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Orientador: Carlos Roque Duarte Correia Acompanha Anexo denominado V.2. Paginação continua Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica Resumo: A reação de arilação de Heck-Matsuda é um procedimento sintético valioso e extremamente versátil para a formação de ligações carbono-carbono, baseada no acoplamento de uma olefina com um sal de arenodiazônio na presença de uma espécie organometálica de paládio zerovalente. Recentemente, a utilização desta reação tem ganhado espaço na arte de sínteses totais, demonstrando a viabilidade da mesma. Neste trabalho, apresentamos o desenvolvimento de metodologias novas e flexíveis para a síntese eficiente de vários produtos naturais e sintéticos com propriedades farmacológicas importantes, utilizando a reação de arilação de Heck-Matsuda como etapa chave. No total, foram sintetizados 21 compostos finais, incluindo: prolinas e pirrolidinas poliidroxiladas racêmicas e quirais, Radicamina B e outros a-C-ariliminociclitóis quirais análogos das Radicaminas A e B, Rolipram, ácidos b-aril-g-aminobutíricos análogos do Baclofeno, e um precursor chave de Prepolicitrina A e Policitrina A. Os compostos sintetizados, assim como seus respectivos intermediários de reação, foram plenamente caracterizados e os resultados obtidos foram comparados com aqueles reportados na literatura quando aplicável. Dados analíticos e espectroscópicos satisfatórios foram obtidos em todos os casos. Abstract: The Heck-Matsuda arylation reaction is a valuable and extremely versatile synthetic procedure for carbon-carbon bond formation, based on the coupling of an olefin with an arenediazonium salt in the presence of a zerovalent palladium organometallic specie. Recently, the use of this reaction has been gaining space in total syntheses, demonstrating its viability. In this work, we presented the development of new and flexible methodologies for the efficient synthesis of several natural and synthetic products with important pharmacologic properties, using the Heck-Matsuda arylation reaction as a key stage. Totally, a set of 21 final compounds were synthesized, including: racemic and chiral polyhydroxylated prolines and pyrrolidines, Radicamine B and other chiral C-aryl-iminocyclitols analogues of Radicamines A and B, Rolipram and b-aryl-g-aminobutyric acids analogues of Baclofen, and a key precursor of Prepolycitrin A and Polycitrin A. The synthesized compounds, as well as their respective reaction intermediates, were entirely characterized and the obtained results were compared with those reported in the literature when applicable. Satisfactory analytical and spectral data were obtained in all cases. Doutorado Química Orgânica Doutor em Ciências

Orientador: Cesar Costapinto Santana Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica Resumo: Fases Estacionárias Quirais (FEQs) têm-se mostrado eficientes na resolução de racematos. O Rolipram, (mais ou menos)-4-(3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil)-2-pirrolidinona, é um antidepressivo que tem apresentado importantes propriedades farmacológicas. A purificação do Rolipram na FEQ tris(3,5-dimetilfenilcarbamato) de celulose adsorvida em sílica através da cromatografia contínua de Leito Móvel Simulado (LSM) foi o objetivo principal deste trabalho. A FEQ foi sintetizada e suas propriedades foram determinadas por análises físicas e químicas. Através de experimentos de adsorção em coluna forma determinados a influência da temperatura sobre o fator de separação ('alfa¿), as isotermas competitivas da adsorção da mistura racêmica e os parâmetros cinéticos e de equilíbrio da separação do N-Boc-Rolipram na FEQ sintetizada. Os experimentos realizados na unidade LSM foram feitos, sob condições diluídas, á temperatura ambiente. O N-Boc-Rolipram foi separado na FEQ sintetizada através do processo cromatográfico contínuo de LMS. As constantes de adsorção de Henry são discutidas e revelam um fator de separação da ordem de 1,20. AS medidas de pureza e excesso enantiomérico das correntes se extrato e refinado forma determinadas. As analises físicas e químicas da FEQ sintetizada revelam boa concordância com os valores teóricos. Efeitos da temperatura sobre o fator de separação mostram que o processo de adsorção é entalpicamente controlado. Ambos os enantiômeros precisam ser realizados par uma melhor compreensão do processo de adsorção. Os parâmetros de equilíbrio e cinética revelam o bom desempenho da FEQ sintetizada na separação dos enantiômeros principalmente o R-Boc-Rolipram Abstract: Chiral stationary phases (CSPs) have shown efficiency in racemate purification. Rolipram, (mais ou menos)-4-(3-(cyclopentyloxy)-4-methoxyphenyl)- pyrrolidin-2-one, is an antidepressant with significant pharmacological properties. The main objective of this work was Rolipram purification in the Chiral Stationary Phase tris(3,5-dimethylphenylcarbamoyl) cellulose supported on silica by Simulated Moving Bed continuous chromatography. CSP was synthesized and its properties were determined by physical and chemical analysis. Kinetics and equilibrium parameters of the N-Boc-Rolipram, effect of the temperature on the separation factor (a) and competitive isotherms of the racemic mixture were evaluated by adsorption experiments with columns packed with the synthesized CSP. The experiments in the 5MB unit were carried out under diluted conditions at room temperature. The N-Boc-Rolipram racemate was separated on the synthesized CSP by the 5MB continuous chromatographic processoHenry constants are discussed and reveal Selectivity elose to 1,20. Purity and enantiomeric excess of extract and raffinate streams were determined. Chemicals and physicals analyses of the CSP obtained find good agreement with theoretical results. The effects of the temperature on the separation factor show that adsorption process is controlled by the enthalpy. Both enantiomers adsorb similarly on the synthesized CSP, but detailed studies need to be making for a good understanding of the adsorption processoKinetics and equilibrium parameters show good performance of the synthesized CSP to separate the enantiomers, mainly R-Boc-Rolipram racemate Doutorado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Doutor em Engenharia Química

Submitted by Carlos Alberto Arcaro Filho (carlos_arcaro@hotmail.com) on 2018-07-13T23:08:25Z No. of bitstreams: 1 Tese Final - Carlos Alberto Arcaro Filho.pdf: 7378512 bytes, checksum: cb295c066a7be41be3508e2daf64d24f (MD5) Approved for entry into archive by Maria Irani Coito null (irani@fcfar.unesp.br) on 2018-07-16T13:17:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 arcarofilho_ca_dr_arafcf_int.pdf: 7378512 bytes, checksum: cb295c066a7be41be3508e2daf64d24f (MD5) Made available in DSpace on 2018-07-16T13:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arcarofilho_ca_dr_arafcf_int.pdf: 7378512 bytes, checksum: cb295c066a7be41be3508e2daf64d24f (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Considerando os avanços no conhecimento acerca dos mecanismos que controlam o metabolismo de proteínas na musculatura esquelética que permitiram a busca por novas opções para o tratamento das atrofias musculares, o presente estudo teve como objetivo a compreensão do potencial antiproteolítico de inibidores de fosfodiesterase, PDE (pentoxifilina, inibidor não-seletivo de PDE; rolipram, inibidor seletivo de PDE4) em músculos esqueléticos de ratos submetidos à atrofia muscular devido à insuficiência insulínica (diabetes mellitus experimental), com ênfase na elucidação da participação de componentes da sinalização do AMP cíclico (AMPc) nesta resposta. Ratos normais e diabéticos (60 mg/kg de estreptozotocina, administração intravenosa) foram tratados com salina (NS e DS) ou com 2 mg/kg de rolipram (NROL e DROL), ou com 25 mg/kg de pentoxifilina (NPTX e DPTX) durante 3 dias, por via intraperitoneal. Após três dias de tratamento, músculos soleus e extensor digitorum longus (EDL) foram removidos, pesados, congelados e processados para diversas análises: (i) conteúdo de AMPc (ensaio imunoenzimático); (ii) atividades das proteases proteassoma, calpaínas e caspase-3 (uso de substratos específicos fluorigênicos); (iii) níveis proteicos e/ou níveis de fosforilação de componentes das vias proteolíticas, efetores intracelulares sinalizatórios e fatores de transcrição (Western blotting); (iv) determinação dos níveis séricos de insulina e citocinas pró-inflamatórias. Foram realizados experimentos ex-vivo, para verificar a ação direta dos fármacos no controle da proteólise muscular e ativação de efetores intracelulares, via incubações dos músculos na presença de rolipram ou de agonistas de EPAC (Exchange protein directly activated by cAMP) e de PKA (proteína quinase dependente de AMPc), proteínas efetoras ativadas pelo AMPc. Também foram realizados experimentos no Laboratório do Prof. Dr. Marco Sandri, no Venetian Institute of Molecular Medicine, Padova, Itália, para a avaliação do papel de PDE4D no controle do processo autofágico-lisossomal em músculos esqueléticos de camundongos jejuados. Os tratamentos de animais diabéticos com rolipram (DROL) ou com pentoxifilina (DPTX) promoveram uma redução nas atividades do proteassoma e calpaínas em soleus e EDL, bem como nos níveis de componentes-chave do sistema proteolítico ubiquitina-proteassoma (MuRF-1, atrogin-1, conjugados poliubiquitinados), e aumento nos níveis de calpastatina (inibidor das calpaínas). Interesante ressaltar que o grupo DROL apresentou redução na atividade e níveis proteicos de caspase-3, em ambos os músculos, enquanto que o grupo DPTX apenas em músculos EDL. Contribuindo com a redução observada na atividade de caspase-3, houve uma redução nos níveis de Bax (proteína pró-apoptótica) e aumento nos níveis de Bcl-2 (proteína anti-apoptótica) em ambos os músculos de animais DROL. Animais diabéticos tratados com salina (DS) apresentaram aumento nas atividades das três proteases, bem como nos níveis de componentes participantes destes processos proteolíticos. Animais normais e diabéticos tratados com salina (NS e DS) apresentaram níveis de AMPc basais e semelhantes entre si, tanto em soleus quanto em EDL, enquanto que os tratamentos de ratos normais e diabéticos com pentoxifilina (NPTX e DPTX) ou rolipram (NROL e DROL) promoveram aumentos de AMPc, em ambos os músculos. Um dos mecanismos que podem estar envolvidos na inibição da proteólise muscular após aumentos nas concentrações de AMPc envolve a proteína EPAC, responsável por integrar a sinalização do AMPc e a sinalização insulínica via ativação da quinase AKT. Animais diabéticos tratados com pentoxifilina ou com rolipram apresentaram aumento nos níveis proteicos de EPAC 1 e na fosforilação de AKT, quando comparados ao grupo DS. Observamos também um aumento na fosforilação inibitória de fatores de transcrição FoxO 1 e 3a em ambos os músculos de animais DROL. Podemos sugerir que parte das ações de rolipram que culminaram em ativação de AKT e inibição de FoxO na musculatura esquelética possam estar associadas aos aumentos observados nos níveis circulantes de insulina em animais DROL. Investigamos, apenas nos animais tratados com rolipram, a possibilidade de participação da proteína PKA no controle da proteólise muscular. Em animais DROL houve ativação da PKA, verificada tanto pelo aumento na fosforilação de substratos de PKA, bem como do fator de transcrição CREB, em soleus e EDL. Vale destacar que animais DS apresentaram níveis reduzidos de p-CREB e de substratos fosforilados por PKA em soleus e EDL. Animais diabéticos tratados com os inibidores de PDE apresentaram uma diminuição de citocinas pró-inflamatórias séricas (TNF-, PTX e ROL; IL-1, ROL) e aumento nos níveis de insulina sérica (ROL) em relação aos animais DS. Nos estudos ex vivo, as incubações de músculos soleus e EDL com rolipram levaram a uma redução da proteólise total, bem como aumento na fosforilação de substratos de PKA e de AKT. Músculos soleus e EDL incubados com agonistas de EPAC apresentaram aumento na fosforilação de AKT, enquanto que a incubação com agonista de PKA promoveu aumento na fosforilação dos substratos de PKA (em ambos os músculos) e aumento na fosforilação de AKT (apenas em EDL), quando comparados aos músculos incubados na ausência do fármaco. Nos estudos para compreensão do papel de PDE4D no controle do processo autofágico-lisossomal, observou-se que o silenciamento gênico da PDE4D em músculos tibialis anterior promoveu uma preservação da massa muscular e da área da fibra em animais jejuados, quando comparados ao músculo controle. Músculos flexor digitorium brevis, silenciados para PDE4D, apresentaram diminuição na expressão de proteínas-chave do processo autofágico-lisossomal, tais como LC3 e p62. Estes resultados evidenciam os mecanismos que podem estar envolvidos na ação direta de inibidores de PDE no controle do metabolismo proteico muscular esquelético, via ativação de duas vias dependentes de AMPc: (i) a via PKA/CREB, que pode participar do controle da transcrição de Bcl-2 e calpastatina, bem como na inativação direta de caspases, inibindo assim os processos proteolíticos dependentes de caspase-3 e calpaínas, (ii) a via EPAC/AKT, via fosforilação e inibição de FoxO 1 e 3A, regulando a expressão dos atrogenes (MuRF-1 e atrogin-1) e promovendo uma diminuição na atividade do sistema ubiquitina-proteassoma. Além disso, o tratamento com inibidores de PDE diminuem o processo inflamatório e aumentam os níveis circulantes de insulina, ações que podem contribuir para os efeitos antiproteolíticos. Evidências iniciais também sugerem que PDE4D participa no controle do sistema autofágico-lisossomal na musculatura esquelética. Todos estes resultados indicam que PDE participam no controle de processos proteolíticos, portanto inibidores de PDE emergem como uma opção interessante na ativação da sinalização do AMPc na musculatura esquelética, com vistas à utilização futura no tratamento de quadros de perda de massa muscular durante situações de atrofia. Considering the advances in the knowledge of the mechanisms controlling the protein metabolism in skeletal muscles that allowed the discover of new options for the treatment of muscle atrophies, the present study aimed to understand the antiproteolytic potential of phosphodiesterase (PDE) inhibitors (pentoxifylline, a non-selective PDE inhibitor; rolipram, a selective PDE 4 inhibitor), in skeletal muscles of rats submitted to muscle atrophy due to insulin insufficiency (experimental diabetes mellitus), with emphasis on the elucidation of the participation of cyclic AMP (cAMP) signaling components. Normal and diabetic rats (60 mg/kg streptozotocin, intravenous administration) were treated intraperitoneally with saline (NS and DS) or with 2 mg/kg rolipram (NROL and DROL) or with 25 mg/kg pentoxifylline (NPTX and DPTX) for 3 days. After three days of treatments, soleus and extensor digitorum longus (EDL) muscles were removed, weighed, frozen and processed for several analyzes: (i) cAMP content; (ii) activities of proteasome, calpain and caspase-3 (use of specific fluorigenic substrates); (iii) protein levels and/or phosphorylation levels of components of proteolytic pathways, intracellular signaling effectors and transcription factors (Western blotting); (iv) determination of serum insulin and proinflammatory cytokines levels. Ex vivo experiments were performed to verify the direct action of the drugs in the control of muscle proteolysis and activation of intracellular effectors, via muscle incubations in the presence of rolipram or agonists of EPAC (Exchange protein directly activated by cAMP) and PKA (cAMP-dependent protein kinase), intracellular effectors activated by cAMP. Experiments were also carried out in the Laboratory of Prof. Dr. Marco Sandri at the Venetian Institute of Molecular Medicine, Padova, Italy, for the evaluation of the role of PDE4D in controlling the autophagic-lysosomal process in skeletal muscles of starved mice. Treatments of diabetic animals with rolipram (DROL) or pentoxifylline (DPTX) promoted a reduction in the activities of proteasome and calpain in soleus and EDL, as well as reduced the levels of key components of the ubiquitin-proteasome system (MuRF-1, atrogin-1, polyubiquitinated conjugates), and increased the levels of calpastatin (calpain inhibitor). Interestingly, DROL rats showed a reduction in the activity and in the protein levels of caspase-3 in both muscles, whereas DPTX rat had reductions only in EDL muscles. Contributing to the reduction in caspase-3 activity, it was observed a reduction in the content of Bax (pro-apoptotic protein) and an increase of Bcl-2 (anti-apoptotic protein) in both muscles of DROL rats. Diabetic animals treated with saline (DS) showed an increase in the activities of the three proteases, as well as increases in the levels of components belonging to these proteolytic processes. Normal and diabetic animals treated with saline (NS and DS) had basal and similar levels of cAMP in both soleus and EDL, whereas the treatments of normal and diabetic rats with pentoxifylline (NPTX and DPTX) or with rolipram (NROL and DROL) promoted increases in cAMP in both muscles. One of the mechanisms that may be involved in the muscle proteolysis inhibition after increases in cAMP involves the EPAC protein, responsible for integrating the cAMP and the insulin signaling pathways via AKT activation. Diabetic animals treated with pentoxifylline or with rolipram showed an increase in the protein levels of EPAC 1 and in the phosphorylation of AKT, when compared with the DS group. We also observed an increase in the phosphorylation (inhibitory) of FoxO 1 and 3a in both muscles of DROL rats. It can be suggested that part of the rolipram actions causing AKT activation and FoxO inhibition in skeletal muscles may be associated with the increases in the circulating levels of insulin observed in DROL animals. It was investigated, only in animals treated with rolipram, the possible involvement of PKA in the control of muscle proteolysis. DROL rats had activation of PKA, verified both by the increase in the phosphorylation of PKA substrates, as well as in the phophorylation of the transcription factor CREB, in soleus and EDL. DS rats had decreased levels of p-CREB and of the PKA substrates, in soleus and EDL. Diabetic animals treated with PDE inhibitors showed a decrease in serum proinflammatory cytokines (TNF-, PTX and ROL; IL-1, ROL) when compared with DS. In ex vivo studies, incubations of soleus and EDL with rolipram caused a reduction of the total proteolysis as well as an increase in the phosphorylation of PKA substrates and and of AKT. Soleus and EDL muscles incubated with EPAC agonist showed increased in the AKT phosphorylation, whereas incubation with PKA agonist promoted an increase in the phosphorylation of PKA substrates (in both muscles) and and increase in the AKT phosphorylation (EDL), when compared with muscles incubated in the absence of the drugs. In studies to understand the role of PDE4D in the control of the autophagic-lysosomal process, it was observed that the PDE4D gene silencing in anterior tibialis muscles caused a preservation of the muscle mass and fiber area in fasted animals when compared with control muscle. Flexor digitorium brevis muscles, silenced for PDE4D, showed a decreased expression of key proteins of the autophagic-lysosomal process, such as LC3 and p62. These results suggested the mechanisms that may be involved in the direct action of PDE inhibitors in the control of skeletal muscle protein metabolism, through activation of two cAMP-dependent pathways: (i) the PKA/CREB pathway, which may participate in transcriptional control of Bcl-2 and calpastatin, as well as causing direct inactivation of caspases, thus inhibiting the proteolytic processes dependent on caspase-3 and calpains, (ii) the EPAC/AKT pathway, via phosphorylation and inhibition of FoxO 1 and 3a factors, regulating the expression of atrogenes (MuRF-1 and atrogin-1) and promoting a decrease in activity of ubiquitin-proteasome system. Treatments with PDE inhibitors also decreased the inflammatory process and increased the circulating linsulin levels, which may be contributing to the antiproteolytic responses. Initial evidence also suggests that PDE4D participates in the control of the autophagy-lysosomal system in skeletal muscles. All these results indicate that PDE participate in the control of proteolytic processes, therefore PDE inhibitors emerge as an interesting option to activate the cAMP signaling in the skeletal muscles, which may be used in the future in treatments muscle mass loss during atrophy situations. FAPESP: Processo 2013/18861-2 FAPESP: Processo 2014/12202-0 FAPESP: Processo 2017/02348-5

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2019-05-21T15:45:26Z No. of bitstreams: 1 Breno Barros de Santana.pdf: 1122974 bytes, checksum: b19bc70484957e1d686d3c51dffd0298 (MD5) Made available in DSpace on 2019-05-21T15:45:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Breno Barros de Santana.pdf: 1122974 bytes, checksum: b19bc70484957e1d686d3c51dffd0298 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 Biotechnology of reproduction has been increasingly used in order to improve genetic material as well as germplasm preservation. Provision of viable oocytes in stage suitable for its use is essential to the success of this technique. An alternative would be to prevent resumption of meiosis after removal of oocytes from follicular environment inducing a meiotic blockage with the aim of providing the oocyte more time available so that it could be possible to suffer modifications required to support fertilization and normal embryonic development. Inhibitors, as Rolipram has been used with this objective. These blockers can improve oocyte competence through a better cytoplasmatic maturation. The goal of this project was to evaluate the effect of rolipram during maturation of bovine oocytes on quantity and quality of embryos produced in vitro. Ovaries was collected at slaughter and transported to the laboratory of Animal Reproduction at UAG/UFRPE - LABRAPE. The COC`s were selected and divided into 5 groups: Control 1 (time 0): oocytes fixed and stained immediately after selection to observe after collection status; control: in vitro maturation for 24 hours in the absence of Rolipram; Rolipram in 3 different treatments: blockage for 24 hours in maturation medium containing (100, 150 and 200 μM). After 24 hours, treatment and control groups were placed in maturation medium for over 24 hours to observe the reversal of the blockage. These oocytes were evaluated using an epifluorescent microscope to check maturation stage. After maturation, oocytes from control (within 24 hours of in vitro maturation) and treatments groups with Rolipram were in vitro fertilized 48 hours post fertilization to assess cleavage and blastocyst formation at D7 post fertilization. In addition, part of the oocytes were stored for expression of the following genes: Mater, BMP15 and BAX, to observe the effect of the blocker on expression of these genes in the embryos. As far as gene expression, no difference was seen between control group and treatments. The oocytes evaluated immediately after follicular aspiration 79.00% were in VG, QVGBD, or MI, characterized as immature and 13.40%, was in MII and 7.60%, were considered degenerate or not identified. In different concentrations of T100 and T200 T150 μ M, we observed significant differences in oocytes that have reached the MII phase comparing with control treatments (P = 0.003). As for the embryonic development, differences in the rate of cleavage (P < 0.05) were observed between T150 and T200 when compared to Control 24 hour Group. A difference was seen on blastocyst rate (P < 0.001) among the treatments compared to control group, being T100 μM the concentration which provided less negative effects during pre-maturing of bovine oocytes. As biotecnologias da reprodução são cada vez mais utilizadas com o objetivo de aumentar a oferta de material genético assim como preservação de germoplasma. A oferta de oócitos viáveis no estágio adequado para sua utilização é fundamental para o sucesso na produção in vitro de embriões. Uma alternativa seria evitar a retomada prematura da meiose após a remoção dos oócitos do ambiente folicular induzindo um bloqueio meiótico com o intuito de fornecer ao oócito mais tempo para que o mesmo possa sofrer modificações necessárias para suportar a fertilização e ter desenvolvimento embrionário normal. Inibidores, como o Rolipram, tem sido utilizado com esse intuito. Estes bloqueadores podem possivelmente melhorar a competência oocitária através de uma melhor maturação citoplasmática. O objetivo desse projeto foi avaliar o efeito do rolipram durante a maturação de oócitos bovinos na quantidade e qualidade de embriões produzidos in vitro. Para tanto, ovários foram coletados em abatedouro e transportados para o Laboratório de Reprodução Animal- LABRAPE da UFRPE/UAG. Os complexos cúmulos oócitos (CCOs) foram selecionados e divididos em 5 grupos: 1 Controle 0 hora: oócitos fixados e corados logo após a seleção para observarmos o status pós-coleta; Controle A: maturação por 24horas na ausência de Rolipram; Rolipram 3 tratamentos: bloqueio da maturação por 24horas em meio de maturação contendo (100, 150 e 200 μM). Após a maturação, uma parte dos oócitos dos grupos tratamentos e o grupo controle foram colocados em meio de maturação base por mais 24 horas para observar a reversão do bloqueio. Estes oócitos foram avaliados em microscópio equipado com epifluorescência. Após a maturação, o restante dos oócitos do grupo Controle e os tratamentos com Rolipram foram fecundados in vitro para avaliação das taxas de clivagem 48 horas pós fecundação e de blastocisto no D7 pós fecundação. Além disso, parte dos oócitos foram desnudados e armazenados para avaliação de expressão dos seguintes genes: Mater, BMP15 e BAX, para observação do efeito do bloqueador na expressão desses genes nos embriões. Não houve diferença estatística na expressão gênica entre grupo controle e tratamentos. Dos oócitos avaliados logo após a aspiração folicular, 79,00% encontravam-se em VG, QVGBD, ou MI, caracterizando-se como imaturos enquanto 13,40%, encontrava-se em MII e 7,60%, considerados degenerados ou não identificados. Nas diferentes concentrações de T100, T150 e T200 μM foram observadas diferenças em oócitos que atingiram a fase de MII comparando os tratamentos com o controle (P= 0,003). Quanto ao desenvolvimento embrionário houve diferenças na taxa de clivagem (P < 0,05) entre T150 e T200 quando comparados ao grupo C/24 e a taxa de blastocisto obteve diferença (P < 0,001) entre os tratamentos comparados ao grupo controle, sendo T100 μM a concentração que proporcionou menos efeitos negativos como diminuição da taxa de clivagem e blastocisto durante a pré-maturação de oócitos bovinos.

COELHO, C. F. Assessment of anti-inflammatory effects of Nitric Oxide administrated by inhalatory way on the experimental model of carrageenan-induced paw edema in mice. 102 p. Thesis Instituto de Ciencias Biomedicas da Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, 2009. The introduction of inhaled nitric oxide (iNO) for the treatment of many pulmonary injuries, as hypertension of the newborn, adult respiratory distress syndrome and lung reperfusion injury has been one of the most significant advances in recent intensive care. Inhaled NO (iNO) is qualified as "microselective" once it dilates only the vessels directly adjacent to the alveolar units being ventilated, but some evidences support that these pharmacological effects of iNO can reach other vasculature, beyond the pulmonary vasculature. Based on these findings, this study aimed to investigate the antiinflammatory effect of inhaled nitric oxide on the mice paw edema and pleurisy induced by carrageenan in mice and advance in knowledge of its possible mechanisms of action. Methods: Paw edema was induced on male Swiss mice (20 – 30 g) by the subplantar injection of carrageenin (CGN; 300 μg) under halothane anesthesia. Edema time-course (mL) was measured by plethysmometry until the maximum of 12 hs following CGN administration. Thirty minutes after CGN injection, some of the animal groups inhaled NO (300 ppm at variable doses, times and multiple administrations), while others received sildenafil (1 mg/Kg, i.p) or rolipram (3 mg/Kg, i.p.) with or without NO. At the end of experiments, the animals were sacrificed and the injected paws were removed to determine mieloperoxidase activity and histological analysis by microscopy. Pleurisy reaction was induced by intratoracic injection of carrageenan. After 4 hours, animals were sacrificed and the pleural cavity was washed with PBS and then the exsudate was collected for the assessment of inflammatory cells acumulation Data are presented as mean values ± SEM. Differences among the groups were analyzed by ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test for multiple comparisons and for comparisons of 2 groups was used T-Student test. P values lower than 0.05 were taken as significant. Results: The 13.6 ppm inhalation of NO during 10 minutes reduced significantly the CGNinduced paw edema. The same dose on less time of inhalation did not show antinflammatory effect. We could observe a decrease in protein nitration after iNO administration on the parameters mentioned above. One administration of iNO on the greatest dose and time showed a good antiinflammatory effect iqual the groups that received more than one administration. Sildenafil and rolipram administrated isolatelly reduced edema more than treatment with iNO alone, but sildenafil potencialized the iNO effect when co-administrated together with iNO. Moreover, iNO, on the greatest dose and time of inhalation, reduced the inflammatory cells accumulation in pleural cavity on the pleurisy model. Conclusion: Inhaled NO was effective in reducing inflammatory signs such as edema and neutrophil infiltration by the 13,6 ppm, with one administration, during 10 minutes. The biochemical way of cGMP seems to be involved, in part, with the anti-inflammatory effect of iNO.

The elevation of intracellular cyclic AMP by phosphodiesterase (PDE)4 inhibitors in eosinophils is associated with inhibition of the activation and recruitment of these cells. We have previously shown that systemic treatment with the PDE4 inhibitor rolipram effectively inhibt eosinophil migration in guinea pig skin. In the present study we compare the oral potency and efficacy of the PDE4 inhibitors rolipram, RP 73401 and CDP 840 on allergic and PAF-induced eosinophil recruitment. Rolipram and RP 73401 were equally effective and potent when given by the oral route and much more active than the PDE4 inhibitor CDP 840. We suggest that this guinea pig model of allergic and mediator-induced eosinophil recruitment is both a sensitive and simple tool to test the efficacy and potency of PDE4 inhibitors in vivo.

Overactivity bladder syndrome has classically been treated with antimuscarinics. However, frequent adverse systemic effects have led to the search for new therapeutic options. β3- adrenoceptor (β3-AR) agonists relax the detrusor smooth muscle (DSM) by the adenylyl cyclase pathway, increasing cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Rolipram, a selective type 4 phosphodiesterase inhibitor (IPDE4), elevates intracelular cAMP levels by supressing hydrolysis. Phosphodiesterase type 5 inhibitors (IPDE5), such as tadalafil, relax DSM by the nitric oxide/cyclic guanosine monophosphate pathway (NO/cGMP). It has been hypothesized that the inhibition of phophodiesterases could potentiate the relaxing effect of β3-AR agonists. The main objective of this study is to evaluate in vitro the effects of the combination of a β3-AR agonist with two different phosphodiesterase inhibitors (IPDE4 and IPDE5) in a experimental model of detrusor overactivity. The experiments were performed on bladder strips of mice and divided in two phases. The following drugs were used: BRL 37344 (β3-AR agonist), tadalafil (IPDE5) and rolipram (IPDE4). In the first phase, after potassium-induced contraction, strips isolated from naive mice were exposed to increasing concentrations of each study drug. In another series of experiments, prior to contraction, strips were incubated with either tadalafil or rolipram and then increasing concentrations of BRL 37344 were added. In the second phase, the same protocol was performed with animals treated with L-NAME for 30 days. Chronic L-NAME administration leads to detrusor overactivity by NO deprivation. Cumulative concentration-response curves were constructed. In the first phase, preincubation with tadalafil increased the relaxing response of BRL 37344 in two concentrations. Pretreatment with rolipram had no effect on the relaxation obtained with BRL 37344. In LNAME- treated mice, rolipram showed the best relaxation when compared to the other drugs. In these animals, rolipram increased the relaxing response of BRL 37344 in almost all concentrations, but no synergistic effect with tadalafil was observed. Phosphodiesterase inhibitors associated with the already proven effective β3-AR agonists may represent a new approach for patients with storage symptons. In our experimental model, the relaxing effect of the β3-AR agonist was potentiated by IPDE4 but not by IPDE5, suggesting cAMP plays an important role in DSM relaxation. Keywords: Detrusor smooth muscle. β3-adrenoceptor agonist. Phosphodiesterase inhibitors. Tratamento da hiperatividade detrusora (HD) tem sido classicamente feito com antimuscarínicos. No entanto, seus frequentes efeitos adversos têm levado à procura por novas opções terapêuticas. Agonistas adrenérgicos beta-3 seletivos relaxam o músculo liso detrusor (MLD) através da via da adenilato ciclase, aumentando a adenosina monofosfato cíclica intracelular (AMPc). O rolipram, inibidor específico da fosfodiesterase tipo 4 (IPDE4), aumenta os níveis de AMPc, inibindo sua hidrólise. Inibidores da fosfodiesterase tipo 5 (IPDE5), como a tadalafila, relaxam o MLD através da via do óxido nítrico/guanosina monofosfato cíclico (NO/GMPc). Tem-se sugerido que o uso combinado dessas drogas pode levar a uma potencialização do efeito relaxante. O principal objetivo deste estudo é avaliar in vitro os efeitos da associação de um agonista adrenérgico beta-3 seletivo com dois diferentes inibidores de fosfodiesterases (IPDE4 e IPDE5) em um modelo experimental de hiperatividade detrusora. Os experimentos foram divididos em duas fases e realizados em banho de órgãos com fragmentos de bexiga de camundongos. As substâncias utilizadas foram o BRL 37344 (agonista adrenérgico beta-3 seletivo), tadalafila (IPDE5) e rolipram (IPDE4). Na primeira fase, os tecidos de animais sem tratamento prévio eram submetidos à exposição de concentrações crescentes de cada uma das drogas estudadas após contração com KCL. Foram também realizados experimentos em que os tecidos eram pré-incubados com tadalafila ou rolipram para posterior adição do beta-3 adrenérgico. Em uma segunda fase, foi realizado o mesmo protocolo experimental com animais tratados com L-NAME por 30 dias. L-NAME foi usado para causar experimentalmente HD nos camundongos pela depleção de NO. Foram construídas curvas concentração-resposta para cada um dos experimentos. Na primeira fase, a pré-incubação com tadalafila aumentou o efeito relaxante do BRL 37344 apenas em duas concentrações (p < 0,05). A pré-incubação com rolipram não aumentou o efeito relaxante do BRL 37344. Nos animais tratados com L-NAME, o rolipram apresentou o maior efeito relaxante quando comparadas as drogas isoladamente. Neste grupo de animais, o rolipram aumentou o efeito relaxante do BRL 37344 em praticamente todas as concentrações, enquanto não foi observado efeito aditivo com a tadalafila. Os inibidores das fosfodiesterases, associados aos já comprovadamente eficazes beta-3 agonistas, podem representar uma nova abordagem dos pacientes com sintomas de armazenamento. No modelo deste estudo, o IPDE4 potencializou o efeito relaxante do agonista adrenérgico beta-3 seletivo, o que não foi observado com o IPDE5, sugerindo um importante papel da via do AMPc no relaxamento do detrusor de camundongos.

Asthma is a condition characterized by reversible chronic inflammation and hyper responsiveness of airways, with a pharmacotherapy well established. However, due to asthma heterogeneity, some patients did not respond to treatment. So, trying to contribute in the development of new candidates to antiasthmatic drugs, we decided to assess a possible relaxant action of PDE4 inhibitors N-sulfonilhidrazonic derivatives (LASSBio-448, -1624, -1832, -1846, -1847, -1848, -1849, -1850 and -1851) in functional model of trachea from non-asthmatic and asthmatic guinea pigs, as well as to characterize the action mechanism of the most promising derivative. All experimental protocols were approved by CEUA/UFPB (certificate 0610/11). Initially, we realize the implementation and standardization of a guinea pig asthma model using ovalbumin (OVA) as sensitizer agent, and it was histologically observed morphological changes associated to asthma, as hypertrophy of the smooth muscle layer, inflammatory cells infiltration and vascular abnormalities. Moreover, rings from sensitized guinea pig trachea showed to be responsive to OVA, differently to the non-sensitized animals. Functionally, the contractile agonist CCh presented efficacy and potency similar between non asthmatic and asthmatic animals, differently histamine demonstrated to be equipotent between the animals, but with a higher efficacy in the asthmatic guinea pigs. In turn, the relaxant agonist aminophylline and isoprenaline presented similar potency and efficacy in both non asthmatic and asthmatic animals. Generally, in the step of pharmacological screening of N-sulfonilhidrazonic derivatives, they presented a equipotent relaxant action and independent of relaxing factors derived from epithelium in both animals groups, with exception of LASSBio-1850 that presented a low efficacy (< 50%) and LASSBio-1847 with a 4 fold higher potency on asthmatic guinea pigs. Among the derivatives evaluated, LASSBio-1632, -1846 and -1847 were the one with higher pharmacological potency on asthmatic animals, and LASSBio-1847 was the most promising and selected to the step of characterization of action mechanism on non-asthmatic and asthmatic guinea pig. Such as LASSBio-1847 was synthetized as a PDE4 inhibitor, an enzyme that hydrolyze cAMP, and the β2 -adrenergic receptors are responsible to initiate the signaling involved to cAMP production on airway smooth muscle, we used propranolol, a β2-adrenergic non-selective blocker, to assess the participation of these receptors. So, we observed that the LASSBio-1847 relaxant curve was shifted showing the involvement of β2 -adrenergic receptors in both animal groups. Since these receptors lead to adenylyl cyclase (AC) activation, we decided to investigate its participation in the LASSBio-1847 relaxant effect. Therefore, we used forskolin, an AC activator, and evidenced that the relaxant curve was 54- and 4-fold shifted to the left in non-asthmatic and asthmatic animals, respectively, indicating that LASSBio-1847 could be acting in a synergic or facilitate the AC activation. β2-adrenergic receptors/AC activation lead to cAMP production that is regulated be its hydrolyzes by PDEs. To evaluate the contribution of these enzymes, we used aminophylline, a non-selective inhibitor of PDEs, and concentration-response curve to aminophylline was shifted to the left in the presence of LASSBio-1847 with gain in the potency around 147- and 4-fold in non-asthmatic and asthmatic animals, respectively, suggesting that the derivative acts by a possible PDE inhibition. The effector the β2-adrenergic receptors/AC/cAMP pathway is PKA, so to confirm its positive modulation by LASSbio-1847, we used H-89, a PKA inhibitor, observed a reduction in the relaxant potency of the derivative, confirming the modulation of this pathway. Until now, all finding have indicated a possible increase in [cAMP]c and to confirm this hypothesis it was carried out the measurement of tissue levels of cAMP by ELISA, that demonstrated that LASSBio-1847 indeed increase the [cAMP]c in a similar magnitude to rolipram, a selective PDE4 inhibitor, in both animals. Thus, it was established the implantation of the guinea pig asthma model, as well as the evaluated N-sulfonilhidrazonic derivatives presented relaxant activity on guinea pig trachea in both non asthmatic and asthmatic animals in an epithelium independent manner, and LASSBio-1847 showed to be one of the most promising compounds in relax this organ by activation of β2-adrenergic receptors/AC/cAMP pathway and inhibit the PDEs, culminating to elevation of [cAMP]c. A asma é uma doença caracterizada por inflamação crônica e hiper-responsividade reversível das vias aéreas, apresentando uma farmacoterapia bem estabelecida. No entanto, devido a heterogeneidade dessa enfermidade, alguns pacientes não respondem apropriadamente ao tratamento. Assim, visando ajudar no processo de desenvolvimento de novos candidatos a fármacos antiasmáticos, decidiu-se avaliar a possível ação relaxante de uma série de derivados N-sulfonilidrazônicos inibidores de PDE4 (LASSBio-448, -1624, -1832, -1846, -1847, -1848, -1849, -1850 e -1851) em um modelo funcional de traqueia de cobaias não asmáticos e asmáticos, bem como elucidar o mecanismo de ação do derivado mais promissor. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo CEUA/UFPB (certidão 0610/11). Inicialmente, realizou-se a implantação e padronização de um modelo de asma em cobaias utilizando ovalbumina (OVA) como agente sensibilizador, onde se observou histologicamente, alterações morfológicas inerentes ao quadro asmático, como hipertrofia da camada muscular lisa, presença de infiltrado de células inflamatórias e anormalidades vasculares. Além disso, os anéis de traqueia de cobaias sensibilizados mostraram-se responsivos à OVA, diferente dos não sensibilizados. Funcionalmente, o agonista contrátil CCh apresentou potências e eficácias relativas similares entre os animais não asmáticos e asmáticos, diferentemente do que se observou para o agonista contrátil histamina, que demonstrou ser equipotente entre os dois grupos de animais, mas com uma maior eficácia nos animais asmáticos. Por sua vez, os agonistas relaxantes aminofilina e isoprenalina apresentaram potências e eficácias relativas similares entre os animais não asmáticos e asmáticos. De modo geral, na etapa de triagem farmacológica dos derivados N-sulfonilidrazônicos, estes apresentaram um efeito relaxante equipotente e independente dos fatores relaxantes derivados do epitélio tanto nos animais não asmáticos quanto nos asmáticos, com exceção do LASSBio-1850 que mostrou apenas uma eficácia moderada (< 50%) e o LASSBio-1847 que apresentou um incremento de potência de cerca de 4 vezes nos animais asmáticos. Dentre os derivados avaliados, o LASSBio-1632, -1846 e -1847 foram os de maior potência farmacológica nos animais asmáticos, sendo esse último o mais promissor e selecionado para a etapa de caracterização do mecanismo de ação nos cobaias não asmáticos e asmáticos. Como o LASSBio-1847 foi sintetizado como um inibidor das PDE4, uma enzima que hidrolisa o cAMP, e os receptores adrenérgicos-β2 são um dos principais responsáveis pela sinalização que leva a produção desse segundo mensageiro no músculo liso das vias aéreas, utilizou-se o propranolol, um bloqueador adrenérgico-β não seletivo, para avaliar a participação desses receptores. Observou-se que houve desvio da curva de relaxamento do LASSBio-1847 para a direita evidenciando a participação dos receptores adrenérgico-β em ambos os grupos de animais. Como esses receptores levam a ativação da adenilil ciclase (AC), decidiu-se investigar o envolvimento da mesma no efeito relaxante do LASSBio-1847. Para tanto, utilizou-se a forscolina, um ativador de AC, e evidenciou-se que a curva de relaxamento da forscolina na presença do derivado foi deslocada para a esquerda em cerca de 54 e 4 vezes nos animais não asmáticos e asmáticos, respectivamente, mostrando que o LASSBio-1847 poderia agir sinergicamente ou favorecer a ativação da AC. A ativação do receptor adrenérgico-β2/AC leva a produção de cAMP que é contrabalanceada por sua hidrólise via PDEs. Para avaliar o envolvimento dessas enzimas, utilizou-se a aminofilina, um inibidor não seletivo de PDEs. A curva-concentração resposta à aminofilina foi desviada para a esquerda na presença do LASSBio-1847 com potencialização do efeito em torno de 147 e 4 vezes, nos animais não asmáticos e asmáticos, respectivamente, sugerindo que o efeito do derivado ocorre por uma possível inibição de PDEs. O efetor da via receptor adrenérgico-β2/AC/cAMP é a PKA, assim para confirmar a modulação positiva dessa via utilizou-se o H-89, um inibidor da PKA, e observou-se que houve uma atenuação na resposta relaxante do derivado, confirmando a modulação dessa via. Até o momento, todos os achados nos indicaram um possível aumento na [cAMP]c e para confirmar essa hipótese foi realizado a medida dos níveis teciduais de cAMP por ELISA, que demonstrou que o LASSBio-1847 realmente eleva a [cAMP]c, numa magnitude similar ao rolipram, em ambos os grupos de animais. Assim, ficou estabelecido a implantação do modelo de asma em cobaias, além de se evidenciar que os derivados N-sulfonilidrazônicos avaliados possuem atividade relaxante em traqueia de cobaias não asmáticos e asmáticos de forma independente de epitélio, sendo o LASSBio-1847 um dos mais promissores em relaxar esse órgão por ativar a via de transdução do receptor β2/AC/cAMP/PKA e inibir as PDEs, que culmina com a elevação da [cAMP]c.

A pneumonia pneumocócica é uma importante causa de mortalidade no mundo. A resposta inflamatória contra as bactérias é necessária para controlar a infecção, mas a permanência e ativação excessiva dos neutrófilos nos pulmões podem resultar em dano tecidual significativo. Os inibidores de fosfodiesterase 4 (PDE4), tais como o rolipram, reduzem a inflamação de forma eficiente. O presente estudo analisou o impacto do tratamento com rolipram em um modelo murino de pneumonia pneumocócica. Camundongos Balb/C foram infectados por via intranasal com 103-106 CFU de Streptococcus pneumoniae e a cinética da inflamação desencadeada foi avaliada. Camundongos infectados com 104-105 CFU foram então tratados com o rolipram em um esquema profilático ou terapêutico, em combinação ou não com o antibiótico ceftriaxona. Foram realizadas contagens das células inflamatórias e bactérias recuperadas e ensaios ex vivo de fagocitose. O tratamento com rolipram durante a infecção por S. pneumoniae levou à diminuição do recrutamento de neutrófilos nos pulmões e vias respiratórias e reduziu a lesão pulmonar. A administração profilática de ROL também diminuiu os níveis das citocinas nas vias aéreas. Apesar da modulação da inflamação por ROL melhorar a pneumonia, a carga bacteriana nos pulmões não foi reduzida. Por outro lado, a antibióticoterapia reduziu o número de bactérias sem diminuir a infiltração de neutrófilos, os níveis das citocinas e a lesão pulmonar. O tratamento combinado de rolipram e ceftriaxona foi mais eficiente na redução da inflamação, aumentando a expressão da proteína pró-resolutiva anexina A1, e reduzindo o número de bactérias através do aumento da fagocitose. Ainda, camundongos deficientes em anexina A1 são mais susceptíveis à infecção pneumocócica. Estes dados mostram que os efeitos imunomoduladores dos inibidores de PDE4 são úteis durante pneumonia pneumocócica grave e sugerem o seu potencial como terapia adjuvante nesta infecção. Pneumococcal pneumonia is a leading cause of mortality worldwide. The inflammatory response to bacteria is necessary to control infection but the permanence and excessive activation of neutrophils in the lungs may cause tissue damage. Phosphodiesterase-4 (PDE4) inhibitors, such as rolipram (ROL), effectively reduce inflammation. This study examined the impact of rolipram in a model pneumococcal pneumonia in mice. Balb/C mice were infected intranasally with 103-106CFU of Streptococcus pneumoniae and the kinects of inflammation were evaluated. 104-104 CFU mice were then treated with ROL in a prophylactic or therapeutic schedule in combination or not with the antibiotic ceftriaxone. Inflammation and bacteria counts were assessed and ex vivo phagocytosis assays were performed. Rolipram treatment during S. pneumoniae infection decreased neutrophil recruitment into the lungs and airways and reduced lung injury. Prophylactic ROL treatment also decreased cytokine levels in the airways. Although modulation of inflammation by ROL ameliorated pneumonia, bacteria burden was not reduced. On the other hand, antibiotic therapy reduced bacteria without reducing neutrophil infiltration, cytokine levels and lung injury. Combined ROL and ceftriaxone treatment was more efficient in reducing inflammation, by increasing pro-resolving protein Annexin A1 expression, and reducing bacteria burden, by enhancing phagocytosis. Furthermore, annexin A1 deficient mice are more susceptible to pneumococcal pneumonia. These data show that immunomodulatory effects of PDE4 inhibitors are useful during severe pneumococcal pneumonia and suggest their potential benefit as adjunctive therapy during infectious diseases

O óxido nítrico é um potente broncodilatador e compostos capazes de aumentar a sua oferta têm demonstrado interesse clínico no tratamento das doenças obstrutivas das vias aéreas. Estee trabalho avaliou comparativamente os mecanismos de relaxamento de dois doadores de óxido nítrico, o complexo de rutênio [Ru(terpy)(bdq)NO+]3+ (TERPY) e o nitroprussiato de sódio (SNP) em traqueias isoladas de ratos saudáveis, grupo Sham, e com asma experimental induzida por ovalbumina, grupo OVA. As traqueias isoladas foram cortadas em anéis, montadas em banho para órgãos isolados e contraída com carbacol para estudo do relaxamento. O efeito relaxante do TERPY e do SNP foi avaliado em concentrações crescentes e cumulativas (10 nM a 100 μM). Foi verificada a participação dos diferentes tipos de canais de K+, a participação da via GCs/GMPc, inibição das PDEs (pelo IBMX, amrinona, rolipram e dipiridamol), a participação dos estoques internos de Ca2+ (pelo ácido ciclopiazônico), assim como a participação do influxo deste íon pelos canais de cálcio controlados por estoque e por voltagem, além da inibição da COX (pelo diclofenaco), do antagonismo dos receptores de leucotrienos (pelo montelucaste) e do sequestro dos íons superóxidos (pelo TIRON). Foram realizadas análises em microscopia de luz para comprovação da presença de infiltrado inflamatório e da broncodilatação exercida pelo TERPY em cortes de bronquíolos de animais asmáticos. Como resultados, verificou-se que a sensibilização com ovalbumina levou a um intenso processo inflamatório com migração celular e hiperreatividade ao carbacol. Evidenciou-se que o TERPY e o SNP relaxaram o músculo liso traqueal de forma concentração-dependente em ambos os grupos. Entretanto, o efeito máximo induzido pelo TERPY foi maior do que o do SNP tanto no grupo Sham quanto no OVA. O mecanismo de relaxamento do TERPY mostrou-se diferente entre os grupos. No grupo Sham, o TERPY exerce relaxamento por ativação dos canais Kv, Kir, KCa e KATP independentemente de GMPc e por redução do influxo de cálcio através do bloqueio dos canais de cálcio operados por voltagem e por estoque. No grupo OVA, o TERPY exerce seu efeito através da por ativação dos canais K+, via NO/GCs/GMP e redução do influxo de cálcio por bloqueio dos canais de cálcio operados por voltagem e operados por estoque. O efeito relaxante do SNP no grupo OVA ocorre através da ativação da via NO/GCs/GMPc, dos canais Kv, KCa e SKCa e por redução do influxo de cálcio pelos canais de cálcio operados por voltagem e operados por estoque. Entretanto, a ativação da enzima GCs parece estar reduzida em músculo liso inflamado, assim como o papel da bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático. O diclofenaco, o montelucaste e o TIRON melhoraram o perfil de relaxamento tanto do TERPY quanto do SNP no grupo OVA. O TERPY é capaz de reverter a contração do carbacol em bronquíolos asmáticos. Em conclusão, tanto o SNP quanto o TERPY têm seus mecanismos de relaxamento modificados pelo processo inflamatório. Entretanto, esta modificação não foi capaz de alterar os parâmetros farmacológicos de potência e eficácia do TERPY. Já o SNP, tem menor eficácia em traqueias de ratos do grupo OVA e isso pode decorrer da menor participação da enzima GCs e da bomba de cálcio reticular, fazendo do TERPY uma droga promissora para reversão do estreitamento das vias aéreas. Nitric oxide is a potent bronchodilator and compounds capable of increasing its supply have demonstrated clinical interest in the treatment of obstructive airways diseases. This study evaluated and compared the mechanisms of relaxation of two nitric oxide donors, ruthenium complex [Ru(terpy)(bdq)NO+]3+ (TERPY) and sodium nitroprusside (SNP) in healthy isolated trachea, Sham group, or experimental model of asthma induced by ovalbumin in rats, OVA group. The isolated trachea was sectioned into rings and contracted with carbachol in an organ chamber for studying relaxation. The relaxing effect of TERPY and SNP was evaluated at increasing concentrations from 10 nM to 100 μM. Thus, we verified the contribution of the different types of K+ channels, the importance of sGC/cGMP pathway, the inhibition of PDEs (for IBMX, amrinone, rolipram and dypiridamole), the influence of the extra and intracellular Ca2+ sources (for cyclopiazonic acid) and the influence of the store and voltage operated calcium channels. Besides inhibition of COX (diclofenac), antagonism of leukotriene receptor (montelukast) and superoxide anion scavenger (TIRON). Analyses were performed under light microscopy for evidence of inflammatory infiltration and bronchoditation by TERPY in slices bronchioles of asthmatic animals. The results verified that sensitization with ovalbumin led to intense inflammatory process and hyperresponsives to carbachol in compared Sham group. TERPY and SNP led to the relaxation of tracheal smooth muscle preparations in a dependent-concentration mode in both groups. However, the maximum effect induced by TERPY was higher than the effect of SNP in Sham and OVA groups. The relaxation mechanism of TERPY in boht groups showed differences. In Sham group, TERPY relaxation by the activation of Kv, Kir, KCa and KATP channels, cGMP-independent mechanisms and by reduction of calcium influx by blocking the store and voltage operated calcium channels. In OVA group, TERPY acts through activation K+ channels, NO/GCs/GMP way and blocking the store and voltage operated calcium channels. The relaxing effect induced by SNP in OVA group was dependent of NO/GCs/GMP pathway, Kv, KCa and BKCa channels and blocking the store and voltage operated calcium channels. However, the activation of the enzyme sGC seems to be reduced in inflamed smooth muscle, as well as the role of the sarcoplasmic reticulum calcium pump. Diclofenac, montelukast and TIRON improved relaxation of the TERPY and SNP in OVA group. The TERPY is able to reverse the contraction of carbachol in asthmatic bronchioles. In conclusion, TERPY and SNP have their mechanisms of relaxation modified by the inflammatory process. However, this modification was not able to alter the pharmacological parameters potency and efficacy to TERPY. Since SNP has less efficacy effect in asthmatic tracheas. This may result from the lower participation of the enzyme sGC and reticular calcium pump, making TERPY a promising drug to reverse the narrowing of the airways. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG

A resposta inflamatória é inicialmente caracterizada pela liberação de mediadores próinflamatórios e pela migração de leucócitos para o local da inflamação. Por outro lado, este processo é finamente controlado pela ação de mediadores anti-inflamatórios e/ou próresolutivosque auxiliam na resolução do processo inflamatório e no retorno da homeostase tecidual. Dentre esses mediadores destaca-se a anexina A1 (AnxA1), uma proteína induzida por glicocorticóides (GC) que medeia diversas funções destes anti-inflamatórios. AnxA1 age como um potente modulador endógeno da inflamação, impedindo a ação de enzimas queatuam na produção de mediadores pró-inflamatórios, inibindo a transmigração dos leucócitos e induzindo a fagocitose de células apoptóticas. Assim, o presente estudo investigou a participação de AnxA1 na resolução da resposta inflamatória espontânea e induzida por antiinflamatórios. Para tal, foi utilizado o modelo murino de pleurisia induzida por LPS (lipolissacarídeo) onde camundongos BALB/c foram injetados com 250 g de LPS por via intrapleural. Posteriormente, as células presentes no lavado pleural foram coletadas em diferentes intervalos pós-injeção e analisadas quanto ao número total e diferencial de leucócitos, número de células com morfologia apoptótica, vias de sinalização envolvidas com apoptose, sobrevivência celular e a expressão da proteína AnxA1. Os resultados mostraram que a injeção de LPS induziu um acúmulo de neutrófilos na cavidade pleural que foi máximo entre 8-24h, diminuiu em 48h ocorrendo resolução completa no tempo de 72h. A resolução natural, avaliada pelo decréscimo no número de neutrófilos observado nos tempos 48-72h, foi acompanhada pelo aumento de células mononucleares e foi associada ao aumento de eventos apoptóticos entre 8-48h, como demonstrado por critérios morfológicos (contagem de células apoptóticas) e bioquímicos (aumento de caspase-3 clivada e Bax). A proteína AnxA1 naforma ativa intacta (37 kDa) foi detectada em animais injetados com PBS, diminuiu intensamente na fase ativa da inflamação neutrofílica (4-24h) e aumentou durante a resolução natural, como visto em 48-72h após desafio com LPS. Observou-se um predomínio de clivagem da proteína AnxA1 (banda de 33 kDa) nos intervalos de tempo onde ocorreu maior recrutamento de neutrófilos. O tratamento de animais com drogas anti-inflamatórias, as quais foram previamente demonstradas induzirem resolução no mesmo modelo inflamatório, a saber: rolipram (um inibidor de PDE4), wortmannin (inibidor de PI3K) e dexametasona (glicocorticoide sintético) diminuiu o número de neutrófilos na cavidade pleural, com um aumento na expressão da proteína AnxA1 na forma ativa e prevenção da clivagem da mesma. Ainda, o aumento de AnxA1 induzido por estas drogas, foi associado com ativação de proteínas pró-apoptóticas (aumento de Bax e clivagem de caspase-3) e inibição dafosforilação de proteínas associadas com a sobrevivência celular (P-ERK1/2 e P-IkB-a). A relevância funcional da AnxA1 para a resolução da pleurisia foi determinada utilizando duas estratégias, um anticorpo neutralizante para a proteína ou um antagonista inespecífico doreceptor onde AnxA1 atua (FPR2/ALXR): ambos os tratamentos inibiram a resolução da inflamação espontânea e induzida por dexametasona, a expressão de AnxA1 e a apoptose de neutrófilos. O efeito direto da participação da AnxA1 na resolução da inflamação aguda foi avaliado utilizando Ac2-26, um peptídeo ativo da porção N-terminal da proteína. A injeção de Ac2-26, por duas diferentes vias de administração, local e sistêmica, diminuiu o número de neutrófilos na cavidade pleural, sem alterar o número de células mononucleares, e aumentou a apoptose de neutrófilos, efeito que foi impedido pela injeção do pan inibidor de aspase zVAD-fmk. Mecanisticamente, a resolução da inflamação promovida pela injeção do peptídeo Ac2-26 foi associada à apoptose de neutrófilos com aumento de Bax e clivagem de caspase-3, decréscimo dos níveis de Mcl-1 e da fosforilação de P-ERK1/2 e P-IkBa,proteínas já demonstradas serem importantes para sobrevivência do neutrófilo. Nossos dados in vivo, utilizando um modelo dinâmico de inflamação aguda, fornecem evidências de que AnxA1 seja um mediador da resolução natural e induzida por anti-inflamatórios com intenso efeito sobre a apoptose de neutrófilos. The inflammatory response is initially characterized by the release of pro-inflammatory mediators and the migration of leukocytes to the inflammation site. On the other hand, this process is finely controlled by the action of anti-inflammatory and/or pro-resolution mediators that promote resolution of inflammation and helps the return to tissue omeostasis. Annexin A1 (AnxA1) is a glucocorticoid (GC)-induced protein that mediates several GC functions. AnxA1 acts as a potent endogenous modulator of inflammation by preventing the action of enzymes that participate in the production of pro-inflammatory mediators, inhibiting theleukocyte transmigration and inducing phagocytosis of apoptotic cells. Thus, this study investigated the role of AnxA1 on the spontaneous and pharmacologically-induced resolution of the inflammatory response. For this, we have used a murine model of pleurisy induced by LPS (lipopolysaccharide) where BALB/c mice were injected with 250 g LPS by intrapleural route. After that, the cells in the pleural lavage were collected at different post-injection intervals and analyzed for total and differential leukocyte count, number of cells with apoptotic morphology, signaling pathways involved in apoptosis and cell survival, and AnxA1 protein expression. Our results have shown that the injection of LPS induced an accumulation of neutrophils in the pleural cavity which was maximal between 8-24h, decreased in 48h with complete resolution occurring at 72h. The natural resolution, showed by the reduction of neutrophils numbers observed at the time of 48-72h, was accompanied by an increase of mononuclear cells and was associated with an increase of apoptotic events between 8-48h, as shown by morphological (apoptotic cells count) and biochemical (increase of caspase-3 cleavage and Bax) criteria. The protein AnxA1 in intact active form (37 kDa) was detected in animals injected with PBS, strongly decreased in the active phase of neutrophilic inflammation (4-24h) and increased during the natural resolution, as seen in 48- 72h after LPS challenge. There was a predominance of AnxA1 protein cleavage (33 kDa band) during the time-points of higher neutrophil recruitment. Treatment of animals with antiinflammatory drugs, which have been previously shown to induce resolution in the same inflammatory model, to know: rolipram (PDE4 inhibitor), wortmannin (PI3K inhibitor) and dexametasone (synthetic glucocorticoid) decreased the number of neutrophils into the pleuralcavity, with an increase of AnxA1 active form expression and prevention of its cleavage. Also, the increase of AnxA1 induced by these drugs has been associated with activation of pro-apoptotic proteins (increase of Bax and caspase-3 cleavage) and decreased phosphorylation of cell survival associated proteins (P-ERK1/2 and P-IKB-a). The functional relevance of AnxA1 for the resolution of pleurisy was determined using two strategies, a neutralizing antibody or a non-specific antagonist at FPR2/ALXR (the receptor which AnxA1 acts): both treatments inhibited spontaneous and dexamethasone-induced resolution of inflammation, expression of AnxA1 and apoptosis of neutrophils. The direct role of AnxA1 on the resolution of acute inflammation was evaluated using Ac2-26, an active peptide of theN-terminal portion of the protein. The injection of Ac2-26, by two different routes of administration, local and systemic, decreased the number of neutrophils in the pleural cavity, without modifying mononuclear cell numbers and increased apoptosis of neutrophils, an effect that was prevented by the injection of the pan caspase inhibitor zVAD-fmk. Mechanistically, the resolution of inflammation promoted by injection of Ac2-26 peptide was associated with neutrophil apoptosis with increase of Bax and caspase-3 cleavage, decrease of levels of Mcl-1, ERK1/2 and IkB-a phosphorylation, important proteins associated with neutrophil survival. Our data in vivo, using a dynamic model of acute inflammation, provide evidence that AnxA1 is a mediator of natural and glucocorticoid-induced resolution of inflammation with profound effect on neutrophils apoptosis.

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:10:34Z No. of bitstreams: 1 Fernanda Barbosa Nunes Coelho Completa.pdf: 588728 bytes, checksum: 9af1e75d5f5ce80d11945e947528ca8f (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:10:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Barbosa Nunes Coelho Completa.pdf: 588728 bytes, checksum: 9af1e75d5f5ce80d11945e947528ca8f (MD5) Previous issue date: 2010-10-21 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Ethanol consumption during gestation is a serious public health problem. During development, the nervous system is particularly susceptible to the toxic effects of ethanol and, in fact, ethanol exposure during perinatal development produces a range of neurobehavioral deficits, among which hyperactivity is one of the most frequently observed. There is evidence that reduced neuronal plasticity could be associated with hiperactivity. PDE inhibitors are drugs that prevent the breakdown of intracellular second-messengers such as cAMP and cGMP, maintaining the activation of protein kinases and of the CREB transcription factor, leading to the expression of plasticity-related genes. In this study we test whether Vinpocetine or Rolipram (PDE inhibitors) treatment can improve or revert hyperactivity in Swiss exposed to alcohol during the third trimester equivalent of human gestation. To that end, two experiments were carried out: In the first one, from postnatal day (PN) 2 to PN8, litters either received ethanol (5g/Kg i.p., 25% in saline solution) or an equivalent volume of saline solution every other day. On PN30, 4 h before the open field test (which lasted for 10 min) animals received Vinpocetine (10mg/Kg or 20mg/Kg diluted in DMSO i.p.) or dimethylsulfoxide (DMSO i.p.). In the second experiment animals were treated almost as before receiving Rolipram (0.5mg/Kg diluted in DMSO i.p.), instead of Vinpocetine, or DMSO i.p. After the tests, animals were sacrificed and frontal cerebral cortices and hippocampuses were dissected and collected for the analysis of cAMP levels. Behavioral results showed that only the Vinpocetine treatment (20mg/Kg) reversed the ethanol-elicited hyperactivity, a result that was not observed for the Rolipram treatment. In this way, the dosage of cAMP levels was done only for the animals that received received Vinpocetine (20mg/Kg). Ethanol neonatal exposure significantly reduced cAMP levels both in the cortex and in the hippocampus. Vinpocentine treatment increased cAMP levels in the cortex and restored it in the hippocampus. Our results suggest that the amelioration of the ethanolinduced hyperactivity by Vinpocetine is linked to an increased neuronal plasticity induced by this drug. O consumo de etanol durante a gestação é um grave problema de saúde pública. Durante o desenvolvimento, o sistema nervoso é especialmente susceptível aos efeitos tóxicos do etanol e a exposição ao etanol durante este período pode gerar um amplo espectro de distúrbios neurocomportamentais, sendo o mais frequente, a hiperatividade. Recentemente, estudos têm sugerido que distúrbios na plasticidade neuronal podem estar relacionados com a hiperatividade. Os inibidores de PDE são drogas que agem impedindo a degradação de segundos mensageiros celulares como AMPc e GMPc, mantendo a ativação de proteínas quinases e de fatores de transcrição como o CREB, levando a expressão de genes relacionados à plasticidade. Neste trabalho, avaliamos através do teste de campo aberto se a administração de Vinpocetina ou Rolipram (inibidores de PDE) seria capaz de amenizar ou reverter a hiperatividade de camundongos Suíços expostos ao etanol no período correspondente ao terceiro trimestre de gestação humana. Para tanto, foram realizadas duas etapas: na primeira etapa, durante o período neonatal, os animais receberam injeções intraperitoneais de etanol (5g/Kg em solução salina a 25%, no 2º, 4º, 6º e 8º dias de vida pós-natal - PN2 a PN8) ou de salina, e 4 horas antes do teste comportamental no campo aberto (10 min), em PN30, receberam Vinpocetina (10mg/Kg ou 20mg/Kg diluídas em DMSO ip) ou somente DMSO ip. Na segunda etapa, os animais foram expostos ao etanol ou à salina no período neonatal nas mesmas condições da primeira etapa e no dia do teste comportamental receberam Rolipram (0,5mg/Kg diluídas em DMSO ip ou somente DMSO ip). Posteriormente aos testes, foram coletados o córtex cerebral frontal e o hipocampo dos animais para avaliação dos níveis de AMPc. Os resultados comportamentais indicam que somente o tratamento com Vinpocetina (20mg/Kg) reverteu a hiperatividade de camundongos expostos ao etanol, resultado que não foi observado com o tratamento com Rolipram. Desta forma, a dosagem dos níveis de AMPc foi realizada apenas nos animais que receberam injeção de Vinpocetina (20mg/Kg). A exposição neonatal ao etanol reduziu significativamente os níveis de AMPc no córtex e no hipocampo. O tratamento com Vinpocetina gerou um aumento nos níveis de AMPc no córtex e restaurou estes níveis no hipocampo. Nossos resultados sugerem que a reversão da hiperatividade pelo tratamento com Vinpocetina pode estar associada ao aumento da plasticidade neural induzida por esta droga.

Orientador: Fábio Rogério Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A busca por estratégias para o tratamento de doenças neurodegenerativas e neurotraumas tem sido realizada mediante o emprego de moléculas que possam atuar impedindo a morte de células nervosas e/ou estimulando a regeneração axonal e dendrítica. Dentre elas se encontram os fatores neurotróficos e, em especial, o fator neurotrófico ciliar (CNTF), membro da família das neurocinas que promove a sobrevivência de uma variedade de populações de neurônios, além de desempenhar papel importante na resposta do tecido nervoso à lesão. Seu mecanismo de ação se dá através da via Janus Quinase/Proteína Transdutora de Sinal e Ativadora de Transcrição (JAK/STAT), conhecidamente envolvida na expressão de diversos genes implicados na neuroproteção através da fosforilação da STAT3. Outra via de sinalização intracelular também relacionada com mecanismos de neuroproteção e regeneração axonal é aquela dependente da concentração citoplasmática do monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), cuja concentração intracelular também pode ser modificada farmacologicamente através da interferência nos seus processos de síntese e degradação. O cAMP está envolvido em diversos eventos fisiológicos envolvendo o sistema nervoso e sua proteção. Seu principal alvo é a Proteína Quinase A, a qual exerce funções, dentre elas, a de estimular vias de sinalização intracelulares comprometidas com a sobrevivência neuronal e regeneração axonal. A estratégia aplicada no presente estudo consistiu na inibição da degradação de cAMP através de um inibidor de fosfodiesterase tipo IV, Rolipram. Diversas evidências sugerem que existam importantes interações entre a atividade do cAMP e a ação de neurocinas que potencializam os efeitos protetores destas últimas. Tendo isso em vista, investigamos os efeitos da associação do Rolipram e CNTF na proteção de neurônios da medula espinal de ratos neonatos após secção do nervo isquiático. Foi estudado um lote de ratos para investigação a curto prazo (tratamento e sacrifício no mesmo dia) para a investigação das vias de sinalização envolvidas e outro a longo prazo (tratamento por cinco dias) para a investigação morfológica com os grupos CNTF (0,3ug/g), Rolipram (2,0ug/g), CNTF + Rolipram (C+R) (0,3ug/g e 2,0ug/g, respectivamente), PBS e DMSO. Os dois últimos foram agrupados em um grupo denominado CONTROLE para análise proteica. As conseqüências no crescimento dos animais (evolução ponderal) foram mais proeminentes, visto que o grupo C+R cresceu menos que os outros grupos, denotando um efeito deletério já a partir do segundo dia de intervenção (P3) no desenvolvimento dos animais. Os tratamentos rápidos desencadearam um padrão diversificado de resultados. O tratamento com CNTF aumentou a fosforilação de STAT3 (pSTAT3) e a STAT3 total. A proteína pró-apoptótica BAD fosforilada aumentou com C+R, porém sua forma total não sofreu alterações. Já o fator de transcrição proteína ligadora ao elemento responsivo ao cAMP (CREB) e sua forma fosforilada, pCREB, não apresentaram alterações após os diferentes tratamentos. Após o tratamento prolongado não houve diferença entre os grupos no índice de Sobrevivência Neuronal. Não observamos efeito aditivo com tratamento simultâneo de CNTF e Rolipram nas vias relacionadas com a sobrevivência neuronal no presente modelo de lesão nervosa periférica Abstract: The search for strategies for the treatment of neurodegenerative diseases and neurotraumas has been performed through the use of molecules that may act as neuroprotective agents and avoid the death of neural cells and/or stimulate axonal and dendritic regeneration. Among these strategies, the neurotrophic factors, specially the ciliary neurotrophic factor (CNTF), member of the neurocytokines, have gained interest due to the fact of being capable of promoting the survival of a variety of neurons besides playing an important role in response to nervous injury. The mechanism of action is through Janus Kinase/ Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT), known to be involved in the expression of a variety of genes implicated in neuroprotection by phosphorylation of STAT3. Another intracellular signaling via also related with neuroprotection and axonal regeneration mechanisms is the one dependent on the cytoplasmic concentration of cyclic adenosine monophosphate (cAMP), whose intracellular concentration may also be modified pharmacologically through the interference in the processes of its synthesis and degradation. cAMP has been reported to be involved in several physiological events involving the nervous system and its protection. Its main target is Protein Kinase A (PKA), which exerts functions such as neuronal survival and axonal regeneration. The strategy applied on this work consisted on the inhibition of the breakdown of cAMP through an inhibitor of phosphodiesterase type IV, Rolipram. It has been described important relationship between the activity of cAMP and action of neurocytokines that potentiate the neuroprotective effects of the latter. In the present work we investigated the effects of the association of Rolipram and CNTF on the protection of spinal motoneurons of neonatal rats after transection of sciatic nerve. A set of rats was used to investigate short period treatment (treatment and sacrifice in the same day) in order to analyse intracelullar signaling vias involved and other set to investigate a prolonged treatment (treatment for five days) to make a morphological analysis of the groups CNTF (0,3ug/g), Rolipram (2,0ug/g), CNTF + Rolipram (C+R) (0,3ug/g e 2,0ug/g, respectively), PBS and DMSO. For proteic analysis, the two latter were grouped in one group called CONTROL. C+R group showed failure to thrive, meaning that a deleterious effect occurred as of the second day of intervention (P3). Short period treatments showed different results. Treatment with induced both phosphorylation and total amount of STAT3. The pro-apoptotic protein BAD raised its levels in response to C+R, but the total levels were not affected. On the other hand, cAMP Responsive Element Binding Protein (CREB) and its phosphorilated form, pCREB, showed no alteration after the treatments. In the prolonged investigation there was no difference between the treatments in the Neuronal Survival Index. There was no additive effect after simultaneous treatment with CNTF and Rolipram in neuronal survival in the present model of peripheral nervous injury Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Meduloblastoma é o tumor intracranial mais comum em crianças, provavelmente derivado de células precursoras da camada granular externa do cerebelo durante seu desenvolvimento. O tratamento padrão consiste em cirurgia, radioterapia e quimioterapia, que produzem graves sequelas nos pacientes e garantem uma sobrevida baixa, o que demonstra a necessidade de novas alternativas terapêuticas para a doença. Evidências demonstram que o receptor do peptídeo liberador de gastrina (GRPR) está superexpresso em diversos tumores humanos, assim como seu agonista (GRP) pode atuar como um fator de crescimento autócrino em tumores cerebrais. No presente estudo, avaliamos a expressão de GRPR e o efeito de seus agonistas, bombesina (BB) e GRP, além do antagonista RC-3095, sobre a viabilidade celular de linhagens de meduloblastoma humano DAOY, D283 e ONS76. Mostramos que meduloblastomas, apesar de expressarem GRPR, não têm sua viabilidade celular afetada por agonistas e antagonista desse receptor. Uma vez que há evidências de que BDNF (fator neurotrófico derivado de cérebro) esteja relacionado à diferenciação celular em meduloblastomas, também avaliamos o efeito de BDNF sobre a viabilidade celular das linhagens de meduloblastoma humano. As linhagens DAOY e D283 tiveram sua viabilidade celular reduzida pela presença de BDNF. Uma vez que a via da PKA tem sido implicada na iniciação e progressão de vários tumores, também avaliamos o efeito de rolipram, um inibidor de fosfodiesterase tipo IV, sobre a viabilidade celular das linhagens de meduloblastoma humano, sendo que rolipram reduziu a viabilidade celular de todas as linhagens estudadas. Os receptores de BDNF e a via da PKA podem, portanto, ser alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de novas terapias para meduloblastomas. Medulloblastoma is the most common intracranial tumor in children and is believed to arise from the precursor cells of the external granule layer of the developing cerebellum. The standard treatment, consisting of surgery, craniospinal radiotherapy and chemotherapy, produces severe sequelae in patients and provides a poor overall survival, indicating the need for new therapeutic alternatives for treating this disease. Evidences show that the gastrin releasing peptide receptor (GRPR) is overexpressed in various human tumors and its agonist (GRP) can act as an autocrine growth factor in brain tumors. In the present study, we evaluated GRPR expression, as well as the effect of its agonists, bombesin (BB) and GRP, and its antagonist RC-3095, over cell viability of the human medulloblastoma cell lines DAOY, D283 and ONS76. We found that medulloblastomas, in spite of expressing GRPR, do not have its viability affected by the presence of agonists and antagonist of this receptor. Since there are evidences that BDNF (brain-derived neurotrophic factor) is related to cell differentiation in medulloblastomas, we also evaluated the effect of BDNF over the viability of medulloblastoma cell lines. The viability of the cell lines DAOY and D283 was reduced by the presence of BDNF. Since the PKA pathway has been implicated in the initiation and progression of various tumors, we also evaluated the effect of rolipram, a phosphodiesterase IV inhibitor, over the viability of the same medulloblastoma cell lines and we found that rolipram inhibited the viability of all the cell lines studied. BDNF receptors, as well as the PKA pathway, may be therefore promising molecular targets for the development of new therapies for treating medulloblastomas.

A isquemia e reperfusão intestinal (I/R-i) é relevante fator para o desenvolvimento da síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). A lesão tecidual decorrente da I/R-i pode ser local e em órgãos distante do sitio isquêmico, notadamente o pulmão. Indivíduos submetidos à isquemia intestinal ao tornarem-se vulneráveis, desenvolvem resposta exacerbada a estímulos inflamatórios secundários constituindo assim a percepção de lesão decorrente de uma dupla agressão. Neste estudo desenvolvemos modelo murino de dupla agressão pulmonar ocasionada pela I/R-i seguida de estímulo da instilação nasal de LPS ou de suco gástrico (SG). A fase de caracterização do modelo de I/R-i revelou aumento de IL-6, G-CSF, KC, IP-10 e MCP-1, mas não de TNF-a no soro e em homogeneizados de pulmão e intestino. Anticorpos anti TNF-a e o etanercepte falharam em inibir o aumento de MPO pulmonar e intestinal após a I/R-i. A instilação nasal de LPS após a I/R-i aumentou a atividade pulmonar de MPO e exacerbou a permeabilidade vascular pulmonar. Neste caso, aminoguanidina ou a vimblastina reverterem o aumento da permeabilidade vascular, sugerindo a participação conjunta de neutrófilos e óxido nítrico no processo lesivo causado pela dupla agressão. A instilação nasal de SG induziu aumento inicial (2h) de MPO pulmonar seguido de influxo de neutrófilos (24h) para o espaço alveolar. Tal processo foi acompanhado por expressão inicial e transiente de TNF-a no LBA e contrabalanceada por IL-10. A resposta inflamatória aumentada de camundongos IL-10 KO à instilação de suco gástrico mostra o papel fundamental desta citocina do controle da inflamação. O rolipram ou o composto PKF 241-466 (inibidores de TNF-a) reduziram a inflamação pulmonar induzida pelo SG. A instilação de SG após a I/R-i (I/R-i +SG) exacerbou o aumento da permeabilidade vascular pulmonar. Os dados apresentados sugerem que a exposição do organismo ao trauma intestinal torna o pulmão suscetível a um estímulo secundário como o LPS e o suco gástrico. Visto a gama de estímulos inflamatórios a que indivíduos internados em unidades de terapia intensiva podem ser submetidos, os resultados deste estudo podem contribuir para a compreensão dos mecanismos reguladores do recrutamento de neutrófilos e geração de mediadores inflamatórios na síndrome do desconforto respiratório agudo. Intestinal ischemia and reperfusion (I/R) is implicated as a prime initiating event in the development of systemic inflammatory syndrome and Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS). Several studies pointed the possibility of massive systemic inflammatory events rendering the lungs more susceptible to an exacerbated inflammatory response, the so called two-hit hypothesis. In this way, minor local inflammatory stimuli could be a trigger for ARDS. In this study we investigated the effects of low-dose LPS or gastric juice (GJ) administered by nasal instillation to mice previously submitted to intestinal I/R. Our data showed that i-I/R alone induced histological signs of edema in lung as well as an increase of lung MPO activity and IL-6, G-CSF, KC, IP-10 and MCP-1 levels. Nasal instillation of LPS following i-I/R increased lung MPO activity and exacerbated lung vascular permeability. In this case, aminoguanidine or vinblastine blocked the increase of vascular permeability, suggesting the role of neutrophils and nitric oxide in injury induced by the two-hit stimuli. Instillation of GJ induced an initial (2h) increase of lung MPO followed by the influx of neutrophils (24h) to the alveolar space. Such process was followed by the transient expression of TNF-a in BAL and balanced by IL-10. The exacerbated inflammatory response of IL-10 KO mice to GJ instillation shows the importance of this cytokine in the control of the inflammation in such model. Treatment with rolipram or PKF 241-466 compound (TNF-a inhibitors) reduced lung inflammation induced by GJ. Nasal instillation of GJ after i-I/R exacerbated the increase in lung vascular permeability. The data shown suggest that the exposition of the organism to mesenteric trauma primes the host organism to a secondary inflammatory stimulus such as LPS or gastric juice. Considering the possible multiple insults to lung to which patients in intensive care units are submitted, the results of this study might contribute to the understanding of the regulatory mechanisms of neutrophils and generation of inflammatory mediators in the context of ARDS.

Muitas evidências demonstram que o peptídeo liberador de gastrina (GRP) é um fator de crescimento que afeta funções neuroendócrinas, incluindo proliferação e diferenciação celular, comportamento alimentar, formação de memória, respostas a estresses, desenvolvimento de neoplasias, desordens neurológicas e psiquiátricas. Porém, os eventos moleculares pelos quais isso ocorre ainda não são totalmente compreendidos. No presente estudo, nós avaliamos as interações entre o receptor do peptídeo liberador de gastrina (GRPR) e a via de sinalização celular da PKA, tanto na proliferação celular de glioblastoma humano (in vitro) quanto na consolidação da memória no hipocampo de ratos Wistar (in vivo). Mostramos que o GRP age em sinergismo com agentes que estimulam a via do cAMP/PKA, promovendo a proliferação de células de glioblastoma humano, pois o tratamento com GRP combinado com um ativador de adenilil ciclase (AC), forskolin, ou um análogo de cAMP, 8-Br-cAMP, ou um inibidor do tipo IV de fosfodiesterase, rolipram, aumentaram a proliferação das células de U- 138MG, quando avaliadas pelo método de MTT. Nenhum destes compostos teve efeito sozinho. O mRNA de GRPR e a expressão protéica em U-138MG foram detectados pelas técnicas de RT-PCR e imuno-histoquímica. No estudo in vivo a bombesina em baixas doses induziu um aumento na consolidação da memória. O resultado foi potencializado na combinação com um ativador do receptor de dopamina D1/D5 (D1R), além de ser prevenido quando combinado com um inibidor da via da PKA. Os resultados sugerem que GRP e GRPR interagem com a via de sinalização cAMP/PKA tanto na estimulação da proliferação celular em linhagem de câncer humano quanto na modulação da memória no hipocampo de ratos. Increasing evidence indicates that gastrin-releasing peptide (GRP) acts as an autocrine growth factor for brain tumors as well as been implicated in memory formation, however, underlying molecular events are poorly understood. In the present study, we examined interactions between the GRPR and cellular signaling pathways in influencing memory consolidation in the hippocampus and on proliferation of glioblastoma cell in vitro. We show here that GRP acts synergistically with agents that stimulate the cAMP/PKA pathway to promote proliferation of human gliobastoma cells. Treatment with GRP combined with the adenylyl cyclase (AC) activator forskolin, the cAMP analog 8-Br-cAMP, or the phosphodiesterase type IV (PDE4) inhibitor rolipram increased proliferation of U138-MG cells in vitro measured by MTT assay. None of the compounds had an effect when given alone. GRP receptor (GRPR) mRNA and protein expression in U138-MG cells was detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry. We investigated the interactions between the GRPR and the PKA pathway in male Wistar rats. BB-induced enhancement of consolidation was potentiated by co infusion of activators of the dopamine D1/D5 receptor (D1R) pathway and prevented by a PKA inhibitor. The results suggest that GRP and the GRPR interact with the cAMP/PKA signaling pathway in stimulating a cancer cell line proliferation and in memory modulation by hippocampal.

O excesso de ferro no enc?falo tem sido relacionado com a patog?nese de diversas doen?as neurodegenerativas, por exemplo, as doen?as de Alzheimer e de Parkinson. Tem sido demonstrado que o per?odo neonatal ? cr?tico para o estabelecimento do conte?do normal de ferro no c?rebro adulto e tamb?m se sabe que o envelhecimento altera a distribui??o cerebral deste metal. N?s descrevemos anteriormente que a administra??o de ferro no per?odo neonatal prejudica severamente a mem?ria de reconhecimento em ratos adultos e que o envelhecimento tamb?m induz preju?zos significativos na mem?ria de reconhecimento. O objetivo deste estudo foi determinar se os d?ficits de mem?ria induzidos pelo tratamento neonatal com ferro e pelo envelhecimento poderiam ser revertidos atrav?s de tr?s diferentes estrat?gias farmacol?gicas. No Experimento I, ratos machos receberam ve?culo (5% de sorbitol em ?gua destilada) ou ferro (10,0 mg/kg via oral) do 12? ao 14? dia p?s-natal. Ao ati ngirem a idade adulta, os grupos foram divididos em tr?s outros grupos experimentais que receberam 6 inje??es de salina ou desferroxamina (DFO, um quelante de ferro). Os animais foram submetidos ? tarefa de reconhecimento do objeto novo (RON) 24 h ap?s a ?ltima inje??o. Os resultados indicaram que o tratamento com DFO na idade adulta foi capaz de reverter o preju?zo de mem?ria de reconhecimento induzido pelo tratamento neonatal com ferro. No Experimento II, ratos machos (23 meses de idade) receberam 6 inje??es de salina ou DFO (300,0 mg/Kg ip). Os animais foram submetidos ao RON 24 h ap?s a ?ltima inje??o. Os ratos tratados com DFO apresentaram ?ndices de reconhecimento normais, enquanto que os ratos do grupo salina apresentaram d?ficits de mem?ria de reconhecimento. Tamb?m foi demonstrado que o DFO reduziu os danos oxidativos a prote?nas no c?rtex e no hipocampo desses animais. No Experimento III, os ratos foram submetidos ao mesmo tratamento neonatal com ferro realizado no Experimento I. Ao atingirem a idade adulta, os grupos foram divididos em 3 outros grupos experimentais que receberam ve?culo (1% de DMSO em salina) ou SKF 38393 [um agonista de receptores dopamin?rgicos do tipo D1] (5,0 mg/Kg ip) ou GBR 12935 [um inibidor da recapta??o de dopamina] (5,0 ou 10,0 mg/Kg ip) imediatamente ap?s o treino do RON. Tanto a administra??o de SKF 38393 quanto de GBR 12935 foi capaz de reverter o preju?zo de mem?ria induzido pelo tratamento neonatal com ferro. No Experimento IV, os ratos foram submetidos ao tratamento neonatal com ferro como descrito nos Experimentos I e III. Ao atingirem a idade adulta, os grupos foram divididos em quatro outros grupos experimentais que receberam ve?culo ou rolipram [um inibidor da fosfodiesterase] (0,01; 0,03 ou 0,1 mg/kg ip) imediatamente ap?s o treino do RON. Os ratos tratados com ferro, que receberam rolipram (0,03 e 0,1 mg/Kg), apresentaram mem?ria de reconhecimento normal. No Experimento V, ratos machos (24 meses de idade) receberam ve?culo ou rolipram (0,1 mg/kg ip) imediatamente ap?s o treino do RON. O tratamento com rolipram reverteu o preju?zo de mem?ria de reconhecimento induzido pelo envelhecimento. Os resultados, em conjunto, mostram que a terapia com quelante de ferro e o aumento dos n?veis do AMPc foram capazes de reverter os d?ficits de mem?ria de reconhecimento induzidos pelo tratamento neonatal com ferro e pelo envelhecimento.

Phosphodiesterases (PDEs) are enzymes that promote hydrolysis of cAMP/cGMP. PDE inhibitors have been useful in the therapy of diseases which are intrinsically related to deregulations in vascular tone by increasing levels of these second messengers. Thus, PDE inhibitors may be important in the treatment of cardiovascular diseases. AAL 195 is a compound synthesized from structural modifications of the molecules of Zardaverina and Rolipram, two PDE4 inhibitors known. Binding assays and molecular modeling showed AAL 195 is a potent and selective inhibitor of these enzymes. Therefore, the aim of this study was to evaluate the vasorelaxant effect of AAL 195 in superior mesenteric artery of rats and elucidate the mechanisms involved in this it. Male Wistar rats (250 – 300g) were euthanized by exsanguination under anesthesia and superior mesenteric artery was removed, cut in rings (2-4 mm), which were mounted in organ baths containing Tyrode's solution at 37°C and gassed with 95% O2 - 5% CO2. For isometric tension recordings, each ring was fixed in a force transducer connected to an acquisition system. The values were expressed as mean ± S.E.M. Data were analyzed using Student's t test or one-way ANOVA, followed by Bonferroni (p