Studies on the phosphorylation of the TGBp1 movement protein of Potato virus X

El Potato virus X (PVX) es un virus de plantas, miembro tipo del género Potexvirus. Su genoma está compuesto por una única molécula de ARN que codificauna replicasa viral, tres proteínas de movimiento (MPs: TGBp1, TGBp2 y TGBp3) y laproteína de la cápside (CP). La proteína TGBp1 es una proteína multifuncionalrequerida para el movimiento viral de célula a célula en la planta hospedera. Diferenteslíneas de investigación sugieren que la fosforilación de las proteínas virales puederegular la replicación y el movimiento viral. En este estudio, se demostró que laproteína TGBp1 es fosforilada por al menos una proteína quinasa, presente enextractos de plantas de Nicotiana tabacum infectadas con PVX y no infectadas, queposee características distintivas de la caseína quinasa 2 (CK2). El análisis en gelesbidimensionales de extractos de plantas infectadas permitió determinar que la proteína TGBp1 producida durante la infección viral presenta múltiples isoformas de diferentespuntos isoeléctricos; el tratamiento con fosfatasas de los extractos de plantasinfectadas indicó la presencia de isoformas fosforiladas. A través de la combinación deestudios de determinación de aminoácidos fosforilados por espectrometría de masa,comparación de secuencias aminoacídicas de TGBp1 de distintos virus y evaluaciónde la fosforilación in vitro de mutantes puntuales y de deleción de la proteína TGBp1,se identificaron tres probables sitios de fosforilación por la quinasa CK2 de N.tabacum: S-165, T-193, T-214. Se observó que la simulación de la fosforilación en losresiduos T-193 y T-214 regula negativamente la dispersión viral y la capacidad de laproteína TGBp1 de hidrolizar ATP. Los resultados sugieren firmemente que unaproteína quinasa de la familia de CK2 estaría involucrada en la fosforilación de TGBp1durante el curso de la infección viral de N. tabacum. Además, se discute el modo enque la fosforilación podría regular las actividades de la proteína TGBp1 durante lainfección viral. Potato virus X (PVX) is the type member of the Potexvirus genus. Its genome isbased on a single RNA molecule encoding one viral replicase protein, three movementproteins (MPs: TGBp1, TGBp2 and TGBp3) and the capside protein (CP). In particular, TGBp1 is a multifunctional protein required for virus cell-to-cell movement inside thehost plant. Recent work on other plant viruses has indicated that viral proteinsphosphorylation by host kinases can regulate processes such us viral replication andmobilization. The results obtained during this Thesis work show that TGBp1 isphosphorylated by at least one kinase protein with properties characteristic of Caseinkinase 2 (CK2). This kinase activity is present in crude extracts prepared from bothnon-infected and PVX infected Nicotiana tabacum plants. Bi-dimensional gelexperiments with crude extracts from PVX infected plants showed that TGBp1expressed during infection presented several isoforms with different Isoelectricalpoints. Some of these isoforms were sensitive to phosphatase treatment, suggestingthat TGBp1 is phosphorylated in multiple residues. Several experimental approaches (mass spectrometer identification of phosphorylated aminoacids, sequence comparisonamong TGBp1 homologues from several viruses, and in vitro phosphorylationexperiments with mutated versions of TGBp1), allowed the identification of threepotential phosphorylation sites by recombinant alpha subunit N. tabacum CK2: S-165, T-193 and T-214. Mimicking phosphorylation on residues T-193 and T-214 had anegative impact on viral spreading and TGBp1 ATP hydrolysis activity. The results presented in this Thesis strongly suggest that a N. tabacum kinaseprotein belonging to CK2 family is involved in the phosphorylation of TGBp1 during PVX infection. How the phosphorylation regulates TGBp1 activities is discussed. Fil: Módena, Natalia A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.