Search

Dentro del proceso agrícola se usan diferentes tipos de cuerpos de agua, por esto el conocimiento de la productividad del cultivo debe incluir el entendimiento del flujo del material microbiológico presente en las fuentes de agua usadas. La última aproximación metodológica pretende la identificación de comunidades bacterianas mediante el análisis de secuencias de ADN reveladas en muestras ambientales. Debido a la alta contaminación que pueden tener las muestras ambientales es importante llevar a cabo un proceso de extracción de ADN óptimo que permita realizar un posterior análisis molecular por métodos basados en PCR. Por esta razón, el objetivo del presente artículo es describir un protocolo químico de extracción de ADN bacteriano para cuerpos de agua usados en la actividad agrícola local, que sea sencillo, eficiente y rápido de aplicar, para obtener ADN de calidad. A partir de muestras de agua obtenidas del lago de Tota (Boyacá, Colombia), se extrajo ADN bacteriano mediante un protocolo químico modificado y comparado con un método estándar comercial. Como resultado se obtuvo ADN bacteriano con una concentración superior a 140 ng/ul y una pureza >1,7 A260/280, resultados similares a los obtenidos con el método estándar comercial con una concentración máxima de 45,94 ng/ul y una pureza superior a 1,8 A260/280. Los resultados sugieren que este protocolo de extracción de ADN es un método rápido y de bajo costo con el cual se obtiene ADN de elevada calidad y pureza que puede ser utilizado en cualquier análisis molecular.

Los estudios sobre salud pública y biodiversidad de mamíferos silvestres incluyen un componente genético. Para las muestras de sangre, se debe tener condiciones óptimas de colección, ya que pueden afectar la preservación y la extracción del ADN. Este estudio evaluó el uso de métodos de preservación de ADN líquido y seco y métodos de extracción de ADN comerciales y no comerciales, en muestras de sangre, recolectadas en campo. Para ello, se recogieron 264 muestras de sangre totales de mamíferos salvajes. Se preservó un primer grupo de muestras en clorhidrato de guanidina (GuHCl) y se extrajo el ADN, utilizando seis kits comerciales: Bioline, Norgen, Invitrogen, Promega y Qiagen, además de dos protocolos no comerciales: fenol-cloroformo isoamil alcohol (PC) y guanidina tiocianato (GIT). Otro grupo de muestras, se preservó en tarjetas Whatman® FTA® y se extrajo el ADN, con PC y GIT. Las extracciones con GIT y PC mostraron los valores y variaciones más altas en la concentración de ADN (ng/µL), mientras que el kit comercial mostró una baja variación. La preservación de la muestra en tarjetas Whatman® FTA® proporcionó una baja variación y cantidad de ADN extraído, en comparación con el uso de GuHCl. En cuanto a la calidad del ADN, los kits comerciales produjeron una mayor pureza (A260/280), mientras que los protocolos basados en GIT y PC proporcionaron resultados muy variables. Además, el uso de GIT y PC originó una mayor cantidad de ADN, pero de calidad variable. En general, la extracción basada en kits comerciales y la conservación Whatman® FTA® permitió obtener calidades y cantidades de ADN más estandarizadas. Studies on public health and wild mammal biodiversity include a genetic component. For blood samples, there must be optimal sample collection conditions since these can affect DNA preservation and extraction. This study evaluated the use of liquid and dry DNA preservation methods and commercial and non-commercial DNA extraction methods on field-collected blood samples. For this, 264 total blood samples were collected from wild mammals. A first group of samples was preserved in guanidine hydrochloride (GuHCl) and DNA was extracted using six commercial kits: Bioline, Norgen, Invitrogen, Promega, and Qiagen, in addition to phenol-chloroform isoamyl alcohol (PC) and guanidine thiocyanate (GIT). Another group of samples was preserved in Whatman® FTA® cards and DNA was extracted with PC and GIT. The extractions with GIT and PC showed the highest values (ng/µL) and variation in DNA concentration, while the commercial kit showed low variation. Sample preservation in Whatman® FTA® cards provided low variation and quantity of the extracted DNA compared with the use of GuHCl. Concerning DNA quality, the commercial kits yielded higher purity, while GIT and PC-based protocols provided highly variable results. Furthermore, the use of GIT and PC yielded a higher amount of DNA, yet, of variable quality. Overall, extraction based on commercial kits and Whatman® FTA® preservation allowed obtaining more standardized DNA qualities and quantities Incluye referencias bibliográficas

The purpose of this study was to select for the extraction of DNA from Leptospira spp from urine samples for the diagnosis of bovine leptospirosis by PCR. Three methods of DNA extraction methods were used: Ethanol-Sodium Hydroxide (EtNa), Chelex® 100 chelating resin and the PureLink® Genomic DNA Mini Kit commercial extraction case. The extracted DNA served for the standardization of three PCR protocols for the identification of the rrl, hap1 and rrs genes, respectively, in the AGROCALIDAD, Ecuador laboratory. A total of 72 bovine urine samples were collected from livestock farms in the province of Manabí, Ecuador. Ten positive samples were obtained by amplifying the rrl gene, which identifies the genus Leptospira. Of the genus-positive samples, eight amplified for the hap1 gene, which codes for the main outer membrane protein of pathogenic species. The agreement between the DNA extraction methods was evaluated with Chelex-100, and the PureLink® Genomic DNA Mini Kit, determining a agreement of 0.74 using the Kappa index., El presente estudio tuvo la finalidad de seleccionar un protocolo de extracción de ADN de Leptospira spp a partir de muestras de orina para el diagnóstico de leptospirosis bovina mediante PCR. Se utilizaron tres métodos de extracción de ADN: Etanol-Hidróxido de Sodio (EtNa), resina quelante Chelex® 100 y el estuche de extracción comercial PureLink® Genomic DNA Mini Kit. El ADN extraído sirvió para la estandarización de tres protocolos de PCR para la identificación de los genes rrl, hap1 y rrs, respectivamente en el laboratorio de AGROCALIDAD, Ecuador. Se colectaron 72 muestras de orina bovina procedentes de ganaderías de la provincia de Manabí, Ecuador. Se obtuvieron 10 muestras positivas mediante la amplificación del gen rrl, el cual identifica al género Leptospira. De las muestras positivas a género, ocho amplificaron para el gen hap1, el cual codifica para la principal proteína de membrana externa de especies patógenas. Se evaluó la concordancia entre los métodos de extracción de ADN con Chelex-100, y el estuche de extracción comercial PureLink® Genomic DNA Mini Kit, determinándose una concordancia de 0.74 mediante el índice Kappa. El presente estudio tuvo la finalidad de optimizar un protocolo de extracción de ADN de Leptospira spp. a partir de muestras de orina de bovinos procedentes de ganaderías de los cantones de Chone y Pedernales de la provincia de Manabí, Ecuador. El ADN extraído sirvió para la estandarización de 3 protocolos de PCR en AGROCALIDAD, para lo cual, se colectaron 72 muestras de orina bovina (n=72). Se identificaron 10 excretores renales (n=10) mediante la amplificación del gen rrl, el cual identifica al género Leptospira. De las muestras positivas a género, 8 (n=8) amplificaron para el gen hap1, el cual codifica para la principal proteína de membrana externa de especies patógenas. Se evaluó la concordancia entre los métodos de extracción de ADN con Chelex-100, y el estuche de extracción comercial PureLink® Genomic DNA; y se determinó la existencia de una concordancia de 0,74 mediante el índice Kappa.

La obtención ácido desoxirribonucleico (ADN) purificado es un punto clave para el desarrollo de técnicas moleculares que permiten caracterizar una especie en estudio. Las matrices vegetales constituyen una de las muestras de mayor complejidad debido a los compuestos químicos que la forman y que muchas veces difieren su concentración en dependencia de la variedad en estudio; este es el caso de muestras recalcitrantes de variedades de cacao (Theobroma cacao) y café (Coffea arabica) donde la pérdida de ADN puede incluso ocurrir en la maceración de las muestras por fenolización del material. En el presente estudio se evaluaron tres kits comerciales disponibles mediante los cuales se obtienen excelentes recobros para variedades no recalcitrantes, así como también modificaciones realizadas a los protocolos tradicionales de Doyle & Doyle (1987) y Doyle & Doyle (1990). Los resultados obtenidos confirmaron el efecto de la variedad y la especie sobre el método de extracción, y de igual manera, que los métodos modificados pueden presentar mayor recobro y pureza que los kits comerciales para algunas especies vegetales.

Banana Streak Virus (BSV), belonging to genus Badnavirus, causes great yield losses in banana. It is an infectious agent that spreads through the seeding of infected material and through mealybugs (Pseudococcidae). It is responsible for significant losses in profitability and a serious constraint in the genetic improvement of Musa sp. The absence of a highly sensitive and specific technique to identify the affected plants has enabled it to be disseminated in the plantations. Therefore, to achieve a correct identification of the plants affected by Badnavirus the following objective was proposed: Diagnose the presence of Badnavirus in the banana plantations of the province of El Oro. Total Nucleic Acid Extracts of banana were obtained with 2% CTAB with which a suitable template DNA was obtained for the analysis of the polymerase chain reaction. Using a pair of primers that flank a region of 221 bp that corresponds to the gene of the reverse transcriptase and RNase H of the ORF 3 of the badnaviruses. With the use of this methodology, it was possible to determine the existence of this virus in 89.36% of the plantations evaluated., El Virus del rayado del Banano (BSV) perteneciente al Género Badnavirus, causa grandes pérdidas en el rendimiento productivo de las bananeras, es un agente infeccioso que se disemina por medio de la siembra de material infectado y a través de las cochinillas Pseudococcidae, es responsable de importantes pérdidas en la rentabilidad y un grave inconveniente en el mejoramiento genético de Musa sp. La ausencia de una técnica altamente sensible y específica para identificar las plantas afectadas, ha posibilitado que el virus del rayado del banano esté diseminándose en las plantaciones. Por lo tanto, para lograr una correcta identificación de las plantas afectadas por el Virus del Rayado del Banano, se planteó el siguiente objetivo: Diagnosticar la presencia de Badnavirus en las plantaciones bananeras de la provincia de El Oro. Los extractos totales de ácidos nucleicos de banano fueron obtenidos con CTAB al 2% con el cual se obtiene un ADN molde apropiado para el análisis de Reacción en cadena de la Polimerasa. Utilizando un par de primers que flanquean una región de 221 pb que corresponde al gen de la transcriptasa inversa y RNasa H del ORF 3 de los badnavirus. Con el uso de esta metodología fue posible determinar la existencia de este virus en el 89.36 % de las plantaciones evaluadas, en la Provincia de El Oro.

La leptospirosis bovina es una importante enfermedad zoonótica cuyo diagnóstico molecular está ampliamentedivulgado. Sin embargo, no existe un método único de extracción de ADN para leptospiras patógenas a partir de muestras clínicas. Eneste trabajo se utilizó orina bovina contaminada con cultivo de Leptospira interrogans serovar Pomona Pomona para analizar el mejormétodo comparando: M1.) resina Chelex-100, M2.) papel FTA Whatman y M3.) hervido de la muestra (protocolo casero). De estas trestécnicas, la primera (M1) presentó la mayor sensibilidad al realizar la PCR de diagnóstico, detectándose hasta 2x102leptospiras/mL. Lametodología aquí planteada resultó tener buen rendimiento para la detección de leptospiras en muestras clínicas animales, aunque esnecesario su validación con mayor número y diversidad de muestras. Bovine leptospirosis is an important zoonotic disease whose molecular diagnosis is widely reported. However, there is not a unique method of extraction of DNA for pathogenic leptospires using clinical samples. In this study, bovine urine was contaminated with pure culture of Leptospira interrogans serovar Pomona Pomona in order to compare three of them: M1.) Chelex-100 resin, M2.) FTA Whatman paper and M3.) boiling of the sample (in-house protocol), being the first one the most sensitive when used in diagnostic PCR, detecting up to 2x102 leptospiras/mL. The methodology proposed in this study turned out to have good performance for the detection of leptospires in animal clinical samples, although it should be applied to a greater number of samples and in different stages of the pathology. Fil: Hamer, Micaela. Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria. Centro de Investigacion En Ciencias Veterinarias y Agronomicas. Instituto de Patobiologia Veterinaria. - Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Pque. Centenario. Instituto de Patobiologia Veterinaria.; Argentina Fil: Saraullo, Vanina Rosa. Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria. Centro de Investigacion En Ciencias Veterinarias y Agronomicas. Instituto de Patobiologia Veterinaria. - Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Pque. Centenario. Instituto de Patobiologia Veterinaria.; Argentina Fil: Brihuega, Bibiana. Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria. Centro de Investigacion En Ciencias Veterinarias y Agronomicas. Instituto de Patobiologia Veterinaria. - Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Pque. Centenario. Instituto de Patobiologia Veterinaria.; Argentina Fil: Watanabe, Olivia. Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria. Centro de Investigacion En Ciencias Veterinarias y Agronomicas. Instituto de Patobiologia Veterinaria. - Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Pque. Centenario. Instituto de Patobiologia Veterinaria.; Argentina Fil: Martinez, Mara Leila. Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria. Centro de Investigacion En Ciencias Veterinarias y Agronomicas. Instituto de Patobiologia Veterinaria. - Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Pque. Centenario. Instituto de Patobiologia Veterinaria.; Argentina Fil: Grune Loffler, Sylvia. Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria. Centro de Investigacion En Ciencias Veterinarias y Agronomicas. Instituto de Patobiologia Veterinaria. - Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Pque. Centenario. Instituto de Patobiologia Veterinaria.; Argentina

La identificación de restos humanos esqueletizados con base en el ADN es un procedimiento muy utilizado en los laboratorios forenses del mundo. Existen al menos tres métodos para la obtención del ADN a partir de este tipo de tejido: mediante solventes orgánicos (fenol-cloroformo), columnas de sílice (QIAquick de QIAgen) y perlas magnéticas recubiertas de polímero (PrepFiler Express™ BTA Forensic DNA Extraction Kit). Cada uno de ellos involucra un procedimiento distinto para la digestión y descalcificación del tejido óseo, así como la aplicación de diferentes principios fisicoquímicos para la purificación y la elución del ADN y el uso de diferentes cantidades iniciales de material pulverizado. Aunque los tres métodos han demostrado ser efectivos dependiendo de la calidad de la muestra, en el Laboratorio de Investigación Genética de Restos Humanos del Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses se estandarizó un protocolo unificado para la digestión y descalcificación, independientemente del método de purificación. Con este fin, se evaluaron variables como la cantidad de material pulverizado, el uso y la concentración de detergentes, la concentración de proteinasa K, el uso de dispositivos concentradores y de los reactivos del estuche PrepFiler Express™ BTA Forensic DNA Extraction y EDTA. El efecto de las variables se evaluó en muestras de tejido calcificado provenientes de los casos forenses del Laboratorio y en el ADN de líneas celulares conocidas analizando la cantidad de ADN recuperado y la calidad del perfil genético. El protocolo unificado de digestión y decalcificación permite una digestión completa del material pulverizado y, por ende, una mejor recuperación de ADN, independientemente del método de purificación usado. En las muestras analizadas el método tuvo un porcentaje de éxito cercano a 80 %. The identification of human remains using DNA from bones and teeth is a current procedure in forensic laboratories worldwide. At least three methods are used in DNA extraction from mineralized tissue: Organic (phenol-chloroform), silica (QIAquick, QIAgen) and magnetic particles (Prepfiler Express™ BTA Forensic DNA Extraction Kit); each one has its own procedure for decalcification, digestion, DNA purification, and elution, as well as for obtaining the initial amount of material. Although the three methods are equally efficient, we standardized a decalcification-digestion protocol to use it with any of the three DNA purification methods. We evaluated the quantity of powder, detergent and protease concentration, device concentrators and buffer for demineralization in bones and teeth from forensic cases of the Laboratory and DNA of common cellular lines by assessing the amount of recovered DNA and the quality of the genetic profile. The unified protocol for digestion and decalcification allowed a full degradation of bone powder, and good quality DNA recovery, independently of the purification method used in the subsequent step. Success percentage with this protocol was nearly 80 %.

Resumen La identificación de restos humanos esqueletizados con base en el ADN es un procedimiento muy utilizado en los laboratorios forenses del mundo. Existen al menos tres métodos para la obtención del ADN a partir de este tipo de tejido: mediante solventes orgánicos (fenol-cloroformo), columnas de sílice (QIAquick de QIAgen) y perlas magnéticas recubiertas de polímero (PrepFiler Express™ BTA Forensic DNA Extraction Kit). Cada uno de ellos involucra un procedimiento distinto para la digestión y descalcificación del tejido óseo, así como la aplicación de diferentes principios fisicoquímicos para la purificación y la elución del ADN y el uso de diferentes cantidades iniciales de material pulverizado. Aunque los tres métodos han demostrado ser efectivos dependiendo de la calidad de la muestra, en el Laboratorio de Investigación Genética de Restos Humanos del Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses se estandarizó un protocolo unificado para la digestión y descalcificación, independientemente del método de purificación. Con este fin, se evaluaron variables como la cantidad de material pulverizado, el uso y la concentración de detergentes, la concentración de proteinasa K, el uso de dispositivos concentradores y de los reactivos del estuche PrepFiler Express™ BTA Forensic DNA Extraction y EDTA. El efecto de las variables se evaluó en muestras de tejido calcificado provenientes de los casos forenses del Laboratorio y en el ADN de líneas celulares conocidas analizando la cantidad de ADN recuperado y la calidad del perfil genético. El protocolo unificado de digestión y decalcificación permite una digestión completa del material pulverizado y, por ende, una mejor recuperación de ADN, independientemente del método de purificación usado. En las muestras analizadas el método tuvo un porcentaje de éxito cercano a 80 %. Abstract The identification of human remains using DNA from bones and teeth is a current procedure in forensic laboratories worldwide. At least three methods are used in DNA extraction from mineralized tissue: Organic (phenol-chloroform), silica (QIAquick, QIAgen) and magnetic particles (Prepfiler Express™ BTA Forensic DNA Extraction Kit); each one has its own procedure for decalcification, digestion, DNA purification, and elution, as well as for obtaining the initial amount of material. Although the three methods are equally efficient, we standardized a decalcification- digestion protocol to use it with any of the three DNA purification methods. We evaluated the quantity of powder, detergent and protease concentration, device concentrators and buffer for demineralization in bones and teeth from forensic cases of the Laboratory and DNA of common cellular lines by assessing the amount of recovered DNA and the quality of the genetic profile. The unified protocol for digestion and decalcification allowed a full degradation of bone powder, and good quality DNA recovery, independently of the purification method used in the subsequent step. Success percentage with this protocol was nearly 80 %.

11 p., A phylogenetic study was carried out between the species Prochilodus reticulatus (Valenciennes, 1850) and P. Magdalenae (Steindachner, 1879) of great socioeconomic value in the country. Initially, the species were collected for DNA extraction and subsequent characterization by RAPD-PCR to establish their phylogenetic relationships using the Jaccard coeficient and the UPGMA method. The phylogenetic analysis of Prochilodus reticulatus and P. Magdalenae showed a close genetic relationship, which suggets that the differences found between them may not be considered significant., Se realizó un estudio filogenético entre las especies Prochilodus reticulatus (Valenciennes, 1850) y P. Magdalenae (Steindachner, 1879) de gran valor socieconómico en el país. Inicialmente, las especies fueron colectadas para una extracción de ADN y su posterior caracterización mediante RAPD-PCR para establecer sus relaciones filogenéticas empleando el coeficiente de Jaccard y el método UPGMA. El análisis filogenético de P. Reticulatus y P. Magdalenae mostró una estrecha relación genética, lo que sugiere que las diferencias encontradas entre ellas pueden considerarse no significativas.

Resumen La PCR sin extracción es una herramienta clave en investigaciones forenses, tratándose de una de las opciones a elegir cuando se tienen muestras con baja cantidad o calidad del ADN. El objetivo de este estudio fue determinar si hay diferencias entre los perfiles genéticos obtenidos por PCR i) en muestras de ADN extraídas con Chelex® 100, ii) en muestras de ADN obtenidas con el reactivo de purificación de muestras en tarjetas FTA, y iii) por la PCR muestras sin extracción, empleando el kit comercial AmpFLSTR® Identifiler®, utilizado de rutina en el laboratorio IdentiGEN de la Universidad de Antioquia. Manchas de sangre almacenadas en tarjetas FTATM Genecard WhatmanTM, papel de Cromatografía y papel filtro, se amplificaron por PCR sin extracción utilizando los buffers EzwayTM, PCRboostTM, STRboostTM y Buffer 5X Colorless Go Taq® Flexi. Los perfiles obtenidos se analizaron por medio de electroforesis capilar. Los resultados muestran que con los buffers utilizados se obtiene la amplificación de todos los marcadores STRs de las muestras almacenadas en los tres diferentes soportes. Esto permite concluir, que utilizando la PCR sin extracción, además de reducirse los costos y el tiempo de procesamiento de las muestras, se logra obtener perfiles genéticos que cumplan los criterios de calidad establecidos por el laboratorio, generando resultados de manera más eficiente al no ser necesario realizar la extracción y purificación del ADN. Abstract The PCR without extraction is a key tool in forensic investigation, being a good option when samples with small amounts or degraded DNA are available. The objective of this study was to compare genetic profiles obtained by PCR using: i) DNA samples extracted using Chelex® 100, ii) DNA samples extracted using an FTA purification reagent, and iii) samples without extraction using the commercial kits AmpFLSTR® Identifiler®, routinely employed in the laboratory IdentiGEN of the University of Antioquia. Blood stains were collected in FTA cards Genecard WhatmanTM, chromatography paper, and in filter papers. PCR without extraction was performed using the buffers EzwayTM, PCRboostTM, STRboostTM, and Buffer 5X Colorless Go Taq® Flexi. The profiles were obtained by capillary electrophoresis. The results show that, using the above-mentioned buffers, all STR markers were amplified, for samples collected in the three different types of support. In conclusion, the PCR without extraction, apart from reducing the cost and time needed for processing the samples, it allows obtaining genetic profiles that meet the quality criteria established by the laboratory, in a more efficiently way, since DNA extraction and purification steps are eliminated.

Los tejidos embebidos en parafina son muestras que reposan en los bancos de patología y almacenan importante información genética, útil para estudios retrospectivos de epidemiología y de patología molecular y para el diagnóstico de enfermedades en humanos y en animales. Dentro de las metodologías descritas para extraer ADN de tejidos en parafina, pocas resultan exitosas a la hora de obtener un material genético, con la cual se pueda amplificar fragmentos superiores a 200pb, por la técnica de PCR. Este trabajo expone la experiencia del laboratorio de biología molecular de la U.D.C.A, relacionada con la aplicación de una metodología poco utilizada para extraer ADN de tejido embebido en parafina y óptimo para amplificar por PCR un segmento de 600pb. Fueron utilizadas dos técnicas ampliamente referenciadas para este tipo de muestras, como son el protocolo de extracción fenólica y el del estuche comercial de QIAGEN® y una tercera metodología comúnmente empleada para extraer ADN de muestras de sangre, pero no para para tejidos en parafina, como lo es la técnica de extracción por sales o salting out. La capacidad amplificable del ADN extraído, se evidenció al obtener un fragmento de 600pb de un gen constitutivo humano. Los resultados mostraron que con la extracción fenólica y el estuche comercial de QIAGEN®, se consiguió el 21% de amplificaciones y con el método de extracción por sales, el 91%. Este trabajo muestra que una técnica no convencional de extracción de ADN a partir de tejido embebido en parafina puede ofrecer mejores resultados que metodologías tradicionales.

Fil: Alegre, Elsa Agustina. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: De Biasio, María Bárbara. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Ramírez, N. N. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Ruiz, Raquel Mónica. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Bastiani, Cristian Eduardo. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Existen diversas estrategias diagnósticas para identificar leptospiras, siendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) una técnica de alta sensibilidad y especificidad. El presente trabajo tuvo como objetivo optimizar técnicas de extracción de ADN a partir de cultivos bacterianos y establecer condiciones de PCR multiplex para diferenciar leptospiras saprófitas de patógenas. Para ello se ensayaron técnicas de bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) y hervido (boiling). Se analizaron dos secuencias de ácidos nucleicos, correspondientes a una fracción de un gen conservado en ambos grupos de bacterias (ARNr 16S) y otra procedente de una fracción de un gen (LipL32) presente sólo en especies de leptospiras patógenas, las cuales dieron amplicones de 474 y 430 pb respectivamente, utilizándose como controles positivos de amplificación muestras de cultivos bacterianos de Leptospira icteroahemorragiae, L. canicola y apatógena (Patoc I), utilizando agua como control negativo. Se concluyó que no existen diferencias en la perdurabilidad del ADN extraído a partir de cepas de referencia al comparar el método de digestión con el detergente CTAB y el de boiling y sus variantes. Considerando el más bajo costo y menor tiempo de desarrollo, este último resultó la mejor alternativa para la obtención de moldes para amplificación por PCR. There are different diagnostic techniques to identify leptospiras; the polymerase chain reaction (PCR) is a method with high sensitivity and specificity. This study aimed to optimize DNA extraction from bacterial cultures and set conditions of multiplex PCR to differentiate saprophytes from pathogens leptospiras. For this, two techniques were tested: cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) and boiling. Two sequences were analyzed, corresponding to a fraction of a conserved gene in both groups of bacteria (16S rRNA) and another in a fraction of a gene present only in the pathogenic leptospiras (LipL32). Two amplicons of 474 and 430 pb respectively were obtained using cultures of Leptospira icteroahemorragiae, L. canicola and apathogenic (Patoc I) as positive controls and water as negative control. It was concluded that there was no difference in the durability of DNA extracted from reference strains compare with CTAB digestion and boiling and its variants. Considering its lower cost and time saving, the latter represents a good alternative for PCR amplification.

El objetivo de la presente investigación fue identificar plantas hermafroditas del híbrido de papaya Pococí. Para la identificación del sexo de las plantas del híbrido Pococí, se utilizó el protocolo descrito por Depeputy et al. (2002), con algunas modificaciones. Esta metodología emplea un PCRCR múltipiple que pepermite la amplificación simultánea de dos fragmentos (1.300 y 800 pb respectivamente) para plantas hermafroditas y de un solo fragmento (1.300 pb) para plantas femeninas. El ADN se extrajo a partir de hojas de plantas de invernadero o campo con dos metodologías de extracción, CTAB y lisis alcalina (NaOH). La amplificación por PCR del ADN extraído de muestras foliares de papaya híbrido Pococí, con ambos métodos de extracción, produjo los fragmentos del tamaño esperado. La determinación del sexo de 1.500 plántulas en almácigo mostró un 46 % de plántulas hermafroditas y un 54 % de plantas femeninas. La proporción observada de plantas femeninas: hemafroditas no varió de la esperada (1:1) según la prueba de chi-cuadrado (p= 0,4237). Las plantas hermafroditas fueron llevadas al campo y al momento de la floración se determinó su sexo. La correspondencia entre el sexado por PCR y la expresión sexual en campo fue de un 98 %.

La identificación de sospechosos en casos criminales se ha facilitado desde la aplicación de pruebas de ADN a diferentes muestras. El uso de esta técnica para la tipificación forense a partir de muestras fecales humanas aún presenta complicaciones, por lo que en esta investigación se evaluaron dos protocolos de extracción de ADN con ciertas modificaciones para determinar el de mayor efectividad. Se realizaron extracciones orgánicas y mediante el kit comercial “DNA IQTM Casework Sample Kit para Maxwell ®16” a trozos de 4 cm2 y 1 cm2 de papel FTA impregnado con heces de un mismo individuo. En todos los casos se obtuvieron resultados útiles. Sin embargo, la tipificación forense óptima (dadas las características del electroferograma) se logró al utilizar el kit comercial en un área de papel FTA impregnado de 1 cm2 en dilución 1:4. The identification of suspects in criminal investigations has been facilitated since DNA test are executed on different samples. The application of this technology for forensic typification from human fecal samples still presents complications therefore this research evaluated two DNA extraction protocols with modifications to determine that of major efficiency. Organic extractions and extractions using the commercial kit “IQTM DNA Casework Sample Kit for Maxwell ® 16” on FTA portions of 4cm2 and 1cm2 impregnated with feces from the same individual were done to accomplish the objective. In all the assays the results were useful, however; the best forensic typification (by the electropherogram characteristics) was obtained by using the commercial kit in an area of 1 cm2 of FTA paper impregnated in a 1:4 dilution.

En el presente trabajo se llevó a cabo la extracción de ADN de biopsias cervicales con informe citológico de lesión intraepitelial cervical, incluidas en bloques de parafina, utilizando el “QIAamp DNA mini kit” (QIAGEN, Alemania) y la detección del Virus de Papiloma Humano (VPH). En el procedimiento original se eliminó la incubación en xilol, reduciendo los lavados del material biológico; la calidad de los ADNs extraídos fue probada mediante PCR para la detección del gen de la β-globina y del VPH, obteniéndose 84,3% y 28,1% de positividad, respectivamente. Estos resultados fueron comparables a los de otros trabajos similares y evidencian la obtención de ADN celular amplificable por PCR a partir de muestras parafinadas, que pudo ser utilizado eficientemente en procedimientos moleculares, eliminando la toxicidad del xilol y disminuyendo la manipulación del material biológico al reducir los lavados. In the present study, DNA from cervical biopsies with a cytological report of intraepithelial cervical lesion and embedded in paraffin blocks was extracted using the “QIAamp DNA mini kit” (QIAGEN, Germany), and the Human Papyloma Virus (HPV) was detected. In the original procedure, the xylene incubation was eliminated, therefore reducing the washes of the biological material; the quality of the DNA extracted was tested by PCR for detecting the β-globine gene and HPV, with 84.3% and 28.1% positivity, respectively. These results were comparable to those of other similar studies, and they demonstrate that it is possible to obtain PCR amplifiable cellular DNA from paraffin embedded samples which can be used efficiently for molecular procedures, eliminating xylene toxicity, and decreasing the manipulation of the biological material by reducing washes.

Introducción: La vía de inestabilidad de microsatélites se ha encontrado sobre todo en cánceres de vías digestivas, de los cuales 90% de los casos pertenecen a pacientes con cáncer hereditario y 15% con cáncer esporádico. De ella se deriva un fenotipo denominado de inestabilidad de microsatélites (IMI+) o fenotipo de error de la replicación (RER+) que induce a la acumulación de mutaciones en tasas más elevadas a las normales. Objetivos: Identificar la presencia del fenotipo IMI+ en los pacientes analizados y evaluar su relación con la diferenciación histopatológica del tumor porque en conjunto han sido asociados con un mejor pronóstico y una mejor respuesta al tratamiento dado. Metodología: Se extrajo ADN de las muestras de sangre (células normales) y las biopsias de tumor (células tumorales) de los 23 pacientes que se pudieron incluir para el estudio y mediante la amplificación por PCR y posterior electroforesis capilar; se tipificó el microsatélite mononucleotídico BAT-26, empleado por su sensibilidad para descubrir el fenotipo IMI+. Finalmente se hizo una correlación estadística según la presencia (IMI+) o ausencia (IMI-) del fenotipo, con los hallazgos histopatológicos utilizando la prueba exacta de Fisher. Resultados: Del total de pacientes, 4 (17%) presentaron IMI+: 3 de ellos con cáncer colorrectal (2 casos posiblemente con cáncer hereditario) y uno con cáncer gástrico. No se encontró ninguna asociación entre el fenotipo IMI+ con el diagnostico patológico, la edad, el sexo y la diferenciación histopatológica del tumor. Conclusión: Se encontró el fenotipo IMI+ en 17% de los casos, sin asociación con el grado de diferenciación histopatológica del tumor, posiblemente por el reducido número de muestras tipificadas, por lo cual es indispensable revisar los métodos de fijación, parafinación y almacenamiento de tejidos, pues las técnicas actuales dificultan la digestión de la proteinaza k y la PCR. Introduction: The path of microsatellite instability has mainly been found in cancers of digestive tracts, of which 90% of cases are hereditary cancer patients and 15% are patients with sporadic cancer. That instability produces a phenotype called Microsatellite instability (IMI+) or phenotype by replication mistake (RER+) that leads to the accumulation of mutations in higher rates to normal. Objectives: To identify the presence of IMI+ phenotype in patients analyzed and evaluated its relationship with the differentiation histopathologic tumor, because which together have been associated with a better prognosis and improved response to treatment given to the patient. Methodology: DNA was extracted from blood samples (normal cells) and biopsy of the tumor (tumor cells) of the 23 patients who were included in the study and through the amplification by PCR and subsequent capillary electrophoresis was typified the microsatellite mononucleotidic BAT-26, who was employed by his sensitivity to detect IMI+ phenotype (95%). Finally, we made a statistical correlation between the microsatellite instability phenotype, the presence (IMI+) or the absence (IMI-), with histopathological findings using Fisher’s exact test. Results: In 17% of cases (4 patients) had IMI+: 3 of them with colorectal cancer (CRC) -2 cases possibly with hereditary cancer- and one with gastric cancer (GC). There was no association between phenotype IMI+ with the pathological diagnosis, age, sex and differentiation histopathologic tumor. Conclusion: We found the phenotype IMI + in 17% of cases without association with the degree of differentiation histopathologic tumor, possibly by the reduced number of samples analyzed, making it essential to review the methods of fixation, paraffin and storage tissue because current techniques hinder digestion of proteinase k and PCR.

Este trabajo tuvo como objetivo comparar y estandarizar un protocolo eficiente para la extracción de ADN de fragmentos de tejido de Podocnemis expansa y evaluar el poder informativo de los marcadores moleculares RAPD e ISSR para el análisis de la estructura genética de la especie colectada en el entorno del parque Nacional do Araguaia, Tocantins, Brasil. El método de extracción fue estandarizado a partir de la evaluación de tres diferentes protocolos permitiendo la obtención de ADN de buena calidad y en cantidad adecuada para las reacciones de RAPD e ISSR. La razón A de las muestras presentó un valor entre 1.8 a 2.3, indicando que estas presentan baja contaminación por proteínas y que los ADNs podrían ser utilizados para evaluar el poder informativo de los marcadores RAPD e ISSR. Los dos marcadores demostraron ser una herramienta eficiente para estudios genéticos de P. expansa

Antecedentes: Las muestras de orina que con frecuencia son utilizadas para análisis clínicos, toxicológicos o tets de control de dopaje, pueden verse mezcladas de forma inconsciente o manipuladas intencionalmente. Objetivos: Disponer de una técnica que permita asegurar la identidad de las muestras de orina. Se propone la identificación del donante a partir de la comparación de perfiles genéticos en muestras de orina y sangre. Comparamos dos métodos de extracción de DNA nuclear. Material y métodos: Extracción de DNA a partir de dos métodos, el protocolo Master Diagnostica (VITRO, S.A.) y el método automático MagNa Pure® de Roche. Se establece los perfiles genéticos según el AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems). Resultados: Se obtuvo 100 % de concordancias entre los perfiles de los dos tipos de muestras. Conclusiones: Tanto de forma manual como automática se puede obtener DNA a partir de muestras de orina. Ambos métodos son válidos, si bien con el manual, se obtiene mayor cantidad de DNA. Se puede identificar al donante de una muestra de orina comparando los perfiles genéticos de la orina y de la sangre. La extracción del DNA de la orina y su posterior almacenamiento a -80ºC permite el establecimiento del perfil genético a posteriori sin alteraciones. Antecedents: Urine samples that are often utilized for clinical, toxicological or doping control tests can be mistaken involuntarily or intentionally tampered with. Objective: To make available a technique that ensures the identity of urine samples. We propose the identification of the donor through genetic profiling in blood and urine samples. Two methods of nuclear DNA extraction are compared. Material and methods: DNA is extracted by two methods, the method of Master Diagnostica (VITRO S.A.) and the automatic method MagNa Pure® of Roche. The genetic profiles are established utilizing the AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (Applied Biosystems). Results: The correspondence between the profiles of both types of samples was 100%. Conclusions: DNA can be obtained from urine samples manually or automatically. Both methods are valid although the manual method yields more DNA. The donor of a urine sample can be identified comparing the genetic profiles of urine and blood. The extraction of DNA from urine and its subsequent storage at -80ºC allows for establishing later a genetic profile without alterations.

Detection of anophelines infected with Plasmodium spp. has traditionally been conducted by optical microscopy and immuno-assays. Currently, methodologies based on Polymerase Chain Reaction (PCR), provide high sensitivity and specificity; however, some authors have reported that inhibitors present in the mosquito’s body can decrease PCR sensitivity for Plasmodium spp. detection and that their effect could be reduced using DNA extraction protocols that efficiently remove those potential inhibitors. Objective To compare two DNA extraction protocols for the detection of Plasmodium spp. infecting Anopheles spp. Materials and methods Ten Anopheles stephensi mosquitoes infected with Plasmodium falciparum were dissected to separate head-thorax and abdomen and processed by one of the extraction protocols, dilutions of the DNA were evaluated by nested PCR. Differences between amplification frequencies were analyzed by the t-Student’s test and the hypotheses were analyzed by the test of difference between proportions of two populations. Results In specimens with DNA extracted by the protocol without chelating resin amplification of parasite DNA was achieved in 11.6% of the samples and with the protocol with chelating resin, in 6.6%. From all of the amplifications, 20% corresponded to undiluted DNA and 7.5% to DNA diluted 1:10; the difference between amplification proportions was statistically significant (p

Standardising a simple protocol for extracting yeast from genomic DNA Resumen: Se estandarizó un protocolo rápido, sencillo y de bajo costo para la extracción de ADN genómico de levaduras a partir de lisis de la pared celular mediante tratamiento enzimático y precipitación por alcoholes. El empleo de la enzima Beta-glucoronidasa en reemplazo de la enzima Zimolasa, permitió obtener ADN en alta concentración (124,9±30,2 ng/μl) y de buena calidad (A260/A280 nm =1,86±0,1), ideal para su uso en estudios de biología molecular. Además, se adicionó un paso de incubación del ADN obtenido a 100° C para inactivar ADNasas. La calidad del ADN obtenido fue evaluada por medio de la amplificación de la región ITS1-5.8S-ITS2, presentando bandas definidas y cuantificables (entre 380 y 880 pb) ideales para estudios de identificación molecular y filogenia.Palabras clave: levadura; extracción de ADN; Beta-Glucoronidasa. Abstract: A quick, simple and low-cost protocol for extracting genomic DNA from yeast by cell wall lysis involving enzymatic treatment and alcoholic precipitation was standardised. Higher DNA yields (124.9±30.2 ng/μl) were obtained by using beta-glucuronidase instead of zymolyase; these had very high quality (A260/A280 nm = 1.86±0.1) and would be suitable for use in molecular biology assays. Moreover, a DNAse inactivation step was also introduced by incubation at 100 °C to further ensure DNA stability. DNA quality was assayed by PCR amplification of the ITS1-5.8S-ITS2 region, revealing defined, quantifiable 380 to 880 bp bands. These results show that the protocol is ideal for molecular identification and phylogenetic studies.Key words: Yeast; DNA extraction; beta-glucoronidase.

Se estandarizó un protocolo rápido, sencillo y de bajo costo para la extracción de ADN genómico de levaduras a partir de lisis de la pared celular mediante tratamiento enzimático y precipitación por alcoholes. El empleo de la enzima Beta-glucoronidasa en reemplazo de la enzima Zimolasa, permitió obtener ADN en alta concentración (124,9±30,2 ng/µl) y de buena calidad (A260/A280 nm = 1,86±0,1), ideal para su uso en estudios de biología molecular. Además, se adicionó un paso de incubación del ADN obtenido a 100° C para inactivar ADNasas. La calidad del ADN obtenido fue evaluada por medio de la amplificación de la región ITS1-5.8S-ITS2, presentando bandas definidas y cuantificables (entre 380 y 880 pb) ideales para estudios de identificación molecular y filogenia. A quick, simple and low-cost protocol for yeast DNA extraction by enzymatic treatment and alcoholic precipitations for cell wall lysis was standardized. By using Beta-glucuronidase instead of Zymolyase higher yields of DNA were obtained (124.9±30.2 ng/µl) with very high quality (A260/A280 nm = 1.86±0.1) and suitable for molecular biology assays. Moreover, a DNAse inactivation step by incubation at 100° C, was also introduced to ensure further DNA stability. DNA quality was assayed by PCR amplification of the ITS1-5.8S-ITS2 region, showing defined, quantifiable bands between 380 and 880 bp. These results are ideal for molecular identification and phylogenetic studies.

Se evaluó el rendimiento de un protocolo de acetato de potasio con modificaciones menores para la extracción del ADN genómico. Los resultados evidencian que empleando el protocolo modificado se obtuvo un ADN de mayor rendimiento (0,61, concentración de 37,34 ng/µL) respecto al protocolo original. La amplificación del ADN vía PCR para regiones mitocondriales evidencia su calidad alta ADN para estudios poblacionales a nivel molecular, en el menor tiempo y costo, sin el uso de reactivos altamente tóxicos. We evaluated the yield of a potassium acetate protocol with minor modifications for the extraction of genomic DNA. The results showed that using the modified protocol gave a higher DNA yield (0.61, and concentration 37.34 ng/µL) was obtained with respect to the original protocol. The amplification of DNA by PCR for mitochondrial regions demonstrated the high quality of this DNA for molecular population studies, in less time and cost, without the use of highly toxic reagents.

El Moko del banano causado por Ralstonia solanacearum es una de las enfermedades más limitantes en la producción de este cultivo en el mundo. Una alternativa viable para reducir la incidencia de la enfermedad consiste en la detección temprana de plantas afectadas y de suelos con altos niveles de inóculo bacterial. En esta investigación se evaluaron diferentes metodologías de extracción de ácidos nucleicos a partir de material vegetal y de suelos para su utilización en el diagnóstico molecular de la bacteria, determinándose además las características de los filotipos y secuevares que causan esta enfermedad en la región bananera de Urabá, Colombia. Los resultados indican que para el caso del diagnóstico de material vegetal, los métodos más efectivos consisten en la utilización de kits comerciales de extracción de ADN que utilizan columnas de silica gel en presencia de altas concentraciones salinas o alternativamente métodos convencionales con buffers que contengan PVPP. Para la detección a partir de muestras de suelo, la metodología más apropiada resultó ser aquella en la cual se realizó previa a la extracción de ADN, el enriquecimiento microbiano en medio liquído semiselectivo SMSA. El diagnóstico molecular mediante PCR múltiple permitió determinar que el agente causal del Moko del banano en Urabá corresponde al Filotipo II, secuevar 4 de R. solanacearum. Los procedimientos establecidos se constituyen en una herramienta a ser empleada en nuestro medio para el diagnóstico temprano del Moko del banano tanto en las investigaciones epidemiológicas como en el manejo de esta enfermedad en el campo. Moko disease of banana caused by Ralstonia solanacearum is one of the most limiting factors in the production of this crop in the world. An alternative to reduce the incidence of this disease consists in the early detection of affected plants and soils with high levels of bacterial inoculum. This research evaluated different methods of nucleic acids extraction from plant material and soils, to be used in molecular diagnosis of R. solanacearum in the banana-growing region of Urabá, Colombia. Results showed that for diagnosis of plant material, DNA extraction should be done with commercial kits including silica gel columns or alternatively conventional methods using buffers containing PVPP. For bacterial detection from soil samples the most appropriated method was the microbial enrichment in SMSA broth medium before DNA extraction. Multiplex PCR analysis indicated that phylotype II, sequevar 4 was the causal agent of Moko disease of banana in the region of Urabá. Techniques applied in this research could be used in epidemiological studies as well as to support management strategies of this disease in banana plantations.

Introducción: La vía de inestabilidad de microsatélites se ha encontrado sobre todo en cánceres de vías digestivas, de los cuales 90% de los casos pertenecen a pacientes con cáncer hereditario y 15% con cáncer esporádico. De ella se deriva un fenotipo denominado de inestabilidad de microsatélites (IMI+) o fenotipo de error de la replicación (RER+) que induce a la acumulación de mutaciones en tasas más elevadas a las normales. Objetivos: Identificar la presencia del fenotipo IMI+ en los pacientes analizados y evaluar su relación con la diferenciación histopatológica del tumor porque en conjunto han sido asociados con un mejor pronóstico y una mejor respuesta al tratamiento dado. Metodología: Se extrajo ADN de las muestras de sangre (células normales) y las biopsias de tumor (células tumorales) de los 23 pacientes que se pudieron incluir para el estudio y mediante la amplificación por PCR y posterior electroforesis capilar; se tipificó el microsatélite mononucleotídico BAT-26, empleado por su sensibilidad para descubrir el fenotipo IMI+. Finalmente se hizo una correlación estadística según la presencia (IMI+) o ausencia (IMI-) del fenotipo, con los hallazgos histopatológicos utilizando la prueba exacta de Fisher. Resultados: Del total de pacientes, 4 (17%) presentaron IMI+: 3 de ellos con cáncer colorrectal (2 casos posiblemente con cáncer hereditario) y uno con cáncer gástrico. No se encontró ninguna asociación entre el fenotipo IMI+ con el diagnostico patológico, la edad, el sexo y la diferenciación histopatológica del tumor. Conclusión: Se encontró el fenotipo IMI+ en 17% de los casos, sin asociación con el grado de diferenciación histopatológica del tumor, posiblemente por el reducido número de muestras tipificadas, por lo cual es indispensable revisar los métodos de fijación, parafinación y almacenamiento de tejidos, pues las técnicas actuales dificultan la digestión de la proteinaza k y la PCR. Introduction: The path of microsatellite instability has mainly been found in cancers of digestive tracts, of which 90% of cases are hereditary cancer patients and 15% are patients with sporadic cancer. That instability produces a phenotype called Microsatellite instability (IMI+) or phenotype by replication mistake (RER+) that leads to the accumulation of mutations in higher rates to normal. Objectives: To identify the presence of IMI+ phenotype in patients analyzed and evaluated its relationship with the differentiation histopathologic tumor, because which together have been associated with a better prognosis and improved response to treatment given to the patient. Methodology: DNA was extracted from blood samples (normal cells) and biopsy of the tumor (tumor cells) of the 23 patients who were included in the study and through the amplification by PCR and subsequent capillary electrophoresis was typified the microsatellite mononucleotidic BAT-26, who was employed by his sensitivity to detect IMI+ phenotype (95%). Finally, we made a statistical correlation between the microsatellite instability phenotype, the presence (IMI+) or the absence (IMI-), with histopathological findings using Fisher’s exact test. Results: In 17% of cases (4 patients) had IMI+: 3 of them with colorectal cancer (CRC) -2 cases possibly with hereditary cancer- and one with gastric cancer (GC). There was no association between phenotype IMI+ with the pathological diagnosis, age, sex and differentiation histopathologic tumor. Conclusion: We found the phenotype IMI + in 17% of cases without association with the degree of differentiation histopathologic tumor, possibly by the reduced number of samples analyzed, making it essential to review the methods of fixation, paraffin and storage tissue because current techniques hinder digestion of proteinase k and PCR.

Se evaluó la eficiencia de procedimientos de lisis y tratamientos de extracción de ADN de trofozoítos de Giardia lamblia respecto a la eficiencia de ruptura, cantidad y pureza de ADN, además de los tiempos de procesamiento y costos. Se testearon cinco métodos de lisis (agua destilada y calor; agua destilada, calor y proteinasa K; buffer de lisis D; buffer de lisis E y un kit comercial) y tres métodos de purificación de ADN (fenol:cloroformo: isoamílico; Chelex 100 y un kit comercial). Los datos obtenidos se analizaron estadísticamente. La combinación de buffer de lisis E y Chelex fue un método simple y económico, que produjo alto rendimiento de ADN con baja pureza. Ella técnica comercial fue un método simple, más costoso que produjo bajas cantidades de ADN con un nivel de pureza apropiado para estudios moleculares The efficiency of lysis procedures and DNA purification treatments of Giardia lamblia trophozoites were evaluated regarding the breaking-up efficiency, quantity and pureness of DNA, processing time and costs. Five lysis methods (distilled water and heating; distilled water, heating and proteinase K; buffer D Lysis; buffer E lysis, and commercial kit), and three DNA purification methods (phenol:chloroform:isoamilic, Chelex 100 and commercial kit) were tested. The obtained data were statistically analyzed. The buffer E lysis and Chelex combination was simple and economic method which produced high DNA performance with low pureness. Commercial kit was simple and expensive method which generated low yields of DNA with appropriate purity level for molecular analysis

The efficiency of lysis procedures and DNA purification treatments of Giardia lamblia trophozoites were evaluated regarding the breaking-up efficiency, quantity and pureness of DNA, processing time and costs. Five lysis methods (distilled water and heating; distilled water, heating and proteinase K; buffer D Lysis; buffer E lysis, and commercial kit), and three DNA purification methods (phenol:chloroform:isoamilic, Chelex 100 and commercial kit) were tested. The obtained data were statistically analyzed. The buffer E lysis and Chelex combination was simple and economic method which produced high DNA performance with low pureness. Commercial kit was simple and expensive method which generated low yields of DNA with appropriate purity level for molecular analysis., Se evaluó la eficiencia de procedimientos de lisis y tratamientos de extracción de ADN de trofozoítos de Giardia lamblia respecto a la eficiencia de ruptura, cantidad y pureza de ADN, además de los tiempos de procesamiento y costos. Se testearon cinco métodos de lisis (agua destilada y calor; agua destilada, calor y proteinasa K; buffer de lisis D; buffer de lisis E y un kit comercial) y tres métodos de purificación de ADN (fenol:cloroformo: isoamílico; Chelex 100 y un kit comercial). Los datos obtenidos se analizaron estadísticamente. La combinación de buffer de lisis E y Chelex fue un método simple y económico, que produjo alto rendimiento de ADN con baja pureza. Ella técnica comercial fue un método simple, más costoso que produjo bajas cantidades de ADN con un nivel de pureza apropiado para estudios moleculares., Facultad de Ciencias Médicas, Instituto de Biotecnologia y Biologia Molecular

La pared de doble contorno de las levaduras hace difícil que se realice la lisis para la extracción del ADN genómico en Candida spp. Existen numerosos protocolos que se basan en métodos enzimáticos y/o físicos. Sin embargo son laboriosos y relativamente caros. El objetivo de este trabajo fue simplificar la extracción de ADN para usar el homogenato obtenido en la amplificación aleatoria de segmentos de ADN (RAPD) asimétrico con un cebador reverso corto CAND R de la secuencia repetitiva de C. albicans CARE 2. Mediante choque térmico se logró obtener suficiente cantidad de ADN de las diferentes especies de Candida para reproducir los diferentes patrones de bandas características de cada una de las especies Abstract The double membrane of pathogenic yeast make the extraction of genomic DNA difficult. The aim of this study was to simplify the extraction of yeast DNA. We report that the use of heat is an easy, efficient and time-saving technique to obtain a homogenate containing high yields of good quality DNA. The use of these technique also prevents the use of toxic components, where small traces may be inhibit the random amplified polymorphic DNA technique. Using a reverse primer (CAND-R), a sequence of 20 oligonucleotides present in the repetitive sequence CARE-2 of C. albicans, we were able to reproduce several bands patterns of different Candida species

El género Cryptococcus comprende, al menos, 38 especies, pero sólo 3 se han informado como patógenas para el hombre y los animales: Cryptococcus laurentii, Cryptococcus albidus y Cryptococcus neoformans; esta última es la más frecuente. La infección se adquiere por la inhalación de los propágulos infectantes del medio ambiente. Los estudios del hábitat se han realizado con técnicas de extracción con soluciones tampón y cultivos en medios selectivos. El objetivo del trabajo fue evaluar varias técnicas de extracción del ADN de Cryptococcus spp . a partir de muestras ambientales. Como controles se emplearon aislamientos de C. neoformans, C. albidus, C. laurentii y Paracoccidiodes brasiliensis. Se emplearon vermiculitas, suelos contaminados en el laboratorio con 10 a 10 6 blastoconidias/g y muestras naturalmente colonizadas con C. neoformans. El ADN se extrajo con métodos físicos, químicos y con un estuche comercial, y se purificó usando bloques de agarosa y columnas de sílica. Para la amplificación con PCR se emplearon los iniciadores CN4-CN5 específicos para C. neoformans. Sólo el estuche comercial permitió extraer y purificar el ADN de las muestras de suelos contaminados hasta una concentración de 10 blastoconidias/g de suelo y de una de las muestras naturalmente colonizadas. Con este trabajo se logró la extracción y amplificación de ADN de Cryptococcus spp. a partir de muestras ambientales lo cual constituye una herramienta importante para delimitar las áreas ecológicas de C. neoformans en nuestro país. The genus Cryptococcus encompasses 38 species, but only 3 are associated with disease in humans and animals, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus albidus and Cryptococcus neoformans. The last one is the most frequently reported. The disease is acquired by the inhalation of infectious propagules present in the environment. The habitat has been established using extraction techniques with buffer supplemented with antibiotics and plating in selective media. The aim of this work was to evaluate several DNA extraction techniques for Cryptocococus spp . from environmental samples. The control isolates were C. neoformans, C. albidus, C. laurentii and Paracoccidiodes brasiliensis. We also used vermiculita and soil samples contaminated with different yeast concentrations (10 to 10 6 cells/g) and samples naturally contaminated with C. neoformans. DNA was extracted with physical and chemical methods and with a commercial kit, and the DNA was purified with agarose blocks and silica columns. For the PCR amplification we used the CN4-CN5 primers, which are specific for C. neoformans. Only the commercial kit allowed DNA extraction and amplification from contaminated soil samples up to a concentration of 10 cells/g and from one sample naturally colonized. With this work we extracted and amplified DNA from Cryptococcus spp. from environmental samples with appropriate PCR specificity, it will be a tool to establish the ecological areas of C. neoformans in our country.

Extraction of amplifiable DNAis a frequent problem when working with degraded specimens like bone samples. The possibility of obtaining as much information as possible from these samples has a particular significance in many forensic investigations. The present investigation was aimed to assess the efficiency of three organic extraction methods for purifying amplifiable DNA from bone samples. The amount of nucleic acids obtained, the success rate in the amplification of DNA microsatellite (STR) markers and amelogenin by PCR, the influence of PCR inhibitors and environmental conditions, and where the samples were found before their processing in the laboratory, were all evaluated in this investigation for the three methods. Results showed that method A (a modification of FBI method for DNA extraction) performed better in producing not a higher amount but a better quality amplifiable DNA, in comparison with the other two methods evaluated. It was also demonstrated that the quality of the DNA to be amplified by PCR was influenced by the presence of inhibitors and/or contaminants and the environmental conditions where the bone sample was taken from. The worst conditions were observed from aquatic environments. The results suggest that the implementation of some specific modifications in the method A (use of purification columns, reliable quantification methods and different dilutions) would help to obtain better DNA extracts intended to be used in different molecular identification tests. Diferentes investigaciones han demostrado que la posibilidad de llevar a cabo estudios de marcadores genéticos está muchas veces limitada por la capacidad de obtener ácidos desoxirribonucleicos (ADN) a partir de muestras degradadas como los restos óseos. Asu vez, la información que de allí se derive resulta de suma importancia en diferentes situaciones médico-legales. El presente estudio se diseñó para comparar la eficiencia de tres métodos orgánicos de extracción de ADN amplificable por la técnica de Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) a partir de muestras de hueso. En esta investigación se procedió a evaluar, comparativamente, la cantidad de ácidos nucleicos obtenidos, el éxito en la amplificación de marcadores microsatélites (STR) y amelogenina por PCR, la posible presencia de inhibidores y el contexto de donde provenían las muestras para los tres métodos. Una modificación del método de extracción utilizado por el FBI (Federal Bureau of Investigation) de los Estados Unidos, denominado método A, aunque no produjo la mayor cantidad de ADN, mostró el mejor rendimiento en cuanto a la calidad requerida para la amplificación por PCR. A la vez, se demostró que dicho rendimiento es influenciado por la posible presencia de inhibidores o contaminantes y por el contexto en el cual permanecieron las muestras previo a su análisis en el laboratorio. Los hallazgos sugieren que la introducción de algunas modificaciones específicas al método A (la incorporación de columnas de purificación, la cuantificación específica de ADN humano en los extractos y el uso de diluciones) podría mejorar sustancialmente el rendimiento de este método de extracción para que pueda ser utilizado con mayor éxito en diferentes investigaciones médico-legales que requieran la disponibilidad de ADN en calidad y cantidad adecuadas.

Aunque las técnicas de referencias citadas por la USDA y OIE son IFI y FC, para el diagnóstico de las infecciones por Babesia equi y Babesia caballi, éstas no permite la diferenciación entre las especies y no descartan resultados falsos negativos. La implementación de la PCR como técnica directa, en la identificación y carac-terización de estos parásitos, sin duda constituye un soporte al diagnóstico clínico de la piroplasmosis equina. Dado lo anteriormente expuesto en el presente trabajo se estandarizó la PCr para la identificación de B. equi y B. caballi. El procedimiento contempló la implementación de un protocolo de extracción de DNA, a partir de muestras de sangre y la optimización de PCR, tanto para la mezcla de reacción como para el programa de termociclación, junto a 4 partidores: P1 y P2 para B equi y P3 y P4 para B caballi. Ambos amplifican en forma selectiva una secuencia conservada de los genes de 16S rDNA, equivalentes a 659 bp para B. caballi y 664 bp para B. equi. La sensibilidad técnica fue de 0,1ng/ml para B. equi y 1ng/ml para B. caballi. El estudio de especificidad técnica no mostró productos de amplificación al utilizar DNAs de Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Echinococcus granulosus, Fasciola hepatica. Se estudiaron 77 muestras de sangre de equinos provenientes de la Región Metropolitana de Chile con y sin sospecha clínica, de las cuales 15 resultaron positivas (14 a B. equi y 1 a B. caballi). Nuestros resultados crearon la necesidad de una evaluación epidemiológica de la PCR y su confrontación con otras técnicas de diagnóstico directo, para lo cual en la actualidad se estudian muestras de sangre equina con sospecha a piroplasmosis

Background: Streptococcus pneumoniae is a common etiologic agent of invasive respiratory infections among children under 5 years of age and older adults. Isolation rates of S. pneumoniae by traditional culture techniques are low. Aim: To study the sensitivity and specificity of two different DNA extraction methods to amplify the ply gene, applied to three different types of blood culture broths, experimentally inoculated with S. pneumoniae. Material and methods: DNA was extracted from the cultures using an organic method or a technique that consists in dilution, washing with NaOH and concentration of the sample. This was followed by PCR amplification of a 355 pb fragment of the pneumolysin gene (ply). Results: The organic DNA extraction method inhibited the PCR reaction at all concetrations studied (0.6 to 10(6) colony forming units/mL). Using the NaOH extraction, ply gene amplification was positive in all three blood culture broths, but only at concentrations of 10³ colony forming units/mL or higher. Using the same DNA extraction method, PCR was negative when the broths were inoculated with seven other related bacterial species, which results in a 100% specificity. Conclusions: Detection of S. pneumoniae by amplification of ply gene from blood cultures using the protocol of NaOH for DNA extraction is specific and provides results in a short lapse. However, the diagnostic sensitivity is not optimal, wich limits its clinical use (Rev Méd Chile 2004; 132: 533-8).

Los huesos antiguos son una buena fuente de ADN, útil en muchos casos para el análisis forense, especialmente cuando el tejido blando está severamente descompuesto o dañado. Existen diferentes métodos para la extracción de ADN a partir de restos óseos, con diferentes eficacias, y que plantean varios problemas técnicos. Se presenta una revisión bibliográfica sobre este tema y se incluyen algunas recomendaciones prácticas. Ancient bones are a good source of DNA, useful on many forensic cases, specially when the soft tissues are putrefied to a high extent. There is many different methods to extract DNA from bones with various degrees of efficiency on the DNA amount obtained. We present a bibliographic review and some practical considerations.