprotein was performed by immunoprecipitation from not transfected cells and Reelin fragment with weight of 250 kDa was isolated in pure form. In the result of the monosaccharide analysis of this isolate, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, galactose, glucose and mannose were determined from high amount to low respectively. As a result, there are many diseases associated with alteration of glycosylation and/or recognition dysfunctions of glycans. Although Reelin is a glycoprotein, literature on glycan profile of Reelin is very limited. Glycan analysis of Reelin with high analytical techniques, LC-MS/MS, was performed for the first time. In addition, purification of the natural form without the use of transfection system to produce reelin is important for preventing possible glycan changes and not been found in the literature. The 85 kDa from the determined Reelin fragment was also shown for the first time. Determination of high amounts of aminoglycans (GlcNAc and GalNAc) demonstrate that N-glycans as well as O-glycans may be an important on Reelin. It is expected that these results and future studies will contribute to detailed understanding of the mechanism of neuropsychiatric diseases and to the research done for diagnosis and treatment of the diseases from the viewpoint of glycobiology.

AMAÇ: Bu çalışmada Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi2011-2013 tarihleri arasında Çocuk Onkoloji AnabilimDalı’nda takipli ve Çocuk Cerrahisi Kliniğince opere edilentoplam 22 retroperitoneal tümörlü hastanın kayıtlarıretrospektif olarak değerlendirildi.GEREÇ VE YÖNTEM: Retroperitoneal tümör nedeniyle2011-2013 arasında cerrahi girişim yapılan olgulargeriye dönük olarak incelendi. Primer retroperitonealtümörü kontrol altına alınan, başka uzak organ metastazıolmayan cerrahi tedavi uygulanan olgular çalışmayadahil edildi. Yaş, cinsiyet, primer tanı anında tümör evresi,cerrahi tedavi yöntemi, patolojik tanı ve takip açısındanolguların dosyaları retrospektif olarak değerlendirildi.BULGULAR: Olgularımızın 9’u (%40) erkek, 13’ü (%60)kadındı. Ortalama yaş erkeklerde 71 ay (3-132), kadınlarda37 ay (6-204) idi. Histopatolojik olarak olguların 15(%68)’i nöroblastom, 4’ü (%18.5) Wilms tümörü, 1’i(%4.5) embriyonal rabdomyosarkom, 1’i (%4.5) berrakhücreli sarkom, 1’i (%4.5) malign sinir kılıfı tümörü olarakdeğerlendirildi. Tanı anında olguların 8’i (%36) evre I, 7’si(%32) Evre III, 7’si (%32) evre IV safhasındaydı.SONUÇ: Olgularımızın %68’i nöroblastom olup,tanı anında hastaların %64’ü evre III ve evre IV idi.Anatomik lokalizasyonları nedeniyle ileri evrelere kadarsessiz tümörler olan retroperitoneal tümörlerin çoğunöroblastomdur ve genellikle ileri evrelerde tanı alırlar., OBJECTIVE: In this study, Selcuk University Facultyof Medicine between 2011 - 2013 follow-up at theDepartment of Pediatric Oncology and Pediatric Surgeryclinic was operated by a total of 22 patients withretroperitoneal tumors were evaluated retrospectively.MATERIAL AND METHODS: Retroperitoneal tumorswere evaluated retrospectively during 2011-2013. Thecases treated with primary retroperitoneal tumor, surgicaltreatment without other distant organ metastasis wereincluded in the study. The files of the cases were primarydiagnosis in terms of age, sex, tumor stage at the timeof diagnosis, surgical treatment method, pathologicaldiagnosis and follow-up reviewed retrospectively.RESULTS: Nine out of 22 cases (40%) male and 13 (60%)were female. Male mean age of 71 months ( 3-132 ) inthe girls 37 months ( 6-204 ). The histological results, 15(68%) of neuroblastoma, 4 (18.5%) Wilms, 1 (4.5% ) EmbryonalRhabdomyosarcoma, 1 (4.5% ) Clear cell sarcoma ,1 (4.5% ) malignant nerve sheath tumors were evaluated.Eight of the cases (36%) were stage I, 7 (32%) were stageIII, 7 (32%) stage IV.CONCLUSIONS: In conclusion, 68% of our cases wereneuroblastoma and 64% of the patients were stage IIIand stage IV at the time of diagnosis. Retroperitonealtumors are generally diagnosed in advanced stages. Wethink that this is due to the anatomical localizations andthe silent as far as the clinically advanced stage.Tamer SEKMENLİ1, İlhan ÇİFTÇİ1, Doğan KÖSE2, Yavuz KÖKSAL2, Nevin SEKMENLİ3

AmaçBu çalıĢmanın amacı; SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattında Yabanıl tip (WT) vemutant Parkin proteinlerinin (Q311R ve A371T) ifadesi sonrasında oluĢan fosforilasyondüzeyindeki değiĢiklikleri proteomik yaklaĢımlarla araĢtırmak, ubikitinlenme vefosforilasyon arasındaki çapraz etkileĢime ıĢık tutmaktır.YöntemHücrelerden elde edilen protein özütleri iki boyutlu jel elektoforezi ile ayrıĢtırıldı.Fosforile olmuĢ proteinler ProQ Diamond boyası ile tayin edilerek protein spotlarıjellerden kesildi ve ardından, proteinler MALDI-TOF/TOF analizi ile tanımlandı.BulgularWT ve mutant tetrasiklin indüksiyonu yapılmıĢ ve yapılmamıĢ hücrelerden eldeedilen proteinlerden 2D tabanlı karĢılaĢtırmalı spot analizi yapıldı. Fosfoprotein boyamasısonrasında jellerde 35±3 fosforillenmiĢ protein spotu, toplamda ise Sypro boyamasısonrasında 215±15 protein spotu gözlenmiĢtir. WT Parkin ifade eden hücrelerde 10,mutant Parkin ifade eden hücrelerde ise 6 proteinin fosforilasyon seviyelerinde indüksiyonsonrası artıĢ olduğu görüldü.SonuçBeklentimiz WT Parkin indüksiyonunun ubikuitinlasyonunu arttırarak ubikitinlenmeve fosforilasyon arasındaki çapraz etkileĢimi baskın hale getirmesi ve dolayısıyla dolaylıyoldan fosforilasyon iliĢkili yolakların düzenlenmesi yönündedir. Nitekim STRINGanalizinin PI3K-AKT yolağını iĢaret etmesi ubikuitin bağımlı fosforilasyon ĢemasınındeğiĢtiğini göstermektedir. Diğer taraftan mutant Parkin indüksiyonu sonrasındatanımlanan fosforile proteinlerin ise Parkinson hastalığı ve endoplazmik retikulumdaprotein iĢlenmesi ile ilgili sonuçlar alınmıĢtır. WT ve mutant Parkin eksprese edenhücrelerdeki farklı hücresel yolakların ön plana çıkması mutant Parkin'in normal WT'egöre farklı fonksiyonu olduğunu göstermiĢtir.Anahtar Sözcükler: Parkin, SH-SY5Y, 2DE, Protein Fosforilasyonu, ProQ Diamond,MALDI-TOF/TOF. ObjectiveThe purpose of this thesis was to investigate the changes in phosphorylation levelsin SH-SY5Y neuroblastoma cell line after expression of the Wild-type and the mutantParkin proteins (Q311R and A371T ). Determination of the changes in phosphorylationlevels upon Parkin expression should allow elucidation of the cross-talk betweenubiquitinilation and phosphorylation.MethodsThe protein extracts prepared from Parkin expressing and non-expressing cells wereprepared and subjected to 2D gel electrophoresis. Phosphorylated proteins were detectedby ProQ Diamond stain and differentially regulated protein spots were excised from thegels. Then, the proteins were identified by MALDI-TOF/TOF analysis.ResultsConsequtive phosphoprotein and total protein staining of the gels revealed theprecense of 35±3 phosphoprotein spots and 215±15 total protein spots on the gels. A totalof 16 phosphoprotein spots of which 10 belonged to the WT Parkin expressing cells and of6 beloged to the mutant Parkin expressing cells were identified as differantially regulated.ConclusionsThe induction of the WT Parkin expression should increase ubiquitinilation events inthe cells and stimulate the cross-talk between ubiquitination and phosphorylation. Indeed,STRING analysis linked the regulated proteins to PI3K-AKT pathway, which is one of themost important signaling pathways regulating cell division. On the other hand, the resultsof phosphorylated proteins which had been identified after an induction of the mutantParkin protein were found to be related to Parkinson's disease and endoplasmic reticulumprotein processing. Observation of such difference in indicated pathways upon either theWT or the mutant Parkin expressions may imply that the mutant Parkin protein isfunctionally different then the WT Parkin protein.Key words: Parkin, SH-SY5Y, 2DE, Protein Phosphorilation, ProQ Diamond, MALDITOF/TOF 118

Giriş ve Amaç: Nöroblastoma (NB) tüm dünyada çocukluk döneminin en yaygın kanseri olmakla beraber yine çocukluk çağındaki en sık karşılaşılan ekstrakraniyal solid kanserlerden birisidir. Tirozin kinaz sinyalizasyonu nöroblastoma da hücre farklılaşmasında temel bir role sahiptir. Mallotus philipinensis'ten (Euphorbiaceae) köken alan doğal polifenolik bir bileşik olan Rottlerin'in proliferasyon ve apoptoz gibi çeşitli hücresel prosesler üzerine olan etkilerinden dolayı kanser tedavisi için büyük bir potansiyele sahip olduğu görülmektedir. Genistein bir fitoöstrojen olup, tirozin kinaz inhibitörü olarak işlev görebilmektedir. Genistein'in büyük olasılıkla prostat, serviks, beyin ve meme gibi çeşitli kanserlerde hücre bölünmesi ve sağ kalımını inhibe etmesi yoluyla kontrolsüz kanser büyüme ve gelişimini inhibe ettiği tespit edilmiştir. Son yıllarda, atipik bir kinaz olan Ökaryotik elongasyon faktörü-2 kinaz'ın (EF2K) birçok kanser hücresinde dramatik bir biçimde upregüle olduğu ve hücre sağ kalımı ile proliferasyonu tetiklediği, ayrıca inhibisyonunun hücre büyümesi ve koloni formasyonunu önemli düzeyde azalttığı öğrenilmiştir. Rottlerin ve Genistein pankreas kanseri gibi diğer solid tümörlerde de bu kinaz üzerine inhibitörik etkiler göstermiştir. Ancak, Rottlerin ve Genistein'in bu kanserdeki etki ve rolleri, ayrıca hücre proliferasyonu, koloni formasyonu, sağkalım, invazyon/metastaz ve hücre ölüm/hücre siklusu üzerine ve bunları düzenleyen yolaklara olan etkileri ile EF2K ilişkisi tam olarak bilinmemektedir. Tüm bu bilginin ardından, çalışmada nöroblastoma hücrelerinde Rottlerin ve Genistein'in ayrı ayrı ve kombine olarak bu hücre davranışları üzerine olan etkileri incelenmiştir. Yöntemler: Bu çalışmada insan nöroblastoma kanser hücre hatları (SH-SY5Y, Kelly) kullanılmıştır. Tedavi amacıyla Rottlerin ve Genistein uygulanmıştır. İn vitro deneyler olarak, hücre proliferasyonu, koloni formasyonu, invazon/migrasyon, yara iyileşmesi testi, flow sitometri ile apoptoz ve hücre siklusu analizleri ile western blot analizi gerçekleştirilmiştir. Bulgular: Çalışmamızdaki bulgular Rottlerin ve Genistein tedavilerinin nöroblastoma hücrelerinde sırasıyla 5 µM ve 30 µM dozlarda hücre proliferasyonu, koloni formasyonu, invazyon/migrasyon ve yara iyileşmesi kapasitelerinde önemli düzeyde azalmalara neden oldukları görüldü. Bu dozların kombinasyonları da aynı analizlerdeki inhibisyon düzeylerini artırdı. Ek olarak bu ilaçlar nöroblastoma hücrelerinde apoptoz düzeylerinde de artışa sebep oldu. Bunun yanında yine aynı ilaçlar G1 hücre siklusu arrestine de neden oldu. Ayrıca, Rottlerin ve Genistein tedavilerinin EF2K overekspresyonunu önemli düzeyde azalttığı ve bu downregülasyona bağlı olarak in vitro nöroblastoma hücre proliferasyonu, koloni formasyonu ve invazyon/migrasyonunu inhibe ettikleri gösterildi. Western blot bulguları nöroblastoma hücrelerinde EF2K'in pro-tümörojenik, metastatik protein ve yolaklardaki upregülasyon üzerinden tümörogenez ve metastazı artırabileceği ve Rottlerin ile Genistein'in anti-proliferatif, anti-metastatik ve apoptotik etkilerini olasılıkla EF2K downregülasyonu üzerinden ortaya koyabildiğini gösterdi. Sonuç: Sonuç olarak tüm bu veriler ile birlikte Rottlerin ve Genistein'in nöroblastoma hücrelerinde hücre proliferasyonu, koloni formasyonu, invazyon/migrasyonu ve hücre siklusu/apoptoz üzerine önemli etkilere sahip olduğu ortaya konulmuştur. Dahası, Rottlerin ve Genistein'in bu etkilerini bu kanserde yeni bir potansiyel terapötik hedef olarak EF2K downregülasyonu üzerinden ortaya koyabilecekleri gösterilmiştir. Özetle, kombine olarak Rottlerin ve Genistein ile tedavi, ileride yapılacak ilave çalışmaların ışığında ve yeni nano ilaç taşıyıcı sistemlerin de yardımıyla nöroblastoma hastalarında faydalı ve uygulanabilir bir girişim olabilecektir., Objectives and Aim: Neuroblastoma (NB) is the most common extracranial solid cancer in childhood and the most common cancer in infancy in the world. Tyrosine kinase signaling networks play a major role in governing cell differentiation, including in neuroblastoma. Rottlerin, a naturally occurring polyphenolic compound derived from Mallotus philipinensis (Euphorbiaceae), appears to have great potential in cancer therapy because of its effects on several cellular processes such as proliferation and apoptosis. Genistein is a phytoestrogen and acts as tyrosine kinase inhibitor. Genistein have been found to inhibit the uncontrolled cell growth of cancer, most likely by inhibiting cell division and cell survival in several cancers such as prostate, cervix, brain and breast. Recently, we learned that Eukaryotic elongation factor-2 kinase (EF2K), an atypical kinase, is dramatically up-regulated in many cancer cells and promotes cell survival and proliferation, its inhibition significantly reduces cell growth and colony formation. Rottlerin and Genistein also showed inhibitory effects on this kinase in another solid tumours like Panc Ca. However, the role that Rottlerin and Genistein in this cancer and effects of these drugs on pathways regulating cell proliferation, colony formation, survival, invasion/metastasis and resistance and relationship between EF2K and these drugs remains are largely unknown. After all of these knowledge, we investigated the effects of Rottlerin and Genistein separately and in combination on these cell behaviours in Neuroblastoma cells. Methods: In this study, the human neuroblastoma cancer cell lines (SH-SY5Y, Kelly) were used. Rottlerin and Genistein were also employed for therapy. As in vitro experiments, cell proliferation, colony formation, invasion, wound-healing tests, western blot, cell cycle and apoptosis analysis by flow cytometry were performed. Results: Our results showed that Rottlerin and Genistein treatments caused a significant reduction in cell proliferation, colony formation, invasion/wound-healing capacity in Neuroblastoma cells at concentrations of 5 µM and 30 µM, respectively (p

Ökaryotik bir ribonükleoprotein olan telomeraz, "hTERT" katalitik alt birimi, "hTR" kalıp RNA'sı ve "p23/hsp90", "SnoRNA", "TEP1", "hnRNAPS C1/2", "La", "L22" ve "hStau" şeklinde bağlı proteinlerden oluşan bir holoenzim komplekstir. Her hücre bölünmesinde, kromozomların uçları (telomerler) kısalmaktadır. Bu kısalma ile birlikte hücresel senesens ve hücre bölünmesinin durdurulması tetiklemektedir. Telomeraz, telomerlere yeni nükleotidlerin eklenmesini katalizleyen (insanda: TTAGGG) bir ters transkriptazdır ve tüm malignant tümörlerin yaklaşık %90'ında belirlenmiştir. İnsan tümör hücrelerinin, evrensel olarak hücresel senesens ve DNA hasar-sinyal yol izlerini baypas ettiği düşünüldüğünde; telomeraz, ilgili moleküler mekanizmalar açısından son derece kritik bir noktada durmaktadır. Bir post-translasyonel modifikasyon olan protein glikozilasyonu, hücre içi ve hücreler arası tanıma, tutunma, sinyal iletimi ve farklılaşma gibi bir çok moleküler ilişkide önemli rollere sahiptir. Özellikle biyolojik tanıma olaylarının büyük bir kısmında bağlanmanın kalite kontrolü ve protein katlanmasında son derece önemlidir. Glikobiyolojinin perspektifinden baktığımızda, çok alt birimli bir ribonükleoprotein olan telomerazın; alt birimlerinin telomeraz kompleksini oluşturmasına ve enzimin katalitik işlevine dair ilgili moleküler mekanizmaların gerekli tanıma ve tutunma reaksiyonlarında glikanların rol oynaması olası görülmektedir. Bu tez çalışmasında, öncelikle hTERT ve farklı türlere ait telomeraz katalitik alt birimi (TERT) amino asit dizilerinde olası glikozilasyon pozisyonlarının biyoinformatik yöntemlerle belirlenmesi; nöroblastoma (SH- SY5Y) ve hepatoselüler karsinoma (Hep G2) hücre hattı örneklerinde, western ve lektin blotlama yöntemleriyle, olası glikanların deneysel olarak incelenmesi ve karşılaştırılması amaçlanmıştır. Yapılan biyoinformatik çalışma sonucunda: TERT proteini amino asit dizisi bakımından farklı türlerde karşılaştırıldığında, bu dizilerin türler arasında yüksek oranda korunduğu ve protein sekonder modellerinde katlanma motifleri açısından farklılıklar olduğu görülmüştür. Homo sapiens hTERT amino asit dizisinde olasılıkla bir N-bağlı ve birden çok O-bağlı glikozilasyon pozisyonu tespit edilmiştir. Ek olarak, Canis familiaris, Bos taurus, Rattus norvegicus ve Mus musculus TERT amino asit dizilerinde de olası O-bağlı glikozilasyon pozisyonları tespit edilmiş olup Rattus norvegicus ve Mus musculus TERT aminoasit dizilerinde olası iki N-bağlı glikozilasyon pozisyonu olduğu görülmüştür. Biyoinformatik verileri destekler şekilde, SH-SY5Y ve Hep G2 hücreleri nukleus lokalizasyonunda, hTERT'e bağlı N-asetilglukozamin (GlcNAc) ve sialik asit (Sia) belirlenmiştir. Her iki hücre hattında da en yoğun şekilde hTERT'e bağlı GlcNAc bulunmuştur. Hep G2 hücrelerinde ek olarak hTERT'e bağlı mannoz tespit edilmiştir. Her iki hücre tipine ait hTERT'de uç şeker olarak belirlenmiş olan α2,6 bağlı Sia'ların, O- ve/veya N-bağlı glikozilasyonla ilişkili olabileceği; hTERT ve etkileştiği bir protein olan TEP-1'in bağlanmasıyla ilgili moleküler reaksiyonlarda, tanıma ve tutunmada rollerinin olabileceği tartışılmıştır., Telomerase, an eukaryotic ribonucleoprotein, is a holoenzyme complex consisting of proteins linked together such as "HTERT" catalytic subunit, "hTR" template RNA and "p23 / hsp90", "SnoRNA", "TEP1", "hNRNAPS C1 / 2 "," La "," L22 "and" hStau. At each cell division, the ends of the chromosomes (telomeres) are shortened. With this shortening, the stopping of cell senescence and cell division is triggered. Telomerase is a reverse transcriptase that catalyzes the insertion of new nucleotides into telomeres (human: TTAGGG nucleotides) and has been identified in about 90% of all malignant tumors. When human tumor cells are thought to bypass the global pathways of cellular senescence and DNA damage signaling. So, telomerase is at a critical point in terms of the relevant molecular mechanisms. Protein glycosylation, a post-translational modification, has a number of important molecular roles, such as intracellular and intercellular recognition, adhesion, signal transduction and differentiation. Protein glycosylation is particularly important in the large proportion of biological recognition events, such as quality control of the binding and protein folding. From the perspective of glycobiology, telomerase, a multi-subunited ribonucleoprotein; it is possible that glycans play a role in the telomerase's subunits' form the telomerase complex and the necessary recognition and attachment reactions of the relevant molecular mechanisms of the catalytic function of the enzyme. In this thesis study, it is primarily aimed to determine possible glycosylation positions in the amino acid sequences of hTERT and telomerase catalytic subunit (TERT) that belongs to different species, by bioinformatic methods; and to experimentally compare and analyze possible glycans from Neuroblastoma (SH- SY5Y) and Hepatocellular carcinoma (Hep G2) cell line samples by western and lectin blotting methods. As a result of the bioinformatics study, it was found that when comparing the TERT protein in different species with respect to the amino acid sequence, these sequences are highly conserved between species and differ in terms of folding motifs in the protein secondary models. In the amino acid sequence of the Homo sapiens hTERT, an N-linked and multiple O-linked glycosylation positions were identified. In addition, possible O-linked glycosylation positions have been identified in the TERT amino acid sequences of Canis familiaris, Bos taurus, Rattus norvegicus and Mus musculus and two possible N-linked glycosylation positions were found in the TERT amino acid sequences of Rattus norvegicus and Mus musculus. In support of bioinformatics data, N-acetylglucosamine (GlcNAc) and sialic acid (Sia) bound to hTERT were identified in the nucleus localization of SH-SY5Y and Hep G2 cells. GlcNAc which is bound to hTERT has been found most intensively in both cell lines. Additionally hTERT-associated mannose was detected in Hep G2 cells. The α2,6-linked Sia, identified as end-sugar in hTERT of both cell types, might be associated with O- and/or N-linked glycosylation; and it is discussed that these α2,6-linked Sias might have attachment and recognition effects on molecular reactions of hTERT, and an interacting protein TEP-1's binding

Nöroblastom beş yaşın altındaki çocuklarda görülen bir kanser türüdür. Kemoterapi (doksorubisin, sisplatin ve etoposid), cerrahi, radyasyon ve kök hücre transplantasyonuna ek olarak tedavi için kullanılır. Kemoterapötik ajanların yan etkileri nedeniyle, sağlıklı hücrelerin korunması için bazı bitki türevli bileşenler kullanılmaktadır. Naringin turunçgillerde bulunan ve antioksidan, apoptotik, antiinflamatuar özelliklere sahip bir flavonoiddir. Bu çalışmada, naringin ve kemoterapi ajanlarının (doksorubisin ve sisplatin) nöroblastom ve astrosit hücre serilerinde tek ve kombine etkilerinin belirlenmesini amaçladık. Bu amaçla, kombinasyonların sıralı ve aynı anda uygulamalarının apoptotik etkileri görüntü tabanlı sitometre ve apoptoz yolağının gen ekspresyonu ile analiz edilmiştir. Çalışma sonuçlarına göre naringin, nöroblastom hücrelerinde p53, Bax, Cyc-c ve kaspaz-3’ü indükleyerek intrinsik apoptoz yolağını tetiklemiştir. Buna ilaveten, naringinin kemoterapi ajanı ile önce veya sonra uygulanması farklı apoptotik etkilere neden olmuştur. Sonuç olarak, naringinin sisplatinden önce ve doksorubisinden sonra uygulanması nöroblastom hücrelerinde daha fazla apoptozise neden olmuştur. Ayrıca, naringinin ön-uygulaması astrosit hücre serilerinde sisplatin toksisitesine karşı koruyucu etki göstermiştir. Abstract ; Neuroblastoma is a cancer type seen in children under five years old. Chemotherapy (doxorubicin, cisplatin and etoposide) use for the treatment in addition to surgery, radiation and stem cell transplantation. Because of the side effects of chemotherapeutic agents, some plant-derived components are used for protecting healthy cells. Naringin is a citrus flavonoid have antioxidant, apoptotic, antiinflamatuar properties. In this study, we aimed that the determination of single and combine effects of naringin and chemotherapy agents (doxorubicin and cisplatin) in neuroblastoma and astrocyte cell lines. With this aim, the effects of the combinations following exposure to the sequentially and simultaneously on apoptosis analyzed by image-based cytometer and gene expressions of apoptosis pathway. According to results of the study, naringin induced intrinsic apoptosis pathway as evidenced by the induction of p53, Bax, Cyt-c and caspase-3 in neuroblastoma cells. In addition, pre- or post treatment of naringin with chemotherapy agent caused different apoptotic effects.In conclusion, naringin treatment before cisplatin and after doxorubicin caused more apoptosis in neuroblastoma cells. Furthermore pretreatment of naringin showed protective effect against cisplatin toxicity in astrocyte cell lines.

Amaç: Nöroblastom çocukluk çağı kanserleri arasında lösemiler ve beyin tümörlerinden sonra görülen en sık 3. kanser türü olup, en sık görülen ekstrakraniyal solid tümördür. Nöroblastom çocukluk çağındaki tüm kanser mortalitesinin %15'inden sorumlu olduğu bilinmektedir. Çocukluk çağının önemli sağlık problemlerinin başında gelen bu hastalığın tedavisi için ülkemizde Ekim 2002 tarihinden itibaren Türk Pediatrik Onkoloji Grubu Nöroblastom 2003 protokolü (TPOG-2003) uygulanmaya başlanmış, 2009 yılında yapılan revizyonlar ile TPOG-2009 protokolü kullanılmıştır. Bu çalışmanın amacı, 2000-2015 yılları arasında Ondokuz Mayıs Üniversitesi Pediatrik Onkoloji Bilim Dalı'nda izlenen nöral krest kökenli olguların önemli özellikleri yönünden retrospektif değerlendirilmesi, TPOG NB-2003 ve TPOG NB-2009 kemoterapi protokollerinin karşılaştırılması ve çizilecek yeni tedavi protokollerine yardımcı olunması olarak belirlenmiştir. Materyal ve Metod: Bu çalışmada Ağustos 2000 ile Aralık 2015 tarihleri arasında Ondokuz Mayıs Üniversitesi Pediatrik Onkoloji Bölümünde tanı konularak tedavi ve takipleri gerçekleştirilmiş olan nöroblastom, ganglionöroblastom ve ganglionörom tanılı 76 hastanın genel demografik ve klinik özellikleri retrospektif olarak değerlendirilmiştir. Bulgular: Hasta grubunda cinsiyet dağılımının benzer olduğu ve ortalama tanı yaşının 38 ay olduğu belirlenmiştir. En sık başvurular Samsun ve Ordu illerinden gelmiştir. Başvuru anındaki başlıca yakınmalar karın ağrısı ve karın şişliği, ateş ve yürüme bozukluğudur; en sık şikâyet bölgeleri karın ve torakstır. Primer tanı yöntemleri olarak MR ve BT tercih edilmiş, MIBG ile %36 ve PET ile %77 oranında metastatik hastalık belirlenmiştir. Hastaların %46'sında evre 4 hastalık olduğu, en sık tümör lokalizasyonunun ise abdomen olduğu tespit edilmiştir. Hastaların %90'ında NSE, %74'ünde LDH, %33'ünde ferritin, %50'sinde VMA ve %61'inde HVA yüksekliği tespit edilmiştir. Hasta grubunun %29'unda MYCN pozitifliği belirlenmiş, %86'sında sitogenetik anomali tespit edilmiştir. Hastaların %55'inde metastatik hastalık mevcut olup bunların %32'sinde kemik metastazı, %42'sinde lenf nodu metastazı, %26'sında kemik iliği metastazı, %20'sinde organ metastazı, %18'inde ise SSS metastazı görülmüştür. Hastaların %22'sinde nüks gelişmiş, en sık nüks alanının sürrenal, karaciğer ve toraks olduğu belirlenmiştir. Primer cerrahi uygulanan hastaların %76'sında total, %21'inde subtotal eksizyon yapılmıştır. TPOG 2003 protokolüne göre 15, 2009 protokolüne göre 33 hasta kemoterapi almış, 2003 protokolü uygulanan hastaların %60'ına ve 2009 protokolü uygulanan hastaların %58'ine radyoterapi verilmiş, 2009 protokolü alan hastaların %30'una ise kök hücre nakli yapılmıştır. Hastaların %61'inde tedavi sürecinde komplikasyon gelişmiş, akut komplikasyonlardan en sık dermatit ve KCFT yüksekliği, subakut komplikasyonlardan en sık KCFT yüksekliği ve kronik komplikasyonlardan en sık tübülopati izlenmiştir. Hastalardan %71'i remisyona girmiş, bunlardan %54'ünde tam remisyon, %17'sinde çok iyi kısmi yanıt gelişmiştir. 2009 protokolü uygulanan hastalardaki tam yanıt oranları 2003 protokolü alanların iki katıdır. Hastalarda genel mortalite oranı %34'tür. Genel sağkalım değerlendirmelerinde 2009 protokolü uygulanan hastalarda tanı yaşı 18 ay altında olanların sağkalımları anlamlı derecede iyidir, 2003 protokolü verilen hastalarda kızların sağkalımları anlamlı derecede iyidir, diğer demografik, klinik ve prognostik faktörlerin genel sağkalımları anlamlı derecede etkilemediği görülmüştür. Olaysız sağkalım değerlendirmelerinde Demografik, klinik ve prognostik faktörlerin olaysız sağkalımları anlamlı derecede etkilemediği görülmüştür. Sonuç: Çalışmamız nöroblastomda 2003 ve 2009 tedavi protokollerinin karşılaştırmalı olarak değerlendirildiği lokal bir çalışmadır. Elde ettiğimiz bulguların daha geniş örneklem büyüklüğü olan ve daha uzun takip süreli çalışmalarla konfirme edilmesi gerekir. Çalışmamızın mevcut bulguları ile ülkemizde nöroblastom konusunda yapılacak araştırmalara kıymetli bir veri kaynağı olacağını düşünmekteyiz. Aim: Neuroblastoma is the 3rd most common cancer type following leukemia and brain tumors, and it is the most frequent extracranial solid tumor among children. Neuroblastoma is responsible for 15% of cancer mortality among children. Turkish Pediatric Oncology Group's Neuroblastoma 2003 protocol (TPOG-2003) was used for the treatment of these children after October 2002, and this was revised in 2009 (TPOG- 2009). The aim of this study is to compare the treatment results of TPOG-2003 and TPOG-2009 in children with tumor of neural crest origin. Material and Method: This study retrospectively evaluated the demographic and clinical data of 76 patients that diagnosed, treated, and followed-up between August 2000 and December 2015 at the Department of Pediatrics, Oncology Division of Ondokuz Mayis University. Results: Sex distribution was similar, and mean age at diagnosis was 38 months. Patients were most frequently referred from Samsun and Ordu provinces. Major complaints at admission were abdominal pain, bloating, fever, and gait disorders. Most frequent sites of complaints were abdomen and thorax. Primary diagnostic methods were MRI and CT, and metastatic disease was found in 36% of MIBG and 77% of PET scans. 46% of patients had stage-IV disease, and most frequent sites of tumor localization were abdomen. 90% of patients had elevated NSE levels, 74% had elevated LDH levels, 33% had elevated ferritin levels, 50% had elevated VMA levels, and 61% had elevated HVA levels. 29% of patients had MYCN positivity, 86% had cytogenetic abnormalities. 55% had metastatic disease, and bone, lymph node, bone marrow, organ, and CNS metastases were determined in 32%, 42%, 26%, 20%, and 18% of these patients, respectively. 22% of patients had recurrent disease, and most frequent sites of recurrence were adrenal, liver and thoracic regions. Total excision was performed in 76%, and subtotal excision was performed in 21% of patients. 15 patients took TPOG-2003 protocol, and 33 patients took TPOG-2009 protocol, and radiotherapy was performed in 60% and 58% of these protocols, respectively. 30% of patients that took TPOG-2009 protocol had also stem cell transplantation. 61% of study population had complications. Most frequent acute complications were dermatitis and liver enzyme elevations, most frequent subacute complications were liver enzyme elevations, and most frequent chronic complications were tubulopathies. 71% of patients had remission (54% complete remission, 17% very good partial response). Complete remission rates were two-fold higher in TPOG-2009. Overall mortality rate was 34%. Overall survival was significantly higher in patients under 18 months in TPOG-2009 group, and girls had better overall survival in TPOG- 2003 group. Remaining demographic, clinical and prognostic factors have not affected survival significantly. Event-free survival was not affected from demographic, clinical, and prognostic factors. Conclusion: This is a local study that compared TPOG-2003 and TPOG-2009 protocols. Nevertheless, these results should be confirmed with larger scaled studies with longer follow-up periods. Our results will contribute to the future research on this subject. 149

In this study, SH-SY5Y human neuroblastoma cells treated with low doses of Bisphenol A (BPA). Bisphenol A is a commonly used endocrine disruptor. The cytotoxicity of BPA to SH-SY5Y cells was determined by MTT and LDH assays, and NO levels were determined by the Griess method. The acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) gene expression levels of the cells were determined by RT-PCR and enzyme activities by the Ellman method. % Populations of cells were determined by Tali cytometer and TNFα and caspase-8 levels were measured with Elisa kits. It was determined that % viability of cells gave a non-monotonic dose response and a correlation between cytotoxicity results and NO levels. The IC50 values for AChE and BuChE enzymes were found to be 2.2 mM and 1.98 mM, respectively. The AChE gene expression level with 1 pM and 1 nM BPA at 48 hours was changed to 0.61 and 1.03 respectively and BuChE gene expression level was changed to 2.18 and 0.73 in comparison with the control. 1 pM BPA and 1 nM BPA decreased TNF-α levels to 0.073 and 0.084 respectively, at 48 hours. At 24 hours, it was determined that only 1 pM BPA treatment decreased TNF-α levels to 0.302. Caspase-8 levels were increased to 168.4%, 297.3% and 287%, 160.2% at 24 and 48 hours with 1 pM and 1 nM BPA, respectively. The apoptotic % cell population with 1 pM BPA and 1 nM BPA increased sequentially at 6 hours (7.3%, 7.7%) and decreased at 48 hours (1.3%, 1%) while the necrotic cell population decreased in 4. and 6. hours (20.3%, 18.3% -19.3%, 21.3%) and increased in 48 hours (23.7%, 27%). The results of this study demonstrate that cell switches from apoptosis to a necroptosis, a programmed death, at 48 hours by applying 1 pM and 1 nM BPA to SH-SY5Y cells. İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xii ŞEKİLLER DİZİNİ xv TABLOLAR DİZİNİ xvii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 9 2.1 SH-SY5Y Nöroblastoma Hücre Hattı 9 2.2 Bisfenol A (BPA) 9 2.3 Östrojen 15 2.3.1 Östrojen Reseptörleri 16 2.3.2 BPA’nın Östrojen Reseptörü Üzerine Etkileri 16 2.3.3 BPA’nın Östrojenin Beyindeki Rolüne olan Etkileri 18 2.4 Nitrik Oksit Sentaz (NOS) 20 2.5 Kolinesterazlar ve Kolinerjik Sistem 22 2.5.1 Kolinesteraz Enzimlerinin Moleküler Formları 24 2.5.2 Kolinesteraz Enzimlerinin Aktif Merkez Yapısı 26 2.5.3 Kolinerjik Antiinflamatuar Yolak 27 2.6 Apoptoz 29 2.7 Nekroptoz 32 2.8 Nekroz 34 3. GEREÇLER VE YÖNTEMLER 36 3.1 Gereçler 36 3.1.1 Hücreler 36 3.1.2 Kimyasal Maddeler ve Kitler 36 3.1.3 Cihazlar 37 3.2 Yöntemler 38 3.2.1 Hücre Kültürü 38 3.2.2 Thoma Lamı ile Hücre Sayımı 39 3.2.3 MTT Sitotoksisite Deneyi 39 3.2.4 Nitrik Oksit (NO) Düzeyinin Griess Yöntemiyle Ölçülmesi 40 3.2.5 Laktat Dehidrogenaz (LDH) Deneyi 41 3.2.6 SH-SY5Y Hücrelerinin Plakalara Ekilmesi 42 3.2.7 SH-SY5Y Hücrelerinden RNA Eldesi ile RNA’ların Miktar ve Saflık Tayini 42 3.2.8 RNA için Denatüre Edici Agaroz Jelin Hazırlanması ve RNA’ların Jel Görüntüsünün Eldesi 43 3.2.9 SH-SY5Y RNA’larından cDNA Eldesi 43 3.2.10 Kantitatif Eş Zamanlı PCR Yöntemi ile Gen Ekspresyon Düzeylerinin Belirlenmesi 44 3.2.11 Gen Ekspresyon Düzeylerinin Belirlenmesi Amacıyla Tasarlanan Primerlerin Dizileri 45 3.2.12 BPA’nın AChE ve BuChE Enzim Aktivitesine Etkisi 45 3.2.13 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin Spesifik AChE Aktivitelerinin Belirlenmesi 46 3.2.14 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin TNF-α Düzeylerinin Belirlenmesi 48 3.2.15 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin Kaspaz-8 Düzeylerinin Belirlenmesi 48 3.2.16 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin Tali Görüntülü Hücre Sitometresi ile Değerlendirilmesi 49 3.2.17 İstatiksel Değerlendirme 50 4. BULGULAR 51 4.1 SH-SY5Y Hücrelerinin Işık Mikroskobuyla Elde Edilen Görüntüsü 51 4.2 BPA’nın SH-SY5Y Hücrelerinde Sitotoksik Etkisi 51 4.2.1 Mtt Sitotoksisite Deneyi 51 4.3 SH-SY5Y Hücrelerinde nNOS Gen Ekspresyon Düzeyi Sonuçları 53 4.4 Nitrik Oksit (NO) Düzeyinin Griess Yöntemiyle Ölçüm Sonuçları 54 4.5 Laktat Dehidrogenaz (LDH) Deneyi 58 4.6 SH-SY5Y Hücrelerinden Elde Edilen RNA Örnekleri ile İlgili Sonuçlar 59 4.7 SH-SY5Y Hücrelerinden Elde Edilen RNA Örneklerinin Jel Görüntüleri 60 4.8 SH-SY5Y Hücrelerinden Saflaştırılan RNA’lardan Oluşturulmuş cDNA’lerin Miktar ve Saflık Tayini 61 4.9 SH-SY5Y Hücrelerinde AChE ve BuChE Genlerinin Ekspresyon Düzeyi Sonuçları 61 4.1 BPA’nın AChE ve BuChE Enzimleri için IC50 Değerlerinin Belirlenmesi 63 4.2 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin Spesifik AChE Aktivitelerinin Belirlenmesi 64 4.2.1 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücre Örneklerindeki Protein Miktarının belirlenmesi 64 4.2.2 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücre Örneklerindeki Spesifik AChE Aktivitelerinin Belirlenmesi 65 4.3 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin TALİ Görüntülü Hücre Sitometresi ile Değerlendirilmesi 67 4.4 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin TNF-α Düzeyleri 71 4.5 BPA Uygulanan SH-SY5Y Hücrelerinin Kaspaz-8 Düzeyleri 72 5. TARTIŞMA 75 6. ÖNERİLER 81 KAYNAKLAR 82 ÖZGEÇMİŞ 93 Bu tez çalışmasında SH-SY5Y hücrelerine düşük dozlarda Bisfenol A (BPA) uygulanmıştır. BPA endüstride sıklıkla kullanılan bir endokrin bozucu maddedir. BPA’nın SH-SY5Y hücrelerin olan sitotoksisitesi MTT ve LDH deneyleriyle, NO düzeyleri Griess yöntemiyle belirlenmiştir. Hücrelerin asetilkolinesteraz (AChE) ve butirilkolinesteraz (BuChE) gen ekspresyon düzeyleri RT-PCR, enzim aktiviteleri Ellman yöntemiyle belirlenmiştir. Hücrelerin % popülasyonları Tali sitometresi ile TNFα ve kaspaz-8 düzeyleri Elisa kitlerle ölçülmüştür. Hücrelerin % canlılık değerinin monotik olmayan doz cevabı verdiği ve sitotoksisite sonuçları ile NO düzeyleri arasında bir korelasyon olduğu tespit edilmiştir. BPA’nın AChE ve BuChE enzimleri için IC50 değeri sırayla 2,2 mM ve 1,98 mM bulunmuştur. 48 saatte 1 pM ve 1 nM BPA, AChE gen ekspresyon düzeyini kontrole göre sırasıyla 0,61 ile 1,03’e; ve BuChE gen ekspresyon düzeyini sırayla 2.18 ve 0,73’e değiştirdiği gözlenmiştir. Spesifik AChE aktivitesinin; 1 pM BPA uygulamasıyla 2. ve 12. saatte arttığı, 4. saat sonunda ise azaldığı görülmüştür. 1 nM BPA uygulamasıyla 4 saatte spesifik AChE enzim aktivitesi artmıştır. 1 pM BPA ve 1 nM BPA uygulamasının 48. saatte TNF-α düzeyini sırasıyla 0,073’e ve 0,084’e azalttığı görülmüştür. 24. saatte ise sadece 1 pM BPA’nın 0,302’e azalttığı belirlenmiştir. Kaspaz-8 düzeyi 24. saatte 1 pM ve 1 nM BPA ile sırasıyla % 154,7 ve % 287’lik; 48. saatte ise % 297,3 ve %160,2’lik artış göstermiştir. 1 pM BPA ve 1 nM BPA ile apoptotik % hücre popülasyonu sırayla 6. saatte (%7,3, %7,7) artıp 48. saatte (%1,3, %1) azalırken nekrotik % hücre popülasyonu ise 4. ve 6. saatte (%20,3; %18,3-%19,3; %21,3) azalıp 48. saatte ise (%23,7, %27) artmıştır. Bu tez çalışmanın sonuçları SH-SY5Y hücrelerine 1 pM ve 1 nM BPA uygulanmasıyla 48 saatte hücrenin apoptozdan yine programlı bir ölüm şekli olan nekroptoza doğru yöneldiğini ortaya koymaktadır.

P2 Pürinerjik reseptörler birçok hücre tipinde var olan ve gelişim, farklılaşma ve ölüm gibi hücresel olaylarda önemli rolleri olan reseptörlerdir. Pürinerjik reseptörler ATP, UTP, GTP ve adenozin gibi nükleotid temelli moleküllerle aktiflenmektedir Pürinerjik reseptörlerin dahil olduğu hücresel iletim şekline pürinerjik sinyalizayon denilmektedir. Bu sinyalizasyon türü normal fizyolojik koşullarda ve hücresel dejenerasyon koşullarında hücre-hücre iletişiminde hücrelerin hem sağ kalımını düzenlemekte hem de onları toksik koşullara karşı korumaktadır. Pürinerjik reseptörler santral ve çevresel sinir sisteminde de yaygın olarak bulunmakta ve nöronal ve glial hücrelerin temel fizyolojik fonksiyonlarında görev almaktadır. Pürinerjik reseptörlerin nöron ve glia üzerine etkileri arasında nörotransmisyon, nöromodülasyon, salgı, kemoatraktan, akut inflamasyon ve nosisepsiyon sayılabilir. Pürinerjik reseptörlerin nöronlar üzerinde bir çok fonksiyonu tanımlanmış olmasına rağmen hücresel sağkalım ve beyin yaşlanma sürecindeki değişiklikleri iyi bilinmemektedir. Hücresel sağ kalıma ilişkin çalışmalar bize P2X ve P2Y reseptörlerinin sinir sistemi hücrelerini apoptozdan koruduğunu söylemektedir. Yapılan bu çalışmada P2 pürinerjik reseptörlerin SH-SY5Y hücre hattında suramin ve PPADS antagonistleri varlığında hücresel sağ kalımının zamana bağlı değişimini ve farklı yaşlardaki fare beyinlerinde reseptör ekspresyonlarının değişimini inceledik. Sonuç olarak literatürdeki bilgilerle uyumlu olarak, kullanılan antagonistlerin hücresel proliferasyonu 12. ve 24. saat içerisinde baskıladığı fakat sonraki 48 ve 72 saat içerisinde bu baskının ortadan kalktığı gösterilmiştir. qPCR ile yapılan ekspresyon çalışmalarının neticesinde ise purinerjik reseptör antagonisti varlığında P2Y1, P2Y2 ve P2Y4 reseptörlerinin ekspresyonlarının baskılandığı, P2Y6, P2Y12 ve P2X7 reseptörlerinin ise ekspresyon düzeylerinin arttığı ortaya konuldu. Farklı yaşlardaki fareler ile yapılan ekspresyon çalışmalarında ise P2Y2 ve P2X7 reseptörlerinin ekspresyonlarının yaşa bağlı olarak azaldığı gösterilmiştir. Sonuçlarımız pürinerjik reseptörlerin nöronal sağkalımda önemli rol oynadığını göstermektedir. Bu reseptörler yaşlanmayı önleyici ve nöron kökenli tümörlerin tedavisini sağlayıcı potansiyel tedaviler için temel hedef niteliği oluşturmaktadır. P2 purinergic receptors are crucially involved in proliferation, differentiation and death mechanisms of various cell types. Purinergic receptors are activated by nucleotide-based molecules such as ATP, UTP, GTP and adenosine. The cellular conduction pathway encompassing purinergic receptors is called as the purinergic signalization. This signalization type organizes cell-cell interactions and cell survival under both physological and pathological conditions and also protects cells against toxic conditions. Purinergic receptors participate in neurotransmission, neuromodulation, release of intracellular molecules, production of chemoattractants, acute inflammation and nociception in both neurons and glial cells. In neurons, the roles of purinergic receptors in cell survival, proliferation and cerebral aging processes are not well known. The cell survival studies have shown that P2X and P2Y receptors protect nervous system cells against apoptosis. In this study, we have investigated the role of P2 receptors in time dependent alteration of cell survival in the presence of antagonists suramin and PPADS using the SH-SY5Y cell line and also P2 receptor expression changes in the brains of aging mice. In line with the reports in the literature, P2 receptor antagonists suppressed neuroblastoma cell proliferation within the first 12 and 24 hours. whereas this suppression disappeared on 48th and 72nd hours. Expression studies conducted with qPCR, showed downregulation of P2Y1, P2Y2 and P2Y4 receptors and upregulation of P2Y6, P2Y12 and P2X7 receptors in the presence of purinergic receptor antagonists. Expression studies performed with the aging mouse brain showed an age-dependent decrease of P2Y2 and P2X7 receptors. Our results suggest that purinergic receptors are critically involved in neuronal survival. These receptors might constitute targets in potential treatment methods aiming prevention of aging and amelioration of neuron-derived tumors. 78

Bu projenin amacı, Rasetam grubu içerisinde yer alan 2 antiepileptik ilaç levetirasetam ve nefirasetamın fare nöroblastoma hattı (NB2a) kanser hücre dizininde olası nörotoksik veya nöroprotektif etkilerinin araştırılmasıdır.Son yıllarda yaşlı bireylerin sayısının giderek artmasıyla birlikte nörodejeneratif hastalıklarda da bir artış söz konusudur. Bu hastalıkların tedavisi genellikle semptomatiktir. Ancak hastalığın progresyonu devam eder. Bu nedenle yeni ilaçlara ihtiyaç duyulmaktadır. Rasetam grubu içerisinde yer alan; levetirasetam ve nefirasetam bu amaçla kulanılabilecek yeni ilaçlardan olabilir. Levetirasetam ve nefirasetam bazı çalışmalarda nöroprotektif bazılarında ise az da olsa nörotoksik etkisi olabileceği bildirilmektedir. Çalışmamızda ilk olarak bu ilaçların nörotoksik etkileri olup olmadığı fare kaynaklı Nöroblastoma (NB2a) dizin hücrelerinde araştırıldı. Bu amaçla ilaçların toksik etkileri Nörotoksisite Tarama Testi (NTT) ile, apopitotik etkileri TUNEL yöntemi ile ve hücre canlılık testi MTT yöntemi ile incelendi. NTT testinde ılımlı nörotoksik etkileri saptanmadı. Nörotoksik etkili klorprifos ile NB2a hücreleri kültür ortamında nörotoksisite oluşturularak levetirasetam ve nefirasetamın nöroprotektif etkileri yüksek konsantrasyonlarda gözlemlendi.Bu koruyucu etki sıkça görmeye başladığımız organafosfat toksisitesine maruz kalmış veya benzeri nörodejeneratif problemler yaşayan kişilerin sağlıklarına kavuşabilme olanağı sağlayabilecektir. Böylece nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde önemli bir halk sağlığı sorunu ortadan kaldırılabilecektir. The aim of this project is to investigate possible neurotoxic or neuroprotective effects of two antiepileptic drugs levetiracetam and nefiracetam, members of racetam group, on mouse neuroblastoma cancer cell lines (NB2a). Physicians diagnose neurodegenerative diseases more often in recent years, mainly due to the increase in the number of elderly people. Treatments of these diseases are usually symptomatic and diseases usually progress. Therefore, new medications are required. Among the rasetam group, levetiracetam and nefiracetam are newly-developed drugs that can be used for this purpose. Levetiracetam and nefiracetam have been reported to be neuroprotective by some researchers while others argued that they may have slight neurotoxic effects. In the present study, we examined whether these drugs have neurotoxic effects using neuroblastoma cell line of mouse origin (NB2a). For this aim, the toxic effects and apoptotic effects of the drugs have been tested by Neurotoxicity Screening Test (NST) and TUNEL method and MTT cell viability test, respectively. There were no moderate neurotoxic effects on NTT test. İn NB2a cell culture neurotoxicity was induced by chlorpyrifos which has neurotoxic properties and neuroprotective effects of levetiracetam and nefiracetam was observed at high concentrations. This protective effect may provide help patients with neurodegenerative problems or those who are exposed to organophosphate toxicity. By this way neurodegenerative diseases, which is a significant health issue can be eliminated. 113

Nöroblastom sempatik sinir sisteminin nöral krestinden köken alan, en sık görülen pediatrik nöroendokrin tümörüdür. Nöroblastik tümörler, farklı tedavi sonuçlarına neden olan, ekstrem heterojenite göstermektedir. Nöroblastom, düşük, orta ve yüksek olmak üzere üç ana risk sınıfı ile kategorize edilmektedir. Hastaların risk kategorisinin belirlenmesinde, moleküler değerlendirmeler giderek önem kazanmıştır. Son zamanlarda nöroblastom tedavi protokolünü etkileyebilecek farklı genlerin literatüre girmesi ile risk sınıflandırmalarının da alt gruplara ayrılıp ayrılamayacağı gündeme gelmiştir. Bu çalışma ile, yüksek risk grubu içinde çok kötü prognoz gösteren hastalarda, bu hastaların 'ultra-yüksek risk' olarak ayrı bir alt-gruba ayrılmasında rol oyanayabilecek bazı genlerin ekspresyonları araştırılmıştır. Bu amaçla, TPOG (Türk Pediatrik Onkoloji Grubu) protokolü kapsamında gerçekleştirilen nöroblastom klinik ve moleküler analizlerin sonuçları değerlendirilerek, sırasıyla yirmi beş ve yirmi dokuz tane, düşük ve yüksek risk grubu hastası seçilmiş ve analiz edilmiştir. Seçilen hastalarda, ALK, ATRX, HIF1a, HIF2a (EPAS), H2AFX ve ETV5 genlerinin ekspresyonlarına bakılmıştır. Bu genlerin, MYCN amplifikasyonu, 1p delesyonu, 11q kaybı ve ALK dışındaki genlerin ise 17q kazancı ile ilişkili olmadığı bulunmuştur. ALK ekspresyonunun 17q kazancı pozitif hastalarda daha fazla olduğu görülmüştür (p=0.018). ETV5 dışında genlerin, yüksek risk grubunda anlamlı olarak arttığı görülmüştür. Ultra-yüksek risk ve yüksek risk grubu hastaları karşılaştırıldığında, ALK ekspresyonunun ultra-yüksek risk grubunda daha fazla (p=0.027), ATRX geninin ise yüksek risk grubu hastalarda daha az eksprese olduğu (p=0.01) bulunmuştur. Elde edilen verilere göre, ALK geninin yüksek risk grubu içerisinde `ultra-yüksek risk` alt grubunun ayrımında belirteç olabileceği düşünülmektedir. Neuroblastoma is the most common pediatric neuroendocrine tumor that arise from the neural crest of sympathetic nervous system. Neuroblastic tumors exhibit extreme heterogeneity, which results in different therapy outcomes. Neuroblastoma is mainly categorized into three risk groups as low, intemediate and high. Molecular evaluation has come into prominence for determination of the risk categories. Recently, identification of new genes that may affect the therapy outcome, raised the possibility of the presence of sub-risk groups. With this study, we aimed to assess the expression of some genes that may play role in identification of `ultra-high risk` group of patients. We analyzed, twenty-five and twenty-nine, low- and high- risk group of patients, respectively, who were chosen according to molecular and clinical data of routine Turkish Society of Pediatric Oncology (TPOG) 2009-protocol. Expression of ALK, ATRX, HIF1a, HIF2a (EPAS), H2AFX and ETV5 genes were evaluated among these patients. No significant relation was found between these genes and status of MYCN amplification, 1p loss, 11q deletion and 17q gain, except ALK, which is found to be highly expressed in patients with 17q gain(p=0.018). All genes found to be highly expressed in high-risk group compared to low-risk group, except ETV5. When `ultra-high-risk` and high-risk groups were compared, ALK found to be highly expressed in `ultra-high- risk` group(p=0.027) significantly, while ATRX found to be highly expressed in high-risk group(p=0.01). Our results show that, ALK can be a candidate gene that may be used to distinguish the `ultra-high risk` subgroup among high risk group of patients. 83

Nöronal hücrelerde Ca+2 iyonlarının hücre içerisine fizyolojik sınırların üzerinde girmesi ve buna bağlı olarak hücre içi oksidatif stres seviyesinin yükselmesi nöronal hasar oluşumunu tetikleyen başlıca faktörlerden biridir. Oksidatif stres aracılı TRPM2 katyon kanallarının aktivasyonu, nöronal hücre ölümüyle ilişkilidir. Curcumin, hücre içi reaktif oksijen türlerini güçlü bir şekilde ortadan kaldırma potansiyeline sahip bir antioksidan molekül olarak değerlendirildiğinden nörolojik hastalıkların tedavisinde etkili bir rolü olabileceği düşünülmüştür. Curcuminin, oksidatif stresle indüklenen nöronal hasara etkilerini daha iyi karakterize etmek için TRPM2 kanal akımları ile oksidatif stres ve apoptoz üzerine olan etkisi SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinde araştırılmıştır. Hücreler deneyler için toplamda dört gruba ayrıldı. Birinci grup kontrol grubu olarak kullanıldı. İkinci grup curcumin uygulanan gruptu. Üçüncü ve dördüncü gruplar TRPM2 pc DNA'sı ile transfekte edildi ve dördüncü grup transfeksiyondan sonra curcumin ile inkübe edildi. Tüm gruplardan Patch-Clamp ve Kalsiyum Sinyali kayıtları alındı. TRPM2 katyon kanal akımları ile hücresel oksidatif stres parametreleri arasındaki ilişkiyi araştırmak üzere; apoptosis, kaspaz 3 ve 9, hücre içi ROT üretimi, mitokondriyal membran depolarizasyonu analizleri yapıldı. PARP ve apoptosis yolaklarındaki iki öncül enzim olan prokaspaz 3 ve 9 ekspresyon seviyeleri ise Western Blot ile tayin edildi. Analizler sonucunda curcuminin hücre içi serbest kalsiyum konsantrasyonunu ve TRPM2 kanal akım yoğunluklarını, apoptosis, kaspaz 9 ve kaspaz 3, mitokondriyal membran depolarizasyonu, hücre içi ROT üretimini düzenlediği gözlemlendi. 5 µM curcumin inkübasyonunun; PARP, prokaspaz 3 ve prokaspaz 9 enzim ekspresyonlarını azalttığı diğer analizlere ek olarak gösterildi. Sonuç olarak, curcumin uygulamasının TRPM2 katyon kanal akımlarını güçlü bir şekilde inhibe ettiği gösterildi. Bu çalışma, nöronal hücreye oksidatif stresle başlatılan TRPM2 kanalları aracılı katyon akışı ve Ca+2 girişinde curcuminin düzenleyici rolü olabileceğini gösteren yeni bir bildirimdir. Nöronal hücre ölümü ve TRPM2 kanal aktivitesinin curcumin uygulaması ile düzenlenmesi, Ca+2 girişi ve apoptozise karşı potansiyel nöroprotektif etkisi olabileceği sonucuna varılmıştır. Neuronal injury can arise from overload of oxidative stress-induced calcium ion (Ca2+) entry and oxidative stress. Activation of TRPM2 during oxidative stress have been linked to neuronal cell death. Curcumin has been considered as a potent antioxidant that detoxifies a variety of reactive oxygen species (ROS) in neurological diseases. In order to characterize the actions of curcumin better in oxidative stress-induced neuronal injury through modulation of TRPM2 channel currents, we tested the effects of curcumin on apoptosis and oxidative stress in the oxidative stress-induced SH-SY5Y neuroblastoma cell line. SH-SY5Y neuroblastoma cells were divided into four groups for the experiments. The first group was used as control. The second group was used as the curcumin administrated group. The third and fourth groups were transfected with TRPM2 pcDNA, and the last group incubated with curcumin after transfection. Whole-cell Patch-Clamp and calcium signaling recordings were acquired from SH-SY5Y neuroblastoma cells in all groups. Moreover, apoptosis, caspase 3 and caspase 9, ROS production, mitochondrial membrane depolarization analyses were performed to investigate the relationship between cellular oxidative stress and TRPM2 cation channel currents. PARP and two precursor enzymes of apoptotic pathway, procaspase 9 and procaspase 3 expression levels were determined by Western Blotting. We observed that modulator role of curcumin on intracellular free Ca2+ concentrations, current densities of TRPM2 channel, apoptosis, caspase 3 and caspase 9, mitochondrial membrane depolarization, intracellular ROS production levels in the SH-SY5Y neuroblastoma cells. In addition, it was proved that extracellular 5 µM curcumin administration can decrease procaspase 3 and 9 activities and PARP expression levels.In conclusion, in our study, TRPM2 channel currents can inhibited strongly by curcumin treatment. It is a novel report which shows the modulator role of curcumin on oxidative stress induced cationic currents and Ca2+ influx through TRPM2 channels. Neuronal cell death and modulation of TRPM2 channel activity by curcumin treatment has neuroprotective activity against apoptosis and Ca2+ entry. 88

Tarımsal üretimde, hasat sonrası depolamada önemli miktarlarda ürün kaybına neden olan, ürün kalitesini olumsuz yönde etkileyen bitki hastalıkları, zararlılar ve yabancı otlarla mücadelede en etkili yöntem olmaları, ekonomik şekilde üretilmeleri ve kullanımlarının kolay olması tarım ilaçlarının (pestisit) sıklıkla tercih edilmelerinin sebebidir. Ancak üreticilerin daha fazla ve kaliteli ürün elde edebilmek için gereğinden fazla pestisit tüketmeleri, bilinçsiz ve hatalı uygulamalar, gıda maddelerinde yüksek düzeyde pestisit kalıntılarına sebep olmaktadır. Yapılan araştırmalarda, pestisitlerin sinir sistemini etkileyici, endokrin sistemi bozucu kronik toksik etkileri yanı sıra mutajenik, teratojenik ve karsinojenik etkilerinin de söz konusu olabileceği rapor edilmiştir. Neonikotinoitler yeni grup insektisitler olup, çeşitli haşerelerin kontrolünde kullanılmaktadır. Neonikotinoitler sistemik özellikte olup, genellikle böceklerin santral sinir sistemini etkiler, paralize ve ölüme sebep olur. Neonikotinoitler tohumların korunmasında kullanıldığında çevrede kalıcı olabilir ve bitkilerin nektar ve polenlerinde kalıntı olarak yerleşebilir. Bu özellikleri arılar ve diğer polen taşıyıcılar için bir risk oluşturabilir ve böylelikle çevre sağlığına zararlı etkileri bulunabilir. Yüksek Lisans Tez çalışmasında sıklıkla kullanılan neonikotinoit grubu insektisitlerden asetamiprid, klotianidin, imidakloprid, thiakloprid, tiyametoksam'ın insan hepatoselüler karsinoma (HepG2) ve nörblastoma (SH-SY5Y ) hücre dizileri üzerine 24 ve 48 saat maruziyetleri sonucu MTT ve NRU testi kullanılarak sitotoksik etki potansiyelleri değerlendirildi. SH-SY5Y hücrelerinde 24 ve 48 saat maruziyet sonucu neonikotinoitlerin IC50 değerleri 0,65 - > 4 mM olarak belirlenirken, HepG2 hücrelerinde ise IC50 değerleri 0,40 - > 4 mM olarak belirlendi. Neonikotinoitlerin SH-SY5Y hücrelerine kıyasla HepG2 hücreleri üzerine sitotoksik etkisinin daha fazla olduğu gözlendi. Tez çalışmasından elde edilen sonuçların, sitotoksik etkiye sahip oldukları tespit edilen neonikotinoit grubu insektisitlerin insan ve çevre sağlığı üzerine toksik etkileri ile ilgili araştırmaların çoğaltılması ve kullanımları konusunda gerekli tedbirlerin alınması hususlarına dikkat çekeceğine inanılmaktadır.Anahtar Kelimeler: Neonikotinoitler, HepG2 hücreleri, SH-SY5Y hücreleri MTT testi, Nötral kırmızısı testi Due to low cost and easy to apply, the use of pesticides have been preferred in combating with plant diseases, pests and weeds which cause loss of significant amounts of the product or product quality at postharvest storage and agricultural production times. Because of unconscious, incorrect applications of pesticides by manufacturers at harvest, close to harvest period, consumption of pesticides more than need to get more and high quality products, high levels of drug residues are found on foodstuffs. Recent studies show that besides chronic toxic effects such as affecting nervous system, disrupting endocrine system, there are mutagenic, teratogenic and carcinogenic effects have been reported. Neonicotinoids are relatively new type of insecticide, used in the last 20 years to control a variety of pests. Neonicotinoids are systemic and share a common mode of action that affect the central nervous system of insects, resulting in paralysis and death. Neonicotinoids can also be persistent in the environment, and when used as seed treatments, translocate to residues in pollen and nectar of treated plants. The potential for these residues to affect bees and other pollinators remain uncertain. Thus they can have harfmful effects on environmental health. The aim of this Master Thesis investigation of the possible cytotoxic effects of common neonicotinoid insecticides (acetamiprid, clothianidin, imidacloprid, thiacloprid, thiamethoxam) on hepatocellular carcinoma and neroblastoma cells by using MTT and NRU methods. It is shown that IC50 values of neonicotinoids in SH-SY5Y cells in the range of 0,65 - > 4 mM, while in HepG2 cells in the range of 0,40 - > 4 mM after 24 and 48 h exposure. HepG2 cells are more sensitive to cytotoxicity of neonicotinoids than SH-SY5Y cells. It is believed that these obtained results, will draw attention to expand researches on toxic effects of neonicotinoid insecticides which are identified as cytotoxic for human and environment health. And also to take necessary precautions for usage of these compounds.Key Words: Neonicotinoids, HepG2 cells, SH-SY5Y cells, MTT test, Nötral red uptake test 85