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ilustraciones, graficas La enfermedad de Alzheimer es la demencia más común en la población mundial, tiene una etiología desconocida y no cuenta con un tratamiento efectivo. Se caracteriza por la agregación del péptido amiloide β y Tau hiperfosforilado, aumento de radicales libres, desregulación lipídica y exitotoxicidad. Teniendo en cuenta esto, los receptores X hepáticos, se postulan como una diana terapéutica, ya que son factores de transcripción que regulan genes encargados de la homeostasis de colesterol y se asocian con mecanismos de eliminación del péptido amiloide β, una menor fosforilación de Tau y una menor respuesta inflamatoria, etc. En este trabajo, se contó con 82 extractos de Angiospermas basales colombianas, a los que se les evaluó su actividad agonista sobre los receptores nucleares LXR β, actividad inhibitoria de acetil colinesterasa y actividad antioxidante, seguida de la evaluación in vivo del efecto protector frente a ambientes tóxicos de paraquat, ceramida y glutamato. Se encontró que, los extractos de Z. martinicense, Zanthoxylum sp., Z. rohifolium, N. reticulata, N. membranácea, Nectandra sp., Myristicaceae sp. 1 y Myristicaceae sp. 2 tienen un efecto agonista sobre LXR β, acompañado de una actividad antioxidante. Adicionalmente, el extracto etanólico de Myriticaceae sp.2 y las fracciones de Z. rhoifolium, Z. martinicense y Zanthoxylum sp., mostraron una marcada actividad inhibitoria de AChE. Por último, Z. rohifolium, disminuye el efecto de concentraciones tóxicas de glutamato. Lo que deja en evidencia el potencial de estos extractos naturales para el tratamiento de la EA. (texto tomado de la fuente) Alzheimer's disease is the most common dementia in the world, has an unknown etiology and d oes not have effective treatment. It is characterized by the aggregation of amyloid peptide β and tau hyperphosphorylation, increased free radicals, lipid deregulation, and excitotoxicity. Considering this, liver X receptors are postulated as a therapeutic target, as they are transcription factors that regulate genes responsible for cholesterol homeostasis and are associated with mechanisms of removal of amyloid peptide β, lower phosphorylation of Tau and lower inflammatory response, etc. In this work, 82 extracts of basal Angiosperms obtained in Colombia were counted, which were evaluated for their agonist activity on LXR β nuclear receptors, continuing with in vitro evaluation of anti-acetylcholinesterase activity and antioxidant activity, followed by in vivo assessment of the protective effect against toxic environments of paraquat, ceramide, and glutamate. Finding that extracts from Z. martinicense, Zanthoxylum sp. Z. rohifolium, N. reticulata, N. membranácea, Nectandra sp., Myristicaceae sp. 1 and Myristicaceae sp. 2 have an agonist effect on LXR β, accompanied by antioxidant activity and particularly, the ethanolic extract of Miriticaceae sp.2 and the fractions of Z. rhoifolium, Z. martinicense and Zanthoxylum sp., showed a marked inhibitory activity of AChE and Z. rohifolium, decreases the effect of toxic concentrations of glutamate. Which highlights the potential of these natural extracts for the treatment of EA. A la Universidad Nacional de Colombia, al programa curricular de la Maestría en Ciencias – Bioquímica y los grupos de investigación de Muerte celular y el grupo de química de productos naturales bioactivos (QUIPRONAB), que permitieron mi formación profesional. Al Ministerio de Ciencia y Tecnología por la financiación de esta investigación mediante los proyectos, Bioprospección del potencial terapéutico de extractos vegetales de las familias Lauraceae y Rutaceae asociados a la actividad farmacológica de LXR en un modelo murino de enfermedad de Alzheimer y análisis computacional" -RC-737 DE 2018 y “Evaluación de los mecanismos moleculares asociados a la activación farmacológica de LXR en modelos de la enfermedad de Alzheimer y del potencial terapéutico de un extracto de Nectandra reticulata (Lauraceae)” RC-727 de 2018 . Al Ministerio de Medio Ambiente por el otorgamiento del Otros N° 21 al Contrato Marco de Acceso a Recursos Genéticos y sus Productos Derivados N° 121 del 22 de enero de 2016 suscrito entre el Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible y la Universidad Nacional de Colombia, por medio del cual se ampara el uso para investigación del material vegetal que hace parte de esta investigación. A mis directores de tesis Adrián Sandoval y Mónica Ávila y a los profesores que han acompañado mi proceso de formación profesional. Maestría Magíster en Ciencias - Bioquímica Enfermedades neurodegenerativas

Introducción: La etiología de la Enfermedad de Parkinson (EP) aun es desconocida, la evidencia aportada por mutaciones en PINK1 y Parkin, así como modelos neurotóxicos sugiere que la EP se asocia a disfunción mitocondrial, pero no se conocen muchos de los mecanismos moleculares que la subyacen. Objetivo: Evaluar el efecto del silenciamiento de los genes PINK1 y Parkin sobre la fisiología mitocondrial y autofagia en células CAD expuestas a C2-ceramida. Metodología: Usando plásmidos lentivirales, se silenciaron los genes PINK1 y Parkin en la línea neuronal dopaminérgica CAD, se evaluaron cambios en viabilidad y vías de supervivencia neuronal, diferenciación, dinámica mitocondrial y autofagia en presencia de un reto neurotóxico inducido por C2-Ceramida. Resultados: el silenciamiento de PINK1 alteró la señalización del IGF1R, lo cual indujo una disminución en la activación de la proteína AKT y HKI, generando pérdida del potencial de membrana mitocondrial, incremento en el fraccionamiento de la red de mitocondrias y fallo en la mitofagia. La deficiencia de Parkin disminuyó los niveles de pERK y alteró la degradación de autofagosomas. Estos factores condujeron a una mayor susceptibilidad al tratamiento con ceramida y finalmente promovieron muerte neuronal. La sobre-expresión de Parkin recuperó el flujo autofágico en las células deficientes de PINK1 o Parkin y protegió de la muerte neuronal inducida por deprivación de nutrientes y ceramida. Conclusión: La deficiencia de PINK1 y Parkin induce muerte neuronal asociada con disfunción en vías de supervivencia, alterando el metabolismo, la dinámica mitocondrial y la autofagia. Abstract Introduction: The etiology of Parkinson's disease (PD) is still unknown, the evidence provided by mutations in PINK1 and Parkin and neurotoxic models suggests that PD is associated with mitochondrial dysfunction, but the underlying molecular mechanisms remain unknown. Aim: To evaluate the effect of silencing PINK1 and Parkin genes on mitochondrial physiology and autophagy in CAD cells exposed to C2-ceramide. Methodology: PINK1 and Parkin genes were silenced using lentiviral plasmids in dopaminergic neuronal CAD line, and changes in viability and neuronal survival, differentiation, mitochondrial dynamics and autophagy were evaluated in the presence of C2-Ceramide. Results: Silencing PINK1 altered IGF1R signaling, which induced a decrease in AKT and HKI activation generating loss of mitochondrial membrane potential, increased mitochondrial fission and failure in mitophagy. Parkin deficiency decreased pERK levels and altered autophagosomes degradation. All these factors led to an increased susceptibility to treatment with ceramide and finally they promoted neuronal death. The overexpression of Parkin regained autophagic flux in PINK1 or Parkin-deficient cells and protected of the neuronal death induced by starvation and ceramide. Conclusion: PINK1 and Parkin deficiency induces neuronal death associated with dysfunction in survival pathways, altering metabolism, mitochondrial dynamics and autophagy Doctorado

La Apolipoproteína E transporta colesterol y otros lípidos en el plasma y en el sistema nervioso central. La ApoE se une a los receptores LDLR para de esta manera controlar la homeostasis de lípidos. Existen tres alelos que traducen a tres isoformas de la proteína: ApoE 2 ApoE 3 y ApoE4, de las cuales, la ApoE4 ha sido definida como un factor de riesgo de la Enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, el mecanismo molecular de esta susceptibilidad no se ha definido aún. El objetivo de este trabajo es estudiar el efecto de las isoformas de ApoE2, 3 y 4 sobre las vías de sobrevivencia y autofagia en la línea CAD y bajo un contexto neurotóxico. La primera parte de los experimentos se enfocó en conocer la respuesta de las ApoE en la línea celular CAD durante la diferenciación, para lo cual las células diferenciadas fueron incubadas durante 24 horas con las isoformas de las ApoE. En la segunda parte se observó la respuesta de las ApoE bajo un contexto neurotóxico, y para esto las células diferenciadas fueron incubadas con las ApoE2, 3 o 4, pasada una hora se adicionó ceramida y se dejó en incubación por 24 horas. Se realizaron ensayos de LDH y MTT. Para cuantificar la presencia de las proteínas se utilizó la técnica de Western blot e inmunofluorescencia para detectar autofagosomas. En el primer modelo se observó un aumento en el metabolismo mitocondrial para el experimento con ApoE4: la viabilidad celular se mantuvo similar a la del control. En el tratamiento con la isoforma 4 de ApoE se da una hiperactivación de las vías Akt, ERK y p38; hay una disminución de AMPK y una inhibición de la autofagia, a diferencia de las isoformas de ApoE 2 y 3, donde se observa la activación de la autofagia. Estos resultados sugieren que la isoforma de ApoE4 está generando posiblemente aumento de ROS, lo que promueve la activación de vías de estrés celular como p38 y ERK. Al inhibirse la autofagia en este tratamiento, se da la acumulación de todos estos daños y se da una sensibilización de las células a la muerte, lo cual se observa en el siguiente modelo estudiado. En el segundo modelo (neurotoxicidad), el tratamiento de ApoE4-­‐ceramida presentó disminución en la viabilidad celular, y los tratamientos con ApoE2-­‐ceramida y ApoE3-­‐ ceramida, no. El tratamiento de ApoE4-­‐ceramida muestra una disminución en la fosforilación de Akt y AMPK, en comparación con los controles y los tratamientos de ApoE2-­‐ceramida y ApoE3-­‐ceramida. La presencia de la proteína ERK fosforilada no varía de manera significativa en los tratamientos y p38 fosforilada; evidencia una mayor presencia en los tratamientos de ApoE2-­‐ceramida y ApoE3–ceramida que en ApoE4-­‐ ceramida. Finalmente, estos resultados sugieren que las vías de sobrevivencia, metabolismo y autofagia en el tratamiento de ApoE4–ceramida presentan una desregulación principalmente en la inhibición de la autofagia que lleva a la muerte celular. En cambio, el tratamiento de ApoE2 y ApoE3 protege a la célula del efecto del neurotóxico mediante la activación de la autofagia. Abstract. Apolipoprotein E (ApoE) carries cholesterol and other lipids, within both, the plasma, and the central nervous system. It binds to APOE receptors in order to control lipid homeostasis. There are three ApoE alleles in humans (ApoE2, 3 y 4). Although ApoE4 has been defined as a risk factor in Alzheimer’s diseases, the molecular effects associated to ApoE4 have not been fully described. The main purpose of the research is to study the differential effects of APOE isoforms in the survival and autophagy pathways under a neurotoxic model context. The first part of the experiments was focused to find out the CAD line’s reaction to the ApoE isoforms during the differentiation. In order to achieve it, the differentiation cells were incubated during a 24 hours period with ApoE isoforms. The second part of the process showed the ApoE reaction in neurotoxic context. To obtain it, the differentiated cells were incubated with the ApoE 2, 3 and 4. After 1 hour of pre-­‐treatment with ApoE,ceramide was added for incubation process during 24 hours. Mitochondrial metabolism was measured by MTT assay and cell survivor by LDH assay. Equally, protein’s expression was evaluated by Western blot’s technique in order to quantify proteins presence and immunofluorescences, so to finally detect, autophagosomes. When differentiated CAD cells were treated with ApoE 4, the first model showed an increase in MTT assay. In what cell viability is concerned, it was fairly similar to the Control one. Now, the increase in MTT assay is associated with an increase in the phosphorylation level of AKT(Ser 473), ERK 1-­‐2 (Thr 202/Tyr 204) and p38 (Thr180/Tyr 182); AMPK decreased and the autophagy was inhibited in comparison to ApoE2 and 3, where autophagy was activated. These results suggest that the isoform ApoE 4 generated an increase in the ROS causing cellular stress pathways as p38 and ERK. The autophagy inhibition in this treatment allows accumulation damage and cell sensitization to cell death, showed in the next model studied. The ApoE 4 and ceramide treatment causes a cellular viability decrease and the ApoE 2 and 3, does not. In the same way, it decreases in the phosphorylation level of AKT and AMPK, compared to ApoE2-­‐ceramide and ApoE3-­‐ceramide treatments. The presences of the phosphorylation of ERK protein does not show a significant variation in the treatments; phosphorylation of p38 variation is mainly revealed in ApoE 2 and 3-­‐ ceramide treatments. Finally, these results suggest that ApoE4-­‐ceramide treatment raises metabolism, and cellular stress response associated to activation of the p38 pathway (maybe associated to an increase production of ROS). Inhibition of autophagy is associated to cellular death whereas ApoE 3 and ApoE 2-­‐ceramide treatment protects cells from the neurotoxic effect through autophagy’s activation. Maestría

La sepsis es un evento inflamatorio generalizado del organismo inducido por un daño causado generalmente por un agente infeccioso. El patógeno más frecuentemente asociado con esta entidad es el Staphylococcus aureus, responsable de la inducción de apoptosis en células endoteliales debida a la producción de ceramida. Se ha descrito el efecto protector de la proteína C activada (PCA) en sepsis y su relación con la disminución de la apoptosis de las células endoteliales. En este trabajo se analizó la activación de las quinasas AKT, ASK1, SAPK/JNK y p38 en un modelo de apoptosis endotelial usando las técnicas de Western Blotting y ELISA. Las células endoteliales (EA.hy926), se trataron con C2-ceramida (130μM) en presencia de inhibidores químicos de cada una de estas quinasas y PCA. La supervivencia de las células en presencia de inhibidores químicos y PCA fue evaluada por medio de ensayos de activación de las caspasas 3, 7 y 9, que verificaban la muerte celular por apoptosis. Los resultados evidencian que la ceramida reduce la activación de AKT y aumenta la activación de las quinasas ASK, SAPK/JNK y p38, en tanto que PCA ejerce el efecto contrario. Adicionalmente se encontró que la tiorredoxina incrementa la activación/fosforilación de AKT, mientras que la quinasa p38 induce la defosforilación de AKT. Sepsis is a generalized inflammatory event induced by the damage produced by an infectious agent. The pathogen most commonly associated with sepsis is Staphylococcus aureus, responsible for the induction of apoptosis in endothelial cells due to the production of ceramide. It has been previously described the protective effect of activated protein C (APC) in sepsis and its relation to the reduced apoptosis of endothelial cells. In this work, the activation of AKT, ASK1, SAPK / JNK and p38 kinase, in a model of endothelial apoptosis, was analyzed using the techniques of Western Blotting and ELISA. Endothelial cells (EA.hy926), were treated with C2-ceramide (130μM) in the presence of chemical inhibitors of each of these kinases and PCA. The survival of the cells in the presence of chemical and PCA inhibitors was evaluated by fluorescent assays of the activation of caspases 3, 7 and 9. The results showed that the ceramide reduced AKT activation and increases activation of ASK, SAPK / JNK and p38 kinases, whereas PCA exerts the opposite effect. Additionally, it was found that the thioredoxin increases the activation / phosphorylation of AKT, whereas p38 kinase induces AKT dephosphorylation.

La enfermedad de parkinson está caracterizada por apoptosis de neuronas dopaminérgicas, la ceramida esta implicada en este evento apoptótico. La Proteína C Activada (PCA) presenta un efecto antiapoptótico en células neuronales primarias murinas y disminuye la perdida neuronal en conejos con daño isquémico induciendo un aumento en la fosforilación de la proteína de supervivencia AKT. Esta investigación tiene el propósito de evaluar el efecto antiapoptótico de PCA en células neuronales dopaminérgicas CAD ante la exposición a C2-ceramida y la mediación de la vía PI3K-AKT en este proceso. Las células fueron diferenciadas por cuatro días en ausencia de suero fetal bovino, se aplicó PCA (100 nM, 12 horas) y luego C2-ceramida (25 uM, 6 horas) se determino la viabilidad mediante el ensayo de MTT, la apoptosis mediante el ensayo de la actividad enzimática de la Caspasa-3 y la condensación del ADN por tinción de Hoechst, la detección de la fosforilación de AKT se realizó mediante Western blot empleando quimioluminiscencia. Los resultados demuestran que el pretratamiento con PCA aumenta la viabilidad, disminuye la actividad de caspasa-3 y aumenta la fosforilación de AKT en células tratadas con C2-ceramida, sugiriendo disminución de apoptosis mediante activación de la vía PI3K-AKT. / Abstract. Parkinson disease is characterized by apoptosis in dopaminergic neurons. Ceramide is involved in this apoptotic event. Protein C (PCA) prevents apoptosis in primary murine neuronal cells and decreases neuronal loss in rabbits with ischemic damage by inducing an increase in phosphorylation of AKT, an survival protein. This research aims to assess the antiapoptotic effect of PCA in dopaminegic neuronal cells CAD against exposure to C2-ceramide and implication of PCA in PI3K-AKT pathway. Cells were differentiated by four days without Phoetal Bovine Serum; they were treated with PCA (100 nM, 12 hours) and then C2-ceramide (25 uM, 6 hours); Viability was determinated by MTT; Apoptosis was tested by Caspase-3 activity assay and DNA condensation by Hoechst stain. Phosphorylated AKT was detected by Western blot. The results demonstrated pre-treatment with PCA increases the viability, reduces the activity of Caspase-3 and increases the phosphorylation of AKT cells treated with C2-ceramida, suggesting an decrease in apoptosis through activation of PI3K-AKT pathway. Maestría

Sphingosine kinase signalling in immune cells (Vit Olivier, Patricia; Melendez, Alirio J. y Hwee Kee, Tay) Abstract 1. Sphingolipids are potent second messengers modulating biochemical intracellular events and acting as ligands to mediate extracellular systems. Sphingosine kinase (SPHK) is the enzyme that phosphorylates sphingosine into sphingosine- 1-phosphate (S1P), a potent bioactive sphingolipid. 2. The fact that SPHK is highly conserved from protozoa to mammals and is ubiquitous in living tissues reveals important roles of the SPHK pathway for the maintenance of health maintenance. This is also supported by comprehensive reviews on features of its main product, S1P, as having intracellular as well as extracellular roles, inducing a wide range of physiological responses from triggering Ca2+ release from internal stores to promoting growth and cell motility. 3. Immune cell activities have been shown to be modulated by the dynamic balance between ceramide, sphingosine and S1P, conceptualized as a rheostat. Cell proliferation, differentiation, motility and survival have been attributed to the regulatory actions of S1P. The properties of SPHK activity in immune cells are linked to the functions of triggered growth and survival factors, phorbol esters, hormones, cytokines and chemokines, as well as antigen receptors, such as Fc y RI and FceRI. 4. Mechanisms of the SPHK signalling pathway are explored as new targets for drug development to suppress inflammation and other pathological conditions. Key words: immune cells, inflammation, lymphocytes, mast cells, monocytes/ macrophages, neutrophils, signalling, sphingosine kinase, sphingosine-1-phosphate. Artículo publicado en Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology.(2005) 32, 153-161. vit@ula.ve Nivel monográfico

En este trabajo se presenta un análisis detallado de los inositolfosfolípidos (IPLs) de células epimastigotes de T. cruzi y de la variación de lípidos libres durante elproceso de diferenciación celular de trypomastigotes a amastigotes y a epimastigotes. Los IPLs están formados por dos componentes que se caracterizaron comofosfatidilinositol (PI) e inositolfosfoceramida (IPC). El PI está constituido pordiacilglicerol y 1-0-alquil-2-acilglicerol y la IPC por N-palmitoildihidroesfingosina, N-palmitoilesfingosina, N-estearoildihidroesfingosina y N-estearoilesfingosina. Testigos de alquilacilgliceroles, no disponibles comercialmente, fueronsintetizados por dos métodos, uno enzimático y otro químico. Durante la diferenciación de trypomastigotes a amastigotes hay un aumento dela ceramida libre, principalmente palmitoildihidroesfingosina, que coincide con laliberación progresiva de la glicoproteína Ssp-4, antígeno de superficie específico decélulas amastigotes, que se encuentra anclado por GPI. La porción lipídica del ancla deesta glicoproteína se identificó como la palmitoildihidroesfingosina; lo que abre laposibilidad de que la ceramida juegue algún rol en la diferenciación celular. Se determinó la presencia en membranas de T. cruzi de fosfolipasas A1, A2, C yde aciltransferasas. También se estudió el primer paso de la biosíntesis de las anclas GPI, es decir,la incorporación de GlcNH2 a partir de UDP-[3H]GlcNAc y se descartó a la IPC comoaceptora de GlcNH2 para la formación de anclas con ceramida. Este resultado indicaríaque las fosfolipasas identificadas estarían involucradas en procesos de remodelaciónde los lípidos de los GIPLs que son utilizados para la construcción de anclas GPI. Este trabajo contribuye al conocimiento de las estructuras y del caminobiosíntético de los GPI de T. cruzi que anclan, a la membrana, glicoproteínasinvolucradas en procesos de diferenciación, reconocimiento y penetración celular. Lainhibición del anclaje de estas glicoproteínas a la membrana constituye una alternativaatractiva como quimioterapia contra la enfermedad de Chagas. A detailed analysis of inositolphospholipids (IPLs) from epimastigote cells of T.cruzi, and the regulated expression of free lipids during the cellular differentiationprocess from trypomastigotes to amastigotes and epimastiogtes is presented. The IPLsare formed by two components that were characterized as phosphatidylinositol (PI)and inositolphosphoceramide (IPC). The PI has a diacylglycerol and an l-O-alkyl-2-acylglycerol,and the IPC is constituted by N-palmitoyldihydrosphingosine, Npalmitoylsphingosine, N-stearoyldihydrosphingosine and N-stearoylsphingosine as thelipid moiety. The alkylacylglycerols needed as standards were synthesized by two differentchemical and enzymatic methods. During the differentiation of trypomastigotes to amastigotes, there is an increase offree ceramides, mainly palmitoyldihydrosphingosine. This is coincident with the progressiveshedding of the Ssp-4 glycoprotein, a surface antigen specific of amastigote cells, that isanchored through GPI. The lipid moiety of this glycoprotein anchor was identified aspalmitoyldihydrosphingosine, which suggests that ceramide plays a role in cellulardifferentiation. The presence of phospholipases Al, A2,C and acyltransferases in T. cruzi membraneswas ascertained. The two latter activities were also proved on IPC. The incorporation of GlcNH2 from UDP-[3H]-GlcNAc, the first step of the GPIanchor biosynthesis, was also studied. The possibility of IPC acting as acceptor of GlcNH2 toform anchors with ceramides was disproved suggesting that the identified phospholipasesmay be involved in the process of remodelling GIPLs used in the formation of GPI anchors. This thesis contributes to the knowledge of structures and biosynthetic pathways of T.cruzi GPIs that anchor membrane glycoproteins involved in cellular differentiation,recognition and penetration processes. Inhibition of the anchoring to membranes, is anatractive alternative in Chagas disease chemoterapy. Fil: Bertello, Laura Elena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.