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Contaminação e Toxicologia Ambientais Master of Environmental Contamination and Toxicology

The aim of this study was to compare two methodologies, evaluating in vitro the biocompatibility of intra-oral orthodontic elastics through cytotoxity test in culture of HEp-2 cells (human larynx carcinoma), comparing two methodologies: diffusion in agar and incorporation of the neutral red assay. Orthodontic elastics of two different commercial labels were used: American Orthodontic (American Orthodontic, Sheboygon, the USA) and Morelli (Sorocaba, São Paulo, Brazil). The results using both methodologies demonstrated low cytotoxity for American Orthodontic and for Morelli. In accordance with the results can be concluded that both methodologies can be used to test orthodontic elastics.

Os implantes mamários de silicone têm sido empregados, tanto nas cirurgias de aumento de mama, quanto na reconstrução do tecido mamário. A segurança biológica deste tipo de implante deve ser garantida, pois, em função da esterilização estes materiais, podem sofrer alterações oriundas dos processos esterilizantes por comprometimento da estrutura química dos polímeros. O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da biocompatibilidade de implantes mamários preenchidos com gel de silicone, de superfície lisa e texturizada submetidos à esterilização por calor seco e óxido de etileno. Empregou-se, para tanto, método in vitro, avaliando a citotoxicidade pelo método de captura do vermelho neutro, utilizando a linhagem celular NCTC clone 929. Os resultados obtidos demonstraram não haver comprometimento da biocompatibilidade dos biomateriais submetidos aos dois processos (calor seco e óxido de etileno), assim como comprovaram a eficácia de ambos na esterilização dos implantes.Silicone breast implants have been widely used for mammary augmentation and reconstruction surgery. Biological safety of these implants can be altered by sterilization methods. This study consisted of the biocompatibility assessment of smooth and textured silicone gel breast implants sterilized by dry-heat and ethylene oxide through cell viability, employing neutral red uptake method. The NCTC clone 929 cell were employed and the results showed no cytotoxicity of implants after both sterilization processes.

This article reports research results related to bioactivity and cytotoxicity tests using neutral red uptake method for glass powders and bulk glass ceramics belonging to the SNCP (SiO2-Na2O-CaO-P2O5) system. The obtained materials showed bioactivity when immersed in SBF promoting the surface deposition of HAp. When analyzed as powders, cytotoxicity was evidenced in the processed materials but not when bulk samples were tested.

O objetivo deste trabalho é caracterizar a citotoxicidade de materiais cerâmicos que podem apresentar biocompatibilidade, e assim, serem usados como componentes em sistemas de implantes. Amostras à base de ZrO2, ZrO2-Al2O3, Si3N4 com AlN/Tr2O3 foram submetidas a testes "in vitro" de citotoxicidade para avaliação biológica preliminar. No teste utilizaram-se extratos dos materiais a serem testados em contato com uma cultura de células de mamíferos (linhagem celular NCTC-clone L929), assim como extratos dos controles positivo (solução de fenol) e negativo (pellets de PVC atóxico). A avaliação da citotoxicidade foi realizada utilizando-se o método de incorporação do corante vital vermelho neutro. Os resultados obtidos demonstraram que os materiais em análise não apresentaram caráter citotóxico, independentemente do tempo de sinterização utilizado e da composição de cada amostra. Dessa forma, estes materiais são fortes candidatos a terem aplicação em sistemas de implantes. The objective of this work was the cytotoxicity characterization of ceramic materials that can present biocompatibility and thus to be used as component in implantations systems. Samples based on ZrO2, ZrO2-Al2O3, Si3N4 with AlN/Tr2O3 were submitted the "in vitro" cytotoxicity tests for preliminary biological evaluation. In the tests, extracts of the materials were used to be tested in contact with a mammalian cell culture (NCTC-clone L929 cell line) as positive (phenol solution) and negative (no toxic PVC pellets) extracts controls. The cytotoxicity evaluation was carried through using the neutral red uptake methodology. The obtained results showed that the analyzed materials independent of sample composition or sintering time did not present cytotoxic character. So, these materials are strong candidates to be applied in implantation systems.

Os implantes mamários de silicone têm sido empregados, tanto nas cirurgias de aumento de mama, quanto na reconstrução do tecido mamário. A segurança biológica deste tipo de implante deve ser garantida, pois, em função da esterilização estes materiais, podem sofrer alterações oriundas dos processos esterilizantes por comprometimento da estrutura química dos polímeros. O objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da biocompatibilidade de implantes mamários preenchidos com gel de silicone, de superfície lisa e texturizada submetidos à esterilização por calor seco e óxido de etileno. Empregou-se, para tanto, método in vitro, avaliando a citotoxicidade pelo método de captura do vermelho neutro, utilizando a linhagem celular NCTC clone 929. Os resultados obtidos demonstraram não haver comprometimento da biocompatibilidade dos biomateriais submetidos aos dois processos (calor seco e óxido de etileno), assim como comprovaram a eficácia de ambos na esterilização dos implantes. Silicone breast implants have been widely used for mammary augmentation and reconstruction surgery. Biological safety of these implants can be altered by sterilization methods. This study consisted of the biocompatibility assessment of smooth and textured silicone gel breast implants sterilized by dry-heat and ethylene oxide through cell viability, employing neutral red uptake method. The NCTC clone 929 cell were employed and the results showed no cytotoxicity of implants after both sterilization processes.

A pandemia de COVID-19 trouxe a necessidade global de desenvolvimento de novos biossensores de uso prático, com rápida reposta, sensíveis e de baixo custo, visando o diagnóstico no ponto de atendimento e monitoramento em massa da contaminação da população. Nesse sentido, os transistores de efeito de campo de grafeno (GFETs) estão entre os biodispositivos mais promissores devido à sensibilidade e rapidez de resposta. Entretanto, a baixa seletividade, inerente ao mecanismo de resposta dos GFETs e o uso de um eletrodo de referência não-polarizável do tipo Ag/AgClsat em sua configuração limitam a aplicação. Neste sentido, nesta Tese de Doutorado apresentam-se o desenvolvimento e a aplicação de um novo tipo de biossensor a base de grafeno monocamada, com detecção híbrida, onde o dispositivo usa princípios elétricos e eletroquímicos, denominado Dispositivo Elétrico-Eletroquímico Vertical de Grafeno (DEEV). O DEEV foi projetado para que um eletrodo formado pela heterojunção de camada grafeno/sonda redox adsorvida fique exposta ao eletrólito e, com isso, pequenas mudanças causadas por analitos na interface eletrodo/eletrólito altere a densidade de carga próxima ao ponto K da primeira zona de Brillouin do grafeno. Esta perturbação altera o ponto de Dirac e causa dispersão de energia, resultando em diferentes valores de capacitância e potencial da interface, que são fortemente correlacionadas à presença do analito. Além disso, foi observado que processos faradaicos podem ocorrer no plano ortonormal do grafeno na presença de uma sonda redox acoplada por interações de van der Waals, intensificando a perturbação da interface pela presença do analito no eletrólito, tornando o DEEV mais sensível quando comparado ao GFET. Como prova de conceito, utilizou-se um DEEV baseado na heterojunção grafeno/ferroceno para detecção de DNA em fita única, obtendo-se um limite de detecção (LOD) na ordem de zeptomolar (10-21 mol L-1). Por ter carga total negativa, o DNA altera a capacitância da interface formada pela heterojunção, alterando também o potencial de circuito aberto (OCP), que por sua vez, responde às mudanças de concentrações de DNA. Por conseguinte, o DEEV foi aplicado como um imunossensor para diagnóstico de COVID-19. Para isso, substituiu-se o ferroceno pela sonda redox neutral red modificada com os domínios RBD da proteína Spike do SARS-CoV-2. Nesta configuração, o biossensor requer 40 µL de amostra de soro de um paciente infectado com COVID-19, sendo possível detectar anticorpos IgG produzidos em resposta à infecção por COVID-19 com LOD de 1,0 pg mL-1. Por fim, desenvolveu-se um biossensor do tipo DEEV para detecção de antígeno (vírus SARS-CoV-2) em amostras de saliva, com LOD de 2,86 fmol L-1, indicando a adequação do biossensor para o diagnóstico de COVID-19 em estágio inicial. Tanto o imunossensor, quanto o biossensor de antígeno para diagnóstico de COVID-19, foram validados em amostras reais e utilizando parâmetros de validação da ANVISA e ABRAMED. The COVID-19 pandemic brought the global need to develop new biosensors for practical use, with quick response, sensitivity, and low cost, aiming point-of-care diagnosis and mass monitoring concerning the contamination of a population. In this sense, graphene field effect transistors (GFETs) are among the most promising biodevices due to their sensitivity and rapidness of response. However, the low selectivity inherent to the response mechanism of GFETs and the use of a non-polarizable reference electrode of the Ag/AgClsat type in its configuration limit its application. In this sense, this Doctorate Thesis presents the development and application of a new type of biosensor based on monolayer graphene, with hybrid detection, where the device uses electrical and electrochemical principles, called Graphene Vertical Electrical-Electrochemical Device (EEVD). EEVD was designed so that an electrode formed by the heterojunction of a graphene layer/adsorbed redox probe is exposed to the electrolyte and, as a result, small variations caused by the presence of analytes at the electrode/electrolyte interface change the charge density near the graphene K point of first Brillouin zone. This perturbation alters the Dirac point and causes energy dispersion, resulting in different values of capacitance and potential of the interface, which are strongly correlated to the presence of the analyte. Furthermore, it was observed that faradaic processes can occur in the orthonormal plane of graphene in the presence of a redox probe coupled by van der Waals interactions, intensifying the interface perturbation by the presence of the analyte in the electrolyte, making EEVD more sensitive when compared to GFET. As a proof of concept, a EEVD based on the graphene/ferrocene heterojunction was used for single-stranded DNA detection, obtaining a limit of detection (LOD) of zeptomolar magnitude order (10-21 mol L-1). Because it has a total negative charge, DNA changes the capacitance of the interface formed by the heterojunction, and varies its open circuit potential (OCP), which in turn responds linearly to alterations of DNA concentrations. Therefore, EEVD was applied as an immunosensor for the diagnosis of COVID-19. For this, ferrocene was replaced by the neutral red redox probe modified with Spike protein receptor binding domain (RBD) of SARS-CoV-2. In this configuration, the biosensor requires 40 µL of serum sample from a patient infected with COVID-19, and it is possible to detect IgG antibodies produced in response to COVID-19 infection with an LOD of 1.0 pg mL-1. Finally, an EEVD-type biosensor was developed for antigen detection (SARS-CoV-2 virus) in saliva samples, with a LOD of 2.86 fmol L-1, indicating the suitability of the biosensor for the diagnosis of COVID-19 in early stage. Both the immunosensor and the antigen biosensor for the diagnosis of COVID-19 were validated in real samples and using validation parameters from ANVISA and ABRAMED.

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2020-11-12T19:16:43Z No. of bitstreams: 3 Tese_BrunaCostabeberGuerino_VersaoParcial.pdf: 1942035 bytes, checksum: 6ec33a751251b91bc77f0e34174cd711 (MD5) Tese_BrunaCostabeberGuerino.pdf: 2492999 bytes, checksum: 160a2603d7afa2f4532e35abc3eaf503 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Made available in DSpace on 2020-11-12T19:16:43Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Tese_BrunaCostabeberGuerino_VersaoParcial.pdf: 1942035 bytes, checksum: 6ec33a751251b91bc77f0e34174cd711 (MD5) Tese_BrunaCostabeberGuerino.pdf: 2492999 bytes, checksum: 160a2603d7afa2f4532e35abc3eaf503 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2020-07-31 CAPES Currently, it is sought to develop new pharmacological therapies for the treatment of diseases that affect the Central Nervous System, often with irreversible sequelae, such as cerebral ischemia. However, many substances with proven neuropharmacological activity, such as guanosine (GUO), are unable to perform their functions at the systemic level, as they have a metabolism and rapid release into the bloodstream when administered orally. Here, we show that the combination of GUO with scalene and the subsequent formation of a nanocomplex, first reported in the literature, can be a potential neuroprotection strategy. First, an ab initio study was carried out to simulate where the connections between the GUO and the scalene would occur, in order to understand the energy level of this new structure. Through a synthetic route, the GUO-scalene complex (GUE) it presented was produced and its formation was confirmed by nuclear magnetic resonance (NMR). Subsequently, the formation of the GUO-scalene nanocomplex (NGUE) was carried out, with a particle size of approximately 180 nm, PDI of 0.285, Zeta potential of 25.09 mV, pH of 6.9 and stability of up to 30 days at room temperature. , as demonstrated by the stability study of this formulation. The NGUE showed an antioxidant effect when tested by the DPPH method. Its biological safety was evaluated by demonstrating that it is not toxic to viable cells of hippocampus slices by MTT, differently from what was observed in the GUE, nor to cells peripheral blood mononucleated by MTT, Neutral Red and Violet Crystal methods. It was observed that NGUE helps to decrease the proliferation of human neuroblastoma tumor cells of the SH-SY5Y lineage, proven by the MTT, Neutral Red, PicoGrren and Violet Crystal methodologies. NGUE has a neuroprotective effect in an in vitro model of cerebral ischemia in slices of the hippocampus of rats and the damage caused by quinolinic acid. These results indicate a perspective of therapeutic use for the developed NGUE. Atualmente, busca-se desenvolver novas terapias farmacológicas para o tratamento de doenças que afetam o Sistema Nervoso Central, muitas vezes com sequelas irreversíveis, como isquemia cerebral. No entanto, muitas substâncias com atividade neurofarmacológica comprovada, como a guanosina (GUO), são incapazes de desempenhar suas funções em nível sistêmico, pois possuem um metabolismo e liberação rápida na corrente sanguínea quando administrados por via oral. Aqui, mostramos que a combinação de GUO com escaleno e a subsequente formação de um nanocomplexo, relatada pela primeira vez na literatura, pode ser uma estratégia potencial de neuroproteção. Primeiro, foi realizado um estudo ab initio para simular onde as conexões entre a GUO e o escaleno ocorreriam, a fim de entender o nível de energia dessa nova estrutura. Através de uma rota sintética, o complexo GUO-escaleno (GUE) que apresentou foi produzido e sua formação foi comprovada por ressonância magnética nuclear (RMN). Posteriormente, foi realizada a formação do nanocomplexo GUO-escaleno (NGUE) um tamanho de partícula de aproximadamente 180 nm, PDI de 0,285, potencial Zeta de 25,09 mV, pH de 6,9 e uma estabilidade de até 30 dias em temperatura ambiente, como demonstrou o estudo de estabilidade desta formulação. O NGUE, apresentou um efeito antioxidante, quando testado pelo método de DPPH .Avaliou-se a sua segurança biológica demonstrando que ele não é tóxico para células viáveis de fatias de hipocampo por MTT, diferentemente do que se observou no GUE, e nem pra células mononucleadas de sangue periférico pelos métodos de MTT, Vermelho Neutro e Cristal de Violeta. Observou-se que NGUE ajuda a diminuir a proliferação de células tumorais de neuroblastoma humano da linhagem SH-SY5Y compravado pelas metodologias de MTT, Vermelho Neutro, PicoGrren e Cristal de Violeta. NGUE apresenta efeito neuroprotetor em um modelo in vitro de isquemia cerebral em fatias de hipocampo de ratos e pelo dano causado pelo ácido quinolínico. Esses resultados indicam uma perspectiva de uso terapêutico para o NGUE desenvolvido.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Uma das ameaças mais graves ao meio ambiente é a poluição do meio aquático e do ar, gerada pelos efluentes e emissão de gases poluentes das indústrias. Dentre os métodos aplicados à purificação da água e do ar, o processo de adsorção é de maior interesse, pelo baixo custo e por possibilitar o uso de diferentes adsorventes renováveis, como o carvão ativado derivado de biomassa residual. Além disso, pesquisas buscam também a combinação de compostos que geram efeito sinérgico na capacidade de adsorção, como filmes de quitosana e carvão ativado. Dessa forma, o objetivo geral do trabalho foi produzir e caracterizar os carvões ativados provenientes de resíduo florestal, bem como sintetizar filmes compósitos de quitosana com carvão ativado (CA), avaliar a capacidade de adsorção dos produtos e suas eficiências de remoção dos corantes azul de metileno e vermelho neutro. Foram produzidos CAs utilizando vapor d’água e CO 2 em diferentes tempos (1, 2 e 3 horas) e temperaturas (600, 750 e 900 °C), além de filmes compósitos de quitosana com CAs. O processo de ativação utilizando vapor d’água e CO 2 à base de resíduo florestal, foi eficaz e gerou CAs com grande volume de poros e área superficial de mais de 1000 m²/g, aproximando-se dos CAs comerciais. Os CAs produzidos à 900 °C durante 2 e 3 horas, tiveram eficiência de remoção de 68 e 84%, respectivamente, do corante azul de metileno em apenas 10 minutos de adsorção. O filme de quitosana com CA produzido à 750 °C, durante 2 horas, proporcionou aumento de 87% da capacidade de adsorção e 43% da eficiência de remoção do corante vermelho neutro, quando comparado ao filme de quitosana pura. A pesquisa mostrou capacidade de produção de adsorventes com a possibilidade de aplicação em tratamento de efluentes, a partir de resíduo da biomassa florestal, agregando valor à matéria prima com baixo potencial de aproveitamento. Palavras-chave: Adsorventes. Filmes. Painel compensado. Precursor. One of the most serious threats to the environment is pollution of the aquatic environment and air, generated by effluents and emission of polluting gases by industries. Of the methods applied to water and air purification, the adsorption process is of greatest interest, due to its low cost and because it is carried out with the use of different renewable adsorbents, such as activated carbon derived from residual biomass. In addition, researchers are also looking for the combination of compounds that generate a synergistic effect on the adsorption capacity, such as chitosan films and activated carbon. Thus, the general objective of the work was to produce and characterize activated charcoal from forest waste, as well as synthesize chitosan composite films with activated carbon (CA), evaluate the adsorption capacity of the products and their removal efficiency of methylene blue and neutral red dyes. CAs were produced using water vapor and CO 2 at different times (1, 2 and 3 hours) and temperatures (600, 750 and 900 °C), in addition to chitosan composite films with CAs. The activation process using water vapor and CO 2 , based on forest residues, was effective and generated CAs with a large volume of pores and a surface area of more than 1000 m²/g, approaching the commercial ones. The CAs produced at 900 °C for 2 and 3 hours had removal efficiency of 68 and 84%, respectively, of the methylene blue dye in just 10 minutes of adsorption. The chitosan film with CA produced at 750 °C for 2 hours provided an increase of 87% in the adsorption capacity and 43% in the removal efficiency of the neutral red dye, when compared to the pure chitosan film. The research showed the capacity to produce adsorbents with the possibility of being used in wastewater treatment, from forest biomass residues, adding value to the raw material with low potential for use. Keywords: Adsorbents. Films. Plywood panel. Precursor.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2020-05-19T17:19:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação - Evelyn Assis de Andrade.pdf: 2754781 bytes, checksum: 0489ad121c0e18a0ec2c9a2e251a6dfb (MD5) Made available in DSpace on 2020-05-19T17:19:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação - Evelyn Assis de Andrade.pdf: 2754781 bytes, checksum: 0489ad121c0e18a0ec2c9a2e251a6dfb (MD5) Previous issue date: 2020-03-06 Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns é conhecida popularmente como “janaúba” e seu látex é empiricamente utilizado como uma “garrafada” para tratamento de diversas doenças, entre elas o câncer. Frente a isso, o objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade citotóxica in vitro e in vivo de compostos presentes no látex de E. umbellata, baseando-se em seu uso e indicação tnofarmacológica e relacionar os resultados com a composição química dessa matriz vegetal. Para tanto, o látex foi coletado e fracionado em extrator Soxhlet, do qual foram obtidas 8 frações, as quais foram utilizadas nos ensaios de citotoxicidade (MTT e vermelho neutro) frente à linhagem B16F10 (melanoma murino); os resultados foram utilizados para o cálculo do CI50 e, com base nestes, pode-se calcular o índice de seletividade (IS). Para os ensaios in vivo, foram utilizados 36 camundongos C57BL/6, machos, nos quais foram inoculadas as células B16F10 para formação do tumor e posteriormente estes animais foram tratados com a subfração diclorometano nas concentrações de 1 mg/kg e 10 mg/kg por 15 dias. Os resultados in vitro demonstraram-se pertinentes para o látex (CI50 = 0,69 ± 0,12 μg/mL, com IS = 0,6 por MTT; e CI50 = 0,02 ± 0,004 μg/mL, com IS = 6,3 por vermelho neutro) e para a fração hexano (CI50 = 24,44 ± 2,30 μg/mL, com IS = 0,8, por MTT e CI50 = 21,30 ± 16,60 μg/mL, com IS = 1,1 por vermelho neutro) e promissores para as subfrações éter de petróleo (CI50 = 5,99 ± 0,23 μg/mL, com IS = 3,98, por MTT) e diclorometano (CI50 = 16,20 ± 7,33 μg/mL, com IS = 0,30 por MTT). A análise espectrofotométrica das frações permitiu determinar que a subfração diclorometano apresenta maior quantidade de terpenos totais expressos em eufol. Acrescenta-se a isso o dado que a análise das frações, por CLAE-EM/EM permitiu quantificar grande quantidade de ésteres de forbois nas frações clorofórmio e acetato de etila e na subfração etanol. Com relação aos resultados in vivo, para o experimento realizado nesse trabalho, se verificou que a subfração diclorometano não demonstrou diferença significativa no volume do tumor nas concentrações testadas, frente ao controle negativo. Conclui-se que o látex de E. umbellata apresenta potencial citotóxico in vitro frente a linhagem B16F10, resultado esse que não foi confirmado nos experimentos in vivo, nesse trabalho. Ainda, pode-se inferir que essa ação pode estar relacionada a presença de terpenos na matriz vegetal. Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns is popularly known as "janauba" and its latex is empirically used for the treatment of several diseases, including cancer. So, the aim of this work was to evaluate the in vitro and in vivo cytotoxic activity of compounds present in E. umbellata latex, based on its use and ethno pharmacological indication,and correlate the results to the chemical composition of this plant. For this, the latex was collected and fractionated in Soxhlet extractor and 8 extracts (samples) were obtained. The extracts were used in the cytotoxicity assays (MTT and neutral red) against the B16F10 (murine melanoma) cell lines. The results were used to calculate the IC50 and, based on these; the selectivity index (IS) was determinate. For in vivo assays, 36 male C57BL/6 mice were used and B16F10 cells were inoculated for tumor formation and subsequently these animals were treated with dichloromethane subfraction at concentrations of 1 mg/ml and 10 mg/ml per 15 days. In vitro results were pertinent for latex (IC50 = 0.69 ± 0.12 μg/ml, with IS = 0.6 by MTT assay; and IC50 = 0.02 ± 0.004 μg/ml, with IS = 6.3 by neutral red assay) and for the hexane fraction (IC50 = 24.44 ± 2.30 μg/ml, with IS = 0.8, by MTT assay and IC50 = 21.30 ± 16.60 μg/ml, with IS = 1.1 by neutral red assay); for the petroleum ether (IC50 = 5.99 ± 0.23 μg/ml with IS = 3.98 by MTT) and dichloromethane (IC50 = 16.20 ± 7.33 μg/ml with IS = 0.30 by MTT) subfractions the results were promising. The spectrophotometric analysis of the fractions allowed determining that the dichloromethane subfraction has the highest amount of total terpenes expressed in eufol. In addition, the analysis of fractions by the LC-MS/MS technique allowed determining that the chloroform and ethyl acetate fractions and the ethanol subfraction presented a large amount of phorbol esters in their compositions. Regarding the in vivo results, for the experiment carried out in this work, it was found that the dichloromethane subfraction did not show a significant difference in the tumor volume in the tested concentrations, compared to the negative control. It is concluded that E. umbellata latex has in vitro cytotoxic potential compared to the B16F10 cell, a result that was not confirmed in the in vivo experiments in this work; it can still be inferred that this action may be related to the presence of terpenes in the plant matrix.

Submitted by Ana Carolina Feitosa Cruz (carolfeitosa1@uol.com.br) on 2019-02-12T15:44:13Z No. of bitstreams: 1 Toxicidade e riscos ecológicos das tintas anti-incrustantes de terceira geração.pdf: 11602263 bytes, checksum: ee6ae9aa2043c3f2ee4d3baa79449400 (MD5) Submitted by Ana Carolina Feitosa Cruz (carolfeitosa1@uol.com.br) on 2019-02-12T19:10:29Z No. of bitstreams: 1 Toxicidade e riscos ecológicos das tintas anti-incrustantes de terceira geração.pdf: 11602263 bytes, checksum: ee6ae9aa2043c3f2ee4d3baa79449400 (MD5) Submitted by Ana Carolina Feitosa Cruz (carolfeitosa1@uol.com.br) on 2019-02-13T11:55:30Z No. of bitstreams: 1 Toxicidade e riscos ecológicos das tintas anti-incrustantes de terceira geração.pdf: 11602263 bytes, checksum: ee6ae9aa2043c3f2ee4d3baa79449400 (MD5) Approved for entry into archive by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br) on 2019-02-13T18:41:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cruz_acf_dr_svic.pdf: 11602263 bytes, checksum: ee6ae9aa2043c3f2ee4d3baa79449400 (MD5) Made available in DSpace on 2019-02-13T18:41:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cruz_acf_dr_svic.pdf: 11602263 bytes, checksum: ee6ae9aa2043c3f2ee4d3baa79449400 (MD5) Previous issue date: 2019-01-14 Rejected by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br), reason: Boa tarde. Favor corrigir: - o nome do arquivo que em um lugar aparece como Tese e em outro com o nome do título do trabalho, que é o correto; - A Linha de Pesquisa; Observei que na página de rosto do trabalho consta o nome do co-orientador e vc não colocou ele. Se o co-orientador foi oficial, vc precisa incluir o nome dele. abs. Disleide Silvia Valerio Gounella Bibliotecária UNESP Campus de São Vicente e-mail: disleide.valerio@unesp.br skype: disleidesilviavaleriogounella telefone: 13-3569-7154 on 2019-02-12T18:48:08Z (GMT) Rejected by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br), reason: Bom dia Por favor, entre em contato com o seu orientador e defina a sua área de pesquisa, dentro das 4 linhas que o Instituto disponibiliza na página da Pós-Graduação. abs. Disleide Silvia Valerio Gounella Bibliotecária UNESP Campus de São Vicente e-mail: disleide.valerio@unesp.br skype: disleidesilviavaleriogounella telefone: 13-3569-7154 on 2019-02-13T11:07:51Z (GMT) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Centenas de compostos são detectados nos diferentes compartimentos ambientais podendo ser de origem natural ou antrópica. Em muitos casos, pouco se sabe a respeito desses compostos, não havendo regulações sobre seu uso, e por isso são denominados compostos de interesse emergente. Dentre eles podem ser citados os biocidas das tintas anti-incrustantes. Tais tintas são utilizadas para proteger e combater a formação e o estabelecimento de comunidades bioincrustantes sobre superfícies expostas à água do mar. Elas são aplicadas em diversas estruturas, tais como embarcações, plataformas petrolíferas, tubulações submarinas, comportas de represas, tanques destinados à aquicultura, entre outras. Assim, essas tintas são utilizadas com o intuito de preservar as estruturas, bem como, a manter a navegabilidade, no caso das embarcações. O composto de interesse para este estudo é um dos biocidas utilizados nas tintas anti-incrustantes, a diclofluanida. Devido as suas características físico-químicas, parte da diclofluanida liberada na coluna d’água tenderá a adsorver ao material particulado e se depositará nas camadas sedimentares. Desta forma este estudo teve o objetivo de avaliar a toxicidade e efeitos subcrônicos da diclofluanida em exposições realizadas em água e sedimento com espécies marinhas. Além disso, experimentos utilizando sedimento também tiveram o objetivo de comparar a influência de diferentes concentrações de matéria orgânica sobre a toxicidade de sedimentos contendo diclofluanida. Para os testes ecotoxicológicos em água foram utilizados embriões do ouriço-do-mar da espécie Echinometra lucunter e fêmeas ovígeras do copépodo Nitocra sp. Já os testes em sedimento foram conduzidos com o copepódo Nitocra sp. e com o anfípodo Tiburonella viscana. No teste de exposição subcrônica à soluções aquosas foram utilizados bivalves da espécie Perna perna, e para sedimentos fortificados foram usados bivalves adultos de Anomalocardia flexuosa. Em seguida, foi realizada a técnica da retenção do vermelho neutro (apenas para P. perna), sendo também analisados o dano em DNA, teores de LPO, GSH, e atividades de GST, EROD, AChE e GPx para ambas as espécies. Para os sedimentos também foram realizadas as análises granulométricas, teor de carbonato de cálcio e de matéria orgânica. Nos testes ecotoxicológicos com soluções aquosas, os níveis tóxicos foram superiores às concentrações ambientais. Embriões de E. lucunter apresentaram maiores porcentagens de larvas anormais a partir da concentração de 1 μg/l, que foi a menor concentração de efeito observado (CEO); a Concentração Efeito Não Observado (CENO) foi de 0,1 μg/l. A CE50–40h foi de 198,5 μg/l e CE10–40h foi de 0,3577 μg/l. Nos testes com Nitocra sp., a CEO foi de 100 μg/l e a CENO foi de 10 μg/l. A CE10-7d foi de 0,0635 μg/l enquanto a CE50-7d foi de 583,83 μg/l. Nos testes de sedimento, as concentrações testadas não foram tóxicas ao copépodo Nitocra sp., e as fecundidades foram semelhantes quando comparados os dois tipos de sedimentos. Para T. viscana as taxas de mortalidade aumentaram 40% na concentração de 1000 ng/g e 30% na concentração de 10000 ng/g. Ao comparar os dois sedimentos, a maior diferença entre as mortalidades foi observada em 1000 ng/g, sugerindo que há uma influência da matéria orgânica na toxicidade da Diclofluanida. Essas investigações mostram que a diclofluanida mostra-se tóxica aos invertebrados marinhos e que, nos sedimentos, sua toxicidade pode ser influenciada pelo nível de matéria orgânica. Para as exposições subcrônicas em água, foi possível observar efeito nas maiores concentrações no vermelho neutro denotando perda da estabilidade lisossômica. Para os biomarcadores também foi possível observar alterações nas glândulas digestivas e brânquias. Para sedimento é possível prever efeito em ambos os órgãos internos e há um incremento dos efeitos nos sedimentos com maiores teores de matéria orgânica. No presente estudo foi possível constatar que o diclofluanida foi responsável por gerar respostas em todos os ensaios de toxicidade realizados em água e apenas um efeito agudo no sedimento com alto teor de matéria orgânica. Os dados de biomarcadores corroboram com os testes de toxicidade. Em água é possível observar um efeito aos organismos nas maiores concentrações testadas e em sedimento é possível observar um aumento de efeito nos organismos nos sedimentos ricos em matéria orgânica. Hundreds of compounds have been detected in different environmental compartments, which may be natural or anthropogenic origin. In many cases, little is known about these compounds, thus there is not regulations for them, leading them be considered effective contaminants and so are called emerging. Among these compounds can be cited the biocides of antifouling paints. They are used to protect and combat the formation and establishment of biofouling communities on surfaces exposed to seawater. They are applied in various structures, such as vessels, oil platforms, submarine pipelines, tanks for aquaculture, among others. Thus, these paints are used with the intention of preserving the structures, as well as maintaining navigability in the case of vessels. The compound of interest for this study is one of the biocides used in antifouling paints, dichlofluanid. Due to its physico-chemical characteristics, part of the dichlofluanid released in the water column tended to adsorb to the particulate material and then deposit in the sedimentary layers. In this way, this study aimed to evaluate the toxicity and subchronic effects of dichlofluanid exposures, after in water and sediment with marine species. In addition, sediment experiments also aimed to evaluate how different concentrations of organic matter in the sediments could influence on their responses. Embryos of the sea urchin Echinometra lucunter and ovigerous females of the copepod Nitocra sp for the ecotoxicological tests in water. The sediment tests were conducted with the copepod Nitocra sp. and with the amphipod Tiburonella viscana. For the exposure tests in water were used bivalves of the species Perna perna and for sediment with bilvalves of Anomalocardia flexuosa. Then, the neutral red retention technique was applied only to P. perna and DNA damage, LPO, GSH, GST, EROD, AChE and GPx for both species. For the sediments were also carried out the granulometric analyzes, calculation of the content of carbonates and organic matter. In ecotoxicological tests with aqueous solutions, the toxic levels were higher than the environmental concentrations. Embryos of E. lucunter presented higher percentages of abnormal larvae from the concentration of 1 μg/l, which was the lowest observed effect concentration (LOEC); the No Observed Effect Concentration (NOEC) was 0.1 μg/l. EC50-40h was 198.5 μg/l and EC10-40h was 0.3577 μg/l. In the Nitocra sp. Tests, LOEC was 100 μg/l and NOEC was 10 μg/l. EC10-7d was 0.0635 μg/l while EC50-7d was 583.83 μg/l. In the sediment tests, the concentrations tested were not toxic to the Nitocra sp and the copepod fecundities were similar when compared the two sediment types. For T. viscana, mortality rates increased by 40% at the concentration of 1000 ng/g and 30% at the concentration of 10000 ng/g. When comparing the two sediments, the greatest difference between mortalities was observed at 1000 ng/g, suggesting that there is an influence of organic matter on the toxicity of Diclofluanid. These investigations show that diclofluanid is toxic to marine invertebrates and that, in sediments, its toxicity can be influenced by the level of organic matter. For the subchronic exposures in water, it was possible to observe effect in the higher concentrations in the neutral red denoting loss of the lysosomal stability. For the biomarkers it was also possible to observe changes in the glands and digestive gills. For sediment it is possible to predict effect in both organs as well, and there is an increase in effects on sediments with higher organic matter contents. In the present study it was possible to verify that dichlofluanid was responsible for generating responses in all toxicity tests performed in water and only an acute effect on the sediment with high organic matter content. Biomarker data corroborate with toxicity tests. In water it is possible to observe an effect to the organisms in the highest concentrations tested and in sediment it is possible to observe an increase of effect in the organisms in the sediments rich in organic matter. FAPESP: 2016/02029-4

Orientador: Profa. Dra. Iara José de Messias-Reason Coorientador: Prof. Dr. Flávio Luís Beltrame Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 13/12/2019 Inclui referências: p. 99-112 Área de concentração: Análises Clínicas Resumo: O sistema complemento desempenha um importante papel na imunidade humoral e inata e pode ser ativado por três vias: clássica (VC), alternativa (VA) e lectina (VL). Essas vias são ativadas por diferentes mecanismos que culminam em uma cascata proteolítica que elimina microrganismos e desencadeia o processo inflamatório. Sua ativação exacerbada está relacionada a reações autoimunes, doenças inflamatórias, promoção de crescimento tumoral e metástase. A espécie Euphorbia umbellata Pax Bruyns tem sido tradicionalmente utilizada para o tratamento de doenças inflamatórias e câncer. Suas atividades biológicas são atribuídas aos constituintes químicos presentes em sua composição como terpenos, alcaloides e flavonoides. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito das frações hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol do látex de E. umbellata e do composto majoritário presente nesta matriz, eufol, sobre a ativação das vias do sistema complemento e na quimiotaxia de neutrófilos, bem como, a atividade do eufol em cultura de células HRT18, B16F10 e 3T3 e seus possíveis mecanismos de indução de morte celular. A avaliação do complemento foi realizada utilizando ensaios hemolíticos para VC e VA e ELISA para VL, e, a quimiotaxia de neutrófilos, foi realizada utilizando a caseína como indutor quimiotático e câmara de Boyden. A citotoxicidade foi avaliada pelas metodologias de redução do MTT, internalização do vermelho neutro pelos lisossomos, cálculo do IC50 e índice de seletividade. Os mecanismos de morte celular foram avaliados pela morfologia celular à fresco e com coloração hematológica; e o ciclo celular e potencial transmembrânico de mitocôndria através de citometria de fluxo. Todas as frações do látex de E. umbellata e eufol induziram um efeito inibitório na ativação da VA. Na VC as frações metanol e acetato de etila inibiram a ativação, e os extratos clorofórmio e o eufol ativaram esta via. A VL foi inibida pela fração hexano, acetato de etila e eufol. A quimiotaxia de neutrófilos foi inibida por todas as frações do látex e pelo eufol. O eufol também foi capaz de induzir morte celular pelas duas metodologias de citotoxicidade avaliadas, no entanto a técnica de internalização do vermelho neutro foi mais sensível. Os valores de IC50 foram 62,7+7,6, 70,7+4,3, 39,0+6,5 ?M para B16F10, HRT18 e 3T3, respectivamente, e o índice de seletividade 0,62 e 0,55 para B16F10 e HRT18. A morfologia das células tratadas com eufol mostraram sinais de morte apoptótica tanto na visualização à fresco quanto com coloração hematológica. Já as análises das fases do ciclo celular e do potencial transmembrânico de mitocôndria não mostraram alterações quando comparadas ao grupo controle. Assim, é possível concluir que o fitocomplexo e o eufol isolado das frações de látex de E. umbellata têm potencial para uso no tratamento de doenças inflamatórias relacionadas ao complemento e possível aplicação na terapia do câncer. Palavras chave: Euphorbia umbellata. Eufol. Sistema complemento. Quimiotaxia. Citotoxicidade. Abstract: The complement system plays an important role in humoral and innate immunity and can be activated by three pathways: classical (CP), alternative (AP) and lectin (LP). These pathways are activated by different mechanisms that culminate in a proteolytic cascade that eliminates microorganisms and triggers the inflammatory process. Its exacerbated activation is related to autoimmune reactions, inflammatory diseases, tumor growth promotion and metastasis. The species Euphorbia umbellata Pax Bruyns has been traditionally used for the treatment of inflammatory diseases and cancer. Its biological activities are attributed to the chemical constituents present in its composition as terpenes, alkaloids and flavonoids. The aim of this work was to evaluate the effect of hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol fractions of E. umbellata latex and the major compound present in this matrix, euphol, on the activation of complement system pathways and neutrophil chemotaxis, as well as the euphol activity in HRT18, B16F10 and 3T3 cell culture and their possible mechanisms of cell death induction. Assessment of complement by CP and AP pathways was performed using hemolytic and ELISA assays for LP and neutrophil chemotaxis was performed using casein as the chemotactic inducer and Boyden's chamber. Cytotoxicity was evaluated by MTT reduction and neutral red internalization by lysosomes methodologies, IC50 calculation and selectivity index. The mechanisms of cell death were evaluated by fresh and hematologically stained cell morphology; and the cell cycle and transmembrane potential of mitochondria by flow cytometry. All latex fractions of E. umbellata and euphol induced an inhibitory effect on AP activation. In CP, methanol and ethyl acetate fractions inhibited activation, and chloroform and euphol extracts activated this pathway. LP was inhibited by the hexane, ethyl acetate and euphol fraction. Neutrophil chemotaxis was inhibited by all latex fractions and euphol. Euphol was also able to induce cell death by the two cytotoxicity methodologies evaluated, however the neutral red internalization technique was more sensitive. IC50 values were 62.7+7.6, 70.7+4.3, 39.0+6.5 ?M for B16F10, HRT18 and 3T3, respectively, and the selectivity index 0.62 and 0.55 for B16F10 and HRT18. The morphology of the euphol treated cells showed signs of apoptotic death in both fresh visualization and hematological staining. Cell cycle phase and mitochondrial transmembrane potential analyzes showed no changes when compared to the control group. Thus, it can be concluded that phytocomplex and euphol isolated from E. umbellata latex fractions have potential for use in the treatment of complement-related inflammatory diseases and possible application in cancer therapy. Keywords: Euphorbia umbellata. Euphol. Complement system. Chemotaxis. Cytotoxicity

O câncer é a segunda principal causa de morte no mundo, e estima-se qye seja responsável por 9,6 milhões de mortes em 2018. Dentre os fatores limitantes do tratamento dos tumores malignos com medicamentos é a resistência e a baixa eficácia das terapias disponíveis, além dos efeitos colaterais que se estendem também a todo tipo celular em divisão. As tioidantoínas são compostos sintéticos que apresentam efeitos biológicos, tais como: antiparasitários, antivirais, antitumorais, antioxidantes, anti-inflamatória. O ácido grandiflorênico é um diterpeno, extraído da parte aérea da planta Sphagneticola trilobata, e já descrito por suas ações anti-inflamatórias, antileishmanicida, antibacteriana e antitumoral. Considerando novas abordagens para o tratamento do câncer, pesquisamos o efeito desses compostos nas linhagens celulares tumorais de mama (MCF-7), de pulmão (A549) e de fígado (HuH7.5), bem como os prováveis mecanismos de morte envolvidos. As tioidantoínas foram testadas em diferentes concentrações (25, 50 e 100 µM), através de ensaios de citotoxicidade pelo MTT, vermelho neutro e azul de tripan, sob as celulas MCF-7 e hemácias ovinas. A avaliação do volume celular e análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo, e análises de fluorescência para determinação do mecanismo de morte induzido pelas tioidantoínas. Três experimentos independentes foram realizados, cada um em triplicata. O tratamento com as tioidantoínas promoveu a morte das células tumorais de mama MCF-7, porém não causou hemólise em hemácias ovinas. O efeito citotóxico resultou no aumento da produção de ROS, e parada do ciclo celular na fase G1/G0, com redução do volume celular, perda de integridade de membrana, despolarização mitocondrial e aumento da fluorescência para anexina, indicando morte celular por apoptose, e aumento da formação de vacúolos autofágicos. O GFA in vitro foi avaliado quanto à citotoxicidade através do teste de avaliação mitocondrial do MTT, vermelho neutro e azul de tripan, nas linhagens tumorais MCF-7 (câncer de mama), A549 (câncer de pulmão) e HuH7.5 (câncer de fígado). A avaliação do volume celular foi realizada por citometria de fluxo, e análises de fluorescência para determinação do mecanismo de morte, através da exposição de fosfatidilserina, integridade de membrana, e formação de vacúolos autofágicos. Foi avaliada ainda a possível indução da formação de espécies reativas de oxigênio por fluorescência. O tratamento com GFA inibiu significativamente a proliferação celular nas três linhagens estudadas, que foi acompanhada de diminuição do volume celular, principalmente na concentração de 400 nM. A avaliação dos mecanismos de morte mostrou que os tratamentos aumentaram: a produção de ROS, a exposição de folfatidilserina, a despolarização de membrana mitocondrial, e formação de vacúolos autofágicos. Observamos que os compostos estudados se mostraram citotóxicos para as linhagens tumorais, alcançando uma indução de apoptose e autofagia nessas células, em proporções maiores que nas células normais testadas, demonstrando que os dois compostos, devem ser melhores estudados como candidatos à terapia antineoplásica. Cancer is one of the leading causes of death worldwide, and the limiting factors for the treatment of malignant tumors is the resistance and low efficacy of the available therapies, as well as the side effects that also extend to every type of cell division. Thioidantoins are synthetic compounds that have biological effects, such as: antiparasitic, antiviral, antitumor, antioxidant, anti-inflammatory and anticarcinogenic. The grandiflorenic acid is a diterpene, extracted from the aerial part of the plant Sphagneticola trilobata, and already described by its anti-inflammatory, antileishmanicida, antibacterial and antitumoral actions. Considering new approaches to cancer treatment, we investigated the effect of these compounds on the tumor cell lines of breast (MCF-7), lung (A549) and liver (HuH7.5), as well as the probable mechanisms of death involved. Thioidantoins were tested at different concentrations (25, 50 and 100 ?M) by MTT, neutral red and trypan blue cytotoxicity assays under MCF-7 cells and ovine red blood cells. Evaluation of cell volume and cell cycle analysis was performed by flow cytometry, and fluorescence analysis to determine the mechanism of death induced by thioidantoins. Three independent experiments were performed, each in triplicate. Treatment with thioidantoins promoted the death of MCF-7 breast tumor cells, but did not cause hemolysis in ovine red blood cells. The cytotoxic effect resulted in increased ROS production and cell cycle arrest in the G1 / G0 phase, with reduction of cell volume, loss of membrane integrity, mitochondrial depolarization and increased fluorescence to annexin, indicating cell death by apoptosis, and increased formation of autophagic vacuoles. GFA in vitro was evaluated for cytotoxicity through the MTT mitochondrial evaluation, neutral red and tripan blue, in MCF-7 (breast cancer), A549 (lung cancer) and HuH7.5 liver). Cell volume evaluation was performed by flow cytometry, and fluorescence analysis for determination of the mechanism of death, through phosphatidylserine exposure, membrane integrity, and autophagic vacuoles formation. The possible induction of the formation of reactive oxygen species by fluorescence was also evaluated. Treatment with GFA significantly inhibited cell proliferation in the three lines studied, which was accompanied by a decrease in cell volume, mainly at the concentration of 400 nM. The evaluation of the mechanisms of death showed that the treatments increased: ROS production, folphatidilserin exposure, mitochondrial membrane depolarization, and autophagic vacuoles formation. We observed that the compounds studied were cytotoxic to the tumor cell lines, achieving an induction of apoptosis and autophagy in these cells, in proportions higher than the normal cells tested, demonstrating that the two compounds should be better studied as candidates for antineoplastic therapy.

A experimentação animal tem sido um grande aliado do homem no progresso da Ciência. Contudo, muito tem se discutido sobre a capacidade preditiva desses modelos in vivo em identificar substâncias químicas tóxicas para o ser humano. O avanço do conhecimento científico do Século XXI tem incentivado a busca de modelos preditivos que considerem a fisiologia do organismo humano, bem como a fisiopatologia das reações adversas física e quimicamente induzidas. Nesse contexto, o foco do presente estudo foi a avaliação de toxicidade dérmica de ingredientes de tinturas de cabelo e agrotóxicos e seus produtos acabados, denominados aqui de misturas da “vidareal” (a real condição que o consumidor está exposto). Uma estratégia integrada de testes in vitro foi desenvolvida para avaliar o potencial desses materiais em induzir reações alérgicas quando em contato com a pele humana. Essa estratégia envolveu diferentes técnicas inovadoras de relevância humana baseadas em eventos-chave da via do efeito adverso da sensibilização dérmica (reatividade com proteínas, ativação de queratinócitos e/ou células dendríticas). O primeiro método implementado “in house” foi o teste denominado direct peptide reactivity assay (DPRA, OECD 442C/2015). No processo de implementação, um refinamento voltado na redução do volume final de reação do ensaio foi realizado e, desta forma, o custo e o uso de solventes orgânicos foram reduzidos consideravelmente. Essas modificações permitiram a “miniaturização da técnica”, denominada micro-DPRA (mDPRA), a qual apresentou desempenho similar ao DPRA convencional na identificação de substâncias alergênicas e produtos acabados como formulações de agrotóxicos contendo glifosato e surfactantes. Além disso, foi estabelecido um segundo refinamento que originou o desenvolvimento de outra técnica, o photo-mDPRA, capaz de identificar fotoalérgenos de contato, o que não era possível pela técnica disponível de fototoxicidade já validada (3T3 neutral red uptake phototoxicity test – OECD 432/2004). Da mesma forma que o mDPRA, o photo-mDPRA também apresentou aplicabilidade para substâncias puras e misturas baseadas em glifosato e surfactantes. Outro ponto desse trabalho foi o estabelecimento de uma plataforma multiparamétrica in vitro para avaliação da sensibilização dérmica de materiais cosméticos: ingredientes cosméticos e produtos naturais de tintura capilar contendo henna [Lawsonia inermis (Lythraceae)]. Além do mDPRA e photo-mDPRA, foram implementados outros sete diferentes ensaios inovadores. Entre eles, quatro apresentaram superioridade frente aos tradicionais modelos em roedores na identificação de ingredientes cosméticos com potencial alergênico: mDPRA, quantificação de interleucina (IL)-18 em queratinócitos humanos HaCaT, U937 cell line activation test (U-SENSTM, OECD 442E/2018) e genomic allergen rapid detection (GARDTM skin). O GARDTM skin obteve a melhor capacidade preditiva em relação aos dados humanos (concordância = 100%), enquanto que mDPRA (concordância = 91,7%), quantificação de IL-18 em queratinócitos HaCaT e U-SENSTM (ambos com concordância = 92.3%) apresentaram predições similares. Expandindo a aplicabilidade dessa estratégia, ela foi utilizada para avaliar dez produtos naturais de tintura capilar contendo henna, vendidos em estabelecimentos comerciais localizados em Goiânia, GO, Brasil. Como primeiro passo, foram realizadas a análise de rótulo e a caracterização dessas misturas da “vida real” por cromatografia líquida de alta eficiência. Para isso, foram avaliadas quanto à presença do potente alérgeno de contato p-fenilenodiamina (p-phenylenediamine, PPD) e do biomarcador da henna, o lawsone. Contrastando com o que foi declarado nos rótulos pelos fabricantes, as análises cromatográficas evidenciaram que todos os produtos continham PPD e um deles não apresentou teores detectáveis de lawsone. Portanto, deparou-se com duas problemáticas: adulteração e falsificação de produtos henna. Além disso, a avaliação toxicológica utilizando a abordagem integrada de testes in vitro estabelecida nesse trabalho mostrou que, de forma geral, as hennas desencadearam alta reatividade peptídica, aumento dos níveis de IL-18 em queratinócitos HaCaT e de expressão de CD86 em células U937 no ensaio U-SENSTM, e induziram alterações nos 200 genes que compõem a assinatura preditiva do GARDTM skin. Desse modo, outra problemática foi encontrada nesses produtos testados: todas as hennas apresentaram potencial em promover dermatite de contato alérgica em humanos. Em paralelo, também foi verificado que os ingredientes de tintura capilar, incluindo o PPD, promoveram modulação de genes relacionados à resposta ao estresse oxidativo em queratinócitos humanos HaCaT, entre eles: nuclear factor erythroid 2- related factor 2 (NRF2), heme oxygenase 1 (HO1), e Fos proto-oncogene (FOS). Assim, ressaltam-se as conseqüências toxicológicas do uso não declarado de PPD em produtos naturais à base de henna, bem como os riscos associados, que podem envolver a sensibilização de consumidores suscetíveis e casos de dermatite de contato alérgica em indivíduos previamente sensibilizados. Ademais, esse trabalho vem contribuir na promoção da inovação e autonomia tecnológica do Brasil dentro da área da Toxicologia do Séc. XXI através do estabelecimento e desenvolvimento de abordagens in vitro de relevância humana para avaliação da sensibilização dérmica. Animal experimentation has been a great ally of man in the progress of Sciences. However, the predictive capacity of in vivo models to identify toxic chemicals to humans has been widely debated. The advance of the 21st Century scientific knowledge has promoted the search for predictive models that consider the human physiology as well as the pathophysiology of the physically and chemically induced-adverse reactions. In this context, the present study focused on the evaluation of dermal toxicity of ingredients of hair dyes and agrochemicals and their finished products, referred to herein as "real-life" mixtures (the real condition of which the consumer is exposed to). An integrated strategy of in vitro tests was developed to evaluate the potential of these materials to induce allergic reactions when in contact with human skin. This strategy involved different human-relevant innovative techniques based on key-events of the adverse outcome pathway of skin sensitization (protein reactivity, activation of keratinocytes and/or dendritic cells). The first method implemented in house was the direct peptide reactivity assay (DPRA, OECD 442C/2015). The refinement process conducted was able to reduce the final reaction volume of the test, yielding in considerable reduction of cost and use of organic solvents. These modifications allowed the "minituarization of the technique", called micro-DPRA (mDPRA), which showed a similar performance to conventional DPRA in the identification of allergenic substances and finished products as surfactants and glyphosate-containing formulations. A second refinement led to the development of the photo-mDPRA, a technique capable of identifying contact photoallergens, which was not possible by the already validated phototoxicity technique (3T3 neutral red uptake phototoxicity test - OECD 432/2004). Similar to mDPRA, photo-mDPRA showed applicability to pure substances and mixtures based on glyphosate and surfactants. This work also established an in vitro multiparametric platform to evaluate the skin sensitization of cosmetic materials: cosmetic ingredients and hair dye products containing henna [Lawsonia inermis (Lythraceae)]. In addition to mDPRA and photo-mDPRA, seven different innovative methods were implemented. Four of them showed superior capacity to identify cosmetic ingredients with allergenic potential as compared to the traditional rodent models, which are: mDPRA, measurement of interleukin (IL)-18 in human HaCaT keratinocytes, U937 cell line activation test (U-SENSTM, OECD 442E/2018) and genomic allergen rapid detection (GARDTM skin). GARDTM skin had the highest predictive capacity in relation to human data (concordance = 100%), while mDPRA (concordance = 91.7%), measurement of IL-18 in HaCaT keratinocytes and U-SENSTM (both with concordance = 92.3%) showed similar predictions. Expanding the applicability of this strategy, it was used to evaluate ten natural henna-containing hair dye products sold in commercial establishments located in Goiânia, GO, Brazil. The first step was the label analysis followed by characterization and quantification of the potent contact allergen pphenylenediamine (PPD) and the henna biomarker lawsone using high performance liquid chromatography. In contrast to what was stated in the labels by the manufacturers, the chromatographic analyses showed that all products contained PPD, and one of them did not present detectable contents of lawsone. Therefore, revealing the adulteration and falsification of henna products. Furthermore, toxicological evaluation using the integrated in vitro testing approach established in this study showed that hennas generally triggered high peptide reactivity, increased IL-18 levels in HaCaT keratinocytes and CD86 expression in U937 cells in U-SENSTM assay, and induced changes in the 200 genes from the GARDTM skin predictive signature. Additionally, all hennas had the potential to trigger allergic contact dermatitis in humans. In parallel, hair dye ingredients, including PPD, promoted modulation of genes related to the oxidative stress response in human HaCaT keratinocytes, including nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2), heme oxygenase 1 (HO1), and Fos proto-oncogene (FOS). Therefore, the toxicological consequences and the associated risks of undeclared use of PPD in natural henna products are highlighted, which include sensitization of susceptible consumers and cases of allergic contact dermatitis in previously sensitized individuals. In addition, this study contributes to promotion of innovation and technological autonomy of Brazil within the area of Toxicology for the 21st Century through the establishment and development of an in vitro human-relevant approaches for skin sensitization assessment. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

No desenvolvimento de novos medicamentos, nove entre dez candidatos promissores que iniciam a fase clínica não receberão aprovação. Reduzir a falha de candidatos a fármacos utilizando ensaios in vitro pode reduzir o uso desnecessário de animais, bem como prever efeitos tóxicos em fases pré-clínicas. O objetivo do presente estudo foi avaliar a citotoxicidade pelo método MTT de quatro novas substâncias nas linhagens celulares A549, H9C2, HEP-G2, LLC-PK1 e NEURO-2. Para substância que apresentou menor citotoxicidade no teste de MTT, realizou-se o teste do vermelho neutro de acordo com a OECD 129 a fim de extrapolar o resultado obtido como dose inicial para o teste de toxicidade aguda (OECD 423). A dose inicial de 300 mg/kg não promoveu efeitos tóxicos observáveis para os animais estudados. Por outro lado, a dose de 2000 mg/kg causou a morte de um animal em cada grupo, entretanto, nenhum dos grupos apresentou alterações macroscópicas na necropsia. Os resultados do presente estudo mostram limitações do teste de vermelho neutro como preditor da dose inicial para o estudo de toxicidade aguda devido a vários fatores como limitada biodisponibilidade in vivo e geração de metabólitos tóxicos. In the development of new medicines, nine out of ten promising candidates entering the clinical phase will not receive approval. Reducing the failure of drug candidates using in vitro assays can reduce the unnecessary use of animals as well as predict toxic effects at preclinical stages. The objective of the present study was to evaluate MTT cytotoxicity of four new substances in the A549, H9C2, HEP-G2, LLC-PK1 and NEURO-2 cell lines. For the substance that showed the lowest cytotoxicity in the MTT test, the neutral red test according to OECD 129 was performed in order to extrapolate the result obtained as the initial dose for the acute toxicity test (OECD 423). An initial dose of 300 mg / kg did not promote observable toxic effects for the animals studied. On the other hand, the dose of 2000 mg / kg resulted in the death of one animal in each group; however, none of the groups presented macroscopic changes at necropsy. The results of the present study shows limitations of the neutral red test as a predictor of the initial dose for the acute toxicity study due to several factors such as limited in vivo bioavailability and generation of toxic metabolites.

Submitted by Agda Marobo Andreotti (36897500836) on 2017-10-19T21:29:31Z No. of bitstreams: 1 TESE DOUTORADO AGDA MAROBO ANDREOTTI.pdf: 5621947 bytes, checksum: ad2de971e6e9dcd6b35700dd4f7bc0d1 (MD5) Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-10-23T18:36:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 andreotti_am_dr_araca.pdf: 5621947 bytes, checksum: ad2de971e6e9dcd6b35700dd4f7bc0d1 (MD5) Made available in DSpace on 2017-10-23T18:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 andreotti_am_dr_araca.pdf: 5621947 bytes, checksum: ad2de971e6e9dcd6b35700dd4f7bc0d1 (MD5) Previous issue date: 2017-08-31 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) O controle da formação de biofilme é essencial para manter a saúde da cavidade anoftálmica dos portadores de prótese ocular. As propriedades físicas da resina acrílica, como a sua rugosidade, podem interferir na adesão de microrganismos nas próteses e na formação de biofilmes. Sendo assim, é necessário utilizar soluções de limpeza eficazes e que não causem irritação tecidual na conjuntiva ocular. O objetivo desse trabalho foi verificar a influência da rugosidade de superfície da resina acrílica utilizada na confecção de próteses oculares na formação de biofilme bacteriano, bem como avaliar a eficácia antimicrobiana e citotoxicidade de diferentes soluções para desinfecção de próteses oculares. Para a análise da rugosidade, corpos de prova de resina acrílica foram confeccionados e divididos em 5 grupos de acordo com a granulação de lixa de polimento utilizada: 120, 400, 800, 1200 e 1200S (lixa + sílica). A rugosidade dos corpos de prova foi mensurada por meio de perfilômetro e imagens de Microscopia de Força Atômica foram obtidas para cada grupo. O crescimento das espécies Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis sobre os corpos de prova foi avaliado após 4 e 24h, por meio da contagem das Unidades Formadoras de Colônia (UFC)/mL. O efeito dos seguintes tratamentos: soro fisiológico, sabão neutro, clorexidina 4%, pastilhas efervescentes Efferdent®, triclosan 1% e citronela sobre biofilme formado sobre os corpos de prova de resina acrílica também foi avaliado por meio da determinação do número de UFC/mL. A citotoxicidade dos agentes antimicrobianos foi avaliada por meio dos testes de MTT e Neutral Red, após tratamento dos corpos de prova, diariamente, por 1, 7, 15, 30, 60 e 90 dias com as soluções já citadas, sendo avaliados ao fim de cada período. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística adequada, considerando se provinham de dados paramétricos ou não paramétricos. Os resultados demonstraram que os menores valores de rugosidade foram encontrados no grupo 800, 1200 e 1200S. A contagem microbiana foi menor no grupo 1200S e esta diferiu estatisticamente (p>0,05) do controle para ambos os tempos de avaliação e bactérias. Na análise da ação antimicrobiana das soluções para desinfecção, todos os protocolos promoveram redução do crescimento dos microrganismos testados comparados ao controle (crescimento sem a presença do antimicrobiano), sendo que os grupos submetidos ao tratamento com clorexidina 4%, pastilhas efervescentes Efferdent® e triclosan 1% eliminaram o biofilme (p>0,01). Ainda nos ensaios de citotoxicidade, em todos os grupos foi observada proliferação celular das células da conjuntiva acima de 84% (p>0,05). Dessa forma, conclui-se que a rugosidade não interfere significativamente na adesão bacteriana e formação de biofilme, exceto para o grupo 1200S, e que os protocolos de limpeza com imersão em clorexidina 4%, pastilhas efervescentes Efferdent® e triclosan 1% são totalmente eficazes na desinfecção e não apresentam citotoxicidade para com as células da conjuntiva humana, sugerindo sua indicação para desinfecção de próteses oculares. The control of biofilm formation is essential to maintain the health of anophthalmic cavity of ocular prosthesis wearers. The physical properties of the acrylic resin, such as surface roughness, may interfere with the adhesion of microorganisms to the prostheses. Therefore, it is necessary to use cleaning solutions that are effective and do not cause tissue irritation in ocular conjunctiva. The aim of this study was to verify the influence of surface roughness of the acrylic resin used in the preparation of ocular prosthesis in the formation of bacterial biofilm, as well as to evaluate the antimicrobial efficacy and cytotoxicity of different disinfectants in ocular prostheses. For roughness analysis, acrylic resin samples were prepared and divided into 5 groups according to the granulation of polishing sandpaper used: 120, 400, 800, 1200 and 1200S (sandpaper + silica). The roughness of the samples was measured using a profilometer and Atomic Force Microscopy images were obtained for each group. The microbial growth for Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis on the samples was evaluated after 4 and 24 h by counting the Colony Forming Units (CFU)/mL. The effect of the following solutions was also evaluated by CFU/mL: non treated group (immersed in saline solution), neutral soap, 4% chlorhexidine, Efferdent® effervescent tablets, 1% triclosan and citronella. The cytotoxicity of the solutions was evaluated by MTT and Neutral Red after treating the samples daily for 1, 7, 15, 30, 60 and 90 days with the solutions already mentioned, being evaluated at the end of each period. Data were submitted to proper statistical analysis, considering whether data were parametric or non-parametric. The results showed that the lowest roughness values were found in groups 800, 1200 and 1200S. 1200S group also presented the lowest values of microbial growth statistically different from control group (p>0,05), for both periods and bacteria evaluated. In the analysis of the solutions, compared to the control group (microbial growth without the presence of the antimicrobial), all protocols promoted a reduction in the growth of the microorganisms, and the groups submitted to disinfection with 4% chlorhexidine, Efferdent® effervescent tablets and 1% triclosan eliminated the biofilm (p>0,01). In addition, all groups showed cell proliferation of conjunctival cells above 84% in the cytotoxicity assays (p>0,05). Thus, it was concluded that the roughness does not significantly interfere in the adhesion of the microorganisms, except for group 1200S, and that the cleaning protocols with 4% chlorhexidine, Efferdent® effervescent tablets and 1% triclosan are totally effective in the disinfection and do not present cytoxicitiy with human conjunctive cells, what suggests their indication for cleaning of ocular prosthesis. CNPq: 141722/2015-0

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Hidroxicloroquina (HCQ), classicamente empregado no tratamento da malária e de doenças autoimunes, tem sido proposta como fármaco de escolha para outros fins terapêuticos. Entretanto, este fármaco é conhecido por causar efeitos colaterais, como distúrbios visuais, que podem ser irreversíveis, sendo que os mecanismos que levam a essas desordens não são completamente conhecidos. A toxicidade produzida na retina pelo uso da HCQ pode ser devida a sua alta taxa metabólica, sendo o tecido muito susceptível à ação de xenobióticos e danos oxidativos. Assim, este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos do fármaco HCQ sobre células da retina, bem como seus possíveis mecanismos de citotoxicidade. Como modelo de estudo, utilizamos culturas de células da retina de embrião de galinha. Para avaliar a viabilidade celular foi usado o ensaio de medida de atividade mitocondrial por MTT. A função lisossomal foi avaliada pela taxa de incorporação do corante vermelho neutro. Os níveis de espécies reativas de oxigênio geral e de ânion superóxido foram avaliados pela sonda CellROX e por Nitro Blue Tetrazolium (NBT), e os níveis de glutationa total foram quantificados usando o reagente de Ellman. A viabilidade foi testada em culturas mistas (glia e neurônios), ou culturas enriquecidas com neurônios ou glia, após tratamento com HCQ. Para comparação foi utilizado a cloroquina (CQ), fármaco da qual a HCQ é derivada. As células foram expostas às concentrações de 25μM, 50μM e 75μM por 24 horas. Os resultados demostram que culturas mistas tratadas com CQ apresentaram redução na viabilidade de 36 e 61% para as concentrações de 50μM e 75μM, respectivamente, enquanto HCQ não altera a viabilidade em nenhuma das concentrações testadas. No entanto, quando culturas enriquecidas com células gliais foram expostas a HCQ por 24 horas, a concentração de 75μM teve uma pequena redução na viabilidade das células, sendo as reduções nas células neuronais mais acentuadas, 20, 33 e 56% para as concentrações de 25μM, 50μM e 75μM, respectivamente. Mesmo um tempo menor de tratamento (6 horas) causou perda de viabilidade em neurônios retinianos. A capacidade de incorporação do corante supravital vermelho neutro, também foi alterada em culturas neuronais tratadas com HCQ por 24 horas, tendo redução de 19 e 32%, comparadas ao controle, para as concentrações de 50μM e 75μM, respectivamente. HCQ reduziu significativamente os níveis de espécies reativas de oxigênio produzidas pelas células neuronais, principalmente ânion superóxido, 43, 52 e 61% para as concentrações de 25μM, 50μM e 75μM de HCQ em 24 horas de tratamento, respectivamente. Os níveis de glutationa total em células neuronais apresentaram redução de 37 e 53% quando tratados com 50μM e 75μM de HCQ por 24 horas, respectivamente, comparado ao controle. Quando o meio condicionado de células gliais foi utilizado em células neuronais tratadas com HCQ por 6 horas, este reverteu completamente o processo de citotoxicidade causado pelo fármaco. E quando os níveis de glutationa total foram mensurados em culturas enriquecidas com glia, tratadas com HCQ por 24 horas, não foram observadas quaisquer alterações. Estes resultados sugerem ação citotóxica de CQ em cultura mista de células da retina de embrião de galinha, o que não é observado no tratamento com HCQ. Entretanto, HCQ mostrou ação citotóxica quando as células são cultivadas separadamente, principalmente sobre neurônios, que é revertida por algum fator liberado pelas células gliais no ambiente extracelular, sendo a glutationa uma possível candidata a exercer essa função neuroprotetora. Hydroxychloroquine (HCQ) is currently used in the treatment of malaria and autoimmune diseases and others therapeutic purposes. However, this drug is known to cause side effects, including producing visual disturbances, which may be irreversible. The mechanisms that produce these visual disorders are not completely known. HCQ - related retinal toxicity may be due to high metabolic rate, being very susceptible to the action of xenobiotics and oxidative damages. Thus, this work aims to evaluate the effects of the HCQ on retinal cells, as well as their possible mechanisms of cytotoxicity. The model used in this work was of cultures of retina cells from chicken embryo. To evaluate cell viability, mitochondrial activity was measured by MTT. The lysosomal function was evaluated by the incorporation rate of the neutral red dye. The levels of reactive species of general oxygen and superoxide anion were evaluated by the CellROX probe and by Nitro Blue Tetrazolium (NBT) and total glutathione levels were quantified using the Ellman reagent. Viability was tested in mixed cultures (glia and neurons) or enriched cultures of neurons and glia after treatment with HCQ and compared with chloroquine (CQ). Cells were exposed to concentrations of 25μM, 50μM and 75μM for 24 hours. The results show that mixed cultures treated with CQ presented a reduction in viability of 36 and 61% at concentrations of 50μM and 75μM, respectively, whereas HCQ did not alter viability at any of the concentrations tested. However, when cultures enriched with glial cells were exposed to HCQ for 24 hours, the concentration of 75μM had a small reduction in cell viability, while that the reduction in neuronal cells was of 20, 33 and 56% at the concentrations of 25μM, 50μM and 75μM, respectively. Even a shorter treatment time (6 hours) there was loss of viability in retinal neurons. The incorporation of neutral red supravital dye was also altered in neuronal cultures treated with HCQ for 24 hours, with reduction of 19 and 32%, compared to the control for the concentrations of 50μM and 75μM, respectively. HCQ significantly reduced the levels of reactive oxygen species produced by the neuronal cells, mainly superoxide anion, 43, 52 and 61% for the concentrations of 25μM, 50μM and 75μM of HCQ in 24 hours of treatment, respectively. In concentrations of 50μM and 75μM of HCQ for 24 for hours, the levels of total glutathione in neuronal cells presented a reduction of 37 and 53%, respectively. When the glial cell conditioned medium was used in neuronal cells for 6 hours after treatment with HCQ, it completely reversed the drug-induced cytotoxicity. When total glutathione levels were measured in culture of glia treated with HCQ for 24 hours no changes were observed. These results suggest cytotoxic action of CQ in mixed culture of chicken embryo retina cells which is not observed in HCQ treatment. However, HCQ showed cytotoxic action when cells are cultured separately, mainly on neurons, which is reversed by some factor released by glial cells in the extracellular environment, and glutathione is a possible candidate to exert this neuroprotective function.

Mestrado em Toxicologia e Ecotoxicologia Atualmente, as terapias anticancerígenas normalmente consistem na combinação de fármacos e também em outras abordagens terapêuticas como a radioterapia, a cirurgia, entre outras, contribuindo para um prognóstico mais favorável dos doentes com cancro, bem como para a melhoria da sua qualidade de vida. Em contrapartida, o aumento da eficácia clínica é acompanhado por uma elevada incidência de efeitos secundários graves. Os efeitos secundários da quimioterapia são uma das grandes limitações à sua utilização e a cardiotoxicidade é considerada um dos efeitos secundários mais graves da quimioterapia. Esta dissertação teve como objetivo avaliar e comparar a toxicidade da doxorrubicina (DOX), do 5-fluorouracilo (5-FU), da ciclofosfamida (CIC) e da sua mistura (Cyclophosphamide+Adriamycin+5-Fluorouracil, doravante designada CAF) em células H9c2 diferenciadas. Para tal, as células H9c2 diferenciadas foram incubadas com DOX, 5-FU e CIC numa gama de concentrações entre 0-5 μM, durante 24 ou 48 horas. As células H9c2 foram também expostas a concentrações de 10, 25 e 50 μM de 5-FU ou CIC, durante 48 horas. Além disso, as células H9c2 diferenciadas foram incubadas com a mistura CAF nas concentrações de 0,2; 1 ou 5 μM de cada fármaco durante 48 horas. Após o tempo de incubação, foram realizados os seguintes testes de citotoxicidade: teste de redução do brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT) e o teste de incorporação do vermelho neutro. A DOX no teste de redução do MTT demonstrou causar citotoxicidade em todas as concentrações testadas, quando comparado com as células controlo, sendo esta citotoxicidade dependente da concentração e mais acentuada para o maior tempo de exposição. No teste de incorporação do vermelho neutro, a DOX provocou citotoxicidade significativa nas concentrações de 0,5; 1; 2,5 e 5 μM, quando comparado com o controlo, sendo a citotoxicidade dependente do tempo de incubação.Relativamente ao 5-FU, após 24 horas de exposição observou-se citotoxicidade no teste de redução do MTT apenas na concentração de 5 μM. Quando as células foram expostas 48 horas ao 5-FU, verificou-se citotoxicidade significativa nas concentrações de 0,5; 1; 2,5 e 5 μM, em comparação com o controlo. No teste de incorporação do vermelho neutro, apenas as concentrações 1; 2,5 e 5 μM de 5-FU causaram toxicidade às células H9c2 diferenciadas. Quando as células foram incubadas com 10, 25 e 50 μM de 5-FU, todas as concentrações testadas causaram citotoxicidade quer esta tenha sido avaliada pelo ensaio de redução do MTT, quer pelo ensaio de incorporação do vermelho neutro. No que diz respeito à CIC, no teste de redução do MTT e às 24 horas, apenas a concentração de 1 μM causou citotoxicidade significativa. Porém, às 48 horas de incubação, as concentrações de 0,13; 0,2; 1 e 5 μM causaram citotoxicidade quando comparado com as células controlo. No teste de incorporação do vermelho neutro não se verificaram diferenças significativas em nenhuma concentração ou tempos de exposição testados, quando comparado com o controlo. No entanto, quando as células H9c2 diferenciadas foram incubadas com 10, 25 e 50 μM de CIC verificou-se toxicidade quando esta foi avaliada pelo teste de redução do MTT; no entanto no teste de incorporação do vermelho não se verificaram quaisquer diferenças significativas nas células expostas a CIC, quando comparado com as células do controlo. No que diz respeito à combinação de fármacos, CAF, esta na concentração de 0,2 μM (de cada fármaco da mistura), causa citotoxicidade de acordo com ambos os testes realizados em células H9c2 diferenciadas, quando comparado com as células do controlo. De facto, a mistura na concentração de 0,2 μM causa citotoxicidade no teste de redução do MTT significativamente maior do que cada um dos compostos isoladamente, quando a citotoxicidade foi avaliada pelo teste de redução do MTT. No teste de incorporação do vermelho neutro, no entanto, não existem diferenças significativas nos níveis de incorporação do corante no interior das células entre a mistura e cada um dos fármacos incubados isoladamente. Quando as células foram incubadas com 1 ou 5 μM de CAF (de cada fármaco da mistura), verificou-se que a toxicidade observada no teste de redução do MTT não era significativamente diferente entre a mistura CAF e qualquer mistura que contenha DOX, ou mesmo a DOX isoladamente. Verificaram-se diferenças significativas apenas entre a mistura e a associação de 5-FU+CIC, e os fármacos 5-FU e a CIC, isoladamente. Concluindo, a DOX, o 5-FU, a CIC e a CAF causam cardiotoxicidade em concentrações na ordem dos micromolar em células H9c2 diferenciadas, apesar dos valores encontrados serem diferentes consoante o teste de citotoxicidade utilizado. A DOX é o fármaco anticancerígeno mais tóxico no modelo celular utilizado, de acordo, com os dois testes de citotoxicidade realizados e parece contribuir de forma significativa para a toxicidade cardíaca da combinação CAF. Currently, the most common therapeutic approaches for cancer combine drugs and also use other procedures, such as radiation therapy and surgery, among others. The use of combined therapeutics contributes both to attain a better prognosis and to improve the quality of life for people living with cancer. Unfortunately, the increased clinical efficacy of combined approaches is accompanied by a higher incidence of severe side effects. In fact, the use of chemotherapy causes severe side effects, which are major limitations for its use and with cardiotoxicity being considered one of its most serious adverse effects. This dissertation aimed to evaluate and compare the toxicity of doxorubicin (DOX), 5-fluorouracil (5-FU), cyclophosphamide (CIC), and their combination (Cyclophosphamide + Adriamycin + 5-Fluorouracil, herein after referred as CAF) in differentiated H9c2 cardiac cells. Thus, differentiated H9c2 cells were treated with several concentrations of DOX, 5-FU and CIC over a range from 0-5 μM, for 24 or 48 hours. Moreover, the cells H9c2 were treated with CAF mixtures containing 0.2; 1 or 5 μM of each drug during 48 hours. After the incubation period, the cytotoxicity was measured using the reduction of 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) and neutral red incorporation assays. According to the MTT assay, the cells treated with DOX showed cytotoxicity for all concentrations tested when compared with the control, and the cytotoxicity was concentration-dependent and more notorious in the longest time of exposure. In the neutral red assay, when compared to the control, the cellular damage caused by DOX was observed for the concentrations of 0.5; 1; 2.5, and 5 μM and showed to be time-dependent. Regarding 5-FU, after an incubation time of 24 hours only the concentration of 5 μM showed significant toxicity in the MTT assay and the cytotoxicity increased in the longest incubation time. In fact, when the cells were exposed to 5-FU during 48 hours a significant cytotoxicity was shown at the concentrations of 0.5; 1; 2.5 to 5 μM, when compared with control. In the neutral red uptake assay, only the concentrations of 1; 2.5 and 5 μM of 5-FU caused toxicity to differentiated H9c2 cells. Additionally, when the cells were incubated with 10, 25 and 50 μM of 5-FU, all tested concentrations caused cytotoxicity observed on both the MTT reduction and neutral red uptake assays. Concerning CIC, in the MTT reduction assay, cells treated for 24 hours only showed significant cytotoxicity for the concentration 1 μM. However, after 48 hours, significant of incubation the cytotoxicity was observed for the concentrations of 0.13; 0.2; 1, and 5 μM when compared to the control cells. In the neutral red uptake assay, no significant differences were observed for any of the concentrations or exposure periods tested, when compared to the control cells. When differentiated H9c2 cells were incubated with 10, 25, and 50 μM of CIC, toxicity was seen in the MTT reduction assay; whereas for the neutral red uptake assay no significant differences where observed when compared to the control cells. Finally, the combination of drugs, CAF, at a concentration of 0.2 μM (of each drug) causes toxicity in the MTT reduction and neutral red uptake assays performed. In fact, the drugs in combination exhibited a significantly higher cytotoxicity, in the MTT assay when compared with each compound alone at a concentration of 0.2 μM. In the neutral red uptake assay, however, no significant differences were observed for the mixture when compared to each drug by itself. When the cells were treated with 1 and 5 μM of CAF, a significant toxicity was seen in the MTT reduction assay when compared to the control cells. Nevertheless, there were no significant differences between the CAF mixture and any mixture containing DOX, or even DOX alone. In fact, significant differences were only observed between CAF and 5-FU, or CIC or the association 5-FU + CIC. In summary, DOX, 5-FU, CIC, and CAF cause cardiotoxicity in differentiated H9c2 cells when in micro-molar concentrations, although with the assay used show different sensitivities to demonstrate that toxicity. Moreover, according to the results, for the cell model used and with the cytotoxicity assays performed, DOX is the most toxic anticancer drug tested and appears to contribute significantly to the cardiac toxicity of the combination CAF.

Submitted by Caroline Araujo de Souza null (carol.souza.bio@gmail.com) on 2016-12-15T00:20:16Z No. of bitstreams: 1 Tese Caroline Araújo de Souza.pdf: 2236156 bytes, checksum: 5f95460c3826a6b458e3d6b8dd1c4a66 (MD5) Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-12-20T15:57:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 souza_ca_me_rcla_par.pdf: 1126567 bytes, checksum: 6efaf566eb9283009d89aa424d7f96de (MD5) Made available in DSpace on 2016-12-20T15:57:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 souza_ca_me_rcla_par.pdf: 1126567 bytes, checksum: 6efaf566eb9283009d89aa424d7f96de (MD5) Previous issue date: 2016-11-04 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Atividades antrópicas geram uma quantidade significativa de poluentes que são lançados no ambiente, muitas vezes ocasionando distúrbios ecológicos e possíveis alterações biológicas em vários níveis: molecular, celular, tecidual, individual, populacional e de comunidade. Entre os xenobiontes presentes nos ecossistemas aquáticos, inúmeros compostos químicos e orgânicos possuem potencial oxidativo, danificando membranas e aumentando os efeitos subletais. Desta forma, as quantificações dos danos celulares e defesas antioxidantes podem ser usadas como biomarcadores de contaminação. Foram coletados espécimes machos de U. cordatus em intermuda, em seis áreas de manguezal do litoral do Estado de São Paulo, com diferentes panoramas de contaminação, a fim de investigar possíveis diferenças sazonais, considerando duas épocas do ano verão (chuvosa) e inverno (estiagem). Inicialmente foi investigada a citogenotoxicidade dos espécimes, com registro das maiores médias de frequência de células micronucleadas (MN‰) nos manguezais de Cubatão e São Vicente, coincidindo ao menor tempo de retenção do vermelho neutro (NRRT, em minutos), indicando sua alta interação com processos degenerativos, causados pelo contato com substâncias tóxicas. O inverso ocorreu nos manguezais de Cananéia e Juréia, considerados prístinos na avaliação dos dois biomarcadores. Os valores para NRRT demonstraram alterações sazonais, indicando uma maior sensibilidade desse marcador citotóxico em relação ao genotóxico. Os animais foram submetidos à biometria para detecção de possíveis alterações na relação do peso (em gramas, com balança de precisão) pela largura da carapaça (em milímetros, usando um paquímetro de precisão). O fator de condição para todas as áreas, independente do período amostral (chuvoso – verão; e seco – inverno), não apresentou diferenças significativas (p BP > BA), tendo se destacado na Juréia, em que se esperavam valores inferiores. Já para a lipoperoxidação as médias foram mais pronunciadas no inverno, com o hepatopâncreas detendo as maiores médias, com destaque a Juréia e Cananéia do restante das áreas. Estes dois biomarcadores fisiológicos foram sensíveis às alterações sazonais. Sob uma análise multivariada, concluímos que seria adequado o uso deste conjunto de biomarcadores durante a estiagem (inverno), em que outras influências biológicas são diminuídas, como é o caso da reprodução de Ucides cordatus, registrada sazonalmente mas para o verão. Além disso, foi constatado que todos os biomarcadores mostrarm sensibilidade à poluição de cada uma das áreas amostrais, com destaque a NRRT e MT como os mais sensíveis à sazonalidade. O fator de condição foi descartado como biomarcador de efeito, pois seus resultados foram pouco explicativos para a contaminação local. Adicionalmente, foi realizado um experimento térmico, compreendendo teste agudo (horas) e crônico (dias), com manutenção de espécimes de U. cordatus sob elevada média térmica (30±1ºC), visando avaliar as respostas fisiológicas frente a esta fonte de estresse. As células dos animais estudados apresentaram decréscimo do tempo de estabilidade da membrana lisossômica, pelo teste do vermelho neutro (NRRT), porém sem registro de diferenças expressivas quanto aos níveis de lipoperoxidação no hepatopâncreas e brânquias. Os dados sobre os danos subletais apresentados confirmam o caranguejo-uçá (U. cordatus) como espécie bioindicadora do estado de contaminação de áreas de manguezal do Atlântico Ocidental, podendo ser utilizadas em pacote tecnológico de monitoramento ambiental que está sendo refinado pelo Grupo de Pesquisa em Biologia de Crustáceos (CRUSTA), da UNESP IB/CLP. Os resultados obtidos evidenciam a necessidade de uma maior atenção do poder público sobre a contaminação de importantes ecossistemas costeiros, como os manguezais, que pela ação sinérgica de xenobióticos na biota pode ter prejudicado seus serviços ecossistêmicos. Anthropic activities generate a significant amount of pollutants that are released into the environment, often causing ecological disturbances and possible biological changes at molecular, cellular, tissue, individual, population and community levels. Among xenobiotics in aquatic ecosystems, many chemical and organic compounds have oxidative potential, damaging membranes and increasing sublethal effects. Therefore, cell damage and antioxidant defenses measurements can be used as contamination biomarkers. U. cordatus intermolt male specimens were collected in six mangrove areas on the coast of the state of São Paulo, all in different contamination scenarios, in order to investigate possible seasonal differences, considering two weather seasons: summer (rainy) and winter (dry). Initially we investigated specimens’ cytogenotoxicity, registering the highest average of micronucleated cells frequency (MN ‰)in the mangrove of Cubatão and São Vicente, matching the lowest neutral red retention time (NRRT, in minutes), indicating its high interaction with degenerative processes caused by the contact with xenobiotics. The opposite occurred in the mangroves of Cananéia and Juréia, considered pristine by the two biomarkers. NRRT values showed seasonal changes indicating a greater sensitivity of the cytotoxic marker in relation to the genotoxic one. Animals were submitted to biometrics to detect possible changes in weight (in grams, using a precision scale) through carapace width (in millimeters, using a precision caliper). The condition factor for all areas, regardless of the sampled period (rainy - summer, and dry - winter), did not show significant differences (p PG> AG), especially in Juréia, in which lower values were expected. As for the lipid peroxidation, means were more pronounced in winter, with the hepatopancreas having the highest averages, especially in Juréia and Cananéia. These two physiological biomarkers were sensitive to seasonal changes. On a multivariate analysis, we concluded that it would be appropriate to use this set of biomarkers during the dry season (winter), in which other biological influences are diminished, such as Ucides cordatus reproduction, recorded seasonally, but in summer. Furthermore, it was found that all biomarkers shown sensitivity to pollution in each of the sampled areas, especially NRRT and MT as the most sensitive to seasonality. The condition factor was dismissed as an effect biomarker because its results did not explain the local contamination. Additionally, a thermal experiment was conducted, including acute (hours) and chronic (days) tests, maintaining U. cordatus specimens under high thermal average (30 ± 1°C), aiming to evaluate the physiological responses to this stress source. Studied animals’ cells showed a decrease in stability time of the lysosomal membrane by neutral red test (NRRT), but no significant difference records in lipid peroxidation levels in hepatopancreas and gills. Sublethal damage data presented confirm uçá-crab (U. cordatus) as a bioindicator species for mangrove areas’ contamination status on the Western Atlantic, being able to be used in the environmental monitoring technological package being refined by the Research Group on Crustaceans Biology (CRUSTA), of the UNESP IB / CLP. The results show the need for greater attention from public authorities on the contamination of important coastal ecosystems, such as mangroves, that from the synergistic action of xenobiotics in their biota may have impaired their ecosystem services. CNPq: 141627/2014-0

O aumento das espécies reativas de oxigênio (ERO) pode levar ao estresse oxidativo (EO) quando não compensado pelos sistemas antioxidantes. Muitas evidências indicam que mesmo um pequeno aumento das ERO pode desempenhar um papel importante na adaptação do músculo esquelético. Já foi demostrado que o EO pode levar a modificações oxidativas, que levam a ativação de vias de degradação. Entretanto, a maior parte dos estudos in vitro utiliza o peróxido de hidrogênio como sistema gerador de ERO. Assim, o objetivo do presente estudo foi verificar o efeito de várias concentrações do radical superóxido na atividade metabólica, mudanças oxidativas e vias de proteólise em cultura de mioblastos e miotubos da linhagem C2C12, precursores de células musculares de camundongos. Anteriormente aos experimentos, foi realizada uma padronização do modelo. Foram utilizados mioblastos e miotubos C2C12, expostos à diferentes doses de pirogalol nas concentrações de 50 μM, 100 μM, 250 μM e 500 μM por 30min. Para investigar a influência do tratamento na citotoxicidade foram realizados testes de viabilidade e atividade metabólica, MTT e vermelho neutro. Para avaliação das defesas antioxidantes intracelulares foi realizada a determinação da concentração de tióis totais. A peroxidação lipídica foi avaliada por quimiluminescência (QL) estimulada por terc-butil. Os efeitos oxidativos em proteínas foram avaliados por meio do conteúdo de proteínas carboniladas por ELISA, e a proteólise por QL. A padronização resultou nas condições adequadas para que os experimentos pudessem ser realizados. Os resultados nos mioblastos mostram que a viabilidade celular, os tióis totais e proteínas carboniladas não apresentaram diferença em nenhuma das concentrações. A concentração de 500 μM foi capaz de diminuir a atividade metabólica no MTT e aumentar a lipoperoxidação na QL. No vermelho neutro a atividade foi diminuída nas concentrações de 250 e 500 μM. A diferença na proteólise não foi considerada estatisticamente significante. Nos miotubos, nenhuma concentração foi capaz de diminuir a viabilidade celular, ou modificar MTT, tióis totais e lipoperoxidação. A concentração de 500 μM diminuiu a atividade do vermelho neutro. Concentrações a partir de 100 μM aumentaram as concentrações de proteínas carboniladas. Nenhuma alteração ocorreu na atividade da proteólise em miotubos. O ânion superóxido influencia no metabolismo celular e nos parâmetros redox das células. Apesar das vias de degradação não aumentarem foi possível avaliar as alterações iniciais que podem levar a adaptação da célula muscular quando submetidas a exposição à ERO. The increase in reactive oxygen species (ROS) can lead to oxidative stress (OS) when not counterbalance by the antioxidant systems. Many evidences indicate that increased ROS plays an important role in the regulation of signaling pathways that are necessary to promote adaptation of skeletal muscle. It has been demonstrated that the OS causes oxidative modifications which lead to activation of degradation pathways. However, most studies in vitro use hydrogen peroxide as ROS stimulis.The objective of this study was to investigate the effect of various superoxide radical concentrations in metabolic activity, oxidative modifications and proteolysis pathways in C2C12 culture. Prior to the experiments, a standardization of the model conditions was performed. C2C12 myoblasts and myotubes were exposed to different concentrations of pyrogallol, 50 μm, 100 μm, 250 μm and 500 μm, for 30min. To investigate the influence of treatment on the cytotoxicity, viability tests were carried out and analysis of metabolic activity, neutral red and MTT. For evaluation of intracellular antioxidant defenses was performed the determination of total thiols. Lipid peroxidation was assessed by chemiluminescence (CL) stimulated tert-butyl. The protein oxidative effects were assessed by carbonyl protein content by ELISA and proteolysis by CL. The standardization resulted in appropriate conditions to enable the experiments to be performed. The results showed that the myoblasts viability, total thiol and protein carbonyls did not differ in any of the concentrations. The concentration of 500 μM was able to decrease the MTT activity and increase the lipoperoxidation in CL. Neutral red activity was decreased at concentrations of 250 and 500 μM. The activity of proteolysis appears to increase with the dose but the difference was not significant. In myotubes, no concentration was able to alterate the viability, MTT, total thiols and lipid peroxidation. The concentration of 500 μM decreased the activity of neutral red. With the exception of the concentration of 50 μM, all other concentrations increased protein carbonyls. No change occurred in the proteolysis activity in myotubes. The superoxide anion influences in the metabolism and redox parameters of the cells. Although degradation pathways was not increased, it was possible to evaluate the initial changes that can lead to adaptation of the muscle cells when subjected to exposure to ROS.

Submitted by Eunice Novais (enovais@uepg.br) on 2018-07-24T14:58:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Mariane A Sanson.pdf: 3058378 bytes, checksum: 43bb48ea0be645db69444ec684b43bac (MD5) Made available in DSpace on 2018-07-24T14:58:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Mariane A Sanson.pdf: 3058378 bytes, checksum: 43bb48ea0be645db69444ec684b43bac (MD5) Previous issue date: 2016-02-16 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Compostos de ouro já apresentam propriedades anti-inflamatórias estabelecidas pela literatura, além de importante potencial antioxidante. A utilização do ouro na forma nanoparticulada é uma aposta promissora para o tratamento de condições inflamatórias, como a doença periodontal, pelo seu mecanismo de ação. Apesar da biocompatibilidade estabelecida do ouro, é importante atentar-se para a possibilidade de efeito tóxico do ouro na forma nanoparticulada, devido a sua maior facilidade de penetrar nos tecidos e atravessar membranas, em resposta principalmente ao seu tamanho e concentração de ouro presente. O objetivo deste estudo foi a caracterização das nanopartículas de ouro (AuNPs) de 10, 20 e 30 nm utilizadas no trabalho, bem como testar seu efeito tópico em modelos de inflamação aguda local in vivo (edema de orelha induzido por TPA e edema de pata induzido por LPS) e verificar sua citotoxicidade em cultura de fibroblastos (3T3) e macrófagos (RAW 264.7) murinos após 12, 24 e 48h pelos ensaios de MTT, VN e teste de exclusão do azul de tripan. Para a caracterização das AuNPs foram realizados os testes de espectroscopia no ultravioleta-visível (Uv-Vis), difratometria de raios-x, absorbância atômica, potencial zeta e microscopia eletrônica de varredura por canhão de emissão de campo elétrico (FEG). Os resultados dos testes de caracterização demonstraram que as nanopartículas apresentavam-se estáveis e realmente com os diâmetros de 10, 20 e 30 nm, como proposto pelo método de síntese, estando adequadas para a utilização nos testes subsequentes. No modelo de edema de orelha induzido por TPA as formulações de AuNPs em creme a 0,1% reduziu a formação do edema em 47,76%, enquanto a formulação em creme a 0,06% reduziu o edema em 33,72% após 6h. Após 24h todas as formulações testadas apresentaram redução da formação do edema, apresentando resultados sem diferença estatística em comparação ao grupo tratado com a dexametasona. No modelo de edema de pata induzido por LPS a formulação de AuNPs em creme a 0,1% foi capaz de reduzir a formação do edema em 84,46% e a formulação em creme a 0,6% reduziu em 86,57%, também sem apresentar diferença estatística em comparação ao grupo tratado com dexametasona. Quanto aos testes de viabilidade celular, os métodos do MTT e VN não foram capazes de obter resultados confiáveis, porém o teste de exclusão do azul de tripan indicou ausência de citotoxicidade das AuNPs em 12h nas culturas de fibroblastos e macrófagos. Após 24h de incubação, a maior concentração (35 mg/L) das dispersões de AuNPs nos 3 diâmetros testados reduziu a viabilidade de macrófagos, e os fibroblastos obtiveram seus valores de viabilidade celular diminuídos pela maioria das dispersões de AuNPs testadas. Após 48h de incubação, todas as concentrações e diâmetros testados das dispersões de AuNPs foram capazes de diminuir drasticamente as porcentagens de viabilidade celular tanto em fibroblastos quanto em macrófagos. Gold compounds already demonstrated anti-inflammatory properties in previous studies, in addition to important antioxidant potential. The use of gold in nanoparticle form is promising for the treatment of inflammatory conditions such as periodontal disease, especially for its mechanism of action. Although the established gold biocompatibility, it is important to pay attention to the possible toxic effect of gold on nanoparticulate form, for its ease of penetration through the tissues and membranes, mainly in response to its size and gold concentration. The study purpose was the physical characterization of gold nanoparticles (AuNPs) of 10, 20 and 30 nm used in the experiments, in addition to test their topical effect in models of acute inflammation in vivo (ear edema TPA-induced and paw edema LPS-induced) and verify its cytotoxicity in fibroblasts and macrophages mice cell cultures after 12, 24 e 48 hours by MTT and Neutral Red assay and exclusion of trypan blue test. To characterize the AuNPs were performed the ultraviolet-visible spectroscopy, x-ray diffraction, atomic absorbance, zeta potential and Field Emission Gun Scanning Electron Microscopy (FEG). The characterization tests results shown that the nanoparticles are stable and truly presented the diameters of 10, 20 and 30 nm, as proposed by synthesis method, and so are suitable for use in subsequent experiments. In the ear edema TPA-induced model AuNPs cream formulation at 0.1% reduced edema formation at 47.76%, while the cream formulation at 0.06% reduced 33.72% of edema after 6 hours. After 24 hours all formulations tested showed a reduction of edema formation, presenting results with no statistical difference compared to the group treated with dexamethasone. In LPS-induced paw edema model the AuNPs cream formulation at 0.1% was able to reduce edema formation in 84.46% and cream formulation at 0.6% decreased 86.57%, also without showing statistical difference compared to the group treated with dexamethasone. In viability tests, the MTT and Neutral Red methods were not able to obtain reliable results, but exclusion trypan blue test indicated no cytotoxicity of AuNPs after 12h in fibroblasts and macrophages cell cultures. After 24h incubation, the dispersions of AuNPs in 3 diameters at the highest concentration (35 mg/L) reduced the macrophages viability and fibroblast viability decreased with most of the tested AuNPs dispersions. After 48h all tested AuNPs dispersions concentrations and diameters were able to reduce the percentages of fibroblasts and macrophages cell viability.

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Berton, Juliana.pdf: 2602704 bytes, checksum: 2cb56990fbaa5b2f82264280c97a04df (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Histidine is an important amino acid in the differentiation of some cell types, such as hepatocytes, for example. Histamine is synthesized from histidine is present in many cancer types, including melanoma. This cancer has as characteristics no differentiated cell and the production a high amount of histamine. The purpose of this work was to study the effects of a histidine supplementation on differentiation and tumor progression. In vitro cell viability were performed by neutral red and MTT assays with histidine at 0,01, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10 and 20 mM cimetidine at 0,01, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10 mM, 10 mM histidine association cimetidine + 0,01 mM and 10 mM cimetidine association + 0,01 mM histidine and evaluated after 24, 48 and 72 hours using B16F10 cells and morphological analysis additionally performed. Histamine at 0,01, 0,1, 1 and 10 mM, terfenadine at concentrations 1, 10, 100 nM and 1 uM and thioperamide at concentrations 1, 10, 100 nM and 1 uM were also assessed by using the MTT cell B16F10. ELISA was performed to quantify histamine with cell culture supernatant treated with histidine, histamine, terfenadine, cimetidine, and thioperamide. For in vivo assays were used C57BL6/J mice underwent implantation of tumor cells and subsequently treated with histidine solution at a dose of 21.4 mg/kg cimetidine 343.3 mg/kg and association between both and evaluated for 11 days as the tumor growth were used. Histological analysis, hematological and biochemical determinations were also performed. Data were analysed by ANOVA One-Way, and Tukey post-test. The results of the MTT viability test, showed cell viability decreased histidine at a concentration of 0,01 mM in 72 hours, cimetidine in concentrations 3 to 10 mM at 48 and 72 hours and cimetidine 10 mM /histidine 0,01 mM association in 48 and 72 hours, results also found in neutral red. Histamine decreased the cell viability of B16F10 cells at 20 mM concentration in 48 h and concentrations 1 and 10 mM at 72 hours, terfenadine decreased cell viability at all concentrations tested at 24 h and stayed up to 10 nM 72 hours and thioperamide decreased the cell viability at all concentrations tested 72 hours MTT assay. In the morphological analysis it was observed that at lower concentrations of histidine discrete cell rounding occurred and the appearance of "blebs" and the highest concentrations of vacuolated cytoplasm. Cimetidine treated cells showed characteristics of apoptosis. The association histidine 0,01 mM/cimetidine 10 mM caused cell death. The histamine ELISA test showed that the treatment with the histamine H1 antagonist may increase or decrease production of histamine and its receiving treatment led to thioperamide produce less or blocking of histamine H3 receptors allows a greater uptake of histamine. In experiments in vivo treatments with histidine and cimetidine inhibited tumor growth by the seventh day of treatment. Biochemical determinations of AST, ALT showed no toxicity after treatment. The histological findings, the group treated with histidine showed necrotic areas and the cimetidine group showed leukocyte infiltration and promoted stimulation of angiogenesis. Metastases were not found in any of the organs analyzed groups. It was concluded that histidine plays an important role in tumor progression and stimulating or inhibitory depending on the dosage/day of treatment. A histidina é um aminoácido importante fator na diferenciação de alguns tipos celulares, como hepatócitos, por exemplo. A histamina, sintetizada a partir da histidina, está presente em muitos tipos de câncer, entre eles o melanoma. Esse tipo de câncer tem como características a não diferenciação celular e a produção de grande quantidade de histamina. O propósito deste trabalho foi estudar os efeitos de uma suplementação de histidina sobre a diferenciação e progressão tumoral. Os ensaios in vitro de viabilidade celular MTT e vermelho neutro foram realizados com histidina nas concentrações 0,01, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10 e 20 mM, cimetidina nas concentrações 0,01, 0,1, 0,3, 1,0, 3,0, 10 mM, associação histidina 10 mM + cimetidina 0,01 mM e associação de cimetidina 10 mM + histidina 0,01 mM e avaliados após 24, 48 e 72 horas utilizando-se células B16F10 e adicionalmente realizada a análise morfológica. Histamina nas concentrações 0,01, 0,1, 1 e 10 mM, terfenadina nas concentrações 1, 10, 100 nM e 1 μM e tioperamida nas concentrações 1, 10, 100 nM e 1 μM também foram avaliadas pelo MTT utilizandose células B16F10. Foi realizado teste de ELISA para quantificação de histamina com sobrenadante de cultura celular tratada com histidina, histamina, terfenadina, cimetidina e tioperamida. Para o ensaio in vivo foram utilizados camundongos C57BL6/J, submetidos ao implante de células tumorais e posteriormente tratados com solução de histidina na dose de 21,4 mg/kg, cimetidina na dose de 343,3 mg/kg e associação entre ambas e avaliados por 11 dias quanto ao crescimento tumoral. Avaliações hematológicas, determinações bioquímicas e análise histológica também foram realizadas. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística ANOVA 1-VIA, e pos-test Tukey. Como resultados no teste de viabilidade MTT, a histidina diminuiu a viabilidade celular na concentração de 0,01 mM em 72 horas, da cimetidina nas concentrações de 3 e 10 mm em 48 e 72 horas e da associação cimetidina 10 mM/histidina 0,01 mM em 48 e 72 horas, resultados também encontrados no vermelho neutro. A histamina diminuiu a viabilidade celular das células B16F10 em 48 h na concentração de 20 mM e em 72 horas nas concentrações de 1 e 10 mM, a terfenadina diminuiu a viabilidade celular em todas as concentrações testadas em 24 h, permanecendo a de 10 nM até 72 horas e a tioperamida diminuiu a viabilidade celular em todas as concentrações testadas em 72 horas no ensaio de MTT. Na análise morfológica observou-se que nas menores concentrações de histidina ocorreu discreto arredondamento celular e aparecimento de “blebs” e nas concentrações maiores vacuolização de citoplasma. As células tratadas com cimetidina apresentaram indícios de apoptose. A associação histidina 0,01 mM/cimetidina 10 mM provocou morte celular. O teste de ELISA para histamina revelou que o tratamento com o antagonista H1 de histamina pode aumentar a produção de histamina ou diminuir sua receptação e o tratamento a tioperamida levou a uma menor produção de histamina ou o bloqueio dos receptores H3 permitindo uma maior recaptação de histamina. Na experimentação in vivo os tratamentos com histidina e cimetidina inibiram o crescimento tumoral até o sétimo dia de tratamento. As determinações bioquímicas das enzimas transaminase oxalacética e transaminase pirúvica revelaram que não houve toxicidade após os tratamentos. Nas avaliações histológicas, o grupo tratado com histidina apresentou áreas necróticas e o grupo cimetidina apresentou infiltrado leucocitário e promoveu estímulo da angiogênese. Metástases não foram encontradas nos órgãos analisados de nenhum dos grupos. Concluiu-se que a histidina tem um papel importante na progressão tumoral sendo inibitório ou estimulante dependendo da dosagem/dias de tratamento.

Orientador : Prof. Dr. Luiz Claudio Fernandes Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Educação Física. Defesa: Curitiba, 09/07/2015 Inclui referências : f. 202-235 Área de concentração: Exercício e esporte Resumo: Ultrassom terapêutico de alta frequência, microcorrente, terapia combinada e suplementação de óleo de peixe, têm sido investigados como adjuvantes no processo de cicatrização. Entretanto, pouco se sabe sobre a interação dos diferentes recursos fisioterapêuticos com a suplementação de óleo de peixe na cura de feridas, sobre parâmetros imunitários. Objetivo: avaliar o efeito dos diferentes recursos na redução percentual da área da ferida, no tempo de oclusão, na massa corporal, nos parâmetros funcionais de macrófagos (atividade fagocítica, captação de vermelho neutro, produção de ânion superóxido, peróxido de hidrogênio e óxido nítrico), na população linfocitária (T CD4+ e T CD8+) e na concentração plasmática de interleucinas (IL-1?, TNF-?, IL-6 e IL-10). Materiais e Métodos: foram randomizados em 9 grupos 125 ratos Wistar: controle sem lesão (C), lesado (L), lesado tratado com ultrassom (LU), lesado tratado com microcorrente (LM), lesado tratado com terapia combinada (LUM), lesado suplementado com óleo de peixe (LP), lesado suplementado e tratado com ultrassom (LPU), lesado suplementado e tratado com microcorrente (LPM) e lesado suplementado tratado com terapia combinada (LPUM). Vinte e quatro horas após o procedimento de ferida excisional o tratamento foi iniciado e ocorreu diariamente sob anestesia, sendo cada grupo dividido em três diferentes subgrupos (n=5) para aplicação dos recursos fisioterapêuticos em 3, 7 e 14 dias. Controle de massa corporal e fotoplanimetria foram realizados diariamente e, após ortotanásia dos animais, macrófagos da cavidade peritoneal e o plasma foram coletados para análise da população linfocitária e concentração de interleucinas. Resultados: ultrassom estimulou a produção de óxido nítrico e diminuiu a expressão de CD4+, a razão CD4+/CD8+ e a concentração plasmática de IL-1?. Microcorrente e terapia combinada diminuíram a produção de ânion superóxido, óxido nítrico, T CD4+, a razão CD4+/CD8+ e a expressão de IL-1?. Suplementação com óleo de peixe reduziu a área da ferida e permitiu sua oclusão completa no período experimental, associado ao aumento significativo da capacidade fagocítica, da retenção de vermelho neutro e da produção de peróxido de hidrogênio. Além disso, reduziu a expressão de de IL-1?, IL-6, TNF-? e T CD8+, associada com o aumento da razão CD4+/CD8+. Interação da suplementação de óleo de peixe com os diferentes recursos, na maioria das vezes debelou o efeito imunomodulador do óleo de peixe nos parâmetros macrofágicos, mas possibilitou significativamente a oclusão completa da ferida, quando associado à microcorrente e terapia combinada. Conclusões: os diferentes recursos fisioterapêuticos quando aplicados isoladamente modularam a atividade do sistema imunológico, amenizando o ambiente inflamatório excessivo, porém, não foram capazes de reduzir a área da ferida. Diferentemente, suplementação com óleo de peixe aumentou a funcionalidade dos macrófagos e foi capaz de reduzir a área da ferida, permitindo a sua oclusão completa em 14 dias. Mas, a associação dos diferentes recursos fisioterapêuticos com a suplementação de óleo de peixe, apresentou resultados contraditórios. Estes resultados corroboram a hipótese de que os diferentes recursos fisioterapêuticos e a suplementação com óleo de peixe possuem papéis importantes, porém distintos, na modulação do sistema imunitário durante a cicatrização de feridas. Palavras-chave: cicatrização de feridas; terapia por ultrassom; terapia por estimulação elétrica; óleos de peixe; ácidos graxos ômega-3. Abstract: High-frequency ultrasound therapy, microcurrent, combined therapy and fish oil supplementation have been studied as adjuvants in the process of wound healing. Despite this fact, little is known about how different agents of physical therapy interact with fish oil supplementation on wound healing, particularly, on immune parameters. Objective: To assess the effect of different agents in the percentage reduction in wound area, occlusion time, body mass, functional parameters of macrophages (phagocytic activity, neutral red uptake, production of anion superoxide, hydrogen peroxide and nitric oxide) lymphocyte population (CD4+ and CD8+) and plasma concentration of interleukins (IL-1?, TNF-?, IL-6 and IL-10). Materials and Methods: were randomized into 9 groups 125 Wistar rats: uninjured control (C), injured (L), injured treated with ultrasound (LU), injured treated with microcurrent (LM), injured treated with combined therapy (LUM), supplemented injured fish oil (LP), supplemented injured and treated with ultrasound (LPU), supplemented injured and treated with microcurrent (LPM) supplemented injured and treated with combined therapy (LPUM). Twenty four hours after the wound excision procedure, the treatment was introduced using anesthesia and persisted daily. Each group was divided into three different subgroups (n = 5) according to the physical therapy agents 3, 7 and 14 days. Body weight control and photoplanimetry were performed daily, and after the animal's orthotanasia, macrophages from the peritoneal cavity and plasma were collected for analysis of lymphocyte populations and concentration of interleukins. Results: ultrasound therapy stimulated nitric oxide production and decreased CD4+ expression, CD4+/CD8+ ratio and the plasma concentration of IL-1?. Microcurrent and combined therapy decreased the production of anion superoxide, nitric oxide, CD4+, CD4+/CD8+ ratio and IL-1? expression. Supplementation with fish oil reduced the wound area and allowed its complete occlusion in the trial period, also permitted a significant intensification in phagocytic capacity, neutral red retention and hydrogen peroxide production, additionally reduced expression of IL-1?, IL-6, TNF-? and CD8+ associated with increased CD4+/CD8+ ratio. Interaction of fish oil supplementation with different physical therapy agents, most of all times, decresed the immunomodulatory effect of fish oil on macrophage parameters, although allowed the complete occlusion of the wound, when associated with microcurrent and combined therapy. Conclusions: different physical therapy agents when used individually modulated the activity of the immune system, which in turn reduced the excessive inflammatory environment. However, they were not able to reduce the wound area. In contrast, fish oil supplementation increased the functionality of macrophages and was able to reduce the wound area, which allowed its complete closure in 14 days. But the combination of these physical therapy resources with fish oil supplementation showed contradictory results. These results support the hypothesis that different physical therapy agents and supplementation with fish oil have important roles, but distinct, in modulating the immune system during wound healing. Key-words: wound healing; ultrasonic therapy; electric stimulation therapy; fish oils; fatty acids omega-3.

O cimento de ion?mero de vidro modificado por resina (CIVMR) tem como fun??o principal servir como liner ou base na presen?a de material restaurador ou at? mesmo como material restaurador. Em cavidades profundas com aus?ncia de sinais e sintomas de pulpite irrevers?vel, a dentina afetada por c?rie pode ser mantida a fim de evitar a exposi??o pulpar, permanecendo, assim, um material muito pr?ximo ? polpa. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da inclus?o de ?xido de zinco ou de extrato de pr?polis em um CIVMR nas propriedades mec?nicas e citotoxicidade. Para o grupo controle, o cimento de ion?mero de vidro modificado por resina (Vitremer, 3M ESPE) foi manipulado em sua formula??o original (G7). As modifica??es foram realizadas atrav?s da inclus?o de ?xido de zinco ao p? do CIVMR nas seguintes propor??es: 10% (G1), 20% (G2) e 30% (G3) com rela??o ao peso, sendo aglutinado com o l?quido original do material. O extrato de pr?polis foi inserido ao l?quido do Vitremer nas seguintes propor??es: 10% (G4), 20% (G5) e 30% (G6) com rela??o em volume, sendo aglutinado com o p? original do CIVMR. Para a an?lise das propriedades mec?nicas foram realizados os testes de resist?ncia ? tra??o diametral, resist?ncia ? compress?o, microdureza e rugosidade superficial, 24 horas ap?s a confec??o dos corpos de prova. Para a an?lise da citotoxicidade foram realizados os testes de MTT e vermelho neutro, sendo avaliados nos per?odos de 24 e 48 horas. Os dados obtidos foram analisados atrav?s do software IBM SPSS 22. A distribui??o de normalidade foi verificada atrav?s do teste de Shapiro-Wilk e a homogeneidade atrav?s do teste de Levene. Os testes de rugosidade, microdureza e compress?o foram submetidos a ANOVA de um fator e Tukey. O teste de tra??o diametral foi submetido aos testes de ANOVA ucelentem fator e de Games-Howell. Os testes de citotoxicidade foram submetidos aos testes de ANOVA de um fator e Duncan. Todos os testes foram realizados com n?vel de signific?ncia de 5%, considerando p < 0,05. N?o foi registrada diferen?a estat?stica entre os grupos testados nos testes de resist?ncia a compress?o e tra??o diametral com rela??o ao grupo controle (G7). Na microdureza, os grupos 2, 4 e 6 n?o diferiram estatisticamente do grupo 7. Com rela??o ? rugosidade, apenas o grupo 6 apresentou m?dia superior ao G7. Nos testes de MTT e vermelho neutro, todos os grupos mostraram valores similares ou superiores ao grupo 7. A adi??o de extrato de pr?polis ou ?xido de zinco n?o interfere nas propriedades mec?nicas e na citotoxicidade do CIVMR nas concentra??es de at? 20%. Resin-modified glass-ionomer cement (RMGIC) is mainly indicated as a liner or base in restorative materials. In deep dentinal cavities where there is not symptomatology, only partial dentine is removed in order to avoid the pulp exposure. Thus, the restorative material is very close to the pulp. The aim of this study was to evaluate the incorporation of zinc oxide or extract of propolis in a RMGIC, subsequently testing the mechanical properties and citotoxicity. For the control group, the RMGIC (Vitremer, 3M ESPE) was handled in its original formulation (G7). Zinc oxide was inserted to the powder of RMGIC in the following proportions: 10% (G1), 20% (G2) e 30% (G3), which were mixed with the original liquid of Vitremer. The extract of propolis was inserted to the liquid of Vitremer in the following proportions: 10% (G4), 20% (G5), 30% (G6), which were mixed with the original powder of Vitremer. Compressive strength, diametral tensile, microhardness and roughness were measured. The cytotoxity was evaluated by MTT assay and neutral red after 24 and 48 hours of exposition. Data were analyzed using the IBM SPSS 22. To verify normality and homogeneity, Shapiro-Wilk and Levene tests were used, respectively, with significance level of 5%. The roughness, microhardness and compressive strength were assessed by one-way ANOVA followed by a multiple-comparison Tukey post hoc test. The diametral tensile was assessed by one-way ANOVA followed by a multiple-comparison Games-Howell post hoc test. For cytotoxity tests, one-way ANOVA and Duncan post hoc test was used to identify intergroup differences. The level of significance was set at p < 0,05. No significant difference was observed in the compressive strength and diametral tensile amog groups in relation to control group (G7). Groups 2, 4 e 6 did not differ in microhardness to the control group (G7). In the roughness test, the group 6 presented the highest mean statistical difference from group 7. Experimental groups showed similar or highest values of cell viability when compared to the group 7 in MTT assay and neutral red tests. The addition of 10% and 20% of extract of propolis or zinc oxide do not interfere in the mechanical proprieties and cytotoxicity of RMGIC.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior In this work different systems for obtaining a fluorescent resonant energy transfer (FRET) were studied between a donor molecule and the acceptor energy in different modes of operation. For this purpose, we have used a quantum dot (QD) core / shell (CdSe / ZnS) acting as a donor and an organic dye Neutral Red (NR) as the acceptor. FRET is a nonradiative process via dipolar interaction and so that it occurs between a donor and acceptor, certain conditions must be observed as the spectral overlap; choice of appropriate donor and energy acceptor in accordance with the lifetime of both; the appropriate distance between the molecules and the parallel dipole orientation. For the optical characterization of energy transfer mechanism and migration, we have used the following techniques: optical absorption (Ab), photoluminescence (PL) and microluminescence surface scan technique (PL). The study of the photoluminescence spectra in which the donor and acceptor are held in the same platform has shown that the quantum dots undergoes suppression of the dye when there is a lower amount of donor to acceptor, and thus the reduction of the nanocrystal luminescence shows the occurrence of process FRET. Furthermore, in particular, PL technique was applied for analyzing the photon diffusion length (LD) in the same previous samples, and it was observed wider curves when scan curves when the quantity of donors were larger than the acceptor and when a greater dilution of the sample occurs. Thus, this study demonstrated the possibility of obtaining fluorescent resonant nonradiative transfer between quantum dots and dyes in different systems. Neste trabalho foram estudados diferentes sistemas para a obtenção da transferência de energia fluorescente ressonante (FRET) entre uma molécula doadora e aceitadora de energia em diferentes meios de atuação. Para tal finalidade, utilizou-se um ponto quântico (PQ) núcleo/casca (CdSe/ZnS) agindo como doador e o corante orgânico Neutral Red (NR) como aceitador. O FRET é um processo não radiativo via interação dipolar e, para que ele ocorra entre um doador e aceitador, algumas pré-condições devem ser observadas como a sobreposição espectral; a escolha adequada do doador e do aceitador de energia de acordo com o tempo de vida de ambos; a distância apropriada entre as moléculas e a orientação dipolar paralela. Para a caracterização óptica do mecanismo de transferência de energia e migração, utilizou-se seguintes técnicas: absorção óptica (Ab), fotoluminescência (PL) e varredura da microluminescência espacial (μPL). O estudo dos espectros de fotoluminescência em que doador e aceitador são mantidos em mesmo meio mostrou que o ponto quântico sofre supressão do corante quando há uma quantidade de doadores inferiores às de aceitadores e, assim a redução da luminescência do nanocristal mostra a ocorrência de processo de FRET. Além disso, em particular, aplicou-se a técnica de μPL para analisar o comprimento da difusão de fótons (LD) nas mesmas amostras anteriores e observou-se que havia maior alargamento das curvas de varredura quando as quantidades de doadores foram maiores que de aceitadores e quando ocorrer uma maior diluição das amostras. Assim, este trabalho demonstrou a possibilidade de obter transferência não radiativa fluorescente ressonante entre ponto quântico e corante em diferentes sistemas. Mestre em Física

O fitoplâncton é sensível às perturbações ambientais e identificar a viabilidade destes organismos é importante para o monitoramento aquático. O termo viabilidade tem sido usado neste contexto para determinar basicamente se o organismo está vivo ou morto. O uso de corantes vitais e mortais tem sido uma das técnicas aplicadas neste tipo de análise, mas ainda não se conhece a potencialidade de alguns corantes que se apliquem a espécies de fitoplâncton. Neste trabalho, foram utilizadas espécies de diferentes grupos taxonômicos mantidas em cultivo, as quais foram submetidas a uma série de corantes vitais e mortais com o objetivo de detectar a viabilidade do fitoplâcton marinho. Dentre os corantes testados, o vermelho neutro, azul de Evans e o fluorescente CMFDA tiveram os melhores resultados (observado x esperado) em testes com diferentes porcentagens de células vivas e mortas. A combinação entre o corante vital vermelho neutro e o mortal azul de Evans não foi efetiva para análise simultânea. Alexandrium tamiyavanichii foi a espécie que teve menor afinidade com os corantes. Também foram comparados diferentes métodos de observação e registro de células coradas e não coradas, provando que é possível substituir a observação direta da microscopia pela filmagem no microscópio ou pela FlowCAM. A vantagem do uso destes métodos é que além de serem mais rápidos, é possível salvar as imagens capturadas e não é necessário fazer a análise instantaneamente. O método da filmagem é vantajoso, pois é fácil de ser desenvolvido em qualquer laboratório. Phytoplankton cells are sensitive to environmental perturbations and, therefore, identifying their viability is important for aquatic monitoring. The term viability has been used in this context to determine whether an organism is alive or dead. The use of vital and mortal stains to detect phytoplankton viability is a promising approach. In this study we investigated the efficiency of several vital and mortal dyes in detecting marine phytoplankton viability. Best results were achieved with neutral red, Evans blue and the fluorescent stain in tests with different percentages of live and dead cells. The combination of neutral red and Evans blue (vital and a mortal stains, respectively) was not effective in simultaneous analysis. Alexandrium tamiyavanichii had low affinity for any given stain. Different observational methods were compared, suggesting that direct microscopic counts can be replaced by image acquisition methods using either a microscope-mounted camera or a FlowCAM. Such imaging methods are fast, allow image archiving, and image processing can be performed on a later stage, which is useful when several experiments need to be run in a short period of time.

Anfotericina B (antifúngico) e Ciclosporina (imunossupressor) são fármacos muito utilizados na clínica médica, porém é comum a ocorrência de Nefrotoxicidade. A proposta do presente estudo foi avaliar o envolvimento da via de sinalização celular PKA na nefrotoxicidade causada pela Anfotericina B e Ciclosporina utilizando linhagens celulares renais: LLC-PK1 (túbulos proximais de porcos) e MDCK (túbulos distais de cães). Para tal avaliamos parâmetros envolvidos na nefrotoxicidade como: Citotoxicidade (Vermelho Neutro e MTT), Morte Celular (Citometria de Fluxo), recuperação do efeito tóxico (Vermelho Neutro), quantificação de citocinas inflamatórias, efeito vasodilatador (quantificação de óxido nítrico) e participação da via PKA (Western Blot). Os resultados mostraram que ambos os fármacos foram citotóxicos para as ambas as linhagens, como avaliado pelos testes Vermelho Neutro e MTT; e causaram fragmentação do DNA, conforme avaliado pela Citometria de Fluxo utilizando Iodeto de Propídeo. As duas linhagens celulares conseguiram se recuperar do efeito tóxico causado pela Anfotericina B e Ciclosporina, porém o tempo de recuperação varia de acordo com o fármaco utilizado e com a linhagem celular empregada. Na análise do envolvimento da via de sinalização PKA na nefrotoxicidade causada pelos fármacos, quando as células foram pré-tratadas com H89 (inibidor da via PKA) e em seguida com os fármacos, não ocorreu diferença significativa entre os grupos, conforme avaliado pelo teste Vermelho Neutro. Quando a mesma análise foi realizada utilizando a Citometria de Fluxo, nas células MDCK a inibição da via PKA diminuiu a porcentagem de morte celular ocasionada pelos mesmos. A inibição da via não afetou a capacidade de recuperação celular em nenhuma das duas linhagens. Quando avaliamos a produção de citocinas pro-inflamatórias relacionadas com o processo nefrotóxico, percebemos que a Anfotericina B estimulou a produção de IL-6 e esta foi dependente da via PKA, enquanto a Ciclosporina não alterou a produção dessa citocina. Em relação ao TNF-, os dois fármacos estimularam a produção do mesmo, mas esta não foi alterada pela inibição da via. Ambos os fármacos causaram diminuição na produção de Óxido Nítrico (substância vasodilatadora) e essa produção mostrou-se dependente da via PKA. Os resultados do Western Blot confirmaram que os dois fármacos induzem a ativação da via PKA. Assim, nossos resultados sugerem que a inibição da via PKA pode auxiliar na prevenção/diminuição da nefrotoxicidade causada pela Anfotericina B e Ciclosporina. Amphotericin B (antifungal) and Cyclosporine (immunosuppressant) are commonly used drugs in medical clinics; however, these often present Nephrotoxicity. The proposal of the present study was to evaluate the involvement of the cellular PKA signaling pathway on Nephrotoxicity caused by Amphotericin B and Cyclosporine using renal cell lines: LLC-PK1 (proximal tubules of pigs) and MDCK (distal tubules of dogs). To accomplish this goal, the present study evaluated parameters involved in Nephrotoxicity, such as cytotoxicity (Neutral Red and MTT), cell death (Flow Cytometry), the recovery of toxic effects (Neutral Red), inflammatory cytokine quantification, the vasodilator effect (quantification of nitric oxide), and the participation of PKA (Western Blot). The results showed that both drugs, when evaluated by neutral Red and MTT tests, proved to be cytotoxic to both cell lines, and when evaluated by Flow Cytometry using Propidium iodide, they caused DNA fragmentation. The two cell lines were able to recover from the toxic effect caused by Amphotericin B and Cyclosporine, but the recovery times varied, depending on the drugs and cell lines used. In the analysis of the involvement of the PKA signaling pathway on Nephrotoxicity caused by these drugs, when cells were pre-treated with H89 (PKA inhibitor) and then with the drugs, no significant difference between the groups, when evaluated by Neutral Red, could be observed. When the same analysis was performed using Flow Cytometry in MDCK, the inhibition of the PKA pathway decreased the percentage of cell death caused by Amphotericin B and Cyclosporine. Inhibition of the pathway did not affect the capacity of cell recovery in either of the two cell lines. When the production of pro-inflammatory cytokines was evaluated as regards the nephrotoxic process, it could be observed that Amphotericin B stimulated the production of IL-6, which proved to be dependent on the PKA pathway, whereas Cyclosporine did not alter the production of this cytokine. In relation to TNF-, both drugs stimulated this production; however, the inhibition of the PKA pathway did not alter this production. Both drugs caused a decrease in the production of Nitric Oxide (vasodilator substance), and this production proved to be dependent on the PKA pathway. Western Blot results confirmed that both drugs induce the activation of the PKA pathway. Thus, the present studys results suggest that the inhibition of the PKA pathway can aid in preventing/reducing Nephrotoxicity caused by Amphotericin B and Cyclosporine.

Em virtude do uso indiscriminado de antimicrobianos, a resistência de microrganismos patogênicos à diversas drogas tem aumentado nos últimos anos. Essa situação tem forçado pesquisadores a procurarem por novas drogas, tais como os medicamentos fitoterápicos que são preparações farmacêuticas (extratos, tinturas, pomadas e cápsulas) de ervas medicinais, utilizadas para o tratamento de inúmeras doenças. Uma das espécies brasileiras do cerrado que tem despertado o interesse de várias áreas é a aroeira (Myracrodruon urundeuva), por apresentar ação antiinflamatória, antiproliferativa, antioxidante e antimicrobiana. Dessa maneira o objetivo deste trabalho foi de avaliar o efeito do extrato hidroalcoólico de aroeira na viabilidade celular dos osteoblastos humanos e analisar a influência do extrato hidroalcoólico de aroeira na expressão de metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) e anquilose progressiva humana (ANKH). Nesse estudo foram utilizados osteoblastos humanos cultivados em Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) adicionado de 10% de soro fetal bovino (SFB). Após atingirem a subconfluência as células foram plaqueadas e tratadas com diferentes concentrações do extrato hidroalcoólico de aroeira (Extrato Bruto; 1:10; 1:100; 1:1.000; 1:10.000). Após 24, 48, 72, 96 horas foi realizada a análise da viabilidade celular por meio da redução do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5- difeniltetrazólio), captação do vermelho neutro e cristal violeta. Também foi feita a redução do MTT após 7, 14, 21 e 28 dias de tratamento com o extrato, para verificar se as células permaneciam viáveis nesses períodos. A análise da expressão gênica de MMP-2 e ANKH foi realizada pelo RT-PCR em tempo real nos períodos de 24, 48, 72 horas, 7, 14, 21 e 28 dias. Os ensaio de viabilidade celular (redução do MTT, captação do vermelho e cristal violeta) mostraram que houve o aumento da viabilidade celular nos grupos tratados com o extrato a 1:10.000; e a diminuição da viabilidade dos osteoblastos humanos nos grupos com extrato bruto e com 1:10. Com relação à expressão de MMP-2 e ANKH, os resultados mostraram que o extrato promoveu uma modulação da expressão desses genes no decorrer dos períodos em comparação com o grupo controle. De um modo geral o extrato, em maiores concentrações (1:100), inibiu a expressão de MMP-2 e aumentou a expressão de ANKH. Tendo em vista os resultados obtidos concluímos que o extrato hidroalcoólico de aroeira em altas concentrações promove redução e/ou morte celular dos osteoblastos humanos e ainda modulam a expressão de MMP-2 e ANKH. Due to the indiscriminate use of antimicrobial, the resistance of pathogenic microorganisms to various drugs has increased in recent years. This situation has forced researchers to search for new drugs, such as herbal medicines that are pharmaceutical preparations (extracts, tinctures, ointments and capsules) medicinal herb, used for the treatment of numerous diseases. One species of the Brazil that has aroused interest in many areas is the aroeira (Myracrodruon urundeuva) because of its anti-inflammatory, antiproliferative, antioxidant and antimicrobial. Thus the aim of this work was to evaluate the effect of hydroalcoholic extract of aroeira on cell viability of human osteoblasts and to analyze extract on the expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) and human progressive ankylosis (ANKH) . In this study, we used human osteoblasts cultured in Eagle\'s medium modified by Dulbecco (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). After reaching subconfluence cells were plated and treated with different concentrations of the aroeira extract hydroalcoholic (brute extract , 1:10, 1:100, 1:1.000, 1:10:000). After 24, 48, 72 and 96 hours analysis was performed of cell viability by the reduction of MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 - diphenyltetrazolium bromide) uptake of neutral red and crystal violet. It was also made MTT reduction after 7, 14, 21 and 28 days of treatment with the extract, to check if the cells remained viable during these periods. The analysis of the gene expression of MMP-2 and ANKH was performed by Real Time RT-PCR in periods of 24, 48 hours, 72 hours, 7, 14, 21 and 28 days. The cell viability assay (MTT reduction, uptake of neutral red and crystal violet) showed that there was a tendency of increased cell viability in the groups treated with the extract 1:10.000, and decreased viability of human osteoblast cells in groups with brute extract and 1:10. With respect to expression of MMP-2 and ANKH, the results showed that the extract promoted a modulation of expression of these genes during the periods, compared to the control group. Generally extract at higher concentrations (1:100) both inhibited the expression of MMP-2 and increased rhe expression of ANKH. Given the results we conclude that the hydroalcoholic extract of aroeira in high concentrations causes a reduction and / or cell death of human osteoblasts and also modulate the expressio of MMP-2 and ANKH.

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stefanie Nolte.pdf: 1509773 bytes, checksum: dbef289d8b9a1e611bef15b9a6d2f33c (MD5) Previous issue date: 2013-02-21 Introduction: Psoriasis is a skin inflammatory disease characterized by keratinocytes hyperproliferation and their incomplete differentiation in the epidermis. Treatment aims to reduce the psoriatic plaques formation; however, many therapeutic regimens do not produce satisfactory results. Searching for new alternatives, this study evaluated the possible effect of the TTHL compound, isolated from the ethanolic extract of Combretum leprosum, on HaCaT proliferation.Methods: The cellular viability was assessed 24 hours after the treatment with different concentrations of TTHL through MTT and neutral red methods. To evaluate the TTHL anti-proliferative activity, the cells were treated with different concentrations of TTHL, in alternate days (96 hours) and analyzed through MTT and Cyquant methods. The cell cycle was evaluated by flow citometry. The possible toxicity by the topical application of the TTHL (0.3 mg/ear) was assessed in vivo, through skin atrophy, by measuring ear thickness of animals and histology.Results: The MTT assay showed, after 24 hours, that TTHL presents cytotoxic activity in HaCaT cells, at the concentrations of 5, 7, 9 and 10 μM, decreasing, respectively, 53.54, 89.53, 89.69 and 90.30 ± 5.84% the cellular viability compared to the control group. The neutral red assay, in the same concentrations, decreased 39.83%, 48.67%, 47.78% and 50.44 ± 4.42%, respectively. In the cellular proliferation assay, the 5, 7 and 10 μM concentrations decreased 24.27%, 59.25% and 82.30% ± 5.96% the cells number, as showed in the MTT method, and 30.30%, 59.59% e 90.90% ± 6.03% as showed in the Cyquant method. The cell cycle assay showed that, at the concentrations of 5, 7 and 10 μM, the non-viable cells number was higher and statistically significant when compared to the control group. Through the skin atrophy assay was possible to conclude that TTHL does not cause atrophy.Conclusion: TTHL is capable of reducing cell viability. These data suggest that TTHL might be a possible tool for the treatment of hyperproliferative diseases, among them, psoriasis. However, additional studies are needed to verify the action mechanism and triterpene safety. Introdução: A psoríase é uma doença inflamatória cutânea caracterizada pela hiperproliferação e diferenciação incompleta de queratinócitos na epiderme. O tratamento tem como objetivo reduzir a formação de placas psoriáticas, porém muitos regimes terapêuticos não produzem resultados satisfatórios. Buscando alternativas, este trabalho avaliou o possível efeito do composto TTHL, isolado do extrato etanólico de Combretum leprosum, sobre a proliferação de HaCaT. Métodos: A viabilidade celular foi avaliada 24 horas após o tratamento com diferentes concentrações de TTHL, através do método de MTT e vermelho neutro. Para avaliar a atividade antiproliferativa, as células foram tratadas com diferentes concentrações de TTHL, em dias alternados e analisadas através do método de MTT e Cyquant. O ciclo celular foi avaliado por citometria de fluxo. A possível toxicidade pela aplicação tópica do TTHL foi avaliada in vivo, pelo ensaio de atrofia cutânea, através da medida da espessura da orelha dos animais e histologia. Resultados: No ensaio de MTT, após 24 horas, o TTHL, apresentou atividade citotóxica nas células HaCaT, nas concentrações de 5, 7, 9 e 10 μM, diminuindo, respectivamente em 53,54, 89,53, 89,69 e 90,30 ± 5,84% a viabilidade celular quando comparado ao grupo controle. No ensaio de vermelho neutro, essas mesmas concentrações diminuíram 39,83%, 48,67%, 47,78% e 50,44 ± 4,42%, respectivamente. No ensaio de proliferação celular, nas concentrações de 5, 7 e 10 μM, observou-se diminuição de 24,27%, 59,25% e 82,30% ± 5,96% no número de células, conforme o método de MTT e 30,30%, 59,59% e 90,90% ± 6,03% conforme o método de Cyquant. No ensaio de ciclo celular observou-se que nas concentrações de 5, 7 e 10 μM o número de células não viáveis foi maior e estatisticamente significante quando comparado com o grupo controle. Através do ensaio de atrofia cutânea foi possível concluir que o TTHL não causa atrofia. Conclusão: O TTHL é capaz de diminuir a viabilidade celular. Esses dados sugerem que o TTHL possa ser uma possível ferramenta para o tratamento de doenças hiperproliferativas, dentre elas, a psoríase. Entretanto, estudos adicionais são necessários para verificar o mecanismo de ação e segurança do triterpeno.

Tese de doutoramento em Farmácia (Toxicologia), apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, 2009. As microcistinas são metabolitos secundários produzidos por cianobactérias de água doce e constituem um risco para a saúde pública uma vez que a ingestão de água contaminada com microcistinas tem sido associada a episódios de hepatotoxicidade humana aguda e crónica. As cianobactérias são constituintes naturais do fitoplâncton de água doce e proliferam massivamente em condições ambientais favoráveis. Porém, a pressão antropogénica sobre os recursos hídricos tem contribuído para o aumento deste fenómeno a nível global, designadamente através da contaminação das massas de água com resíduos urbanos, industriais e agrícolas, cujo conteúdo enriquecido em azoto e fosfatos constitui um estímulo para o crescimento cianobacteriano. A proliferação intensa de cianobactérias (florescência) tem como consequência a acumulação de densidades elevadas de biomassa que, após a fase de senescência, liberta para a água níveis potencialmente nocivos de cianotoxinas. Uma proporção elevada das florescências é composta por cianobacterianas tóxicas e as cianotoxinas mais frequentes são as microcistinas. As microcistinas são um conjunto de aproximadamente 60 variantes estruturais partilhando a estrutura heptapeptídica cíclica comum ciclo(-D-alanina1-L-x2-D-eriro- -iso-aspartato3-L-z4-Adda5-D-glutamato6-N-metil-desidroalanina7) em que x e z são aminoácidos-L variáveis e Adda é o ácido (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-decafenil-4,6-dienóico. A MCLR (com leucina e arginina nas posições variáveis) é a variante mais tóxica e mais comum. O órgão-alvo principal das microcistinas é o fígado uma vez que os hepatócitos expressam ao nível da membrana citoplasmática polipéptidos transportadores dos aniões orgânicos, através dos quais as microcistinas entram na célula. Assim, a maioria dos estudos toxicológicos com microcistinas tem sido conduzida no fígado in vivo e em células hepáticas in vitro. Com base em estudos de toxicidade aguda em animais, foi estabelecido em 1998 pela Organização Mundial de Saúde o valor-guia de 1 nM para a MCLR em água de consumo. Porém, este valor constitui uma medida preventiva parcial, uma vez que não contempla efeitos noutros órgãos nem efeitos crónicos, nomeadamente efeitos cancerigénicos. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que a MCLR apresenta toxicidade noutros órgãos tais como os intestinos, os rins, o cérebro, pulmões e sistema reprodutor. Por outro lado, e embora a informação disponível sobre a toxicidade crónica não permita ainda a revisão daquele valor, a MCLR está actualmente classificada pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como um composto potencialmente cancerigénico (classe 2B). Alguns estudos epidemiológicos associaram o aumento da incidência de hepatocarcinoma e cancro do cólon em populações humanas ao consumo de água contaminada regularmente com microcistinas. Por outro lado, estudos de carcinogenicidade em ratinhos revelaram que a MCLR é um promotor tumoral no fígado, pele e cólon. Recentemente tem sido descrita a actividade genotóxica da MCLR em diferentes tipos celulares. Contudo este é ainda um assunto alvo de alguma controvérsia na comunidade científica e não é ainda claro que a MCLR tenha, per si, capacidade de iniciação tumoral. Portanto, o conhecimento dos mecanismos subjacentes a uma eventual acção cancerigénica das microcistinas apresenta imensas lacunas. O objectivo do trabalho apresentado nesta tese foi a avaliação do potencial cancerigénico de microcistinas. Numa fase inicial seleccionou-se um modelo experimental in vitro (trabalho apresentado no capítulo 2). Para tal avaliou-se o efeito de extractos semi-purificados de duas estirpes de Microcystis aeruginosa, uma produtora de MCLR e outra não produtora de cianotoxinas, no crescimento e viabilidade de linhas celulares de hepatócitos humanos (HepG2) e de ratinho (AML12) e numa linha celular de rim de macaco (Vero-E6), através de testes de citotoxicidade (MTT e LDH). A escolha dos hepatócitos é óbvia, uma vez que o fígado é o órgão-alvo das microcistinas. Usaram-se hepatócitos humanos e de ratinho porque a sensibilidade à MCLR pode depender da espécie. Usou-se também uma linha celular de rim, com o intuito, à data do planeamento do trabalho, de incluir nos ensaios um modelo celular não hepático como controlo negativo. As estirpes de M. aeruginosa foram isoladas de florescências naturais colhidas na albufeira de Montargil e são actualmente mantidas na colecção de algas “Estela Sousa e Silva” do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA). A caracterização da produção de cianotoxinas pelas estirpes usadas neste trabalho foi elaborada previamente no âmbito de outros trabalhos de investigação decorridos no Departamento de Saúde Ambiental do INSA. A utilização da estirpe de M. aeruginosa não tóxica teve como finalidade assegurar que os efeitos observados se deviam à MCLR e não a qualquer efeito da matriz do extracto cianobacteriano. Contrariamente ao esperado, a linha celular de rim Vero-E6 apresentou uma sensibilidade similar ou até ligeiramente superior à dos hepatócitos (HepG2 e AML12). Por outro lado, o extracto da estirpe produtora de MCLR induziu um efeito genotóxico (aumento da frequência de micronucleos) nas células Vero-E6. Perante estes resultados inesperados e considerando o desconhecimento ainda existente acerca da toxicidade das microcistinas em células não hepáticas, seleccionou-se este modelo celular para a avaliação dos potenciais efeitos genotóxicos da MCLR. Para tal, a citotoxicidade da MCLR nas células Vero-E6 foi confirmada através da comparação dos efeitos de extractos de M. aeruginosa e MCLR pura (capítulo 3) e o limiar de citotoxicidade (25 μM) foi determinado, usando os testes MTT, LDH e Neutral Red. Os resultados deste trabalho demonstraram que a citotoxicidade da MCLR apresenta uma forte dependência do binómio dose/tempo de exposição e indiciaram que poderá manifestar-se primeiramente ao nível lisossomal e, sequencialmente, ao nível da mitocôndria e da membrana citoplasmática. Essa hipótese foi comprovada pelas metodologias de microscopia electrónica de transmissão e de imunofluorescência (capítulo 4). Estas metodologias permitiram identificar os alvos intracelulares da MCLR (retículo endoplasmático, lisosomas, citosqueleto, mitocôndria e membrana citoplasmática) e concluir que, de acordo com a dose e tempo de exposição, a MCLR desencadeia uma resposta autofágica nas células Vero, seguida da morte celular por apotose e necrose à medida que a dose e o tempo de exposição aumentam. Muitos destes resultados haviam sido já descritos para hepatócitos, mas apenas muito pontualmente para outros tipos celulares. Caracterizados os efeitos citotóxicos da MCLR, foram avaliados os efeitos genotóxicos nas células Vero e nas células HepG2 (capítulo 5) através do teste do Cometa e do ensaio dos micronúcleos (MN). O primeiro permite detectar quebras na cadeia de ADN, enquanto que o segundo avalia efeitos ao nível cromossómico, designadamente efeitos resultantes da quebra de cromossomas (clastogénese) ou da perda de cromossomas (aneugénese). Os resultados obtidos comprovaram que a MCLR (em doses subcitotóxicas, 5-20 μM) induz o aumento da frequência de micronúcleos em ambas as linhas celulares, mas não induz danos na molécula de ADN. A semelhança dos resultados obtidos com as células Vero e HepG2 sugerem que a MCLR actua através de um mecanismo genotóxico comum nas células hepáticas e renais, muito possivelmente através de um mecanismo aneugénico. A distinção entre actividade clastogénica e aneugénica poderá ser importante para a avaliação do risco, uma vez que para os agentes aneugénicos pode ser possível estabelecer um limiar de exposição abaixo do qual não decorrem riscos de efeitos genotóxicos, o que não é aplicável aos agentes clastogénicos. A identificação do tipo de micronúcleos pela técnica de FISH recorrendo a uma sonda pancentromérica permitirá esclarecer qual o mecanismo associado a este efeito genotóxico da MCLR. Com o intuito de avaliar o efeito da MCLR na proliferação da linha celular Vero-E6, utilizou-se o teste de incorporação de BrdU, que avalia a transição G1/S do ciclo celular (capítulo 6). Os resultados permitem concluir que a exposição a doses muito baixas (1-10 nM) de MCLR estimula a proliferação das células Vero-E6. Note-se que a dose de 1nM correspondente ao valor-guia da MCLR em água de consumo definido pela OMS e está contemplado na legislação portuguesa (Dec-Lei 306/ 2007, 27 Agosto) como valor paramétrico de referência. A análise por Western-blot da expressão de cinases proteicas activadas por mitogénicos (ERK1/2, JNK, p38) revelou que a MCLR estimula a proliferação da linha celular Vero-E6 através da activação da via de sinalização ERK1/2. Integrando os resultados apresentados nesta dissertação, poder-se-à concluir que a MCLR desencadeia uma multiplicidade de efeitos nas células Vero, sugerindo que estas poderão constituir um modelo celular adequado para o estudo dos efeitos nefrotóxicos das microcistinas. Embora o fígado seja o principal órgão de acumulação e eliminação da MCLR, cerca de 10% é excretada pela urina, pelo que os rins poderão também estar expostos a esta toxina. É de particular importância a avaliação dos efeitos decorrentes da exposição continuada a baixas doses, atendendo ao potencial cancerigénico da MCLR. Os resultados aqui apresentados acerca do efeito genotóxico e da capacidade da MCLR estimular a proliferação nas células Vero contribuem para o conhecimento dos efeitos e mecanismos subjacentes à eventual acção cancerigénica das microcistinas, sobretudo porque os estudos nesta área têm sido conduzidos maioritariamente em modelos hepáticos. Os resultados salientam, também, a necessidade de rever o valor-guia estabelecido para as microcistinas. Microcystins are secondary metabolites produced by freshwater cyanobacteria that constitute a risk for human health because they have been associated with acute and chronic human hepatotoxicity after the ingestion of microcystin-contaminated water. Cyanobacteria are freshwater phytoplanktonic organisms that proliferate massively under favourable environmental conditions. However, the anthropogenic pressure on water resources has contributed to the increase of cyanobacterial proliferation worldwide, namely, through the water contamination with nitrogen- and phosphate- enriched urban, industrial and agriculture residues, that constitute a growth stimulus for cyanobacteria. The massive cyanobacterial proliferation (bloom) leads to the accumulation of high biomass densities in water that, after senescence phase, releases potential harmful levels of cianotoxins. Cyanobacterial blooms are often composed by toxic species and microcystins are the most frequent cianotoxins. Microcystins are a group of approximately 60 structural variants sharing the common cyclic heptapeptide struture cyclo (-D-alanine1 -L-x 2 -D-erythro- -iso-aspartic acid3 -L-z 4 -adda5 -D-Glu6 -N-methyl-dehydroalanine7 ), where x and z are variable Laminoacids and ADDA is (2S, 3S, 8S, 9S)-3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10- phenyldeca-4,6-dienoic acid. MCLR (with leucine and arginine in variable positions) is the most toxic and common variant. The main target organ for microcystins is the liver because hepatocytes express the membrane organic anion polypeptide transporters; through witch microcystins enters the cell. For this reason, toxicological studies have been conducted mainly in liver in vivo and in cultured hepatic cells. Based on animal acute toxicity studies, the World Health Organization has established, in 1998, the guideline of 1 nM for MCLR in drinking water. Nevertheless, this value constitutes only a partial preventive measure because it does not include the toxicity of MCLR on other organs, neither chronic effects, namely carcinogenic effects. However, recent studies have been demonstrated the MCLR induces toxicity on other organs such as the intestines, kidney, brain, lungs and reproductive system. On the other hand, despite the information on chronic toxicity of MCLR does not allow the revision of that value, MCLR is classified by the International Agency for Research on Cancer (IARC) as a potential human carcinogen (class 2B). Some epidemiologic studies have associated the increase of human hepatocarcinoma and colorectal cancers with the ingestion of frequently microcystin-contaminated water. On the other hand, rodent carcinogenicity studies have revealed that MCLR is a tumour promoter in liver, skin and colon. Recently, the genotoxic activity of MCLR has been described in several cell types. However, this is a matter of some controversy in scientific community and it is still not clear if MCLR can act as a tumour initiator. Thus, the mechanisms underlying an eventual carcinogenic activity of microcystins are still largely unknown. The aim of this thesis was the evaluation of the carcinogenic potential of microcystins. The first step was the selection of an in vitro cell model (presented in chapter 2). For that purpose, the effects of semi-purified extract from two Microcystis aeruginosa strains, a MCLR-producer and a non-toxigenic strain, on the growth and viability of human (HepG2) and mouse (AML12) hepatocytes and of a monkey kidneyderived cell line (Vero-E6), were evaluated by cytotoxicity assays (MTT and LDH).The use of hepatocytes is obvious given the fact of the liver be the target-organ of microcystins. Human and mouse hepatocytes were tested because the sensibility to MCLR may be specie-dependent. The kidney cell line was used, with the initial intent, to include a non-hepatic cell line as a negative control. M. aeruginosa strains were isolated from natural blooms collected in Montargil reservoir and belongs, presently, to the “Estela Sousa e Silva” algal collection from National Health Institute Dr. Ricardo Jorge (INSA). The characterization of cyanotoxin production by those strains was previously performed by other researchers at the Department of Environmental Health /INSA. The non-toxigenic M. aeruginosa strain was used to ensure that the observed toxic effects of MCLR-producer strain were due to MCLR and not to the cyanobacterial extract matrix. Conversely to what could be expected, the kidney Vero-E6 cell line showed a similar, or even higher, sensitivity to MCLR than the hepatocyte cell lines (HepG2 and AML12). In addition, the extract from the MCLR-producer strain induced a genotoxic effect (increase of micronuclei frequency) in Vero cells. Given these unexpected results, and considering the uncertainties regarding the toxicity of microcystins in non-hepatic cells, the Vero-E6 cell model was selected to further evaluate the potential genotoxic effects of MCLR. For that purpose, the cytotoxicity of MCLR was confirmed in this cell model, by comparing the effects of M. aeruginosa extracts and pure MCLR (chapter 3). The threshold of cytotoxicity was determined (25 µM) by the MTT, LDH and Neutral Red cell viability assays. The results from this work have demonstrated that the cytotoxicity of MCLR strongly depends on the dose/time of exposure and showed that it is exerted sequentially on lysossomes, mitochondria and cell membrane. This hypothesis was confirmed by transmission electron microscopy and immunofluorescence (chapter 4). These methods enabled to identify the intracellular targets of MCLR (endoplasmic reticulum, lysosomes, mitochondria and cell membrane) and to conclude that, accordingly to the dose and time of exposure, MCLR triggers an autophagic response in Vero cells, followed by apoptotic and necrotic cell death. Many of these results were previously described for hepatocytes, but rarely for other cell types. After the characterization of the cytotoxic effects of MCLR, the genotoxic effects were evaluated on Vero and HepG2 cell lines (chapter 5) by the comet and the micronucleous (MN) assays. The Comet assay detects DNA strand breaks and the MN assay evaluates the effects at chromosome level, namely, chromosome breaks (clastogenic effect) or chromosome loss (aneugenic effect). The results demonstrate that MCLR (at subcytotoxic doses, 5-20 µM) induces the increase in MN frequency on both cell lines, but it does not induce damages in DNA molecule. The similarity of results between Vero and HepG2 cells suggests that MCLR acts through a common genotoxic mechanism in liver and kidney cells, probably by an aneugenic mechanism. The distinction between clastogenic and aneugenic activity could be important for risk assessment, because for aneugenic compounds it may be possible to establish a threshold level, below which no hazard to human health is predicted, witch is not valid for clastogens. The identification of the MN by the fluorescence in situ hybridization (FISH) technique using a pancentromeric probe will enable to clarify the mechanism underlying this genotoxic effect of MCLR. To effect of MCLR on Vero-E6 cell line proliferation was determined by the BrdU incorporation assay that evaluates the G1/S transition in cell cycle (chapter 6). The results showed that the exposure to low doses of MCLR (1-10 nM) stimulates the proliferation of Vero-E6 cells. It should be noted that 1nM corresponds to the WHO guideline for MCLR in drinking water and is a mandatory level in Portuguese water legislation (Dec-Lei 306/ 2007, 27 Agosto). The Western-blot analysis of mitogen activated protein kinases (ERK1/2, JNK and p38) revealed that MCLR stimulates Vero cells proliferation by the activation of the ERK1/2 signalling pathway. Taken together, the results presented in this thesis shows that MCLR triggers a multiplicity of effects on Vero-E6 cell line, suggesting that this cells might be an appropriate cell model to study the nephrotoxic effects of MCLR. Although the main target organ for MCLR accumulation and elimination is the liver, approximately 10 % is excreted by the urine, witch means that the kidney might also be exposed. Given the potential cancerigenic effects of MCLR, it is of major importance to evaluate the effects of prolonged exposure to low doses. The results presented here regarding the genotoxic activity of MCLR and its ability to stimulate the proliferation of Vero cells contributes to the knowledge of the effects and mechanisms underlying the eventual cancerigenic activity of microcystins, primarily because the studies in this area have been conducted mainly in hepatic models. The results also emphasise the importance to re-evaluate the guideline of microcystins. O trabalho conducente à presente dissertação foi apoiado financeiramente pela Fundação para a Ciência e Tecnologia, no âmbito da bolsa de doutoramento com a referência SFRH/BD/10585/2002.

As nanopartículas de ouro (AuNPs) estão entre as nanopartículas metálicas mais amplamente estudadas para aplicações biomédicas. Metabólitos presentes em diversos extratos de plantas têm sido explorados para a preparação de diferentes AuNPs. No presente estudo, os fitoquímicos escolhidos como agentes redutores e estabilizadores para síntese das AuNPs, foram a mangiferina (MGF) e o resveratrol (RESV). Devido ao aumento da produção e da utilização das AuNPs, sérias preocupações são levantadas sobre os efeitos perigosos desses nanomateriais sobre a segurança ambiental e humana. O presente estudo investigou o nível de toxicidade das AuNPs reduzidas e estabilizadas com MGF (MGF-AuNPs) e RESV (RESV-AuNPs) in vitro e in vivo, comparando-as com o método clássico de síntese de AuNPs, no qual o citrato de sódio é o agente redutor e estabilizante (CITR-AuNPs). Foi realizado o ensaio de citotoxicidade, de acordo com a norma ISO 10993-5, pelo método de incorporação do corante vermelho neutro; o ensaio de toxicidade aguda com Daphnia similis, de acordo com a norma ABNT NBR 12713; o ensaio de toxicidade aguda com embriões de zebrafish, com a presença e ausência do córion do animal (FET Test), de acordo com o protocolo da OECD 236; o ensaio de microinjeção das amostras em embriões de zebrafish e o ensaio comportamental com as larvas de zebrafish. A nanotecnologia verde provou ser uma ferramenta valiosa na síntese AuNPs, não exigindo o uso de solventes e outras substâncias, pois os elétrons disponíveis dos fitoquímicos RESV e MGF forneceram energia suficiente para reduzir o sal de ouro. A toxicidade das AuNPs variou de acordo com o ensaio e com o modelo in vitro e in vivo. No ensaio de citotoxicidade em células de roedores, o índice de citotoxicidade (IC50) foi obtido das CITR-AuNPs, cujo IC50 foi 72%, que corresponde à concentração de ouro de 74,16 μg mL-1. No ensaio de toxicidade aguda com Daphnia similis, as amostras que causaram efeito tóxico agudo foram os redutores RESV e MGF, as CITR-AuNPs e as RESV-AuNPs, sendo os redutores mais tóxicos que as nanopartículas. Não foi possível estimar a concentração da amostra que causa imobilidade a 50% dos organismos (CE50;48h) para RESV, assim a CE50;48h considerada para o RESV foi menor que 3,12%, que corresponde a concentração de 10,29 μg mL-1. Para MGF a CE50;48h foi 21,52%, que corresponde a concentração de 150,64 μg mL-1. Para as CITR-AuNPs, a CE50;48h foi 29,71%, que correponde a concentração de ouro de 30,60 μg mL-1, e para as RESV-AuNPs a CE50;48h foi 25,88%, que correponde a concentração de ouro de 38,56 μg mL-1. No FET Test com embriões na presença do córion, as RESV-AuNPs causaram atraso no desenvolvimento embrionário, no processo de eclosão, sendo obtida a concentração da amostra que causa efeito letal em 50% dos organismos (CL50;96h) no valor de 34,97%, correspondente a concentração de ouro de 52,10 μg mL-1. No FET Test com embriões na ausência do córion, assim como no ensaio de microinjeção, as amostras não causaram efeito tóxico agudo nos animais. No ensaio comportamental a alteração da atividade locomotora foi observada em todas as amostras, e a toxicidade neurocomportamental foi atribuída aos agentes redutores CITR, MGF e RESV. O presente estudo verificou importância de avaliar a toxicidade das amostras em organismos diferentes, pois Daphnia similis e embriões de zebrafish apresentaram maior sensibilidade comparada as células de mamíferos. Além disso, dados inéditos da avaliação da toxicidade de AuNPs sintetizadas e estabilizadas com fitoquímicos MGF e RESV foram apresentados neste trabalho, contribuindo com a nanotoxicologia/ nano-ecotoxicologia. Gold nanoparticles (AuNPs) are among the most widely studied metallic nanoparticles for biomedical applications. Metabolites present in different plant extracts have been explored for the preparation of different AuNPs. In the present study, the phytochemicals chosen as reducing and stabilizing agents for the synthesis of AuNPs were mangiferin (MGF) and resveratrol (RESV). Due to the increased production and use of AuNPs, serious concerns are raised about the dangerous effects of these nanomaterials on environmental and human safety. The present study investigated the level of toxicity of reduced and stabilized AuNPs with MGF (MGF-AuNPs) and RESV (RESV-AuNPs) in vitro and in vivo, comparing them with the classical method of AuNPs synthesis, in which sodium citrate is the reducing and stabilizing agent (CITR-AuNPs). The cytotoxicity assay was performed, according to the ISO 10993-5 standard, using the method of incorporation of the neutral red dye; the acute toxicity test with Daphnia similis, according to ABNT NBR 12713; the acute toxicity test with zebrafish embryos, with the presence and absence of the animal\'s chorion (FET Test), according to the OECD 236 protocol; the microinjection assay of samples in zebrafish embryos and the behavioral assay with zebrafish larvae. Green nanotechnology proved to be a valuable tool in the synthesis of AuNPs, not requiring the use of solvents and other substances, as the available electrons from the phytochemicals RESV and MGF provided enough energy to reduce the gold salt. The toxicity of AuNPs varied according to the assay and the in vitro and in vivo model. In the cytotoxicity assay in rodent cells, the cytotoxicity index (IC50) was obtained from CITR-AuNPs, whose IC50 was 72%, which corresponds to a gold concentration of 74.16 μg mL-1. In the acute toxicity assay with Daphnia similis, the samples that caused an acute toxic effect were the RESV and MGF reducers, the CITR-AuNPs and the RESV-AuNPs, the reducers being more toxic than the nanoparticles. It was not possible to estimate the concentration of the sample that causes immobility to 50% of the organisms (EC50;48h) for RESV, so the EC50;48h considered for the RESV was less than 3.12%, which corresponds to a concentration of 10.29 μg mL-1. For MGF the EC50;48h was 21.52%, which corresponds to a concentration of 150.64 μg mL-1. For CITR-AuNPs, EC50;48h was 29.71%, which corresponds to a gold concentration of 30.60 μg mL-1, and for RESV-AuNPs, EC50;48h was 25.88%, which corresponds to gold concentration of 38.56 μg mL-1. In the FET Test with embryos in the presence of the chorion, the RESV-AuNPs caused a delay in embryonic development, in the hatching process, and the concentration of the sample that causes a lethal effect in 50% of the organisms (LC50;96h) was obtained at a value of 34, 97%, corresponding to a gold concentration of 52.10 μg mL-1. In the FET Test with embryos in the absence of the chorion, as well as in the microinjection assay, the samples did not cause an acute toxic effect in the animals. In the behavioral assay, alteration in locomotor activity was observed in all samples, and neurobehavioral toxicity was attributed to the reducing agents CITR, MGF and RESV. The present study verified the importance of evaluating the toxicity of the samples in different organisms, since Daphnia similis and zebrafish embryos showed greater sensitivity compared to mammalian cells. In addition, unpublished data from the evaluation of the toxicity of AuNPs synthesized and stabilized with phytochemicals MGF and RESV were presented in this work, contributing to nanotoxicology/nano-ecotoxicology.

Os procedimentos descritos por Draize são a base dos testes de irritação ocular e cutânea adotados internacionalmente para avaliar produtos e substâncias. Entretanto, eles têm sido criticados por motivos éticos, devido à crueldade com os animais e, por isso, metodologias alternativas têm sido estudas para avaliar a toxicidade de produtos que entram em contato com o ser humano. Sendo assim, um estudo comparativo foi realizado entre testes de irritação ocular, cutânea e mucosa oral usando coelhos e testes in vitro pelos métodos de difusão em ágar e de captura do vermelho neutro, ambos usando as linhagens celulares NCTC clone 929, FPC-IAL e SIRC. Os cosméticos avaliados foram batons, bases faciais, pós compactos, blushes, sombras para os olhos, máscaras para os cílios, lápis ou delineadores para os olhos, e sabonetes líquidos de uso adulto e infantil. Os testes in vivo e as linhagens celulares utilizadas no método de difusão em ágar foram escolhidas de acordo com o local de uso dos produtos, com exceção da linhagem NCTC clone 929 que foi utilizada na avaliação de todas as amostras. Das 204 amostras, 141 foram avaliadas pelo teste de irritação cutânea e linhagem FPC-IAL, 80 pelo teste de irritação ocular e linhagem SIRC e 78 pelo teste de irritação de mucosa oral e linhagem FPC-IAL. Somente as amostras de sabonetes líquidos foram avaliadas também pelo método de captura do vermelho neutro com as três linhagens celulares. Na avaliação in vitro as amostras foram analisadas em diferentes concentrações e o parâmetro observado foi viabilidade celular com o corante vermelho neutro. Os resultados obtidos permitiram observar que as amostras positivas no método de difusão em ágar que apresentaram até índice de zona 3 ou seja, halo de morte celular variando de 0,5 a 1,0 cm a partir da amostra, segundo a Farmacopéia Americana, não apresentaram irritação ocular, cutânea ou de mucosa oral. As amostras que apresentaram índice de zona 4, apresentaram diferentes graus de irritação ocular e cutânea com exceção de 2 sabonetes líquidos de uso infantil que não apresentaram reações in vivo, embora apresentaram citotoxicidade até a concentração de 10%. Este método apresentou correlação significante com o teste de irritação ocular, inclusive para os valores individuais da córnea e conjuntiva. Quanto ao método de captura do vermelho neutro obteve-se correlação significante para o teste de irritação cutânea e ocular, podendo inferir que quando as amostras de sabonetes líquidos apresentarem IC50 maior que 0,085% não irão induzir irritação cutânea e ocular nos coelhos. Não foi observada relação entre a origem das linhagens celulares usadas e o tecido alvo utilizado no teste in vivo, sendo que todas as linhagens mostraram correlação significante com a linhagem NCTC clone 929. De acordo com os dados, conclui-se que os métodos in vitro são mais sensíveis e que o método de difusão em ágar usando a graduação da Farmacopéia Americana, pode ser adotado como ensaio de triagem na avaliação de cosméticos. Isto resulta de sua capacidade de predizer a irritação, contribuindo significativamente para a redução dos testes que utilizam animais. The procedures described by Draize are the basis of both ocular and cutaneous irritation tests and have been adopted internationally for in vivo evaluation of products and substances. However, they have been criticized for ethical reasons, due to their cruelty towards animals. Therefore, alternative methodologies are being studied to evaluate the toxicity of products, which have contact with human beings. Thus, a comparative study was performed between ocular, cutaneous and oral mucosa irritation tests using rabbits and in vitro tests through agar diffusion method and neutral red uptake method, both with the use of NCTC clone 929, FPC-IAL and SIRC cell lines. Lipsticks, makeup base, face powder, blushes, eye shadows, mascara, pencils and eyeliners, as well as liquid soap for children and adult use were evaluated. The in vivo tests and the cell lines used in the agar diffusion test were chosen according to the place where the products are used. Only the NCTC clone 929 linage was used in the evaluation of all the samples. From the 204 analyzed samples, 141 were evaluated through the cutaneous irritation test and FPC-IAL lineage, 80 through the ocular irritation test and SIRC lineage, and 78 through the oral mucosa irritation test and FPC-IAL lineage. Only the samples of liquid soap were also evaluated through the neutral red uptake method with the three cells lines. The samples submitted to the in vitro evaluation were analyzed in different concentrations and the observed parameter was cellular viability with the use of neutral red. The results obtained revealed that the agar diffusion test positive samples which presented up to degree 3 zone rate, that is cellular death halo varying from 0,5 to 1,0cm from the samples, according to USP 25, didn’t provoke ocular, cutaneous or oral mucosa irritation. The samples which presented degree 4 zone also showed different degrees of ocular and cutaneous irritation, except to two units of liquid soap for children use which didn’t present in vivo reactions, although citotoxicity up to 10% concentration. This method showed significant correlation with the ocular irritation test and also concerning the individual values of cornea and conjunctiva. As for the neutral red uptake test, it presented significant correlation in the ocular and cutaneous irritation test, what make it possible to infer that when the liquid soap samples present IC50 above 0,085% they won’t cause ocular and cutaneous irritations in rabbits. No relation was observed between the origin of the cell lines and the target tissue used in the in vivo test, having all the cellular lines shown significant correlation with the NCTC clone 929 line. According to the data, the in vitro methods are more sensitive and the diffusion agar method, using the American Pharmacopeia graduation, can be adopted as a sorting procedure in the evaluation of cosmetics. This is a result of its capacity of predicting irritation, what largely contributes for the reduction of animal using tests.

Submitted by Clarice Rosa Machado (clarice.machado@ufn.edu.br) on 2022-07-07T12:26:55Z No. of bitstreams: 2 Tese_AltevirRossatoViana_SemAssinaturas.pdf: 2319753 bytes, checksum: facaf192f4ccb3464708f51b0f3a6e2c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Made available in DSpace on 2022-07-07T12:26:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese_AltevirRossatoViana_SemAssinaturas.pdf: 2319753 bytes, checksum: facaf192f4ccb3464708f51b0f3a6e2c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2022-03-28 CAPES Currently, cancer and bacterial infections are amoung the main causes of death in the world. The resistance of these diseases to traditional treatments is the main factor for the development of studies in the area. Nanotechnology, combined with drug repositioning, can improve understanding, bioavailability, biocompatibility and consequently lead to the cure of patients. The drug encapsulation can prolong drug circulation time, increasing its therapeutic effects, such as accumulating in the tumor microenvironment. The objective of this thesis was to produce, characterize and analyze the morphology of liposomes containing Sb2O3 and As2O3 in different formulations, in addition to their biological activity in tumor cell lines, bacterial strains and in cleavage of plasmid DNA. Thus, this is an experimental in vitro study, where liposomal vesicles were produced by the reversed-phase evaporation method, followed by the use of a 750W probe with an amplitude of 40%. The liposomes were characterized by size assessment techniques, polydispersity index (IPD), zeta potential, pH analysis, active content, morphology and formulation components, using a previously calibrated potentiometer, inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES), scanning electron microscopy with energy dispersive spectrometry (SEM-EDS) respectively. The stability of the formulations was evaluated through the physicochemical above at room temperature (25°C), refrigeration (4-8°C) and climatic chamber (40°C) in three different periods. Cytotoxicity was evaluated at 24 and 72 h, using Trypan Blue, 3-4,5-dimethyl-thiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), Neutral Red and dsDNA PicoGreen; with tumor lines NB4, HL-60, T98G, U87MG, HepG2, A375 and A549. Furthermore, the production of reactive oxygen species (ROS) was evaluated by the Dichlorofluorescein assay (DCFH-DA) in tumor cells. The minimum inhibitory concentration (MIC) was tested on bacterial strains Escherichia coli (ATCC 35218), Staphylococcus aureus (ATCC 2913), Enterococcus faecallis (ATCC 29212) and multidrug resistant S. aureus and Klebsiella pneumoniae strains. The interaction of the formulations with the plasmid DNA was performed by the quantification of single-strand breaks, causing a change in the conformation of the genetic material from supercoiled (FI) to relaxed circular (FII). The initial characterization parameters of the liposomes showed that the vesicles were smaller than 150 nm, IPD around 0.280, negative surface charge -10.7 mV and pH close to neutral 7.39 shortly after synthesis. The best storage conditions were at room temperature and under refrigeration, in relation to the climatic chamber after 30 days of analysis. In the assays to evaluate the cytotoxicity, there were concentration-dependent effects, with success close to the positive control (H2O2). Higher concentrations of the formulations (>100 µg mL-1) also caused an increase in intracellular ROS. In the MIC assay, the concentration that inhibited 50% of the strains tested was above 256 µg mL-1. Liposomes were also unable to interact and cause degradation on direct exposure to plasmid DNA. Finally, in addition to having a potential biological effect on all tumor cells tested, the production of ROS proved to be an important mechanism of action of liposomes containing the actives, especially after 72h of incubation. Atualmente, o câncer e as infecções bacterianas estão entre as principais causas de óbito no mundo. A resistência dessas doenças aos tratamentos tradicionais são o principal fator para o desenvolvimento de estudos na área. A nanotecnologia, aliada ao reposicionamento de fármacos, pode melhorar o entendimento, biodisponibilidade, biocompatibilidade e, consequentemente levar à cura dos pacientes. O encapsulamento de fármacos pode, por exemplo, prolongar o tempo de circulação do medicamento, aumentando os seus efeitos terapêuticos, como, acumular-se no microambiente tumoral. O objetivo desta tese foi produzir, caracterizar e analisar a morfologia de lipossomas contendo Sb2O3 e As2O3 em diferentes formulações, além de avaliar sua atividade biológica em linhagens tumorais, cepas bacterianas e na clivagem do DNA plasmidial. Desse modo, vesículas lipossomais foram produzidas pelo método de evaporação em fase reversa, seguido da utilização de sonda de 750W com amplitude de 40%. Os lipossomas foram caracterizados pelas técnicas de avaliação do tamanho, índice de polidispersão (IPD), potencial zeta, análise do pH, teor do ativo, morfologia e componentes das formulações, foram utilizados potenciômetro previamente calibrado, espectrometria de emissão óptica por plasma indutivamente acoplado (ICP-OES), microscopia eletrônica de varredura com espectrometria dispersiva de energia (MEV-EDS) respectivamente. A estabilidade das formulações foi avaliada por meio de parâmetros físico-químicos em temperatura ambiente (25°C), refrigeração (4-8°C) e câmara climática (40°C) em três períodos diferentes. A avaliação da citotoxicidade foi realizada nos tempos de 24 e 72h, por meio dos ensaios Azul de Tripan, brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio (MTT), Vermelho Neutro e dsDNA PicoGreen; com as linhagens tumorais NB4, HL-60, T98G, U87MG, HepG2, A375 e A549. Além disso, a produção de espécies reativas do oxigênio (EROs) foi avaliado pelo ensaio de Diclorofluoresceína (DCFH-DA) nas células tumorais. A concentração inibitória mínima (CIM) foi testada nas cepas bacterianas Escherichia coli (ATCC 35218), Staphylococcus aureus (ATCC 2913), Enterococcus faecallis (ATCC 29212) e em isolados multidroga resistentes S. aureus e Klebsiella pneumoniae. A interação das formulações com o DNA plasmidial foi realizada pela quantificação das quebras de fita simples, acarretando mudança de conformação do material genético de superenovelado (FI) para circular relaxado (FII). Os parâmetros iniciais de caracterização dos lipossomas demonstraram que as vesículas possuíam tamanho inferior a 150 nm, IPD cerca de 0,280, carga superficial negativa -10,7 mV e pH próximo ao neutro 7,39 logo após a síntese. As melhores condições de armazenamento foram à temperatura ambiente e sob refrigeração, em relação à câmara climática após análises de 30 dias. Nos ensaios para avaliação da citotoxicidade houve efeitos concentração-dependente, com êxito próximo ao controle positivo (H2O2). As maiores concentrações das formulações (>100 µg mL-1) também ocasionaram uma elevação de EROs intracelular. No ensaio da CIM, a concentração que inibiou 50% das cepas testadas ficou acima de 256 µg mL-1 . Os lipossomas também não foram capazes de interagir e causar degradação na exposição direta ao DNA plasmidial. Por fim, além de possuírem um potencial efeito biológico em todas as células tumorais testadas, a produção de EROs mostrou-se ser um mecanismo de ação importante dos lipossomas contendo os ativos, principalmente após 72h de incubação.

As doenças hepáticas têm sido uma das preocupações e um desafio para a saúde pública. Apesar dos avanços da medicina moderna, a busca por alternativas terapêuticas têm aumentado, devido a fatores como, por exemplo, efeitos adversos a longo prazo do tratamento de patologias hepáticas. Diante disso, os produtos naturais se tornam uma alternativa terapêutica para tratamento de diversos distúrbios, inclusive hepáticos. Achyrocline satureioides (Lam.) DC. (Marcela) é uma planta nativa do Brasil e muito utilizada na medicina popular, sendo suas partes empregadas com várias finalidades terapêuticas, tais como analgésica, antioxidante, anti-inflamatória entre outras. O objetivo deste estudo foi buscar evidências de tradicionalidade do uso de plantas medicinais hepatoprotetoras nativas do Brasil e avaliar o efeito hepatoprotetor, em modelo in vitro, de A. satureioides contra danos induzidos por paracetamol. Em uma primeira parte deste estudo, foi feita uma revisão das espécies das plantas brasileiras utilizadas como agentes hepatoprotetores, citadas em 25 livros de diferentes regiões do país. Baseado nas 153 espécies encontradas no levantamento realizado na primeira parte deste estudo, foi realizada uma análise abrangente com estudos científicos mais relevantes entre as plantas utilizadas no uso tradicional, dentre eles A. satureioides. Em uma segunda parte, foi realizada experimentalmente a avaliação do efeito hepatoprotetor e citotóxico de A. satureioides em células HepG2 contra danos induzidos por paracetamol. Foram utilizadas as inflorescências de A. satureioides para o preparo dos extratos aquoso e etanólico para avaliar a toxicidade e o efeito protetor de ambos, nas concentrações de 6,25 a 100 μg/mL. A citotoxicidade foi avaliada pela redução do MTT e incorporação do corante vermelho neutro (VN). A atividade hepatoprotetora foi avaliada em células HepG2 após a incubação com paracetamol. Não houve alteração significativa na viabilidade celular nas diferentes concentrações testadas para os extratos aquosos de A. satureioides. Quanto ao extrato etanólico, não foi observada redução significativa na viabilidade celular no teste de redução do MTT. No entanto, no teste de VN observamos uma leve citotoxicidade em concentrações a partir de 12,5 μg/mL. Para a análise de hepatoproteção, os extratos foram co-incubados com 100 μg de paracetamol por 3h. Observamos que ambos os extratos de A. satureioides co-incubados com paracetamol protegem eficientemente as células da morte em todas as concentrações testadas e em ambos os ensaios. Da mesma forma, a silimarina (usada como controle positivo) também protegeu as células da morte. Os resultados contribuem para um possível uso seguro da planta, mas há a necessidade de realizar outros testes para validação do uso. Liver diseases have been one of the concerns and a challenge for public health. Despite advances in modern medicine, the search for therapeutic alternatives has increased, due to factors such as long-term adverse effects of the treatment of liver diseases. In view of this, natural products become a therapeutic alternative for the treatment of various disorders, including liver disorders. Achyrocline satureioides (Lam.) DC. (Marcela) is a plant native to Brazil and widely used in folk medicine, and its parts are used for various therapeutic purposes, such as analgesic, antioxidant, anti-inflammatory, among others. The objective of this study was to seek evidence of the traditional use of hepatoprotective medicinal plants native to Brazil and to evaluate the hepatoprotective effect, by in vitro model, of A. satureioides against paracetamol-induced damage. In the first part of this study, a review of the plant species used as hepatoprotective agents, cited in 25 books from different regions of the country, was carried out. Based on the 153 species studied, elaborated in the study carried out in the first part, a comprehensive analysis was carried out with the most relevant scientific studies among the plants used in the traditional use by them A. satureioides. In a second part, an evaluation of the hepatoprotective and cytotoxic effect of A. satureioides on HepG2 cells against paracetamol-induced damage was carried out experimentally. A. satureioides inflorescences were used for the preparation of aqueous and ethanolic extracts to evaluate the toxicity and protective effect of both, at concentrations of 6.25 to 100 μg/mL. Cytotoxicity was assessed by MTT reduction and neutral red dye (NR) incorporation. Hepatoprotective activity was evaluated in HepG2 cells after incubation with paracetamol. There was no significant change in cell viability at different concentrations tested for aqueous extracts of A. satureioides. As for the ethanol extract, no significant reduction in cell viability was observed in the MTT reduction test. However, in the VN test, we observed a slight cytotoxicity at concentrations from 12.5 μg/mL. For the analysis of hepatoprotection, the extracts were co-incubated with 100 μg of paracetamol for 3h. We observed that both A. satureioides extracts co-incubated with paracetamol efficiently protected cells from death at all concentrations tested and in both assays. Likewise, silymarin (used as a positive control) also protected the cells from death. The plant results contribute to a possible use, but there is a need to carry out tests to validate the use.

Este trabalho avaliou a capacidade em corar, a facilidade de remoção e a ação antimicrobiana de evidenciadores de biofilme dental em prótese total. A capacidade em corar foi avaliada por método visual aplicando-se evidenciadores sobre a superfície interna da prótese total superior. Após fotografia, as próteses coradas foram escovadas (escova e dentifrício específicos para prótese total) e novamente fotografadas. Os diapositivos foram projetados em folhas de papel (aumento de 10 X); as áreas total e corada das próteses contornadas com grafite, recortadas e pesadas, para obtenção, em porcentagem, dos resultados da facilidade de remoção. A ação antimicrobiana foi avaliada pelo método de difusão em ágar e os resultados obtidos pela medida dos aros e halos de inibição formados. A melhor capacidade em corar foi apresentada pelo azul de metileno (0,05%), eritrosina (5%), fluoresceína sódica (1%), Replak e vermelho neutro (1%). Eosina (1%), fluoresceína sódica (1%) e eritrosina (5%) apresentaram a maior facilidade de remoção. Não apresentaram ação antimicrobiana eosina (1%), eritrosina (5%), fluoresceína sódica (1%), proflavina (0,3%), Replak e vermelho neutro (1%). As soluções que apresentaram maior capacidade de corar, facilidade de remoção e ausência de ação antimicrobiana, requisitos necessários para auxiliar estudos que avaliam métodos de higiene e de orientação aos pacientes, foram eosina (1%), vermelho neutro (1%) e eritrosina (5%). This study evaluated the disclosing ability, removal facility and antimicrobial effect of biofilm disclosing agents applied on complete dentures. Disclosing ability was evaluated by means of the visual method. The solutions were applied on the internal surface of dentures. After being photographed, the dentures were brushed with denture-specific brush and dentifrice and photographed again. The obtained slides were projected on paper (10 X amplification) and the total and stained surfaces were outlined with graphite, cut off and weighed, in order to assess removal facility. The evaluation of antimicrobial effects was carried out by means of the method of diffusion in agar, and the results were obtained by measuring the length of the halos and rings. In terms of disclosing ability, the best solutions were 0.05% methylene blue, 5% erythrosin, 1% sodic fluorescein, Replak and 1% neutral red. One percent eosin, 1% sodic fluorescein and 5% erythrosin were the most easily removed solutions. One percent eosin, 5% erythrosin, 1% sodic fluorescein, 0.3% proflavine, Replak and 1% neutral red presented no antimicrobial effect. The solutions which presented the greatest disclosing ability and removal facility as well as absence of antimicrobial effect - which are essential requirements in the assessment of hygiene methods and guidance on oral health - were 1% eosin, 1% neutral red and 5% erythrosin.