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Fil: Achkar, Natalia Patricia. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. Las plantas, como organismos foto-autótrofos y sésiles, deben superar las fluctuaciones ambientales, entre ellos la cantidad y calidad de luz, que desafian su supervivencia. Para esto, las mimas reprograman su desarrollo en busqueda de una fuente de luz adecuada. Tal plasticidad está orquestada a nivel transcripcional por la expresión y represión de factores de transcripción específicos, que son frecuentemente blancos del silenciamiento mediado por micro-ARNs (miARNs). En este trabajo mostramos que las plantas inhiben la biogénesis de miARNs durante largos períodos de luz limitada, seguido de una recuperación rápida después de la restauración de luz, para orquestar el desarrollo de la planta en respuesta a la transición oscuridad/luz. La forma activa desfosforilada del factor de biogénesis de miARNs HYL1 es degradada durante la privación de luz, mientras que una reserva inactiva de proteína fosforilada permanece protegida dentro del núcleo. La degradación del componente activo de HYL1 conduce a la liberación de silenciamiento génico que desencadena el desarrollo característico de la respuesta de la planta a oscuridad. Tras la restauración de luz, una desfosforilación rápida de las reservas de HYL1 conduce a la reactivación de la biogénesis de miARNs, un cambio en el programa de desarrollo y la activación de la respuesta fotomorfogénica. Además, encontramos que la fosforilación de HYL1 en su dominio C-terminal y la variación en su longitud podrían tener funciones reguladoras en la proteína, probablemente modificando su afinidad para interactuar con componentes de la vía de biogénesis de miARNs o de las vías de señalización de luz azul. As photo-autotrophic and sessile organisms, plants depend on light, a resource that may become scare in nature. To overcome such environmental fluctuations, plants reprogram their development to adjust their growth in search for a proper light source. The developmental plasticity of plants is orchestrated at the transcriptional level by the expression and represion of specific transcription factors, which in turn are common targets of miRNA-mediated silencing. The regulation of the miRNA biogenesis is not an unusual phenomenon. In this thesis, we show that plants rely on a microRNA (miRNA) biogenesis shutdown during long periods of limited light, followed by a quick recovery after light restoration, to orchestrate the plant development in response to dark/light transition. Mechanistically, an active form of the miRNA biogenesis factor HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1) is degraded during light deprivation while an inactive pool of phosphorylated protein remains protected inside the nucleus. Degradation of the active HYL1 component leads to the release of gene silencing, triggering the developmental features characteristic of the plant response to dark. Upon light restoration, a quick dephosphorylation of the HYL1 reserve pool leads to the reactivation of miRNA biogenesis, a switch in the developmental program and the activation of the photomorphogenic response. Additionally, we found that the phosphorylation of the C-terminal region of HYL1 also appears to have regulatory roles on the protein activity. Such protein modification and the length of this domain impact the affinity of HYL1 with other interacting partners of either the miRNA or the blue light signaling pathways. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Fil: Rojas, Bruno Ezequiel. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. La fosfoenolpiruvato (PEP) carboxiquinasa dependiente de ATP (PEPCKasa, EC 4.1.1.49) es una enzima citosólica que cataliza la descarboxilación reversible del oxaloacetato a PEP. En plantas, esta enzima posee múltiples funciones: i) es parte de los mecanismos de concentración del CO2 que operan en la fotosíntesis C4 y CAM, ii) participa en las respuestas al estrés biótico y abiótico, iii) está involucrada en el metabolismo del nitrógeno y de los aminoácidos y iv) juega un rol clave en la gluconeogénesis. En esta Tesis, estudiamos las PEPCKasas presentes en Arabidopsis thaliana: la AthPEPCKasa1 (At4g37870) y la AthPEPCKasa2 (At5g65690). Realizamos la caracterización cinética, estructural y regulatoria de las proteínas recombinantes expresadas en Escherichia coli. Describimos la regulación alostérica de estas enzimas por metabolitos y dipéptidos. También estudiamos la regulación postraduccional de la AthPEPCKasa1 por proteólisis, óxido reducción y fosforilación. En todos los casos, los resultados se discutieron en un escenario metabólico. Por otra parte, se desarrolló un método fluorométrico para medir actividad quinasa de proteínas. También clonamos y la caracterizamos las quinasas de proteína recombinantes SnRK1 de Arabidopsis thaliana y SOS2 de Malus domestica. Además, estas quinasas se utilizaron para estudiar la fosforilación de enzimas involucradas en el metabolismo del carbono en plantas. En conjunto, los resultados obtenidos en esta Tesis profundizaron el conocimiento sobre la regulación del metabolismo del carbono en plantas por mecanismos postraduccionales. Anticipamos que nuestros resultados abrirán nuevas perspectivas en la regulación del metabolismo vegetal, en especial en la gluconeogénesis y la síntesis de azúcares alcoholes. ATP-dependent phosphoenolpyruvate (PEP) carboxykinase (PEPCK, EC 4.1.1.49) is a cytosolic enzyme that catalyzes the reversible decarboxylation of oxaloacetate to PEP. In plants, this enzyme has multiple functions: i) is part of the mechanisms of CO2 concentration operating in C4 and CAM photosynthesis, ii) participates in biotic and abiotic stress responses, iii) is involved in nitrogen and amino acids metabolisms, and iv) plays a crucial role in gluconeogenesis. In this Thesis, we studied in detail the PEPCKs present in Arabidopsis thaliana: AthPEPCK1 (At4g37870) and AthPEPCK2 (At5g65690). We performed the kinetic, structural, and regulatory characterization of the recombinant proteins expressed in Escherichia coli. We described the allosteric regulation of these enzymes by metabolites and dipeptides. Also, we studied the post-translational regulation of AthPEPCK1 by proteolysis, oxidation-reduction, and phosphorylation. In all cases, the results obtained were discussed in a metabolic scenario. On the other hand, we developed a fluorometric assay to measure protein kinase activity. Also, we cloned and characterized the recombinant protein kinases SnRK1 from Arabidopsis thaliana and SOS2 from Malus domestica. These kinases were then employed to study the phosphorylation of enzymes involved in plant carbon metabolism. Altogether, the results obtained in this Thesis deepen the knowledge regarding the regulation of carbon metabolism in plants by post-translational modifications. We anticipate that our results will open new perspectives on plant metabolism regulation, especially for gluconeogenesis and the synthesis of sugar alcohols. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Universidad Nacional del Litoral

Fil: Ferrero, Danisa María Luján. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. En las semillas, el metabolismo es principalmente heterotrófico y depende de la sacarosa que proviene de los tejidos fotosintéticos para suplir sus necesidades metabólicas. El desarrollo de las semillas se caracteriza por variaciones en el flujo del carbono, primeramente, destinado a solventar la formación del nuevo tejido, y posteriormente destinado a la acumulación de compuestos de reserva. Todo este desarrollo está genéticamente programado y numerosas señales inducen cambios en el metabolismo, donde las quinasas de proteínas juegan un rol fundamental, regulando postraduccionalmente por fosforilación a diferentes actores del metabolismo. Para contribuir al conocimiento de la regulación global del metabolismo y la partición del carbono en tejidos heterotróficos de plantas, nos focalizamos en evaluar la regulación alostérica y la ocurrencia de la fosforilación de enzimas claves. Además, estudiamos las quinasas de proteínas involucradas. Obtuvimos resultados novedosos para la ADP-glucosa pirofosforilasa de endosperma de trigo, enzima clave para la síntesis de almidón. La caracterización bioquímica de la enzima recombinante se condijo con los resultados para la misma enzima purificada de fuente. En un análisis comparativo a lo largo del desarrollo de semillas de trigo y de ricino, determinamos que esta enzima únicamente se fosforila en semillas de trigo, específicamente por quinasas dependientes de calcio. La información obtenida abre líneas de investigación para comprender la síntesis de almidón en semillas de cereales. Estos estudios serán importantes para el diseño de estrategias y herramientas biotecnológicas para mejorar los rendimientos de cultivos de interés agronómico y considerar la aplicación del almidón en biocombustibles y bioplásticos. Seed metabolism is mainly heterotrophic and depends on the sucrose synthesized from photosynthetic tissues to supply its metabolic needs. Seed development is characterized by variations in the carbon flux, destined, firstly, to solve the formation of the new tissue, and later, to accumulate reserve compounds. This development is genetically programmed and numerous signals induce changes in metabolism, where protein kinases play a fundamental role, post-translationally regulating different metabolism actors by phosphorylation. To contribute to the knowledge in global regulation of metabolism and carbon partitioning in heterotrophic tissues of plants, we focused on evaluating allosteric regulation and the occurrence of phosphorylation of key enzymes. Furthermore, we studied the protein kinases involved. We obtained novel results for wheat endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase, a key enzyme in the biosynthesis of starch. The biochemical characterization of the recombinant enzyme was consistent with the results for purified enzyme from endosperm. In a comparative analysis throughout the development of wheat and castor beans seeds, we determined that this enzyme is only phosphorylated in wheat seeds, specifically by calcium-dependent kinases. The information obtained opens lines of research to understand the synthesis of starch in cereal seeds. These studies will be important for the design of biotechnological strategies and tools to improve the yields of crops and consider the application of starch in biofuels and bioplastics. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas Universidad Nacional del Litoral

[ES] El cáncer es una enfermedad poligénica, altamente heretogénea y de causas diversas. A partir del año 2000 se propusieron diferentes características distintivas (“cancer hallmarks”) que son comunes a los distintos tipos de cáncer. Entre ellas el valor de pH intra- y extracelular, más alcalino en el citosol y más ácido en el exterior que en células normales. El pH intracelular alto está relacionado con la regulación del crecimiento celular y la proliferación. Uno de los elementos involucrados en la regulación del pH intracelular es el sistema de expulsión de protones del citoplasma, que en caso de la levadura es la bomba de protones, o H + -ATPasa de la membrana plasmática Pma1, mientras que en células animales es NHE1, un antiportador de H + /Na+ menos potente que Pma1. Se ha demostrado que la expresión ectópica de Pma1 en fibroblastos de ratón aumenta el pH intracelular y causa transformación tumorogénica. TORC1, un complejo regulador del crecimiento en todos los eucariotas, está activado por pH intracelular alto, explicando el efecto de este parámetro sobre el crecimiento celular. En este trabajo se propone un modelo en Saccharomyces cerevisiae para estudiar el conjunto de funciones reguladoras de la homeostasis del pH, teniendo en cuenta los elementos descritos anteriormente. Para estudiar la relación entre el pH intracelular y el crecimiento se estudiaron los diferentes perfiles de crecimiento en la cepa silvestre y en mutantes con pérdida de función, en los cuales se compararon los valores obtenidos para la velocidad de crecimiento, el rendimiento y la duración de la fase Lag de las levaduras al suministrarles ácidos débiles. También se determinó el valor de pH intracelular de las cepas de interés y su variación al tratarlas con ácidos débiles como el acético. Por otro lado, para estudiar el papel de la fosfatasa Sit4 como posible regulador de la bomba de protones Pma1, se analizaron a través de la técnica Western Blot los niveles de fosforilación de los residuos Ser507 y Ser899 de Pma1 en la cepa silvestre y en la cepa mutante sit4Δ con presencia y ausencia de glucosa. Sit4 es regulada directamente por el complejo TOR y se estima que pueda tener un papel importante en la regulación de la homeostasis de pH intracelular. Por último se estudió el papel del gen SSD1 como estabilizador de los mensajeros de las ciclinas de la fase G1 del ciclo celular, como posible diana de la regulación de la proliferación., [EN] Cancer is a polygenic and highly heterogeneous disease with diverse causes. Since 2000, different cancer hallmarks that are common to different types of cancer have been proposed. Among them is the intracellular and extracellular pH value, more alkaline in the cytosol and more acid in the exterior than normal cells. High values of intracellular pH are related to the regulation of cell growth and proliferation. One of the main elements involved in the pHi regulation is the proton expulsion system, which in the case of yeast is the proton pump, or H + - ATPase of the plasma membrane Pma1, whereas in animal cells it is NHE1, a H + /Na+ antiportrier less potent than Pma1. Ectopic expressión of Pma1 in mouse fibroblasts has been shown to increase intracellular pH and cause tumorogenic transofrmation. TORC1, a growth regulator complex in all eukaryotes is activated by high intracellular pH, explaining the effect of this parameter in cell growth. In this study, we propose a model in Saccharomyces cerevisiae, to study the set of regulatory functions of pH homeostasis, taking into account the elements described above. In order to study the relationship between intracellular pH and growth, different growth profiles were studied in the wild strain and mutants with loss of function, in which the values obtained for growth rate, yield and lag phase were compared between yeasts by supplying them with weak acids. The intracellular pH value of the strains of interest and their variation were also determined by treating them with weak acids, such as acetic acid. On the other hand, to study the role of the phosphatase Sit4 as a possible regulator of the proton pump, the phosphorylation levels of residues Ser507 and Ser899 of Pma1 were analyzed through Western Blot technique in the wild strains and sit4Δ with presence and absence. Sit4 is directly regulated by the TOR complex and is estimated to have an important role in the regulation of pHi homeostasis. Finally, the role of the SSD1 gene as a stabilizer of cyclin messengers of the G1 phase of the cells cycle was studied as a possible target for the regulation of proliferation.

En esta tesis doctoral se ha descrito que la proteína intracelular STIM1 se regula por fosforilación en los aminoácidos Ser575, Ser608 y Ser621. Esta fosforilación es llevada a cabo por las quinasas ERK1/2, y la fosforilación permite la activación de STIM1 para actuar como sensor de los niveles de Ca2+ intraluminales. La ausencia de esta fosforilación conlleva defectos en el nivel de multimerización de la proteína, y la ausencia de unión al canal de Ca2+ ORAI1, responsable de la entrada de Ca2+ extracelular hacia el citosol. Además, este trabajo pone de manifiesto que la fosforilación de STIM1 en los aminoácidos Ser575, Ser608 y Ser621 es necesaria para la disociación de la proteína de microtúbulos EB1, lo que le permite a STIM1 su reorganización hacia yuxtaposiciones del retículo endoplasmático y la membrana plasmática. Por otro lado el trabajo ha descrito que esta fosforilación de STIM1 es un mediador clave en la señalización celular iniciada por el factor de crecimiento epidérmico (EGF) en células de adenocarcinoma endometrial humano (células Ishikawa), de modo que la desfosforilación de STIM1 reduce significativamente la migración de estas células y la transición epiteliomesénquima estimulada por EGF. Finalmente el trabajo describe que la inhibición de la entrada de Ca2+ regulada por depósitos intracelulares (SOCE) mediada por la fitoalexina resveratrol es debida principalmente a la inhibición de la fosforilación de STIM1 y no a un efecto de bloqueo de los canales de Ca2+ regulados por STIM1., In this Doctoral Thesis we have described that STIM1, an endoplasmic reticulum Ca2+ sensor, is regulated by phosphorylation at residues Ser575, Ser608 and Ser621. The upstream kinase for this phosphorylation is ERK1/2. As a result of this phosphorylation STIM1 becomes fully activated to act as a Ca2+ sensor by letting phosphoSTIM1 to multimerize and to bind to the Ca2+ channel ORAI1, which is the channel that mediates the Ca2+ influx to the cytosol in response to Ca2+-store depletion. In this regard, a defective phosphorylation abrogates the multimerization and the binding to ORAI1. Moreover this work demonstrates that phosphorylation of STIM1 at Ser575, Ser608 and Ser621 is required for the dissociation from the microtubule growing end regulator EB1. This dissociation let STIM1 to relocalize in endoplasmic reticulum-plasma membrane juxtapositions. On the other hand, this Thesis describes that phospho-STIM1 is a key mediator in the signalling pathway triggered by the epidermal growth factor (EGF) in Ishikawa cells (endometrial adenocarcinoma cells), and dephospho- STIM1 inhibits cell migration and epithelial-mesenquimal transition in response to EGF. Finally, this work describes that the phytoalexin resveratrol inhibits of storeoperated calcium entry by inhibiting the phosphorylation of STIM1 and not by acting as a Ca2+ channel blocker.

La enfermedad de Alzheimer es un desorden neurodegenerativo que se caracteriza por la presencia de los denominados ovillos neurofibrilares que son depósitos intraneuronales compuestos principalmente por la proteína asociada a microtúbulos Tau hiperfosforilada y proteolizada. En el presente trabajo hemos estudiado los mecanismos que regulan las modificaciones postraduccionales de Tau inducidas por el estrés hiperosmótico e inflamatorio. Nuestros resultados muestran que sólo el estrés hiperosmótico induce la proteólisis de Tau y la apoptosis y que estos efectos están mediados por la activación de las caspasas 6 y 3, través de un mecanismo en el que están implicadas las quinasas JNKs. En este trabajo estudiamos el efecto del estrés hiperosmótico y la neuroinflamación sobre los niveles y la fosforilación de Tau y las vías de señalización intracelular implicadas en este proceso. Nuestros resultados muestran que sólo el tratamiento con TNF-α induce la expresión génica de Tau y que ambos tipos de estreses promueven su fosforilación en los residuos Thr-50, Thr-181 y Thr-205 mediada principalmente las quinasas p38 y las JNKs. Adicionalmente, analizamos distribución de la proteína Tau fosforilada y sin fosforilar y comprobamos que ambos tipos de estreses promovían la acumulación de Tau en el soma de la célula (citoplasma y núcleo) y que modificaban la localización de las formas fosforiladas de Tau de una manera específica del residuo fosforilado. También comprobamos que las modificaciones en la fosforilación y la localización de Tau en respuesta al estrés hiperosmótico se acompañaban de la desorganización del citoesqueleto y que las promovidas por la inflamación producían una disminución en el transporte axonal. Por último, el análisis funcional de Tau mutada en los residuos Thr-50 y Thr-69 realizado en las células HEK-293 y PC-12 diferenciadas nos indica que ambos residuos son esenciales para su funcionalidad., Alzheimer’s disease is a degenerative brain disorder characterized neuropathologically by the presence of neurofibrillary tangles, which are intracellular aggregates of hyperphosphorylated and proteolyzed Tau, a protein associated to microtubules. In this work we studied the mechanisms that regulate the posttranslational modifications of Tau induced by hyperosmotic stress and neuroinflammation. Our results show that only the hyperosmotic stress promotes Tau proteolysis and apoptosis in SH-SY5Y cells. These effects are mediated by the activation of caspases 6 and 3 through a mechanism that involved JNKs. We also studied the effect of hyperosmotic stress and neuroinflammation on Tau expression and phosphorylation and the signaling pathways involved. Our results show that only TNF-α treatment increases Tau expression and that both stimuli induce Tau phosphorylation at Thr-50, Thr-181 and Thr-205. This last process is regulated mainly by p38s and JNKs. Additionally, we analyzed Tau distribution (phosphorylated or not) and we observed that both stresses promote Tau accumulation in soma (in cytoplasma and nucleus), and also modify the location of phosphorylated Tau in a site-specific manner. We showed also that modifications of Tau phosphorylation and distribution in response to hyperosmotic stress were associated to cytoskeleton disorganization and that inflammation impairs axonal transport.

[ES] La H+-ATPasa de la membrana plasmática de la levadura Saccharomyces cerevisiae (Pma1) regula el crecimiento celular por energizar la entrada de nutrientes y por modular el pH intracelular y extracelular. Los principales factores ambientales que regulan su actividad son la fuente de carbono (glucosa que es fermentable e induce crecimiento rápido activa más que etanol que es respirable e induce crecimiento lento) y el pH del medio (pH ácido externo activa). La activación va unida a doble fosforilación de Ser911 Thr912 en el dominio inhibidor carboxi-terminal de la enzima pero se desconocen las kinasas y fosfatasas involucradas. En este proyecto se utilizará un método de filtración rápida de los cultivos seguida de inmersión de las células en nitrógeno líquido para preservar el estado fisiológico de Pma1. Se investigará el efecto de rapamycin (inhibidor de TOR), de temperatura no permisiva en un mutante termosensible de TOR, de un mutante en Tco89 (una subunidad de TOR) y en mutantes en dos proteínas esenciales redundantes, la proteína fosfatasa Sit4 y la proteína de unión a RNA Ssd1. Está última ha sido relacionada recientemente con tolerancia a acidificación intracelular. Todas estas proteínas tienen en común el promover el crecimiento celular, probablemente a través de aumentar el pH intracelular y estos estudios sirven de modelo para el papel del pH intracelular en el crecimiento rápido de las celular tumorales., [EN] Yeast plasma membrane H+-ATPasa (Pma1) regulates cell growth by energizing nutrient uptake and modulating intracellular pH (together with potassium transport). Main factors regulating Pma1 are carbon source (glucose activates and induces fast growth and fermentative metabolism) and external acid pH. Activation of PMa1 correlates with double phosphorylation of Ser-9141 and Thr-912 within the inhibitory carboxy-terminal domain of the enzyme. The nature of the protein kinases and phosphorylation sites such as Ser507 are not known. This project has investigated the activity of Pma1 in strains with null mutations in the genes SSD1, SIT4 and TCO89. The RNA-binding protein Ssd1 has been identified as a positive factor for cell growth and for tolerance to intracellular acidification and it exhibits synthetic lethality with protein phosphate Sit4. Tco89 is a subunit of protein kinase TORC1, a master regulator of growth that is hyper-activated in cancer cells. The role of TORC1 in Pma1 activity has been investigated with the specific inhibitor rapamycin and with the effect of non-permisive temperature in a thermosensitive mutant of TOR. All these regulatory proteins have in common to promote cell growth and division, probably by increasing intracellular pH by activating PMa1 and potassium transport (Sit4 and TORC1). They could also reinforce cellular systems inhibited by intracellular acidification. Our results suggest that there is a regulation of the H+-ATPasa of the plasma membrane by TOR and protein phosphatase Sit 4. These studies with the yeast system serve as a model for the homeostasis of intracellular pH during the fast growth of tumor cells.

[EN] One of the most studied regulatory systems of protein synthesis in eukaryotic cells is based on the inactivation of the eIF-2 translation initiation factor, by phosphorylation of its α subunit. Throughout the last decades, several protein kinases responsible for eIF-2α phosphorylation have been identified and characterized; they are activated under different experimental conditions, such as lack of nutrients (limiting levels of free amino acids) or the presence of double-stranded RNA. Preliminary data from the laboratory suggested that Li+ inhibits at least one of the kinases, HCI (hemin controlled inhibitor), that is activated in rabbit reticulocytes lysates in the absence of hemin or, independently, by oxidation of –SH groups in the protein. The project´s objective is to develop the methodology required to confirm this hypothesis, once partially purified fractions of the kinase and the initiation factor have been obtained. If this is achieved, we would be closer to know whether HCI would join the known targets of lithium: inositol monophosphatases and glycogen synthase kinase-3 (or its Drosophila counterparts, the shaggy kinase)- whose inhibition is assumed to be responsible for the varied physiological effects of this cation., [ES] Uno de los sistemas más estudiados de regulación de la síntesis de proteínas en células eucarióticas se basa en la inactivación del factor de iniciación de la traducción eIF-2, por fosforilación, de su subunidad α. A lo largo de las últimas décadas, se han identificado y caracterizado varias proteínas quinasas, responsables de la fosforilación de eIF-2α, que se activan en distintas condiciones experimentales, como por ejemplo el ayuno (niveles limitantes de aminoácidos libres) o la presencia de RNA de doble cadena. Datos preliminares del laboratorio sugieren que el Li+ inhibe al menos una de estas quinasas, el HCI (hemin controlled inhibitor), que se activa en lisados de reticulocitos de conejo en ausencia de hemina o, independientemente, por oxidación de grupos –SH de la proteína. El objetivo del proyecto es poner a punto la metodología necesaria para confirmar esta hipótesis, una vez se hayan obtenido las fracciones parcialmente purificadas del HCI y del factor de iniciación. De lograrse este objetivo, estaríamos más cerca de saber si HCI se uniría a las dianas conocidas del litio- las inositol monofosfatasas y la glucógeno sintasa quinasa-3 (o sus homólogos, de Drosophila, las quinasas shaggy) – cuya inhibición, se asume, es la responsable de los variados efectos fisiológicos de este catión tóxico.

Esta Tesis Doctoral recoge el trabajo realizado por el doctorando en el campo de la N-glicosilación de proteínas. La N-glicosilación es una modificación post-traduccional de las proteínas de sumo interés e importancia puesto que afecta a su estabilidad y función. También está relacionada con determinadas enfermedades humanas como los Desórdenes Congénitos de Glicosilación (CDG). Los Capítulos I y II se centraron en la búsqueda a escala genómica, identificación y análisis funcional de genes de Saccharomyces cerevisiae implicados en el proceso de fosforilación de N-oligosacáridos. Se encontraron 199 genes cuya función es requerida, directa o indirectamente para el proceso mencionado. El Capítulo III recoge los estudios realizados sobre la influencia de la actividad de la V-ATPasa en las distintas etapas de la síntesis de N-oligosacáridos que se llevan a cabo en el Aparato de Golgi. Se ha encontrado que la actividad de esta enzima influye, de una forma determinante, fundamentalmente sobre los procesos que tienen lugar en la región de trans-Golgi. En el Capítulo IV se ha identificado el gen responsable de la mutación mnn3 y se ha caracterizado desde un punto de vista funcional. En el Capítulo V se analizaron y discutieron los cambios en los patrones de expresión génica globales de los mutantes mnn2 y mnn3, en relación con el patrón de la cepa silvestre. Por último, el Capítulo VI recoge un estudio sobre las características de los sitios de N-glicosilación en proteínas, con especial atención a los factores que afectan a su utilización como receptores de N-oligosacáridos. El trabajo incluye la incorporación de nuevos sitios de glicosilación en proteínas modelo, y el análisis de su grado de ocupación por N-oligosacáridos en estas proteínas. Parte del trabajo presentado en esta Tesis ha sido publicado en cuatro artículos científicos en revistas internacionales de prestigio.

Memoria presentada por Iria Barcia Sanjurjo, graduada en Ciencia y Tecnología de los Alimentos para optar al grado de Doctor en Bioquímica y Biología Molecular por la Universidad de Santiago de Compostela (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular) y realizada en el Instituto de Biología Molecular y Celular del Cancer de Salamanca., Esta Tesis Doctoral ha sido realizada dentro del Proyecto de Investigación Zimofeed: 08MMA003CT financiado por la Secretaria Xeral de Investigación e Desenvolvemento da Xunta de Galicia. Doña Iria Barcia Sanjurjo ha disfrutado de un contrato predoctoral financiado por la Vicerrectoría de Investigación e Innovación junto con el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela. La investigación en el laboratorio del Centro de Investigación del Cancer (CIC-C.S.I.C) ha sido financiada por los siguientes proyectos: Ministerio de Educación y Ciencia (SAF2004-02900; SAF2007-60242; CDS-2007-0017 y SAF2010-14935). Junta de Castilla y León, Consejería de Sanidad (SAN/673/SA05/08; BOCyL Nº 170). Junta de Castilla y León, Consejería de Educación (CSI14A08; CSI006A11-2 y grupo de excelencia GR-15). Kutxa-Fundación INBIOMED.

El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas perteneciente al género Potexvirus. Sugenoma está compuesto por una única molécula de ARN que codifica una replicasaviral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y la proteína de lacápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncional requerida para elmovimiento viral célula a célula en la planta hospedera. Se ha demostrado que esta MP es fosforilada en los residuos T193 y T214 por una quinasa tipo CK2. Diferenteslíneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puederegular la replicación y el movimiento viral. El objetivo de este trabajo fue estudiar elrol de la fosforilación en la regulación funcional de la proteína de movimiento TGBp1de PVX y en su interacción con la proteína de plantas remorina (REM). Para ello seconstruyeron por mutagénesis dirigida versiones de TGBp1 no fosforilables (T193A y T214A) y otras que simulan la fosforilación (T193D y T214D). En ensayos detranscomplementación de la movilización célula a célula de un virus defectivo paradicha función, se demostró que las modificaciones en ambas treoninas resultanperjudiciales en la complementación del movimiento viral. Se determinó que lafosforilación de TGBp1 en la T193 regula la estabilidad de esta proteína viral por mediode un mecanismo que involucra la presencia de una secuencia de degradación tipo PEST en el extremo C-terminal de dicha proteína. A través de la combinación deestudios que involucran el análisis comparativo in silico de varias TGBp1s de virus delos géneros Alpha y Betaflexiviridae y de estudios por mutagénesis dirigida, sedeterminó que la T193 y la secuencia PEST C-terminal se encuentran conservadas entodas las TGBp1s analizadas, sugiriendo que la fosforilación en la T193 de estas MPssería un mecanismo regulatorio de la estabilidad de dichas proteínas. Por otra parte, elanálisis funcional de las fosfomutantes T193 y T214 de TGBp1 determinó que lafosforilación en dichos residuos afecta negativamente la actividad supresora del PTGSde TGBp1. Los ensayos de interacción entre TGBp1 de PVX y la proteína REMdeterminaron que tanto el dominio N- como el C-terminal de TGBp1 son necesariospara la interacción y que la misma no es regulada por fosforilación en los residuos T193 y T214 de TGBp1. Por otro lado, este trabajo presenta las primeras evidenciasque la interacción entre distintas proteínas TGBp1s y REM se encontraría conservadaentre los virus que utilizan estrategias de movilización del tipo Triple Bloque de Genes (TGB). Los análisis realizados para determinar el efecto biológico de REM sobre la TGBp1 de PVX demostraron que la proteína REM no interfiere en la actividad del PTGSde esta proteína viral. Finalmente estudios de localización subcelular determinaronque la localización subcelular de TGBp1 es influenciada por la presencia de las otrasproteínas virales y que a su vez varía según si la proteína se encuentra fusionada en suextremo N- o C- terminal a GFP. Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome is basedon a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movementproteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capsid protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside thehost plant. Previously it has been demonstrated that TGBp1 is phosphorylated by a CK2-like kinase in T193A and T214 residues. Recent works on other plant viruses haveindicated that viral protein phosphorylation by host kinases can regulate processessuch us viral replication and mobilization. The aim of this work is to evaluate the roleof phosphorylation in regulating the functional activities of the movement protein TGBp1 of PVX and its interaction with the protein Remorin (REM). For this aimdifferent TGBp1 mutants have been developed by direct mutagenesis where theidentified threonines have been replaced by alanine (T193A and T214A) or aspartate (T193D and T214D) residues. The virus movement function of the phosphomutantswas assessed by complementation of PVX cell-to-cell movement in trans. It was shownthat all mutants were non-functional for virus movement, and that phosphorylation of T193 is essential for stability of the MP by a degradation mechanism that involves a PEST sequence at the C-terminus of TGBp1. Several experimental approaches involvingsequence comparison among TGBp1 homologues from viruses belonging to the Alphaand Betaflexiviridae genera and direct mutagenesis show that the T193 residue andthe PEST sequence are conserved among all TGBp1 analyzed, suggesting thatphosphorylation of T193 in these MPs could be a mechanism by which protein stabilityis regulated in several viruses. The results obtained in this work also have shown thatphosphorylation of T193 and T214 of TGBp1 negatively affects the PTGS suppressionactivity of this MP. Two-hybrid assays and pull down experiments demonstrated thatthe N- and C-term domain of TGBp1 are involved in the interaction between PVX TGBp1 and REM and that this interaction is not regulated by TGBp1 phosphorylation. In addition, this work presents the first evidence that the interaction between REMand other TGBp1s could be a conserved mechanism used by different TGB-containingviruses. The studies conducted to determine the biological effect of REM on TGBp1from PVX showed that REM protein does not interfere with PTGS- suppressing activityof TGBp1. Finally, sub-cellular localization studies demonstrated that TGBp1localization is influenced by the presence of other viral proteins and by the use of N- or C-terminal GFP fusion proteins. Fil: Binaghi, María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas, miembro tipo del género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codificauna replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y laproteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncionalrequerida para el movimiento viral de célula a célula en la planta hospedera. Diferenteslíneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puederegular la replicación y el movimiento viral. En este estudio, se demostró que laproteína TGBp1 es fosforilada por al menos una proteína quinasa, presente enextractos de plantas de Nicotiana tabacum infectadas con PVX y no infectadas, queposee características distintivas de la caseína quinasa 2 (CK2). El análisis en gelesbidimensionales de extractos de plantas infectadas permitió determinar que la proteína TGBp1 producida durante la infección viral presenta múltiples isoformas de diferentespuntos isoeléctricos; el tratamiento con fosfatasas de los extractos de plantasinfectadas indicó la presencia de isoformas fosforiladas. A través de la combinación deestudios de determinación de aminoácidos fosforilados por espectrometría de masa,comparación de secuencias aminoacídicas de TGBp1 de distintos virus y evaluaciónde la fosforilación in vitro de mutantes puntuales y de deleción de la proteína TGBp1,se identificaron tres probables sitios de fosforilación por la quinasa CK2 de N.tabacum: S-165, T-193, T-214. Se observó que la simulación de la fosforilación en losresiduos T-193 y T-214 regula negativamente la dispersión viral y la capacidad de laproteína TGBp1 de hidrolizar ATP. Los resultados sugieren firmemente que unaproteína quinasa de la familia de CK2 estaría involucrada en la fosforilación de TGBp1durante el curso de la infección viral de N. tabacum. Además, se discute el modo enque la fosforilación podría regular las actividades de la proteína TGBp1 durante lainfección viral. Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome isbased on a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movementproteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capside protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside thehost plant. Recent work on other plant viruses has indicated that viral proteinsphosphorylation by host kinases can regulate processes such us viral replication andmobilization. The results obtained during this Thesis work show that TGBp1 isphosphorylated by at least one kinase protein with properties characteristic of Caseinkinase 2 (CK2). This kinase activity is present in crude extracts prepared from bothnon-infected and PVX infected Nicotiana tabacum plants. Bi-dimensional gelexperiments with crude extracts from PVX infected plants showed that TGBp1expressed during infection presented several isoforms with different Isoelectricalpoints. Some of these isoforms were sensitive to phosphatase treatment, suggestingthat TGBp1 is phosphorylated in multiple residues. Several experimental approaches (mass spectrometer identification of phosphorylated aminoacids, sequence comparisonamong TGBp1 homologues from several viruses, and in vitro phosphorylationexperiments with mutated versions of TGBp1), allowed the identification of threepotential phosphorylation sites by recombinant alpha subunit N. tabacum CK2: S-165, T-193 and T-214. Mimicking phosphorylation on residues T-193 and T-214 had anegative impact on viral spreading and TGBp1 ATP hydrolysis activity. The results presented in this Thesis strongly suggest that a N. tabacum kinaseprotein belonging to CK2 family is involved in the phosphorylation of TGBp1 during PVX infection. How the phosphorylation regulates TGBp1 activities is discussed. Fil: Módena, Natalia A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Las MAP quinasas fosfatasas (MKPs) son componentes regulatorios importantes en aquellos procesos fisiológicos en los cuales participan las MAPKs debido a su capacidad de inactivar específicamente a estas enzimas. En este trabajo se analizó el rol funcional y la regulación transcripcional y post-traduccional de MKP-1 en células esteroidogénicas. Demostramos que hCG y AMPc incrementan los niveles de MKP-1 por mecanismos transcripcionales y post-traduccionales. Los resultados obtenidos indican que hCG/AMPc promueven la fosforilación de MKP-1 por acción de PKA y ERK1/2 y que esta modificación promueve su estabilización. También demostramos que esta fosfatasa se localiza tanto en núcleo como en mitocondrias. En lo que respecta al papel funcional de MKP-1, se comprobó que la expresión de MKP-1 inhibe la producción de esteroides por su capacidad de interferir con la inducción de StAR, una proteína clave para la esteroidogénesis. En conclusión, en este trabajo demostramos que LH/ACTH, además de promover la activación de enzimas necesarias para la síntesis de esteroides como ERK1/2, también dispara la activación de mecanismos que contribuyen a la inactivacion de esta enzima. Se concluye que el aumento en la expresión de MKP-1 y la estabilización de la proteína por acción de hCG/AMPc es un mecanismo clave para el cierre de la acción hormonal sobre la esteoidogénesis. MAP kinase phosphatases (MKPs) are important regulatory components in the physiological processes in which the MAPKs are involved, due to its ability to inactivate specifically these enzymes. In this study we have analyzed the functional role and transcriptional and post-translational regulation of MKP-1 in steroidogenic cells. We show that hCG and cAMP increase MKP-1 levels by transcriptional and posttranslational mechanisms. The results indicate that hCG/cAMP promotes MKP-1 phosphorylation by PKA and ERK1/2 action and that this modification promotes its stabilization. We also show that this phosphatase is localized in nucleus and mitochondria. Regarding the functional role of MKP-1, it was found that the expression of MKP-1 inhibits the production of steroids by its ability to interfere with the induction of StAR, a key protein for steroidogenesis. In conclusion, in this work we demonstrate that LH/ACTH, in addition of promoting the activation of ERK1/2, which is necessary for steroid synthesis, also triggers the activation of mechanisms that contribute to the inactivation of this enzyme. We show the increased expression of MKP-1 and stabilization of the protein by hCG/cAMP action, as a key mechanism for the closure of hormone action on steroidogenesis. Fil: Brion, Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La activación de Rap1b por la proteína de intercambio activada por AMPc (Epac) y sufosforilación mediada por la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA), son requeridas parala mitogénesis dependiente de AMPc. Sin embargo, el rol de la fosforilación permanece incierto. Evaluamos potenciales cambios conformacionales inducidos por la fosforilación de Rap1b, utilizando el intercambio hidrogeno/deuterio acoplado a espectroscopia de masa (DXMS)y cristalografía. Velocidades de intercambio hidrogeno/deuterio para Rap1b fosforilada (Rap1-P)y fosfomimética (Rap1-D) mostraron un perfil de intercambio idéntico, con velocidadesincrementadas en regiones discretas a lo largo de la proteína, incluyendo un dominio alrededordel sitio de fosforilación y la región efectora. La estructura cristalina de Rap1b-G12V-S179Dmostró que la presencia del S179D induce cambios en la interfase con los switch I y II. Nuestro segundo objetivo fue la búsqueda de efectores de Rap1b modulados porfosforilación. Entre los clones aislados por doble hibrido, se encontró la proteína asociada a la adenilil ciclasa 1 (CAP1). Rap y CAP presentaron una asociación independiente del nucleótido,pero dependiente de la isoprenilación de Rap1b. Aunque la fosforilación demostró modularnegativamente esta interacción, su efecto sobre la señal mitogénica mediada por Rap1 fuepositivo. CAP1, actuando como proteína andamio de Rap, resultó necesaria para la acción de Rap1, siendo requerida además para su activación y fosforilación, efecto que estaría mediado porla estimulación del aumento de los niveles de AMPc. Activation of Rap1b by the exchange protein activated by cAMP (Epac) and its cAMPdependentprotein kinase (PKA)-mediated phosphorylation are required for cAMP dependentmitogenesis. However, the role of phosphorylation remains unknown. We assessed potential conformational changes induced by phosphorylation of Rap1busing the amide hydrogen/deuterium exchange mass spectroscopy (DXMS) and Crystallography. Exchange rates PKA-phosphorylated (Rap1-P) and phosphomimetic (Rap1-D) Rap1b proteinsshowed the same pattern of exchange, revealing an increased exchange rate in discrete regionsalong the protein, including a domain around the phosphorylation site and the effector domain. Crystal structure for the full length Rap1b-G12V-S179D showed that the presence of the S179Dinduce changes at the interface with switch I and II. Our second objective was finding Rap1b effectors modulated in a phospho-dependentfashion.. Within the clones isolated by Two Hybrid, we found the adenylate cyclase-associatedprotein 1 (CAP1). Rap/CAP association showed to be nucleotide independent, but dependent on Raps’ isoprenylation. Although, phosphorylation showed to negatively modulate this interaction,it had positive effect on the mitogenic signal mediated by Rap1. CAP, acting as a scaffoldingprotein for Rap1b, was necessary for Rap1 mediated action, and required for Rap1b activationand phosphorylation, effect mediated by stimulating the increase of the levels of cAMP. Fil: Edreira, Martín Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Giardia intestinalis es un parásito que infecta humanos. El proceso de exquistación es fundamental para que Giardia pueda infectar a un nuevo hospedero. Es un proceso biológico muy interesante, en donde la forma dormitante (quiste) detecta que las condiciones ambientales son las adecuadas para la reactivación celular. En este trabajo se estableció un método para la purificación de quistes del parásito, y se realizaron experimentos de exquistación. Se analizaron cambios en el patrón de fosforilación durante las tres fases del proceso de exquistación usando una tinción específica de fosfoproteínas. Se encontraron dos proteínas fosforiladas, y fueron identificadas usando MALDI-TOF. Además, por medio de experimentos de inhibición se estableció que la actividad serina-treonina kinasa es necesaria para que ocurra la citoquinesis en la fase final del proceso. Se analizó la vía de señalización dependiente de calcio y calmodulina en Giardia. Por un lado, se identificaron proteínas de unión a calcio de la familia EF-hand por medio de bioinformática; también se realizó un acercamiento experimental usando una tinción para proteínas de unión a calcio. Por otro lado, se clonó el gen de calmodulina del parásito y se obtuvo una proteína recombinante contra la que se desarrollo un anticuerpo altamente específico. Con el anticuerpo se realizaron experimentos de western-blot y de inmunofluoresencia, que permitieron determinar el nivel de expresión y la localización de calmodulina durante la exquistación y enqustación de Giardia. Además, usando experimentos de pull-down se aislaron e identificación por primera vez cuatro proteínas de unión a calmodulina en este organismo. / Abstract. The parasite Giardia intestinalis undergoes a differentiation process that allows it to infect its mammal host. That process is excystation. The excystation is a highly interesting biological process in which the dormant form (cyst) perceives that the environmental conditions are right for cell reactivation. We report a new method for quick and effective isolation of parasite cysts. We examined the importance of protein phosphorylation during the passage from cyst to trophozoite. Using a specific staining for phosphoproteins. We found two phosphorylated proteins and identified them with MALDI-TOF. In addition, the inhibition of serine-threonine kinases during excystation specifically affected the cytokinesis. In this study we analyzed the calcium/calmodulin signal pathway in Giardia. We used two approaches to identify calcium binding proteins. First, we analyzed its completed genome sequence for genes encoding EF-hand-containing proteins. Second, we carried out assays with a specific staining for calcium binding proteins. On the other hand, we produced a highly specific antibody against the calmodulin of the parasite which allowed us to detect the protein level on western-blot and its localization in immunofluorescence assays. This is the first report of the isolation and identification of calmodulin binding proteins in the parasite Giardia intestinalis. Doctorado

La estructura de los filamentos gruesos de músculo estriado en el estado relajado ha sido finalmente comprendida a nivel molecular. La estructura revela interacciones intra- e intermoleculares que mantienen las cabezas de miosina unidas formando hélices adosadas a la superficie del filamento grueso. La fosforilación de las cadenas ligeras reguladoras de la miosina induce el debilitamiento de estas interacciones permitiendo la activación de los filamentos gruesos, produciendo el desorden y la liberación de las cabezas de miosina, y permitiendo su interacción con los filamentos delgados. Estos resultados abren las puertas para la comprensión del mecanismo molecular de la regulación ligada a miosina de la contracción muscular, de relevancia ya que las mutaciones asociadas a la cardiomiopatía hipertrófica medioventricular están ubicadas cercanas al sitio de fosforilación en las cadenas ligeras reguladoras de miosina. The structure of the thick filaments of striated muscle has been finally understood at the molecular level. The structure reveals intra- and inter-molecular interactions that held the myosin heads forming helices on the thick filament surface. The phosphorylation of the myosin regulatory light chains induces the weakening of these interactions, allowing the activation of thick filaments, and enabling their interaction with the thin filaments. These results open the possibility to the understanding of the molecular mechanism of the myosinlinked regulation of muscle contraction. This is of relevance as the mutations associated with mid ventricular cardiomyopathy are located near the phosphorylation site in the regulatory light chain.

Returning to normal pH after acidosis, similar to reperfusion after ischemia, is prone to arrhythmias. The type and mechanisms of these arrhythmias have never been explored and were the aim of the present work. Langendorff-perfused rat/mice hearts and rat-isolated myocytes were subjected to respiratory acidosis and then returned to normal pH. Monophasic action potentials and left ventricular developed pressure were recorded. The removal of acidosis provoked ectopic beats that were blunted by 1 mM of the CaMKII inhibitor KN-93, 1 mM thapsigargin, to inhibit sarcoplasmic reticulum (SR) Ca21 uptake, and 30 nM ryanodine or 45 mM dantrolene, to inhibit SR Ca21 release and were not observed in a transgenic mouse model with inhibition of CaMKII targeted to the SR. Acidosis increased the phosphorylation of Thr17 site of phospholamban (PT-PLN) and SR Ca21 load. Both effects were precluded by KN-93. The return to normal pH was associated with an increase in SR Ca21 leak, when compared with that of control or with acidosis at the same SR Ca21 content. Ca21 leak occurred without changes in the phosphorylation of ryanodine receptors type 2 (RyR2) and was blunted by KN-93. Experiments in planar lipid bilayers confirmed the reversible inhibitory effect of acidosis on RyR2. Ectopic activity was triggered by membrane depolarizations (delayed afterdepolarizations), primarily occurring in epicardium and were prevented by KN-93. The results reveal that arrhythmias after acidosis are dependent on CaMKII activation and are associated with an increase in SR Ca21 load, which appears to be mainly due to the increase in PT-PLN., Centro de Investigaciones Cardiovasculares

Los LePRKs son receptores quinasa que se localizan en la membrana plasmática de polen, posiblemente mediando interacciones polen-pistilo. Previamente, hemos demostrado que LePRK2 se encuentra fosforilada en polen maduro y germinado, y se desfosforila cuando microsomas de polen son incubados con extractos de estigma-estilo. Esto sugiere que por lo menos LePRK2 podría estar transduciendo una señal del pistilo a través de la actividad de LePRK2. En esta tesis, mostramos que la desfosforilación de LePRK2 está mediada por una molécula proveniente del pistilo resistente al tratamiento térmico, alcalino y proteasas. Basándonos en la desfosforilación de LePRK2, desarrollamos un protocolo de purificación con el cual obtuvimos un pico aislado de ~3550 Da (determinado por UV-MALDI-TOF MS) correspondiente a esta molécula peptídica que nombramos MrX. Con el fin de evaluar los efectos de MrX en tubos polínicos en crecimiento, realizamos ensayos de germinación in vitro en presencia de MrX parcialmente purificado y determinamos la longitud del tubo polínico como marcador del estado fisiológico. La adición de MrX al medio de germinación resultó en un aumento del largo del largo del tubo polínico en una forma dependiente de la dosis, mientras que las fracciones control no tuvieron efecto alguno. Nuestra hipótesis plantea que las interacciones polen-pistilo a través del complejo de LePRKs involucran la percepción de MrX por LePRK2, seguido de una desfosforilación de ésta y un incremento de la tasa de crecimiento del tubo polínico. LePRK1 and LePRK2 are pollen specific receptor kinases that belong to a plasma membrane high molecular weight complex possibly involved in pollen-pistil interactions. Previously, we have shown that LePRK2 is phosphorylated in mature and germinated pollen grains, but is dephosphorylated when pollen microsomes are incubated with stigma-style extracts. This suggests that LePRK complex might be transducing a signal from pistils through LePRK2 activity. In this thesis, we show that LePRK2 dephosphorylation is mediated by a heat-, base- and protease-resistant molecule from pistils. Based on LePRK2 phosphorylation, we developed a purification protocol and obtained an isolated peak of ~3550 Da peptidic compound (as determined by UV-MALDI-TOF MS) that we named MrX. In order to assess the effects of MrX on growing pollen tubes, we did in vitro germination assays in the presence of partially purified fraction of MrX and determined pollen tube length as a marker of the physiological state. MrX addition to germination medium resulted in pollen tube length increase in a dose-dependent manner, but not when pollen grains were incubated with control fractions. We hypothesize that pollen-pistil interactions through LePRK complex involve MrX perception by LePRK2, followed by LePRK2 dephosphorylation and an increase in pollen tube growth rate. Fil: Wengier, Diego Leonardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

En este trabajo se estudió la participación de las CDPKs en dos procesos de desarrollo: la tuberización y la nodulación. Por un lado se obtuvo la secuencia genómica de StCDPK1, se determinó su estructura y organización génica y se la comparó con otras quinasas pertenecientes al grupo II-A de las CDPKs. La localización cromosómica más probable de este gen resultó ser el extremo distal “inferior” del cromosoma 12. Además se obtuvo un anticuerpo policlonal anti-StCDPK1 con el cual se confirmó la presencia de esta isoforma en las fracciones solubles y particuladas de estolones inducidos, siendo mayor en la fracción asociada a membranas. Se observó que la proteína StCDPK1 aumenta en respuesta a concentraciones crecientes de sacarosa en forma gradual, alcanzando el máximo a 8% sacarosa (condiciones inductoras de tuberización). Se obtuvieron plantas transgénicas con expresión disminuida de StCDPK1 (β7) que mostraron cierta insensibilidad a las giberelinas (GAs). Además, presentaron una respuesta más temprana a las condiciones inductoras de la tuberización y una sensibilidad aumentada a las altas concentraciones de sacarosa. En presencia de hormonas inductoras de la tuberización (ácido abscícico -ABA y bencilaminopurina- BAP) la expresión de StCDPK1 no se vio afectada en la línea transgénica β7, pero sí en las plantas salvajes, lo mismo ocurrió al estudiar el efecto de las GAs a tiempos cortos. Nuestros datos sugieren que StCDPK1 podría estar involucrada en la tuberización, y que la sacarosa y las fitohormonas ABA y BAP estimulan su transcripción, actuando como un regulador negativo de este proceso de desarrollo. Por otra parte en Medicago truncatula se identificó una CDPK (MtCPK3) que se expresa principalmente en raíces en desarrollo. Estudios de expresión de MtCPK3 y otra isoforma de alfalfa estrechamente relacionada (MsCPK3), junto con datos de actividad quinasa dependiente de calcio, indicaron que estas isoformas pueden participar en los eventos de fosforilación que ocurren durante la formación del nódulo. Ensayos de expresión transitoria mostraron que la miristoilación y palmitoilación son necesarias para la localización en membrana plasmática de estas isoformas. Se detectó una inducción temprana (10 minutos) de MtCPK3 en raíces inoculadas con Rhizobium sp. que resultó estar asociada a una respuesta al estrés inducido por la infección. Asimismo las citoquininas indujeron la expresión de MtCPK3, sugiriendo que esta isoforma podría ser un componente común en las señales de transducción disparada por Rhizobium sp., citoquininas y estrés abiótico. Raíces transgénicas con expresión disminuida de MtCPK3 produjeron un número significativamente mayor de nódulos que las plantas control, sugiriendo que esta quinasa podría regular negativamente la acción de señales vegetales que controlan la relación entre los tejidos proveedores de energía y aquellos de reserva. In this work the participation of CDPKs in two developmental processes: the tuberization and the nodulation was studied. On one side the genomic sequence of StCDPK1 was obtained, its structure and genetic organization was determined and compared with others kinases of the CDPKs group II-A. The most probable chromosomic location of this gene turned out to be the distal end of chromosome 12. In addition, a polyclonal antibody against StCDPK1 was obtained and the presence of this isoform in the soluble and particulate fractions of induced stolons was confirmed, being greater in the membrane-associated fraction. It was observed that the StCDPK1 protein increased in the presence of different sucrose concentrations, being highest at 8% sucrose (tuber inducing conditions). Transgenic plants with diminished expression of StCDPK1 (β7) showed certain insensibility to gibberellins (GAs). In addition, they displayed an earlier response to tuber inducing conditions and an increased sensitivity to high sucrose concentrations. In the presence of tuber inducing hormones (abscicic acid - ABA and bencilaminopurine - BAP) StCDPK1 expression was not affected in the transgenic line β7, but it increased in wild type plants; the same happened when studying the early response to GAs. Our data suggest that StCDPK1 could be a negative regulator of tuberization eventhough sucrose and the phytohormones ABA and BAP stimulate its transcription. On the other hand, we identified a Medicago truncatula CDPK (MtCPK3) that is mainly expressed in developing roots. Expression studies of MtCPK3 and MsCPK3 (a closely related isoform in alfalfa), along with calcium dependent protein kinase activity assays indicated that these isoforms could participate in the phosphorylation events triggered during nodule formation. Transient expression studies showed that myristoylation and palmitoylation are necessary for the plasma membrane localization of these isoforms. An early MtCPK3 induction (10 minutes) was detected in Rhizobium sp. inoculated roots, but turned out to be associated to a stress response induced by the infection. Cytokinins also induced MtCPK3 expression,suggesting that this isoform could be a common component in the transduction pathways triggered by Rhizobium sp., cytokinins and abiotic stress. Transgenics roots with diminished MtCPK3 expression produced more nodules (x 3) than control plants, suggesting that this kinase could negatively regulate the action of plant signals that control sink-source interactions. Fil: Gargantini, Pablo Rubén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Heart rnitochondrion ATPase activity, ADP:O ratio (P:O) and Respiratory Control (RCR) are compared between guinea pigs from high altitude (Morococha, 4540 m) (HA) and those from sea level (SL). The study comprised 60 male guinea pigs, 30 from each altitude level, with mean weight 400-450 grams. Heart mitochondria were obtained by differential centrifugation at 4°C. P:O ratio and RCR were measured polarographically by Tyler method, and ATP hydrolysis was done by Holton et al. Method. Mean values obtained for heart mitochondria at SL and HA, expressed in mmoles oxygen uptake/mg protein/hour, were, with Glutamate + Malate as subtrates, respectiveIy: P:O 2.90, RCR 6.02 and P:O 2.93, RCR 6.0; and, with Pyruvate + Malate as subtrates, respectively P:O 2.60, RCR 5.0 and P:O 2.70, RCR 4.80. ATPase activity was at SL and HA, respectively: 57.50 and 64.50 mmoles P /mg protein/hour. The results suggest that high altitude guinea pigs may have developed the ability to perform oxydative phosphorylation more efficiently, and that the slight increment observed in ATPase activity indicates that some adjustments are made to maintain the equilibrium within the mitochondrial environment., Se compara la actividad de ATPasa, la relación ADP:O (P:O) y el Control Respiratorio (RCR) en mitocondria de corazón entre cobayos de altura (Morococha, 4540 m.s.n.m.) (Alt) y cobayos del nivel del mar (Lima, 150 m,s.n.m.) (NM). El estudio se realizó en 60 cobayos machos, 30 en cada nivel de altitud, con un peso promedio de 400 a 450 gramos. Las mitocondrias de corazón fueron obtenidas por centrifugación diferencial a 4° C. La relación P:O y el RCR fueron medidos polarográficamente por el método de Tyler, y la hidrólisis del ATP se realizó por el método de Holton et al. Los valores medios obtenidos en mitocondrias de corazón al NM y en Alt, expresados en micromoles de oxígeno consumido / mg de proteína/hora, fueron: con Glutamato + Malato como sustratos, respectivamente: P:O 2.90, RCR 6.02 y P:O 2.93, RCR 6.0; y con Piruvato + Malato como sustratos, respectivamente: P:O 2.60, RCR 5.0 y P:O 2.70, RCR 4.80. La actividad ATPasa fue al NM y en Alt, respectivamente: 57.50 y 64.50 mmoles de P /mg proteína/hora. Los resultados sugieren que los cobayos de altura han desarrollado la habilidad de realizar la fosforilación oxidativa en forma más eficiente, y el ligero incremento observado en la actividad de ATPasa indica que tal vez se realizan pequeños ajustes para mantener el equilibrio dentro del medio ambiente mitocondrial.

En este trabajo se estudiaron genes posiblemente involucrados en los procesos deseñalización relacionados con la tuberización. Se identificaron los genes StCDPK1, StCDPK2 y StCDPK3, que son los primeros miembros de la familia CDPK de Solanumtuberosum. En particular se caracterizó el gen StCDPK1 que codifica para una quinasaactiva con todas las propiedades de las CDPKs. Se demostró que StCDPK1 semiristoíla in vitro y que su localización subcelular depende de miristoilación ypalmitoilación. Por otra parte se determinó que existe una fuerte correlación entre la expresión de StCDPK1 y el engrosamiento del estolón. Mediante ensayos de hibridación in situ seobservó que StCDPK1 se expresa en el ápice de estolones inducidos a tuberizar. También se determinó que StCDPK3 se expresa diferencialmente en estolonestempranos. En ensayos de Western blot se identificaron dos CDPKs, de 55 y 60 kDa, cuyaexpresión correlaciona con la expresión de los genes StCDPK3 y StCDPK1respectivamente. Se determinó que la actividad CDPK asociada a estolonestempranos y la actividad CDPK asociada a estolones inducidos poseen diferenteespecificidad de sustrato y distinta localización subcelular. Por otra parte se estudió el efecto de la sacarosa sobre la tuberización y sobre laexpresión de StCDPK1. Se determinó la importancia de las actividades quinasadurante la inducción de la tuberización inducida por sacarosa y se demostró que esteazúcar induce la expresión de StCDPK1 mediante un mecanismo que involucra laactividad de fosfatasas de la familia PP1/PP2A. Además, se identificó el gen StPP2A1c que codifica para la primer fosfatasa de lafamilia PP2A de Solanum tuberosum. Se determinó que el gen StPP2A1c se expresadiferencialmente durante la tuberización y, mediante ensayos de complementación enlevaduras, se demostró que este gen codifica para una fosfatasa funcional. In this work we studied genes which are possiby involved in the signalling eventsleading to tuber development. The first members of Solanum tuberosum CDPK family, StCDPK1, StCDPK2 y StCDPK3, were identified. The gene StCDPK1, which encodesan active kinase with all the features of CDPKs, was characterized. It wasdemonstrated that StCDPK1 suffers myristoylation in vitro and that its subcellularlocalization depends on myristoylation and palmitoylation. On the other hand, a strong correlation between StCDPK1 expression and stolonswelling was established. Using in situ hybridization we observed that StCDPK1 isexpressed in the apical dome of tuberizing stolons. Moreover, StCDPK3 is differentiallyexpressed in early stolons. By Western blot assays, two CDPKs of 55 y 60 kDa which correlated with theexpression of StCDPK3 y StCDPK1 respectively, were detected. The CDPK activityassociated to early and induced stolons showed different substrate specificity andsubcellular localization. The effect of sucrose on tuberization and StCDPK1 expression was also analyzed. Theimportance of protein kinase activities during sucrose-induced tuber development wasestablished and the induction of StCDPK1 by sucrose, through a mechanism thatinvolves PP1/PP2A phosphatase activities,was demonstrated. Besides, we identified StPP2A1c, a gene that encodes the first phosphatase of the PP2A family in Solanum tuberosum. StPP2A1c was differentially expressed duringtuberization and encoded a functional phosphatase, as was observed in yeastcomplementation assays. Fil: Raíces, Marcela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Cells respond to environmental or cellular changes, rapidly switching protein activities from one state to another. In eukaryotes, a way to achieve these changes is through protein phosphorylation cycles, involving independent protein kinase and protein phosphatase activities. Current evidences show that phosphatases and kinases are also involved in the molecular basis of immune response and in diseases such as diabetes obesity and Alzheimer. In protozoan parasites like Trypanosoma and Leishmania, several kinases and phosphatases have been identified, many of them have been cloned but in several cases their biological role remains undetermined. In this review, the state-of-the art is summarized and the role of phosphatases and kinases in biological phenomena such as remodeling, invasion and pathogenic capacity of protozoan parasites is described. The real chance to use these components of signal transduction pathways as target for chemotherapeutic intervention is also discussed (Rev Méd Chile 2000; 128: 1150-60).

Cells respond to environmental or cellular changes, rapidly switching protein activities from one state to another. In eukaryotes, a way to achieve these changes is through protein phosphorylation cycles, involving independent protein kinase and protein phosphatase activities. Current evidences show that phosphatases and kinases are also involved in the molecular basis of immune response and in diseases such as diabetes obesity and Alzheimer. In protozoan parasites like Trypanosoma and Leishmania, several kinases and phosphatases have been identified, many of them have been cloned but in several cases their biological role remains undetermined. In this review, the state-of-the art is summarized and the role of phosphatases and kinases in biological phenomena such as remodeling, invasion and pathogenic capacity of protozoan parasites is described. The real chance to use these components of signal transduction pathways as target for chemotherapeutic intervention is also discussed (Rev Méd Chile 2000; 128: 1150-60).

Trabajos previos de nuestro laboratorio han permitido caracterizar unafosfoproteína novel (p43), intermediaria en la síntesis de esteroides en lazona fasciculata de la corteza adrenal de rata (Paz C. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 224:709-716). En la presente Tesis, se describe la caracterizaciónmolecular de p43 asi como también la regulación hormonal del transcripto. Los resultados obtenidos mostraron que p43 es homóloga a una acil-CoAtioesterasa mitocondrial. La secuencia aminoacídica deducida de la proteína presentó sitios consensode fosforilación para diferentes proteínas quinasas y un motíf para serina Lipasa. Anticuerpos dirigidos contra un péptido sintético que incluye dichomotif y otro contra la región N-terminal de p43, bloquearon la actividadbiológica de la proteína. El transcripto de p43 fue detectado en ovario deratas pseudopreñadas, en zona fasciculata y glomerulosa de adrenal derata, en una línea tumoral de células de Leydig, en cerebro de ratón y enplacenta humana. El tratamiento de ratas con dexametasona (Dx) provocauna disminución en los niveles del ARNm de p43 de manera dosisdependienteen adrenales de rata. El tratamiento posterior con ACTH nosólo revierte el efecto de la Dx, sino que produce un aumento rápido (5 min)en los niveles del mensajero alcanzando un máximo a los 15 min (62%) yretornando a los valores basales a los 30 min posteriores al estímulo. Eltratamiento con actinomicina D o cicloheximida antes del estímulo con ACTHprovoca una disminución o un aumento en los niveles del ARNm de p43respectivamente. Estos resultados relacionan por primera vez que unaactividad de acil-CoA tioesterasa está involucrada en los procesosesteroidogénicos. We have previously reported the purification of a phosphoprotein (p43)intermediary in steroid synthesis from adrenal zona fasciculata (Paz C. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 224:709-716). Here we describe the cloning andsequencing of a cDNA encoding p43 as well as the hormonal regulation ofp43 transcript. The protein resulted homologous to a very recently describedmitochondrial peroxisome proliferator-induced very-long-chain acyl-CoAthioesterase. The deduced amino acid sequence of the protein showsconsensus sites for phosphorylation by different protein kinases, and a Lipaseserine motif. Antibodies raised against a synthetic peptide that includes the Lipase serine motif and against the N-terminal region of p43 block the actionof the protein. The transcript of p43 was detected in ovary of pseudopregnantrats, rat adrenal zona fasciculata and glomerulosa, mouse Leydig tumor cellline, rat brain and human placenta. Inhibition of adrenocorticotropin hormone (ACTH)release and steroid synthesis by dexamethasone produced a dosedependentdecrease in the abundance of the adrenal transcript. Thetranscript was induced by in vivo stimulation of the adrenals with ACTH. Theeffect had a rapid onset (5 min), reached maximal stimulation (62%) at 15min and returned to basal levels at 30 min. ACTH effect on p43 transcriptwas inhibited by actinomycin D and enhanced by cycloheximide. Our resultsprovide the first evidence linking acyl-CoA thioesterases, with very-long-chainspecificities, and a protein intermediary in steroid synthesis, therebysupporting a regulatory role for acyI-CoA thioesterases in steroidogenictissues. Fil: Finkielstein, Carla V.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.