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Universidade Federal de Minas Gerais The present work describes the search of bioactive secondary metabolites isolated from plants, against enzymes: gGAPDH (glyceraldehydes-3- phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi and lysosomal cathepsins K, V, L and S. This work is divided in two parts: Part I: Study of the oil from the nut shells of Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - Chagas disease, a parasitic infection caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, is a major public health problem affecting millions of individuals in Latin America. On the basis of the essential role in the life cycle of T. cruzi, the enzyme gGAPDH has been considered an attractive target for the development of novel antitrypanosomatid agents. From the dicloromethane extract of A. occidentale were isolated phenolic compounds which were investigated on their inhibition activity against gGAPDH and trypomastigote forms of T. cruzi. The most promising compound was the 6-n-pentadecylsalicylic acid (AC1) with IC50 values of 28 μM against gGAPDH and 66.7 μg/mL against trypomastigote forms. In addition, a detailed mechanistic characterization of the effects of AC1 on the T. cruzi gGAPDHcatalyzed reaction showed clear noncompetitive inhibition with respect to both substrate G-3-P and cofactor NAD+. Part II: Study of natural products and synthetic derivatives searching for inhibitors of lysosomal cysteine peptidases - After completing the human genome, eleven lysosomal cysteine peptidases were identified. Those enzymes are involved in general protein degradation. The lysosomal cysteine peptidases are found in various tissues and those are found in many organs. Cathepsin K is associated to bone resorption, cathepsin L to skin cancer, at last cathepsins V and S are associated to the immune system. In this work, four enzymes (cathepsins K, V, L and S) were selected as a molecular target for the identification of new inhibitors. Some potent inhibitors of cathepsin V were found, and a study including kinetic characterization of the most potent inhibitors, including potency (IC50), mechanism of action and constant Ki was carried out. The most promising compound is the acridone alkaloid citbrasine (107), with values of IC50 of 1.2 μM and Ki of 0.24 μM. Moreover, it was determined that citbrasine is a competitive inhibitor against cathepsin V in relation to the substrate ZFRMCA. Additionally, it was carried out the study of molecular modeling for acridone alkaloids that showed significant inhibition of cathepsin V. Este trabalho descreve a busca de metabólitos secundários bioativos de plantas, com o intuito de serem avaliados contra as enzimas: gGAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal) do Trypanosoma cruzi e as catepsinas lisossomais K, V, L e S. A descrição deste trabalho está dividida em duas partes. Parte I: Estudo do óleo das cascas da castanha de Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - A doença de Chagas, uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é um importante problema de saúde pública que afeta milhões de pessoas na América Latina. Com base no papel essencial no ciclo de vida de T. cruzi, a enzima gGAPDH tem sido considerada um alvo atraente para o desenvolvimento de novos agentes tripanocidas. Do extrato diclorometânico das cascas da castanha de A. occidentale obtiveram-se compostos fenólicos que foram avaliados frente à enzima gGAPDH e as formas tripomastigotas de T. cruzi. A substância mais promissora foi o ácido 2-pentadecenil-6- hidroxibenzóico (AC 1), com valores de IC50 de 28 μM na enzima gGAPDH e 66,7 μg/mL nas formas tripomastigostas. Além disso, foi determinado que AC1 é um inibidor do tipo não-competitivo para a enzima gGAPDH em relação tanto ao substrato G-3-P (Ki = 2 μM ) quanto ao cofator NAD+ (Ki = 4 μM). Parte II: Estudo de produtos naturais e derivados sintéticos buscando inibidores de cisteíno peptidases lisossomais - Depois de completado o genoma humano, onze cisteíno peptidases lisossomais foram identificadas. Essas enzimas têm a função primária de degradar proteínas, de forma não seletiva, dentro do lisossomo e são encontradas em vários órgãos e tecidos. A catepsina K está associada ao processo de reabsorção óssea, catepsina L ao câncer de pele e as catepsinas V e S ao sistema imune. Neste trabalho, foram selecionadas quatro enzimas (catepsinas K, V, L e S) como alvos moleculares para a identificação de novos inibidores. Foi realizada a caracterização cinética dos inibidores mais potentes frente à catepsina V, através da potência biológica (IC50), mecanismo de ação e constante Ki. A substância mais promissora foi o alcalóide acridônico citibrasina (107), com valor de IC50 de 1,2 μM e Ki de 0,24 μM. Além disso, foi determinado que citibrasina é um inibidor do tipo competitivo para a catepsina V em relação ao substrato ZFRMCA. Adicionalmente foi realizado o estudo de modelagem molecular para os alcalóides acridônicos que apresentaram inibição significativa frente à catepsina V.

A Helicobacter pylori é uma bactéria que reside no estômago e está associada a diversas doenças do sistema gastrointestinal. Sua sobrevivência e replicação está relacionada à atividade enzimática da urease, permitindo a bactéria resistência à acidez gástrica. Fármacos antimicrobianos são usados frente à H. pylori, no entanto existem casos de resistência antibiótica. Diante da necessidade por novos agentes antibacterianos este estudo teve como objetivo a investigação de compostos de origem natural e sintética frente a urease de Canavalia gladiata (UJB). A triagem in vitro dos compostos e Produtos Naturais (PNs) foi realizada utilizando o método espectrofotométrico de medição do produto reacional azul de indofenol à λ = 600 nm. A padronização do ensaio foi realizada pelo estudo de cinética enzimática da UJB e os dados de Km, Vmáx e Kcat foram determinados (4,25 ± 0,62 mmol/L, 44,34 ± 1,33 mmol/L/min e 2062,3 s-1, respectivamente) sendo similares aos valores da literatura. Dentre as 37 chalconas avaliadas nove apresentaram inibição significativa (1a, 1c, 1g, 1h, 2a, 2b, 2c, 2d e 2m) com potência inibitória variando entre IC50 = 5,7 e 18,8 µmol/L. O mecanismo de inibição foi determinado por ensaios in vitro e in silico, sendo as chalconas 1h (Ki = 2,98 µmol/L), 2a (Ki = 6,19 µmol/L), 2c (Ki = 1,87 µmol/L) e 2m (Ki = 3,13 µmol/L) inibidores competitivos e a chalcona 1c (Ki = 17,3 µmol/L) inibidor não-competitivo. As chalconas 2c e 2m apresentaram os melhores valores de CIM (250 e 128 µg/mL, respectivamente) anti-H. pylori em ensaios in vitro. Dentre os PNs avaliados, cinco compostos oriundos do fungo Fusarium proliferatum (5a–5e) também foram inibidores de UJB, dentre os quais os compostos 5a e 5b foram os mais potentes, sendo inibidores competitivos de urease (Ki de 0,55 e 1,1 µmol/L). Cristais obtidos do extrato ativo do cogumelo Pholiota nameko foram analisados por RMN 1D e 2D e o composto foi identificado como manitol, o qual apresentou um valor de IC50 de 35,5 µmol/L frente à urease. A atividade inibitória enzimática do manitol poderia ser uma explicação para a atividade gastroprotetora e anti-H. pylori encontrada em trabalhos anteriores. Através de triagem in silico as propriedades farmacocinéticas de todos os compostos foram investigadas. Além de investigar a biodisponibilidade desses compostos, foi possível aliar esses resultados para entender o comportamento das chalconas nos ensaios in vitro em H. pylori. Através dos ensaios in vitro e in silico foi possível encontrar novos e promissores inibidores de UJB. Helicobacter pylori is a bacteria living in the stomach and it’s associated with several diseases in the gastrointestinal system. The survival and replication of H. pylori is related to the enzymatic activity of urease, which allow the resistance of bacteria to gastric acidity. Antimicrobial drugs are used against H. pylori, but there are occurrence of antibiotic resistance. In the view of the need for new antibacterial agents, this study aimed to investigate new compounds, of natural and synthetic source against urease. In vitro screening of compounds and Natural Products (NPs) was performed using the spectrophotometric method by measuring the reaction product (indophenol blue) at λ = 600 nm. The enzyme kinetics study of urease (Canavalia gladiata) (UJB) was performed for assay standard and the Km, Vmax and Kcat data (4.25 ± 0.62 mmol/L, 44.34 ± 1.33 mmol/L/min and 2062.3 s-1, respectively) were found similar to literature. Among the 37 chalcones assessed, nine showed significant inhibition (1a, 1c, 1g, 1h, 2a, 2b, 2c, 2d and 2m) with inhibitory potency ranging between IC50 = 5.7 and 18.8 µmol/L. The inhibition mechanism was determined for the most potent compounds by in vitro and in silico assays, which chalcones 1h (Ki = 2.98 µmol/L), 2a (Ki = 6.19 µmol/L), 2c (Ki = 1.87 µmol/L), and 2m (Ki = 3.13 µmol/L) showed competitive behavior and 1c non-competitive (Ki = 17.3 µmol/L). Chalcones 2c and 2m revealed the best MIC values (250 and 128 µg/mL, respectively) anti-H. pylori in vitro. Among NPs evaluated, five compounds from the fungus Fusarium proliferatum (5a-5e) were also inhibitors of UJB, which compounds 5a and 5b showed lower IC50 values with competitive behavior on urease (Ki of 0.55 and 1.1 µmol/L). Crystals obtained from the active extract of Pholiota nameko mushroom were analysed by 1D and 2D NMR experiments, and the compound was characterized as mannitol, which showed an IC50 value of 35.5 µmol/L on UJB. The inhibitory enzymatic activity by mannitol could be a clue for the gastroprotective action and anti-H. pylori potential found in previous work. By in silico screening, the pharmacokinetic properties of all compounds were investigated using Lipinski's Rule of Five (RO5) as the main parameter. In addition to bioavailability study of these compounds, it was possible to use the obtained results to understand better the chalcones behavior (2c and 2m) revealed on H. pylori in vitro assay. By using in vitro and in silico tests it was possible to find new and promising UJB inhibitors. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ARGINASE: FROM THE IMMOBILIZATION TO MODULATION OF AFFINITY ASSAY IN COLLECTIONS OF NATURAL PRODUCTS. The use of natural products from plants dates from antiquity and they are often targets as they exhibit biological properties of interest for new drug discovery. Unfortunately screening natural products for biologically active compounds, is laborious, time consuming and Costly. To meet this end, new affinity assay model based on the use immobilized protein have developed and it was the objective of this work. This work consisted of the immobilization of arginase on to magnetic beads (Arg-MBs) for screening of natural products extracts. The modulation of the assay was initially carried out for the compounds: catechin and epicatechin (reported as arginase inhibitors) and as negative control (not inhibitor), acyclovir. For the assays, two ethanolic extracts were selected: Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) and Tabebuia ochracea (Bignoniaceae). From the leaves extract of Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) 12 ligands were identified, and 9 of these characterized by LC-HRMS. While from crude ethanolic roots extract of Tabebuia ochracea (Bignoniaceae) nineteen ligands were fished out. For chemical elucidation, these compounds need to be isolated in milligram scale. The number of ligands identified in the two ethanolic extracts showed the potential of the affinity assay developed. The development of the assays, results and studies for structural elucidation of the ligands identified will be discussed in detail in this dissertation. ARGINASE: DA IMOBILIZAÇÃO À MODULAÇÃO DE ENSAIOS DE AFINIDADE EM COLEÇÕES DE PRODUTOS NATURAIS Desde a antiguidade plantas são usadas para remediar uma dada patologia, e são frequentemente alvos, pois exibem propriedades biológicas de interesse para a descoberta de novos medicamentos. Infelizmente, a triagem de produtos naturais para compostos biologicamente ativos é trabalhosa, demorada e dispendiosa. Assim, novos modelos de triagem baseado em afinidade têm sido desenvolvidos com proteínas imobilizadas e foi o objetivo desse trabalho. Este trabalho consistiu na imobilização da arginase em partículas magnéticas (Arg-MBs) para triagem em matrizes de produtos naturais. A modulação do ensaio foi feita inicialmente para os compostos: catequina e epicatequina (reportados como inibidores de arginase) e como controle negativo (não inibidor da enzima), o aciclovir. Para os ensaios, dois extratos etanólicos foram selecionados: Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) e Tabebuia ochracea (Bignoniaceae). Do extrato das folhas de Byrsonima coccolobifolia (Malpighiaceae) 12 ligantes foram identificados, sendo 9 destes inferidos por LC-HRMS. No extrato de raízes de Tabebuia ochracea (Bignoniaceae) dezenove ligantes foram retidos. Para caracterização esses compostos deverão ser isolados em escala multimiligrama. O número de ligantes identificados nos dois extratos etanólicos demostrou o potencial do ensaio de afinidade desenvolvido. O desenvolvimento dos ensaios, resultados e os estudos para elucidação estrutural dos ligantes identificados serão detalhadamente discutidos nessa dissertação. CAPES: código de financiamento - 001

O Cerrado é reconhecido como a savana mais rica do mundo em biodiversidade, porém pouco explorado do ponto de vista químico. Dentre os gêneros de plantas existentes neste bioma, encontra-se Erythroxylum (família Erythroxylaceae) que é conhecido principalmente pela produção de alcaloides tropânicos. Este trabalho descreve o estudo comparativo do perfil químico das flores das espécies E. campestre, E. suberosum e E. tortuosum, assim como o estudo químico das folhas de E. tortuosum. Para o perfil químico das flores foram obtidos extratos em hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, que foram analisados por RMN 1H, CLAE UV/DAD e CG-EM. Os dados mostraram semelhança de perfil químico entre as espécies estudadas, sugerindo a presença de terpenos, flavonoides e alcaloides. A partir das análises por CG-EM foi possível identificar hidrocarbonetos, aldeídos e um derivado fenólico. Os extratos das folhas de E. tortuosum foram preparados de modo semelhante ao procedimento utilizado para as flores, além de realizar extração ácido-base no extrato metanólico para obtenção de alcaloides. Dos extratos acetato de etila e metanólico das folhas foram identificadas seis substâncias: α-amirina (I), β-amirina (II), campesterol (III), estigmastan-3,5-dieno (IV), β-sitosterol (V) e 4’,7-di-O-metilquercetina-3-O-β-rutinosídeo (IX), sendo o flavonoide o composto majoritário dos extratos. Através da extração alcaloídica foi possível identificar três alcaloides tropânicos: tropacocaína (VI), cocaína (VII) e 6-metoxi-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octan-3-ol (VIII), sendo o último relatado pela primeira vez no gênero Erythroxylum. Os resultados obtidos contribuem para o conhecimento químico da biodiversidade do Cerrado devido à escassez de estudos relacionados à constituição química das espécies estudadas. The Cerrado is known as the world’s richest savanna in biodiversity, but still little explored from the chemical view. Among the genus of plants found in this biome, there is Erythroxylum (Erythroxylaceae), which is known mostly for the tropane alkaloids metabolites. This work describes a comparative study of flowers chemical profile from E. campestre, E. suberosum e E. tortuosum, as well as the chemical study of E. tortuosum leaves. To obtain the chemical profile of flowers for the different species, the extracts were prepared in hexane, dichloromethane, ethyl acetate and methanol, which were analyzed by 1H NMR, HPLC UV/DAD and GC-MS. The data showed similar phytochemical composition in the species investigated, suggesting attendance of terpenes, flavonoids and alkaloids. The GC-MS analysis afforded to identify hydrocarbons, aldehydes and a phenolic derivative. The extracts of the leaves of E. tortuosum were prepared likewise the flowers extracts, but to obtain alkaloids it was performed an acid-base extraction of the methanolic extract of the leaves. From the ethyl acetate and methanolic extracts of leaves, were identified six substances: α-amyrin (I), β-amyrin (II), campesterol (III), stigmastan-3,5-diene (IV), β-sitosterol (V) and 7,4’-di-O-methylquercetin-3-O-β -rutinoside (IX), which flavonoid was found as the major compound of extracts. Through the alkaloid extraction it was possible to identify three tropane alkaloids: tropacocaine (VI), cocaine (VII) and 6-methoxy-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-3-ol (VIII), and among them, compound (VIII) was described for the first time in Erythroxylum genus. The results obtained are important for the chemical knowledge of the Cerrado biodiversity, since there are not much data in the literature about the species studied in this work. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O gênero Eryhtroxylum pertence à família Erythroxylaceae e é amplamente utilizado na medicina popular. Estudos mostraram que neste gênero foram encontrados metabólitos secundários das classes dos alcaloides, flavonoides, esteroides e terpenos. O presente trabalho foi subdividido em três etapas, sendo: (i) estudo dos compostos orgânicos voláteis (COVS) presentes nas folhas de E. deciduum; (ii) estudo do perfil químico das folhas de quatro espécies do gênero Eryhtroxylum (E. deciduum, E. suberosum, E. campestre e E. tortuosum) e avaliação citotóxica dos extratos frente a células HeLA; (iii) estudo químico e desreplicação do extrato etanólico das folhas de E. deciduum, e avaliação citotóxica frente a células tumorais 4T1. Para o estudo dos COVS utilizou as técnicas hidrodestilação e HSPE, apresentando como constituição química principal, hidrocarbonetos alifáticos além de cetonas, aldeídos, alcoóis, ésteres e esteroides. O perfil químico das quatro espécies foi realizado utilizando técnicas qualitativas como CCD, CLAE-DAD, CG-EM e RMN de 1H, evidenciando a predominância de flavonoides, alcaloides e esteroides. Os extratos diclorometano e metanol de E. campestre e E. suberosum; acetato de etila de E. deciduum e metanol de E. tortuosum apresentaram potencial citotóxico significativo frente a células HeLA (in vitro). O estudo fitoquímico da fração acetato de etila de E. deciduum levou ao isolamento de dois flavonois glicosilados: 4’,7-di-O-metilquercetina-3-O-β-rutinosídeo (I) e kaempferol-3-O-rutinosídeo (II), ambos confirmados pela fragmentação em análise de espectrometria de massas sequencial e por experimentos de Ressonância Magnética Nuclear. A desreplicação por CLUE- EM do extrato etanólico das folhas de E. deciduum levou a identificação de quatro flavonoides, sendo estes I e II, além da rutina (III) e catequina ou epicatequina (IV), todos já relatados para o gênero. Este mesmo extrato foi avaliado por ensaios in vitro frente a células tumorais do tipo 4T1, apresentando inibição semelhante ao controle cisplatina. Os resultados obtidos são importantes para o conhecimento das espécies estudadas, uma vez que a literatura apresenta dados bastante restritos. The genus Eryhtroxylum belongs to the family Erythroxylaceae and is widely used in folk medicine. Studies have shown that in this genus secondary metabolites of the classes of alkaloids, flavonoids, steroids and terpenes were found. The present work was subdivided in three stages, being: (i) study of the volatile organic compounds (VOCS) present in the leaves of E. deciduum; (ii) study of the chemical profile of the leaves of four species of the genus Eryhtroxylum (E. deciduum, E. suberosum, E. campestre and E. tortuosum) and cytotoxic evaluation of the extracts against HeLA cells; (iii) chemical study and dereplication of the ethanolic extract of E. deciduum leaves, and cytotoxic evaluation against 4T1 tumor cells. For the study of VOCS, the hydrodestilation and SPME techniques were used, presenting as main chemical composition, aliphatic hydrocarbons besides ketones, aldehydes, alcohols, esters and steroids. The chemical profile of the four species was performed using qualitative techniques such as CCD, HPLC-DAD, GC-EM and 1H NMR, evidencing the predominance of flavonoids, alkaloids and steroids. The dichloromethane and methanol extracts of E. campestre and E. suberosum; E. deciduum ethyl acetate and E. tortuosum methanol showed significant cytotoxic potential against HeLA cells (in vitro). The phytochemical study of the ethyl acetate fraction of E. deciduum led to the isolation of two glycosylated flavonoids: 4 ', 7-di-O-methylquercetin-3-O-β-rutinoside (I) and kaempferol-3-O-rutinoside (II), both confirmed by the fragmentation in analysis of sequential mass spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance experiments. The UHPLC-MS dereplication of the ethanolic extract of the leaves of E. deciduum led to the identification of four flavonoids, these being I and II, besides rutin (III) and catechin or epicatechin (IV), all already reported for the genus. This same extract was evaluated by in vitro assays against 4T1 type tumor cells, exhibiting inhibition similar to the cisplatin control. The results obtained are important for the knowledge of the studied species, since the literature presents very restricted data. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

ESTUDO QUÍMICO DE Eugenia dysenterica DC. (MYRTACEAE) EM ASSOCIAÇÃO AO CONTROLE DE FORMIGAS CORTADEIRAS Atta laevigata E EFEITO ALELOPÁTICO – O estudo descrito neste trabalho contribui para o conhecimento químico e biológico da espécie E. dysenterica, encontrada especialmente em região de Cerrado e conhecida popularmente como “cagaita”. Espécies do gênero Eugenia são utilizadas na medicina popular para o tratamento de diversas doenças e E. dysenterica possui relatos de atividade antiviral, fungicida, citotóxica, entre outras. Este trabalho descreve o isolamento e identificação estrutural de sete metabólitos secundários presentes no extrato etanólico das flores de E. dysenterica, assim como a avaliação biológica dos extratos etanólicos das flores, folhas, galhos e sementes frente a formigas cortadeiras da espécie A. laevigata e avaliação do efeito alelopático. O estudo das flores foi realizado utilizando diferentes técnicas cromatográficas e os compostos isolados foram identificados por experimentos uni e bidimensionais de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C. A investigação química do extrato das flores, realizada pela primeira vez, levou a identificação dos compostos ácido gálico, galato de etila, quercetina, miricetina, kaempferol, (-)-epicatequina e a juglanina. Os extratos etanólicos de E. dysenterica e as frações obtidas do extrato das flores, não apresentaram resultados significativos nos ensaios por ingestão frente às operárias A. laevigata. Já os ensaios alelopáticos realizados com os extratos etanólicos brutos das folhas, flores, galhos e sementes forneceram resultados satisfatórios, sendo que os extratos das flores e folhas (2 mg/mL) apresentaram os maiores valores de inibição, permitindo a germinação de menos de 5% das sementes avaliadas. CHEMICAL STUDY OF Eugenia dysenterica DC. (MYRTACEAE) IN ASSOCIATION TO LEAF-CUTTING ANTS Atta laevigata CONTROL AND ALELOPATIC EFECT – The study described in this work contributed to the chemical and biological knowledge of species E. dysenterica, found especially in Cerrado and popularly known as “cagaita”. Species of Eugenia are also used in folk medicine for various diseases and biological activities have been reported for E. dysenterica such as, antiviral, fungicidal, cytotoxicity, among others activities. This work describes the isolation and structural identification of seven secondary metabolites presente in the ethanolic extract of flowers of E. dysenterica, as well as the biological evaluation of the ethanolic extracts of flowers, leaves, stems and seeds against leaf-cutting ants A. laevigata and evaluation of allelopathic effect. The study of flowers was carried out using chromatographic technics and the isolated compounds were identified by 1D and 2D NMR experiments. The chemical investigation of flowers extract, first time investigated, led to identified the compounds ethyl gallate, gallic acid, kaempferol, quercetin, myricetin, (-)- epicatechin and juglanin. The ethanolic extracts of E. dysenterica and the fractions obtained from the flower extract didn’t show significant results in the ingestion tests against the workers A. laevigata. The allelopathic assays performed with the crude ethanolic extracts of leaves, flowers, stems and seeds provided satisfactory results. The flowers and leaves extracts (2 mg/mL) showed the highest inhibition values, allowing the germination of less than 5% of seeds evaluated. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O gênero Banisteriopsis é bastante difundido na medicina tradicional. Este trabalho tem como objetivo contribuir com informações sobre a constituição química e sobre a avaliação da atividade biológica do óleo essencial, do extrato etanólico das folhas e das frações da Banisteriopsis laevifolia. A prospecção química indicou a presença de flavonoides, terpenoides, saponinas, fenóis e esteroides. Não foi detectada a presença de compostos nitrogenados característicos de algumas espécies desta família. A classe de metabólitos predominante foi de flavonoides, com maiores concentrações nas frações acetato de etila e n-butanol. As atividades antibacterianas, antifúngicas e a citotoxidade do óleo, extrato etanólico e frações foram avaliadas pelo método da microdiluição em caldo, de onde foram calculadas as concentrações inibitórias mínimas (CIM). O extrato etanólico e frações não inibiram o crescimento das bactérias Gram-positivas testadas com CIM menores que 400 μg mL-1. Para as bactéria Gram-negativas testadas as frações hexânica e hidroetanólica foram mais efetivas contra a bactéria F.nucleatum (CIM de 100 μg mL-1). O extrato etanólico apresentou atividade antifúngica com CIM de 31,2 μg mL-1. As frações acetato de etila e n-butanol apresentaram CIM de 187,5 μg mL-1 e 93,7 μg mL-1, respectivamente, despertando o interesse para o isolamento. A atividade antioxidante foi avaliada pelo método do radical livre DPPH. O extrato etanólico e as frações acetato de etila e n-butanol mostraram-se ativa, visto que apresentaram valores de CE50 (4,53 μg mL-1, 4,07 e 8,39 μg mL-1, respectivamente) equivalentes ao do BHT (7,3 μg mL-1). A Análise por CLAE-EM/EM das frações mais ativas (acetato de etila e n-butanol) permitiu identificar compostos fenólicos (ácidos fenólicos e flavonóis) de reconhecida atividade biológica na literatura. Na análise dos componentes voláteis por CG-EM dos óleos essenciais das folhas, coletadas em dois períodos estudados (seco e chuvoso), foi encontrada uma pequena variação nos compostos. As principais classes identificadas para o óleo coletado no período da seca foram álcoois alifáticos (23,4%), terpenoides (18,7%), ésteres (10,4%), e alcanos de cadeia longa (9,2%). O período da chuva apresentou maior número de terpenoides (26,8%). Os compostos majoritários (3Z)-hexenol, fitol e untriacontano estão presentes nos dois períodos de coletas das folhas, em quantidades diferentes (19,4%; 9,8%; e 7,5% no período da seca, e 17,0%; 14,9%; e 15,3% no período chuvoso, respectivamente). O óleo essencial das folhas de B. laevifolia do período chuvoso não foi efetivo frente às bactérias bucais Gram-positivas e Gram-negativas testadas. Entretanto, exibiu atividade antifúngica relevante (CIM de 1000 μg mL-1) contra Candidas. Desta forma, os resultados da atividade biológica para o extrato etanólico, frações, e para o óleo essencial da B. laevifolia são promissores. Este estudo contribuiu para o conhecimento químico e biológico da espécie B. laevifolia. The Banisteriopsis genus is widespread in traditional medicine. This work aims to contribute with information about the chemical composition and on the evaluation of the biological activity of the essential oil, the ethanol extract of the leaves and partitions of the Banisteriopsis laevifolia. The phytochemical screeningtest of ethanol extract and partitions of leaves indicated the presence of flavonoids, terpenoids, saponins, phenols and steroids compounds. Nitrogenous compounds, characteristic of some species of this family, were not detected. Flavonoids were the predominant metabolite, with the highest concentrations on the partitions ethyl acetate and n-butanol. The antibacterial activity, antifungal and cytotoxicity of the essetial oil, ethanol extract and partitions were assyed by microdilution broth method (MBM), where the minimum inhibitory concentrations (MIC) were calculated. The ethanol extract and partitions did not inhibit growth against to Gram positive bacteria tested, with MIC less than 400 mg L-1. For the Gram negative bacteria tested, the hexane and hydroethanol partitios were more effective against F. nucleatum bacteria (MIC 100 ug mL-1). The ethanol extract showed antifungal activity with MIC of 31.2 mg L-1. Ethyl acetate and n-butanol partitions showed MIC 187.5 mg L-1 and 93.7 mg L-1, respectively, arousing interest for isolation studies. The antioxidant activity was evaluated by the DPPH free radical method. The ethanolic extract, ethyl acetate and n-butanol partitions were active, since they showed EC50 values (4.53 ug mL-1, 4.07 and 8.39 ug mL-1, respectively), values equivalent to the BHT (7.3 mg L-1). The analysis by HPLC-MS/MS of the most active fractions (ethyl acetate and n-butanol) identified phenolic compounds (flavonols and phenolic acids) which exert recognized biological activity. The GC-MS analysis of the essential oils from leaves collected in two periods studied (dry and wet), showed a small variation in the number of compounds. The major classes identified for the oil collected in the dry period were aliphatic alcohols (23,4%), terpenoids (18.7%), sterols (10.4%) and long-chain alkanes (9.2%) compounds. Terpenoids (26.8%) were the major class for the rain season. The major compounds (3Z) -hexenol, phytol and untriacontano are present in the two seasons but in different amounts (19.4%, 9.8% and 7.5% during the dry season, and 17.0 %, 14.9% and 15.3% in the rainy season, respectively). The essential oil from rainy season was not effective against to the oral bacteria Gram positive and Gram negative tested. However, showed significant antifungal activity with MIC 1000 mg L-1 against Candidas. Thus, the promising results with respect to biological assays of ethanolic extract and partitions from B. laevifolia contributed to the chemical and biological knowledge of the species B. laevifolia. Dissertação (Mestrado)

No presente trabalho foi realizado o estudo químico de Eriotheca pubescens com a finalidade de isolar e identificar estruturalmente metabólitos secundários presentes no caule e nas folhas desta espécie. Além disso, foi realizada avaliação do potencial antioxidante através do método de captura dos radicais livres com DPPH e avaliação do potencial de inibição frente às catepsinas K, L e V através de ensaio in vitro utilizando o substrato fluorogênico Z-FR-MCA. O estudo químico do extrato etanólico do caule levou ao isolamento e identificação dos triterpenoides α-amirina e β-amirina; dois diterpenoides, ácido 7-oxo-labda-8,13-dien-15-oico e o ácido Δ13,14-ent-labd-8β-ol-15-oico; quatro derivados do ácido benzoico, o ácido p-hidroxibenzoico, o ácido 3,4- diidroxibenzoico, o ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzoico, o ácido 3-metoxi-4- hidroxibenzoico e o flavonoide quercetina. Do extrato etanólico das folhas foram isolados e identificados dois triterpenoides, sendo estes a lupenona e o lupeol. No ensaio de atividade antioxidante o ácido 3,4-diidroxibenzoico (EC50 de 0,34 ± 0,0083 mM) e a quercetina (EC50 de 0,11 ± 0,0057 mM) apresentam elevado potencial antioxidante. Nos ensaios frente às catepsinas K, L e V, os extratos e a maior parte das frações apresentaram atividade inibitória superior a 50% e das substâncias isoladas e avaliadas o ácido p-hidroxibenzoico mostrou-se um moderado inibidor (IC50 de 135,81 ± 17,07 μM) e a quercetina um potente e seletivo inibidor (IC50 de 2,2 ± 0,2 μM), ambos para catepsina V. Estes resultados são importantes para contribuir com o conhecimento químico e biológico desta espécie, que até o momento não possui relatos de estudos químicos e biológicos. In the present work the chemical study of Eriotheca pubescens lead to the isolation and structural identification of secondary metabolites present in the stems and leaves of this species. Furthermore, it was evaluated of antioxidant potential by the capture method of free radicals using DPPH and the study also was lead to search cathepsins K, L, and V inhibitors through in vitro test using the fluorogenic substrate Z-FR-MCA. The chemical study of the ethanolic extract from the stem led to the isolation and identification of triterpenoids α-amyrin and β-amyrin; two diterpenoids, 7-oxo-labda-8,13-dien-15-oic acid and ent-Δ13,14- labd-8β-ol-15-oic acid; four derivatives of benzoic acid, p-hydroxybenzoic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid, 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid, 3-methoxy-4- hydroxybenzoic acid and flavonoid quercetin. From the ethanolic extract of the leaves, it has been isolated and identified two triterpenoids, lupenona and lupeol. The compounds 3,4-dihydroxybenzoic acid (EC50 0,34 ± 0,0083 mM) and quercetina (EC50 de 0,11 ± 0,0057 mM) showed high antioxidant potential using DPPH assays. The extracts and the major fractions showed above 50% inhibitory activity against cathepsins K, L and V. The p-hydroxybenzoic acid was shown to be a moderate inhibitor (IC50 135,81 ± 17,07 μM) and quercetin a potent and selective inhibitor (IC50 2,2 ± 0,2 μM), both against cathepsin V. These results are important to contribute the chemical and biological knowledge of this species, which so far has no reports of chemical and biological studies. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Tendo em vista que espécies do gênero Psychotria são descritas como fontes de alcalóides, principalmente do tipo β-carbolínicos, com potencial atividade biológica, focamos neste trabalho o estudo fitoquímico das folhas de Psychotria capitata Ruiz & Pav. (Rubiaceae) de vasta ocorrência no Cerrado goiano. O estudo desta espécie levou ao isolamento e elucidação estrutural dos alcaloides: bufotenina e N-óxido de bufotenina e da cumarina iso-escopoletina. Esses alcaloides foram encontrados majoritariamente em todas as frações estudadas. Além disso, foi identificado em mistura, dois alcaloides: o 6-hidroxi- 2-metil-1,2,3,4-tetraidro-β-carbolínico e o 7-carboxil-2-metil-3,4-diidro-β- carbolínium. Este último inédito, contudo ainda em fase de elucidação estrutural. Adicionalmente, considerando o grande potencial bioativo dos alcaloides indólicos, particularmente os isolados de Psychotria no que diz respeito à atividade biológica no sistema nervoso central, submetemos as frações e compostos isolados de P. capitata à avaliação in vitro tendo como alvo biológico as isoenzimas monoaminoxidases MAO-A e MAO-B. Essa avaliação foi realizada em colaboração com o grupo de pesquisas da FF/UFRGS que desenvolve estudos na busca de inibidores das enzimas envolvidas em doenças neurodegenerativas tais como doença de Parkinson e de Alzheimer, sendo que a busca de compostos que possam interagir com as enzimas colinesterase (AChE e BChE) e monoaminooxidases (MAO-A e MAOB) são consideradas importantes para a compreensão das bases neuroquímicas dessas doenças. As frações alcaloídica de P. capitata (10 μg/mL) apresentaram taxas de inibição entre 60 e 89%, mostrando o potencial destas frações. A bufotenina (86 μM), apresentou inibição para MAO-A, sendo seletiva para a mesma, enquanto que o N-óxido de bufotenina não apresentou inibição para essas enzimas. Dessa forma contribui-se para o estudo de espécies da família Rubiaceae, confirmando o grande potencial da mesma como fonte de alcaloides indólicos com núcleo β-carbolinicos com atividade biológica de grande interesse. Regarding that Psychotria species are described as sources of alkaloids, mainly β-carboline type with potential biological activity, this work focused on the phytochemical study of Psychotria capitata Ruiz & Pav. (Rubiaceae) leaves with widely occurrence on Cerrado Biome. The study of this specie led to the isolation and structural elucidation of the alkaloids: bufotenine and bufotenine-N-oxide and coumarin iso-scopelletin. These alkaloids were found mostly in all studied fractions. Furthermore, two alkaloids were identified in misture: 6-hydroxide-2-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β- carboline and 7-carboxyl-2-methyl-dihydro-β-carbolinium. Last one is novel alkaloid which however still in structural elucidation. Additionally, considering the great bioactive potential of indol alkaloids, particularly those found in Psychotria species regarding to central nervous system biological activity, we have submitted fractions and isolated compounds of P. capitata to in vitro evaluation with monoamineoxidases MAO-A and MAO-B as bio targets. These biological essays was realized in collaboration with research group of FF/UFRGS that develops studies searching for enzymatic inhibitors involved in neurodegenerative disease such as Parkinson´s disease and Alzheimer. Thus, search of compounds that interact with cholinesterase (AChE and BCHE) and monoamineoxidases (MAO-A and MAO-B) enzymes are important to the comprehension of neurochemical bases of these diseases. The alkaloidal fractions of P. capitata (10 mg/mL) showed inhibition rates between 60 and 89 %, which demonstrate the potential of these fractions. Bufotenine showed selective inhibiton (89 μM) to MAO-A, while bufotenine-Noxide didn´t showed inhibition to none of the enzymes. Therefore, this work contributes to the study of the species of Rubiaceae family, confirming the great potential of this family as source of indol alkaloids with a β- carboline nucleous, which show biological activity of great interest. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O presente trabalho descreve o estudo químico de E. suberosum, no intuito de elucidar estruturas de metabólitos secundários presentes nas folhas, caule e raiz, além de avaliar, por meio de teste in vitro, a atividade dos extratos, frações e, quando possível das substâncias isoladas, em busca de inibidores de catepsinas utilizando como ferramenta o substrato fluorogênico ZFR-MCA. Estas enzimas, também conhecidas como cisteíno peptidases lisossomais, estão envolvidas em diversos processos fisiológicos, além de estarem associadas a muitas condições patológicas, estando as catepsinas K, L e V, envolvidas no desenvolvimento de doenças como osteoporose, câncer de pele e aterosclerose, respectivamente. Baseado nos processos patológicos em que estas catepsinas estão envolvidas, a busca de inibidores específicos pode ser uma nova abordagem para o tratamento destas doenças. O estudo do extrato etanólico das folhas levou a identificação de quatro flavonoides pertencentes à classe dos flavonois, sendo estes a quercetina e seus derivados 3-Omonoglicosídeos hiperina e isoquercitrina e 3-O-diglicosídeo, ombuina-3- rutinosídeo, todos já relatados para esta espécie. Do extrato etanólico da raiz, foi isolada a mistura dos flavanois catequina e epicatequina, além do éster graxo do β-sitosterol. No caule foram identificados a mistura dos esteroides campesterol, estigmasterol e β-sitosterol. Este estudo também sugere a presença dos alcaloides tropanos, tropacocaína e nortropacocaína no extrato etanólico das folhas, sendo estes relatados pela primeira vez na espécie. Nos ensaios frente às catepsinas K, L e V, todos os extratos apresentaram inibição superior a 60% quando avaliados na concentração de 50 μg/mL. Já as frações oriundas da partição líquido-líquido, apresentaram inibição mais expressiva frente às catepsinas V e L, quando avaliadas nas concentrações de 5 e 50 μg/mL. O flavonol quercetina apresentou um valor de IC50 de 2,2 ± 0,2 μM para a catepsina V e baixa afinidade para as catepsinas K e L quando avaliado na concentração de 100 μM. Este é um resultado importante, uma vez que os relatos na literatura para flavonoides como inibidores de catepsinas são bastante restritos. This work describes the chemical study of E. suberosum, aiming to elucidate structures of secondary metabolites in the leaves, stem and roots. Cathepsins assays were used to evaluate in vitro activity of extracts, fractions and isolated compounds, using fluorogenic substrate ZFR-MCA. These enzymes, also known as lysossomal cysteine peptidases are involved in many physiological processes, and are associated with many pathological conditions. Cathepsins K, L and V are involved in the development of diseases such as osteoporosis, skin cancer and atherosclerosis, respectively. Based on pathological processes in which cathepsins are involved, the search for specific inhibitors can be a new approach for the treatment these diseases. The study of ethanolic extract from leaves led to the identification of four flavonoids belonging to the flavonol class: quercetin and its derivatives 3-O-monoglycosides hyperin and isoquercitrin, and 3-O-diglycosides, ombuin-3-rutinoside, all previously reported for this species. The mixture of flavanols, catechin and epicatechin were isolated from ethanolic extract from roots, besides the fatty ester of sitosterol. The mixture of steroids campesterol, stigmasterol and β-sitosterol were identified from the stem extract. This study also suggests the presence of tropane alkaloids, tropacocaine and nortropacocaine, in the ethanolic extract from leaves of E. suberosum, reported for the first time in this species. In the evaluation for cathepsins K, L and V, the extracts (concentration of 50 mg/mL), showed significant inhibition of all enzymes with percentage inhibition values above 60%. The fractions showed significant activity against cathepsin V and L when evaluated at concentrations of 5 and 50 mg/mL. The quercetin flavonol showed IC50 value of 2.2 ± 0.2 μM against cathepsin V and low affinity for cathepsins K and L (100 μM). This is an important result since literature reports for flavonoids as inhibitors of cathepsin V are quite limited. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O estudo descrito neste trabalho contribui para o conhecimento químico e biológico das espécies B. coccolobifoliae E. malaccensis, conhecidas popularmente como“murici” e “jambo-vermelho”, respectivamente. Estas espécies são encontradas em diversas regiões do Brasil, principalmente nasáreas do Cerrado, e são largamente apreciadas pelos frutos comestíveis. Diversas aplicações na medicina popular estão relacionadas a estas espécies, como atividade antibacteriana, antidiarreica, anti-inflamatória e no controle de diabetes. O estudo do extrato etanólico das raízes de B. coccolobifolialevou à identificação da mistura dos triterpenos αe β-amirina, mistura dos esteroides campesterol, estigmasterol e β-sitosterol, ácido oleanólico (triterpeno do tipo oleaneno) e glochidonol (triterpeno do tipo lupano), relatado pela primeira vez no gênero Byrsonima. Do extrato etanólico das folhas de E. malaccensisfoi possível isolar dois flavonoides pertencentes à classe dos flavonois, mearnsetina e mearnsitrina. As substâncias foram identificadas com base nos dados de RMN de 1 H, 13 C, HSQC, HMBC e/ou CG/EM, em comparação com a literatura. Foi tambémverificado o potencial de inibição dos extratos e suas frações, frente às catepsinas K, V e L. Essas enzimas são encontradas majoritariamente nos lisossomos e podem participar de processos celulares bastante especializados levando ao desenvolvimento de diversas patologias como doenças cardiovasculares, osteoporose, aterosclerose, tumores malignos, pancreatite, entre outras. Os extratos e a maioria das partições mostraram atividade inibitória significativa frente a estas enzimas, quando avaliados nas concentrações de 125 e 50 µg/mL, sendo os melhores resultados observados para a catepsina V. Os flavonoides mearnsetina e mearnsitrina não apresentaramatividade quandoavaliados nas catepsinas K e V, na concentração de 25 µM. The study described in this work contributed to the chemical and biological knowledge of species B. coccolobifoliaand E. malaccensis,known popularly as "murici" and "jambo-vermelho", respectively. These species are found in various regions of Brazil, especially in Cerrado areas, and are widely appreciated by ediblefruit. Several applications in folk medicine are related to these species,such as antibacterial activity, antidiarrheal, anti-inflammatory and on control diabetes (antidiabetic). The study of roots ethanolic extract of B. coccolobifolialed to the identification of mixture of triterpenes α-amiryn and β-amiryn, mixture of steroids campesterol, stigmasterol and β-sitosterol, oleanolic acid(olenene-type triterpene) and glochidonol (lupane-type triterpene), reported for the first time in the Byrsonima genus. Of the leaves ethanolic extract of E. malaccensiswas possible to isolate two flavonoids, mearnsetin and mearnsitrin, both of flavonol class. The structural identification was carried out on the basis of 1D- and 2D-NMR experiments, GC/MS and comparison with literature data. It was also measured the inhibition potential of extracts and your fractions of these plants against cathepsins K, V and L. These enzymes are found mainly in lysosomes and may also involved in selective and controlled pathological processes, such as cardiovascular diseases, osteoporosis, atherosclerosis, malignant, pancreatitis, many others. The extracts and most partitions showed considerable inhibition against cathepsins (concentration of 125 and 50 µg/mL), and the best results are observed for cathepsin V. The flavonoids mearnsetin and mearnsitrin have not presented activity when evaluated in cathepsins K and V (concentration of 25 µM). Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

This work had the aim to assess some biological eects of the Bidens sulphurea (Asterace ) (also know as Cosmos sulphureus), assessed eects were: cytotoxicity, antibiotic and phototoxicity. The phototoxicity was ephasized, since the primary aim of this work was to evaluate if this plant\'s pigments could be used as photosensitizers in the photodynamic therapy, in a non invasive way, using light emitted by LED, for treatment of dermatosis, particularly, onicomicosis. The conclusion of this work is that, of the two Bidens sulphurea varieties studied, the one that bear the greater photodynamic activity, when irradiated with white light, or red light ( 600 nm) and did showed greater antibiotic eect (in the dark) was the orange variety. The orange variety did showed an increase in the toxicidy to the Artemia salina nauplii, when irradiated with red light. Este trabalho teve por objetivo, avaliar alguns efeitos biologicos do extratos bruto (etanolico) das ores de Bidens sulphurea (Asterace), os efeitos avaliados foram: citotoxicidade, efeito antibiotico e fototoxico. Deu-se ênfase aos efeitos fototoxicos, pois o objetivo primario era avaliar se os pigmentos desta planta poderiam ser utilizados como fotosensitizadores para a terapia fotodinâmica, empregando-se luz emitida por LED, para o tratamento de um modo não invasivo de dermatoses, tais como a onicomicose. Concluiuse que, das duas variedades da planta estudada (variedades laranja e amarela), a que apresenta maior fototoxicidade tanto quando irradiado por luz branca, e vermelha ( 600 nm), quanto efeito antibiotico (no escuro) foi a variedade laranja, a qual tambem mostrou uma grande toxicidade frente aos nauplios de Artemia salina quando irradiada com luz vermelha. Mestre em Química